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Identificación de un tipo celular en los órganos periféricos de ratón:
«Células Dendríticas» Equipo 6
Sara Hernández Xico
Carlos Manuel Malpica Márquez
Greysi Gutiérrez Porras
Identification of a novel cell type in peripheral lymphoid organs of mice
Autor: Ralph M. Steinman
Morfología, cuantificación y distribución en el tejido.
The Rockefeller University, New York.
Laboratorio de Zanvil A. Cohn
Artículo recibido para su publicación él 19 de enero de 1973.
Revista Journal of Experimental Medicine
Premio Nobel de medicina 2011
El 50% del premio fue concedido a Ralph M. Steinman por el descubrimiento de las células dendríticas.
El 50% restante fue otorgado a Bruce A. Beutler y Jules A. Hoffman, por sus descubrimientos relativos a la activación de la inmunidad innata.
Los aportes de los premiados iniciaron un camino que condujo al replanteo de aspectos esenciales de la respuesta inmune.
Un poco de historia…
Ralph M. Steinman, Premio Nobel de Medicina 2011.
Descubrimiento de las células dendríticas y la caracterización de su papel en la inmunidad adaptativa.
Inmunólogo canadiense, murió tres días antes del anuncio del Premio Nobel.
• Realizó sus estudios de grado en la Universidad McGill de Montreal.
• Doctorado en Medicina en 1968 en la Universidad de Harvard.
• Completó su formación médica como residente interno del Hospital General de Massachusetts.
• Recibió galardones por sus investigaciones sobre células dendríticas, tales como el Premio Albert Lasker para la Investigación Médica Básica (2007).
• Fue miembro de la Academia Nacional de Ciencias de los Estados Unidos en el 2001.
Ralph M. Steinman
Su lucha contra el cáncer… Steinman murió de cáncer de páncreas.
Luchó su cáncer mediante el uso de
terapias experimentales con sus
descubrimientos.
Como todas las vacunas contra el
cáncer, ha sido un reto conseguir la
inmunoterapia con células dendríticas
para destruir tumores en las personas.
El objetivo es activar selectivamente ciertas células T que se adaptan mejor para apuntar el cáncer.
Una de las dificultades es que las células dendríticas de cada persona son diferentes, por lo que las vacunas deben ser personalizadas, haciéndolas costosas y requieren mucho trabajo para producirse.
Un documento que publicó a principios de este año en el Journal of Clinical Oncology describe una vacuna de células dendríticas en glioma avanzado, una forma agresiva de cáncer cerebral. Nueve de las 22 personas que la recibieron estuvieron vivas un año después y sin signos de progresión, una rareza en un cáncer tan grave como éste.
Él tenía una gran fe en las células dendríticas
Creía que establecerían la inmunidad, y que curaría el
cáncer.
Hoy sabemos, gracias a Steinman y colaboradores, que las células dendríticas son responsables, de activar linfocitos T vírgenes y también de orquestar la respuesta adaptativa hacia microbios, tumores y antígenos propios e imponer un perfil determinado de respuesta T efectora.
Las células dendríticas son capaces de sensar señales de peligro en tejidos periféricos, migrar hacia órganos linfáticos secundarios (ganglios linfáticos, bazo) y activar linfocitos T.
A su vez, estas células son responsables de cambiar el curso de la respuesta inmune adaptativa, merced a su capacidad de liberar citoquinas que inducen la diferenciación de células T CD4 hacia perfiles T efectores particulares.
Cada uno de estos perfiles inmunológicos pone en juego diversos mecanismos inmunitarios frente al desafío con diferentes patógenos (virus, bacterias, parásitos y hongos) y al desarrollo de tumores.
En este contexto, no es exagerado asumir que las células dendríticas,
aun cuando pertenecen a la inmunidad innata,
constituyen el “motor” y “cerebro” de la
inmunidad adaptativa.
identificó, células con morfología y funcionalidad diferente a otras poblaciones celulares de bazo de ratón, a las cuales bautizó con el nombre de “células dendríticas”
En 1973, en un trabajo publicado en la revista Journal of Experimental Medicine (Identification of a novel cell type in peripheral lymphoid organs of mice)
Introducción Durante el curso de las observaciones sobre las células de
bazo de ratón que se adhieren a superficies de cristal y de plástico, estaba claro que esta población era muy heterogénea.
Además de fagocitos mononucleares, granulocitos y linfocitos, notaron células estrelladas con propiedades distintas de las anteriores.
En el trabajo se caracterizan propiedades funcionales in vitro, así como su localización y propiedades in situ.
Materiales y métodos Ratones outbred mantenidos en la Universidad Rockefeller
Suspenciones de células individuales de bazo se prepararon en dos formas generales.
Método 1 1.- el método manual involucraba tomar el bazo con pinzas
finas en un medio a temperatura ambiente , además por aspiración varias veces en una pipeta Pasteur y se transfirieron a un tubo Falcon.
Los restantes grupos de tejido se dejaron sedimentar durante 5 minutos.
El sobrenadante se aspiró y se centrifugó durante 10 min a temperatura ambiente.
El sedimento de células se resuspendieron en medio de 199 a 10% de suero de ternera fetal ([FCS] se calentó durante 30 minutos a 56 ° C; Medio 199 y FCS se obtuvieron de Grand Island Biological Company, Grand Island, NY).
Se suplementó con 100 U / ml de penicilina.
Método 2
Otro método de recolección de células de bazo (fragmentos por sí solos, o fragmentos y células individuales) fue con colagenasa clostridial durante 15 min en un baño de agua a 37 ° C, sin agitación.
La pequeña cantidad de tejido no digerido residual se dejó sedimentar, y luego la suspensión sobrenadante, de una sola célula se aspiró, se centrifugó, se lavó y se resuspendió en medio de cultivo como se describió anteriormente.
Las alícuotas de la suspensión de células se cultivaron en cubreobjetos de vidrio o de plástico en cajas de Petri durante 1 hora a 37 ° C.
Las células no adherentes se eliminaron con cuatro a cinco lavados de Medio 199 con remolino de las placas de cultivo entre lavados.
Un procedimiento más vigorosa incluye el uso de un único lavado en la que el chorro de fluido de lavado se dirige con una jeringa directamente en la monocapa de células adherentes, en vez de a un lado del recipiente de cultivo.
Las células adherentes fueron examinadas inmediatamente o después de un nuevo cultivo en medio 199-10% FCS a 37 ° C.
En otros órganos…
Células adherentes de la cavidad peritoneal y medula ósea fueron cosechadas como se ha descrito previamente.
Células de exudado peritoneal se obtuvieron a partir de ratones inyectados durante 3 días por vía intraperitoneal de tioglicolato.
Timo, ganglios linfáticos, el hígado, las placas de Peyer, y el intestino fueron interrumpidas por el procedimiento enzimático descrito para el bazo.
Microscopía de contraste de fase
Examen con microscopio de contraste de fases se realizó en células vivas cultivadas en cámaras de Sykes-Moore, o en las muestras fijadas por 5 minutos a temperatura ambiente en 1,25-2,5% glutaraldehído, tamponado con cacodilato de sodio 0,1 M, pH 7,4.
Observaciones sobre las células vivas se registraron en película negativa Kodak Plus X, no. 7231, utilizando una serie de 500 aparatos cinefotomicrográficos.
Procedimientos de tinción
Tinción vital para las mitocondrias y los lisosomas se obtuvo mediante la aplicación de Janus verde y rojo neutro, respectivamente, a concentraciones de 1: 10.000 (mg / ml de medio 199) durante 1 minuto a temperatura ambiente.
Cubreobjetos fijos en metanol absoluto se tiñeron con Giemsa, mientras que la solución de formaldehído al 4% en agua se utiliza para los procedimientos de ácido periódico de Schiff y hematoxilina-eosina.
0,1% de azul de toluidina en tampón fosfato 0,1 M, pH 6,2, se utiliza para teñir los ácidos nucleicos de células fijados con glutaraldehído después del tratamiento con ribonucleasa (RNasa 0,5 mg / ml) en 0,1 M de fosfato, pH 7,0, para 2 horas a 37 ° C.
Varios tinciones histoquímicas se aplicaron a células fijadas 5 min en 1,25% de glutaraldehído incluyendo: fosfatasa ácida (16); dependiente de magnesio adenosina trifosfatasa (ATPasa); Azul de Prusia de Perls para el ion férrico; y la técnica de Graham y de Karnovsky para la peroxidasa.
También se utilizó el método de Kaplow para la peroxidasa.
Microscopía Electrónica Muestras para microscopía electrónica se prepararon de dos
formas
1.- Fijados en glutaraldehído células se rasparon de cubreobjetos y se cosechan como una pastilla como se describe previamente. El sedimento se fijó posteriormente durante 15 minutos en una mezcla de tetróxido de osmio-glutaraldehído frío seguido de tinción en bloque durante 15 minutos con 0,5% de acetato de uranilo magnesio en solución salina, pH 5,0.
2.- Alternativamente las células fueron procesadas por completo en cubreobjetos previamente recubiertos con carbono vaporizado. El método fue idéntico a la de Ross, excepto que el glutaraldehído 2,5% en tampón de cacodilato 0,1 M, pH 7,4, fue el fijador.
RESULTADOS
Morfología de las células de ratón bazo adherentes Observaciones de contraste de fase:
Como se ha señalado por otros autores , de 10 50% de las células nucleadas en el bazo del ratón se adhieren a las superficies de cristal y de plástico después de 60 minutos a 37 ° C.
Varios tipos de células nucleadas, así como las células que mueren, restos de células, glóbulos rojos y plaquetas, se pueden distinguir por microscopía de contraste de fase de las preparaciones de células adherentes fijados en glutaraldehído.
Granulocitos maduros, pueden ser reconocidos por su contenido en pequeños gránulos de fase densa (neutrófilos) o más grandes gránulos refringentes (eosinófilos). Los mielocitos menos maduros son células grandes, con un contorno irregular, y contienen numerosos gránulos de fase densa agrupados sobre una zona de Golgi clara y núcleo oval o en forma de riñón.
Las células linfoides también se adhieren al vidrio y generalmente asumen formas circulares con superficies de células lisas.
Linfocitos pequeños poseen una cromatina densa y una alta relación núcleo citoplasma.
Linfocitos grandes tienen un núcleo más refringentes y más citoplasma, en el que uno puede discernir muchos, orgánulos grandes, circulares de fase densa.
Las células plasmáticas, también son reconocidas por sus núcleos característicos excéntricos y zonas de Golgi claras.
Los fagocitos mononucleares que contienen núcleos en forma de riñón están presentes en diversos grados de diferenciación que van desde los monocitos a macrófagos grandes complejos.
La superficie de los monocitos se alborotó, y gránulos citoplasmáticos y vesículas son con frecuencia en una posición perinuclear.
Los macrófagos también tienen una superficie de volantes, pero exhiben un mayor número de orgánulos citoplasmáticos: vesículas de pinocitosis, lisosomas, mitocondrias filamentosas, fagocitado objetos, y las inclusiones refráctiles.
Con frecuencia, los macrófagos están cubiertas con linfocitos, glóbulos rojos, y las células muertas que forman racimos que sólo puede ser interrumpido por lavado vigoroso.
Además de granulocitos, linfocitos y fagocitos mononucleares, hay una cuarta variedad de adherente, de células nucleadas cuyas características morfológicas son bastante diferentes.
El proceso de identificación
Primeramente es descrito en el articulo acerca de la identificación de las células conocidas como : linfocitos, granulocitos y fagocitos mononucleares y por ultimo se menciona que es identificada una célula de adhesión cuyas características morfológicas son distintas a las demás
Características
El citoplasma de estas células grandes se dispone en seudópodos de varias formas , longitudes y números , esto resulta en diferentes formas para la célula , que pueden ser , estrelladas , alargadas bipolares hasta dendríticas
La mayoría de los seudópodos son largos , y uniformes en anchura , poseen terminaciones contundentes y también eran apreciables procesos espinosos.
El citoplasma de estas células contiene muchos gránulos circulares largos y de fase densa , steinman menciono que en la superficie de esta célula no se encontraban vesículas visibles y había muy poco material fagocitado , también no se había asegurado su capacidad de activar endocitosis.
El núcleo de la célula dendrítica es muy largo y posee una forma contorneada , su membrana nuclear esta conformada por una línea densa de fase uniforme , su nucleoplasma es translucido exceptuando zonas de largas masas cromatinas generalmente opuestas a la membrana.
Dadas las características morfológicas se llego a la conclusión que la célula dendrítica puede adquirir diversos tipos de formas , y que existían normalmente en los tejidos de adhesión en proporciones de población en un rango de 5 – 50% en las células del bazo del ratón
Colorantes
Para los diversos métodos de identificación se usaron colorantes específicos para diversos tipos de tinción.
Colorantes vitales: los organelos esféricos de fase densa que llenan los seudópodos de las células dendríticas pueden ser teñidos de manera natural con verde de janus estas son las mitocondrias , mientras que lisosomas se tiñen con rojo neutral
Colorantes histológicos de células de adhesión fijadas : el núcleo y citoplasma de las células dendríticas se tiñe débilmente tras la aplicación de diversas tinciones básicas como lo pueden ser :azul de toluidina , GIEMSA y hematoxilina , que pueden ser identificadas tras la fijación con glutaraldehido, metanol o formaldehido , esto haciendo uso de un microscopio de contraste de fases
Colorantes histoquímicos: las células dendríticas difieren en el procedimiento de tinción de otros macrófagos , primero por el contenido de sus granulos y su localización , localización de algunas enzimas como ATPasa en la membrana de la cual la célula dendrítica carece , la tercera diferencia es la respuesta al azul de Prusia que tiñe a muchos macrófagos y a la celula dendrítica no
La identificación
Para la identificación de la célula dendrítica se realizo en base a métodos de microscopia de contraste de fase y campo claro así como microcinematografía , Las observaciones realizadas en la célula dendrítica demostraron sus cualidades respecto a las de otros macrófagos cuando son preparados de la misma forma
Movimiento
El protoplasma de la célula dendrítica se mueve hacia atrás y adelante en una manera pulsátil , también su núcleo encaja en los confines de los seudópodos , la célula constantemente saca y retrae pequeñas dendritas citoplasmas en largos periodos , formas y orientación
Microscopia electrónica
Se identifico a la célula dendrítica en secciones delgadas de la población celular , esto en base a criterios de estudios de contraste de fase
Entre las observaciones realizadas se encontró que :
Posee una superficie celular suave desprovista de micro proyecciones y lagunas
El citoplasma contiene grandes mitocondrias con cristae bien desarrollada y secciones cortas de RER
La región perinuclear es pequeña y contiene al aparato de Golgi , asi como cuerpos membranosos y multivesiculares
Largos micro túbulos radian desde la región perinuclear desde el eje de los seudópodos
Se observan microfilamentos cerca del plasmalemma
Ribosomas relativamente menores en numero
Diferencias:
Superficie celular
Mitocondrias numerosas y pequeñas
Aparato de Golgi hipertrofiado
Célula Dendrítica Dendritic Cell – De la palabra
griega Árbol (por sus ramificaciones)
Ratón atímico desnudo
Distribución tisular de células dendríticas
1.0-1.6% de la población total de células nucleadas
Suspensiones de células individuales de diversos órganos.
Las células se cultivaron durante 1 h en cubreobjetos de vidrio. Después del lavado, se contó el número de células dendríticas adherentes por triplicado. Cada valor comprende datos de al menos cuatro ratones.
“Es concebible que la totalidad de la población de células dendríticas del bazo se limita a pulpa blanca”
El porcentaje de células dendríticas fue consistentemente mayor (1.5-6 veces) en pulpa blanca frente a pulpa roja.
El bazo tiene ambas pulpas y es difícil separarlas, ya que la pulpa roja se encuentra distribuida en hebras estrechas a lo largo de los nódulos pulpa blanca.
Porcentajes similares en hembras y machos.
Las DC no se encontraron en timo. Similares en contorno y morfología nuclear.
Citoplasma diferente
Las mitocondrias filamentosas, gránulos pequeños de fase densa (lisosomas).
Células
dendríticas
Órganos linfoides
periféricos
* Bazo* Placas de Peyer * Ganglios linfáticos
Criterios morfológicos después de la adhesión y difusión sobre superficies de vidrio o plástico.
Microscopia de contraste de
faseCaracterísticas
* Núcleo refractante* Mitocondria grande* Vesículas de pinocitosis* Abundantes lisosomas * Núcleo adherente* Procesos citoplasmáticos
Célula reticular(Primitiva)
No específico, cualquier célula
que tiene procesos
citoplasmáticos largos
Microscopia electrónica
Generalidades
Ralph M. Steinman
Características morfológicas
Núcleo grande
Refringentes
Retorcida en forma
Nucléolos pequeños (normalmente dos)
A diferencia de los macrófagos no participan en la endocitosis activa
Órganos linfoides periféricos
Referencias
http://news.sciencemag.org/2011/10/new-nobelist-used-his-discovery-battle-his-cancer
http://www.scielo.org.ar/scielo.php?pid=S0025-76802011000800016&script=sci_arttext
