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Conceptos básicos para tinciones histologicas. Colorantes: clasificación, tipos y funcion
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Barrera Briseño Nancy Karina
Técnicas de tinción en histología
Laboratiorio de Biolocia Celular
Medicina 1er. Semestre Dr. Horacio|
UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE BAJA CALIFORNIAFacultad de Medicina y Psicología
Introducción
Tinción de Gram; Permite diferenciar entre dos grupos de bacterias:
- Bacterias Gram positivas- Bacterias Gram negativas
Imagen tomada de: BIOLOGÍA (2º BACHILLERATO A DISTANCIA):
TUTORÍAS EN LA WEB Paloma Román Gómez 2008
http://perso.ya.com/geopal/biologia_2b/unidades/ejercicios/act5bact
ema7.htm
Por ello se desarrollaron unas
técnicas conocidas como tinciones
Para poner de manifiesto las diferentes estructuras que
integran una sección histológica, es necesario crear
artificialmente un contraste diferencial entre los diversos
elementos del tejido.
Una tinción es un procedimiento para
visualizar un tejido que puede implicar el
uso de uno o varios colorantes de modo
simultáneo o sucesivo.
¿Que es una tinción?
Citología cervicovaginal teñida con Papanicolau
ColorantesPrimero, debemos definir qué son estas sustancias,
su conformación, clasificación y otros aspectos
importantes
Naturaleza química de los colorantes
Un compuesto químico es coloreado porque sus moléculas absorben
cuantos de radiación electromagnética en la parte visible del espectro.
En las moléculas orgánicas
Los dobles enlaces se alternan
con sencillos provocando que
los electrones del enlace se
muevan de un átomo al otro
cambiando las posiciones de
los enlaces.
Generalmente, los colorantes presentan
anillos aromáticos en su estructura.
Características de los
colorantes
Un colorante
debe ser capaz
de realizar dos
cosas:
1.- Teñir o
colorear
2.- Unirse a las
estructuras
celulares
Molécula
orgánica
Teñir
Unirse
COLORANTE
Los colorantes suelen ser moléculas
orgánicas que presentan anillos aromáticos
y que absorben la luz visible por efecto de
los electrones asociados a combinaciones
de átomos llamados Cromóforos.
Capacidad de teñir
Espécimen histológico de tejido pulmonar humano teñido con hematoxilina y eosina.
Anillo
aromático++
Grupo
cromóforo
Cromógenos
Para que el colorante pueda teñir un
tej ido ha de ser capaz de unirse a
las estructuras celulares. El
elemento químico que le confiere
esta capacidad se denomina grupo
Auxocromo
Capacidad de unirse
Tinción simple con cristal violeta de Staphylococcus aureus, nos proporciona información sobre la forma y la agrupación en racimos
COLORANTE
Cromógeno
Gpo. Cromóforo
Gpo. Auxocromo
Principales grupos
Básicos
Aminas primarias NH2
Aminas secundarias NHR
Aminas terciaciarias NR2
Ácidos
Hidroxilo –OH
Carboxilo –COOH
Sulfhidrilo SH2
Gpo. Auxocromo
El grupo nitro -NO2
El grupo nitroso –N=O
El grupo indamina (imino) >C=N-
El grupo azo –N=N-
Configuración quinonica
Gpo. Cromóforo
Clasificación de colorantes
Por origen Por gruposPor
incorporación
ClasificaciónDe los colorantes por grupo
SEGÚN EL GRUPOCROMOFORO
SEGÚN EL GRUPO AUXOCROMO
Básicos o catiónicos
Azul de metileno
Nitrados Acido pícrico
Ácidos o aniónicos
Eosina Colorantes azoicos Orange G, Sudan negro, etc
Sin carga (neutros)
IsiotiocianatosÁcido + Básico
Derivados del xanteno Eosina Y, Fluoresceína sódica
Derivados de la acridina Acriflavina
Derivados de las iminasquinónicas
Orceína
Derivados de diarilmetanos y triarilmetanos
Amino-triarilmetanos
Derivados de la antraquinona Rojo nuclear rápido
Derivados de las ftalocianinas Azul alcián
Flavonoides Hematoxilina
ClasificaciónDe los colorantes por incorporación
COLORANTES VITALES COLORANTES DE EXCLUSIÓN
Aquellos que son captados únicamente por células vivas
Solo son incorporados por células muertas presentes en cultivo
Son a los que se les permite la entrada a través de la membrana.
Se basa en que la membrana de las células muertas no es capaz de funcionar como barrera de entrada
para ese colorante.
Ej. Rojo neutro y verde Janus Ej. Azul tripán
La tinciones mas habituales son:Tetraciclinas, Alizarina, Colorantes de tipo
Procion.-
Permiten estudiar el crecimiento del tejido óseo
Cuantificar la proporción de células vivas (no teñidas) o detectar mortalidad en cultivos celulares.
Naturales Artificiales
Hematoxilina Azul de metileno
Carmín Safranina
Azafrán Azul de anilina
Orceína Naranja G
ClasificaciónSe pueden clasificar, en función de su origen, en naturales y artificiales. Por
ejemplo:
Tinción de hematoxilina-eosina. Esclerosis segmentaria con formación de sinequias. Intersticio con infiltrado linfocitario. Fibrosis y atrofia tubular (x 400).
Fibras elásticas teñidas con orceína nítrica (flechas) x 400.
CELULAS EPITELIO BUCAL: 400X
¿Como se unen los
colorantes al tejido?
¿Cuáles son los
fenómenos fisicoquímicos
implicados?
MECANISMOS DE UNIÓN Tinción-Sustrato
Relaciones electrostáticas Acido-Base
Enlaces coordinados, mordientes y quelantes
Aumentan la reactividad del tejidoestableciendo una interacción
tejido colorante.
Enlaces covalentes Isiotiocianatos - Sustrato
Puentes de hidrógenoColorante-sustrato en soluciones
no acuosas
Interacciones hidrófobas en la disolución diferencial: coloraciones
de lípidosFuerzas de Van der Waals
Impregnaciones
El colorante forma agregados metálicos insolubles que quedan retenidos en el tejido gracias a la
malla molecular creada en el proceso de fijación.
Esto ocurre porque los iones del colorante unidos
al sustrato cambian la longitud de onda de
absorción de luz y, por lo tanto, el color observado
del objeto teñido es distinto al del colorante libre.
MetacromasiaSi es azul ¿Por qué tiñe de rojo?
Cromotrópicos
Antes de continuar
debemos definir algunos
conceptos
Glosario de términos relacionados
con las tinciones
Término Definición
Mordiente Reactivo que aumenta la reactividad del tejido estableciendo una interacción tejido colorante
Alumbre Modifica el colorante añadiéndole grupos auxocromos y confiriéndole un carácter muy básico
Coloración indirecta en un tiempo Aquella en la que el tratamiento del tejido con el colorante y el mordiente se realiza simultáneamente en una misma solución
Coloración indirecta en dos tiempos Cuando colorante y mordiente actúan separadamente
Glosario de términos relacionados
con las tinciones
Término Definición
Tinción progresiva Tinciones en las que los colorantes y mordientes se aplican siguiendo una secuencia definida y bajo estricto control de los tiempos para lograr una intensidad determinada.
Tinción regresiva Primero se sobre colorea y posteriormente se elimina el exceso de colorante por diferenciación
Diferenciacion Consiste en eliminar el exceso de colorante mediante agentes diferenciadores (disoluciones alcoholicasde acidos o alcalis, etanol, acetona, etc.)
Tinciones más
utilizadas
Tinción de hematoxilina-
eosina. Esclerosis
segmentaria con formación de
sinequias. Intersticio con
infiltrado linfocitario.
Fibrosis y atrofia tubular
(x 400).
Tinción general, contiene un colorante básico para las
estructuras acidas como (ADN Y ARN) y otro acido para el
citoplasma y estructuras extracelulares.
Hematoxilina: C.I. 75290) es un compuesto que se obtiene
de la planta leguminosa Haematoxylum campechianum ,
conocida también con el nombre de palo de Campeche.
Requiere ser oxidada para convertirse en una molécula
coloreada. AZUL
Eosina: Derivado halogenado del xanteno. Molécula
autofluorescente por sus átomos halógenos y es soluble
en agua y en alcoholes lo que le confiere mucha
versatilidad para la tinción histológica. Presenta un cierto
carácter ácido. ROSA
Hematoxilina-eosina
Ejemplos de tinciones
tricrómicas:
El tricrómico de Masson
El tricrómico de Van Gieson
Es una técnica para la coloración de fibras
colágenas y elásticas. Se observan colores
distintos; tejido conjuntivo de verde, tejido
muscular de verde pardo, eritrocitos de
rojizo, núcleos azul negro y citoplasma y
fibras musculares rosa.
Tricrómicos
Extensión de sangre
periférica (Tinción May
Grünwald- Giemsa):
eritrocitos de tamaño y
contenido de hemoglobina
inferior al normal
característicos de la Anemia
de Cooley
Es una tinción general que se emplea mucho
en hematología, permite distinguir, por su
coloración, los gránulos de los diferentes
leucocitos polimorfonucleares. Contiene una
mezcla de colorantes catiónicos (azul de
metileno) y aniónicos (eosina)
Giemsa
Citología ginecológica
Tinción de Papanicolaou
Coloración histológica empleada
principalmente para extensiones citológicas,
sirve para la detección precoz del carcinoma
de cérvix. Contiene una mezcla de
colorantes que no produce sobre coloración.
Normalmente tiene 4 colorantes: uno nuclear
(hematoxilina), eosina Y, que tiñe de rosa el
citoplasma, verde brillante que tiñe el moco
y Orange G que tiñe la queratina.
Papanicolau
Tinciones aplicables a
tejidos concretosAlgunas tinciones nos sirven para teñir ciertos tejidos específicos, a
continuación veremos los ejemplos mas relevantes.
TINCIONES APLICABLES A TEJIDOS CONCRETOS
Tejido nervioso Impregnaciones argénticas
Tejido conjuntivoTécnica de reticulina, de Wigert de
resorcina-fucsina, etc.
Musculo estriadoTinción de hematoxilina
fosfotúngstica ácida PTAH
HuesoExigen descalcificación o desgaste.
Coloración con tionina o tinción negativa
HigadoH-E, Tinción tricrómico, reticulina, PAS y PAS-distasa, azul de Pearls.
Neurona
TINCIONES APLICABLES A TEJIDOS CONCRETOS
RiñónH-E, PAS, tricrómico y técnica de
metenamina de plata.
PielPAS, Técnica de argentafinidad de
Masson Fontana, Tricrómico de Gallego
Microorganismos en diversos órganos
Hongos – PAS o meteanina de plata de Grocott
Bacterias: Gram, Ziehl Neelsen, Giemsa
Riñon H-E
Piel Tricrómico de Gallego
Gram
Tinciones
subcelularesEn microscopia óptica también podemos resaltar e identificar determinados
orgánulos mediante tinciones mas o menos especificas y diferenciales. A
continuación se citan ejemplos de métodos de tinción mas utilizados:
TINCIONES SUBCELULARES
Núcleo
EN CORTES. Hematoxilina férrica, safranina-light green o verde metilo.EXTENSIONES CROMOSOMICAS. Carmín acético u Orceína acética.
NucléoloGrumos de Nissil: azul toluidina, violeta de cresilo y verde metilo-pronina
MitocondriaEN CELULAS VIVAS. Verde JanusEN CORTES. Fucsina de Altmann
Aparato de Golgi Impregnaciones argénticas
Gránulos de secreción y cuerpos de inclusión
Método de Mann, con eosina amarillenta y azul de metileno, posterior diferenciación en Orange G.
Vacuolas de los fagocitos
Se inyecta al animal una suspensión de partículas de carbón antes de obtener el tejido. Las células que fagocitan el carbón las acumulan en sus vacuolas de fagocitosis.
Impregnaciones
ArgénticasSe le denomina así a toda coloración histológica en la que se emplean sales
metálicas para generar precipitados metálicos sobre estructuras que se pretenden
destacar.
1. IMPREGANCION PRIMARIA
Los tejidos don expuestos a una solución ligeramente alcalina en
la que hay una concentración no muy alta de AgNO3 que proporciona
iones de plata en exceso
2. SEGUNDA FASE
Los cortes son tratados con una solución (hidroquinona y sulfito)
que captura parte de los iones de plata que se han unido débilmente al
tejido
Impresiones ArgénticasImplica 2 pasos
Tinción negativaNo todos los colorantes se unen a las
estructuras tisulares. Algunas tinciones se
basan en la exclusión de la coloración. El
contraste negativo consiste en teñir todo
menos la estructura que queremos visualizar.
Referencias
ATLAS de HISTOLOGÍA VEGETAL y ANIMAL, Departamento de Biología Funcional y Ciencias de la Salud. Facultad de
Biología. Universidad de Vigo. España Recuperado el 25 de Agosto del 2014 de:
http://webs.uvigo.es/mmegias/inicio.html
TÉCNICAS DE TINCIÓN HISTOLÓGICA, Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Medicina. Departamento de Anatomía
Patológica. Recuperado el 25 de Agosto del 2014 de:
http://www.uam.es/departamentos/medicina/patologia/Tecnicas.htm
Técnica de Tinción de Gram, Paloma Román Gómez 2008. Consejería de educación comunidad de Madrid. Recuperado el 07
de Septiembre del 2014 de:
http://perso.ya.com/geopal/biologia_2b/
"Spunic". (s.f.). COLORACIÓN. 27 de Septiembre del 2014, de Rincón del vago Sitio web:
http://html.rincondelvago.com/coloracion.html
Ilarraza Aleida. (4 de junio de 2011). HEMATOXILINA-EOSINA. 27 de Septiembre del 2014, de Blogspot Sitio web:
http://hematoxilina-eosina-uc.blogspot.mx
Gracias
¿Que es un cuanto?
¿Qué es la radiación electromagnética?
Molécula orgánica
Espectro visible
Enlaces conjugados
Resonancia
Cromóforos
Mordiente
Fuerzas de Van der Waals
Metacromasia
Alumbre
Tinción Argéntica
Preguntas
información extra
¿Que es un cuanto?
• Un quantum o cuanto es la menor cantidad de
energía que puede transmitirse en cualquier
longitud de onda.
• Considerado el creador de la teoría cuántica, el
físico alemán Max Planck enunció que la radiación
electromagnética se emite en unidades discretas de
energía denominadas quantum o quantos.
http://www.astromia.com/glosario/quantum.htm
¿Qué es la radiación electromagnética?
• La radiación electromagnética es un tipo de campo
electromagnético variable, es decir, una
combinación de campos eléctricos y magnéticos
oscilantes, que se propagan a través del espacio
transportando energía de un lugar a otro
http://blog.educastur.es/proyectosiesvegadeo/files/2010/01/la-radiacion.pdf
Molécula orgánica
• Compuesto orgánico o molécula orgánica es una
sustancia química que contiene carbono, formando
enlaces carbono-carbono y carbono-hidrógeno
http://es.wikipedia.org/wiki/Compuesto_org%C3%A1nico
Espectro visible• Se llama espectro visible a la región del espectro electromagnético
que el ojo humano es capaz de percibir. A la radiación
electromagnética en este rango de longitudes de onda se le llama
luz visible o simplemente luz. No hay límites exactos en el espectro
visible: un típico ojo humano responderá a longitudes de onda de
400 a 700 nm, aunque algunas personas pueden ser capaces de
percibir longitudes de onda desde 380 hasta 780 nm.
http://es.wikipedia.org/wiki/Espectro_visible
Enlaces conjugados
• Un sistema conjugado se da cuando en un compuesto
químico con enlaces simples y dobles alternados, los
electrones que forman los enlaces dobles se deslocalizan,
es decir, se sitúan de manera uniforme alrededor del
compuesto. Estos electrones deslocalizados no forman en
realidad enlaces dobles entre dos átomos en particular,
sino que pertenecen a todo el grupo de átomos, y le dan
más estabilidad y fuerza al enlace simple, sin llegar a ser
un doble enlace.
http://es.wikipedia.org/wiki/Compuesto_org%C3%A1nico
Resonancia
• La Resonancia (denominado también Mesomería) en
química es una herramienta empleada
(predominantemente en química orgánica) para
representar ciertos tipos de estructuras moleculares. La
resonancia consiste en la combinación lineal de estructuras
de una molécula (estructuras resonantes) que no coinciden
con la estructura real, pero que mediante su combinación,
nos acerca más a su estructura real.
http://www.ecured.cu/index.php/Resonancia_qu%C3%ADmica
Cromóforos
• Un cromóforo es la parte o conjunto de átomos de una
molécula responsable de su color. También se puede
definir como una sustancia que tiene muchos electrones
capaces de absorber energía o luz visible, y excitarse para
así emitir diversos colores, dependiendo de las longitudes
de onda de la energía emitida por el cambio de nivel
energético de los electrones, de estado excitado a estado
fundamental o basal.
http://es.wikipedia.org/wiki/Crom%C3%B3foro
Radical químico incorporado a una molécula orgánica y responsable del
color.
Los Cromóforos mas abundantes en colorantes biológicos son:
El grupo nitro -NO2
El grupo nitroso –N=O
El grupo indamina (imino) >C=N-
El grupo azo –N=N-
Configuración quinonica
Mordiente
• Aquella sustancia que sirve para unir un colorante a un
sustrato. // Reactivo que aumenta la reactividad del tejido
estableciendo una interacción tejido-colorante// Reactivos
mordientes. Son los reactivos o sustancias que preparan al
tejido para la coloración
http://www.ecured.cu/index.php/Reactivos_mordientes
Fuerzas de Van der Waals
• En fisicoquímica, las fuerzas de Van der Waals, o
interacciones de Van der Waals, es la fuerza atractiva o
repulsiva entre moléculas (o entre partes de una misma
molécula) distintas a aquellas debidas al enlace covalente
o a la interacción electrostática de iones con otros o con
moléculas neutras.
http://es.wikipedia.org/wiki/Fuerzas_de_Van_der_Waals
Metacromasia
• Ocurre porque en la reacción del colorante con
determinadas estructuras las moléculas de colorante se
aproximan mucho entre ellas, de modo que se produce un
cambio en su rango de absorción lumínica lo que hace que
eras estructuras se vean de diferente color.
Alumbre
• Se trata de un tipo de reactivo utilizado en los procesos de
tinción. Esta constituido por una sal doble de sulfato de un
metal trivalente y otro monovalente. Generalmente, los
metales son aluminio y potasio o amonio (NH4). El alumbre
modifica el colorante añadiéndole grupos auxocromos y
confiriéndole un carácter muy básico.
Tinción Argéntica
• La tinción argéntica es el uso de plata (en latín, Argentum)
para modificar selectivamente el color o la apariencia de un
objeto. Es una técnica frecuente de tinción en histología
donde se utiliza para revelar detalles extremadamente
finos.
http://es.wikipedia.org/wiki/Tinci%C3%B3n_arg%C3%A9ntica
Tinción Negativa
• Tinción negativa es una técnica de microscopía que permite
contrastar las muestras mediante una sustancia opaca a los fotones
(microscopía óptica) o a los electrones (microscopía electrónica). En
el primer caso, se emplea nigrosina o tinta china; para el caso de
bacterias que esporulan, esta técnica permite visualizar las esporas
como entes refringentes sobre un campo de fondo oscuro.1 En caso
de microscopía electrónica de transmisión, se emplean sustancias
de alto número atómico que, por tanto, resultan opacas a los
electrones transmitidos. Típicamente, estas sustancias son acetato
de uranilo, citrato de plomo o molibdato de amonio. Al electrónico,
esta técnica permite visualizar virus, flagelos, bacterias y otros entes
de escaso tamaño.
http://es.wikipedia.org/wiki/Tinci%C3%B3n_negativa
![Tincion Gram y Morfologia Bacteriana LESP [PQCMAOG]](https://img.pdfslide.es/doc/110x75/5571f19949795947648b641d/tincion-gram-y-morfologia-bacteriana-lesp-pqcmaog.jpg)
