Instituto de Fısica, Universidad de Antioquia

Informe practica de Microscopıa:Iluminador de Kholer

Alejandro Correa Lopeza*, Vıctor Moreno-Marına**.

aUniversidad de Antioquia.

24 octubre de 2012

Resumen

La microscopıa es el conjunto de tecnicas y metodos destinados a hacer visible losobjetos de estudio que, por su pequenez, estan fuera del rango de resolucion del ojohumano. Si bien el microscopio es el elemento centra de la microscopıa, para producirlas imagenes adecuadas se requiere ademas de todo un conjunto de metodos y tecnicasafines pero extrınsecas al aparato. Algunas de ellas son tecnicas de preparacion ymanejo de los objetos de estudio, tecnica de salida, procesamiento, interpretaciony registro de imagenes, etc. Exceptuando tecnicas especiales como las utilizadas enmicroscopio de fuerza atomica, microscopio de iones en campo y microscopio de efectotunel, la microscopıa generalmente implica la difraccion, reflexion o refraccion dealgun tipo de radiacion incidente en el sujeto de estudio.

Palabras Claves: Microscopio, diafragmas de apertura y de campo, pupilas deentrada y de salida, ventanas de entrada y de salida, objeto, imagen, aumento.

*alejoco25@gmail.com**vmorenomarin@gmail.com

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Laboratorio de Optica Optica Geometrica: el Microscopio

1. Introduccion

En microscopıa optica, la iluminacion es elmecanismo mediante el cual se hace incidir luzsobre el plano del especimen en observacion.Para la microscopıa optica de transmision, lailuminacion puede lograrse por mecanismos quevan desde la obtencion de un campo iluminadode manera homogenea, o por la proyeccion deuna imagen de la fuente de luz sobre la mues-tra. Otro metodo conocido como iluminacion decampo oscuro consiste en obtener iluminacionindirecta sobre el plano de la muestra median-te la obstruccion del camino optico entre lafuente luz y el plano de la muestra. La influenciadel factor iluminacion en microscopıa optica essubestimada frecuentemente por el usuario delmicroscopio, sobretodo el papel del condensadoren la resolucion de las imagenes obtenidas en elmicroscopio, debido a que existe una creenciapopularizada por Zernicke de que la resolucionde las imagenes es independiente de la correc-cion introducida por el condensador. Anterior-mente, el metodo de iluminacion de preferenciaera el de iluminacion crıtica el cual consiste enproyectar una imagen nıtida de la fuente sobreel plano de la muestra con mayor intensidad so-bre el centro del campo. Este metodo permiteobtener el mayor brillo posible a partir de lafuente de iluminacion empleada, sin embargo elmetodo posee la desventaja de proporcionar unailuminacion dispareja sobre el campo. En el ano1893, Aughust Kohler del instituto Carl Zeissintrodujo un metodo de iluminacion que llevasu nombre. El metodo de Kohler, ademas debrindar el mayor brillo posible a partir de lafuente de iluminacion, soluciona el problema dela homogeneidad de la misma sobre el campo,pues, en lugar de proyectar una imagen de lafuente sobre el plano de la muestra, proyecta laimagen del diafragma de apertura del conden-

sador. Ası, se obtiene una iluminacion brillante,homogenea y con alto grado de coherencia sobreel un campo. Por sus caracterısticas la ilumi-nacion Kohler tambien es conocida como ilumi-nacion coherente, y constituye uno de los meto-dos de iluminacion mas utilizado en microscopıaoptica.

2. Marco Teorico

A continuacion se expondran los conceptosbasicos de la Optica Geometrica que se uti-lizaron en esta experiencia de laboratorio.

2.1. Condensador

En microscopıa optica, un condensador es unsistema de lentes que concentra los haces de luzpor debajo de la muestra que se desea observar[2].

2.2. Diafragma de Apertura y Di-afragma de Campo

El diafragma de apertura (D.A.) es el diafrag-ma que limita la cantidad de rayos emergentesde un punto axial en el objeto. Usualmente seidentifica por su cercanıa a las lentes. Este di-afragma limita el brillo de la imagen. Por otrolado, el diafragma de campo (D.C.) es el diafrag-ma que limita la cantidad de luz que ingresa alcampo, usualmente se ubica cerca del plano deobservacion limitando la porcion del objeto quepuede verse a traves del sistema.

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2.3. Pupilas y Ventanas

Cuando se utilizan diafragmas tipo iris en unmontaje optico, estos deben ir centrados a largodel eje optico del sistema. Si bien fısicamentelos diafragmas limitan el ancho de los rayosque cruzan determinada seccion transversal dearea del sistema optico, es preciso considerarque a cada diafragma corresponde una imagenque tambien influye en el comportamiento delmontaje y nos permite obtener mas informa-cion sobre el adecuado funcionamiento del mis-mo. Aquı introducimos los conceptos de pupilade entrada y pupila de salida. Para un sistemasimple compuesto por una lente y un diafrag-ma, al diafragma le corresponde una pupila deentrada y una de salida, sin embargo cuando elsistema es compuesto existe un criterio asociadoal angulo subtendido por el radio del diafragma.Las pupilas pueden ubicarse en cualquier partedel eje del sistema, excepto que ellas no puedencoincidir con el objeto o la imagen [2].

2.3.1. Pupila de entrada

Es la imagen del diafragma de apertura forma-da por todas las lentes que le preceden, vistadesde el punto de vista del objeto. En presencia

de varios diafragmas y lentes la pupila de entra-da del sistema sera la que subtienda el menorangulo desde el punto de vista del objeto.

2.3.2. Pupila de salida

Es la imagen del diafragma de campo formadapor todas las lentes que le siguen, vista desdeel punto de vista de la imagen. En presencia devarios diafragmas y lentes la pupila de salida delsistema sera la que subtienda el menor angulodesde el punto de vista de la imagen.

2.4. Determinacion de los Dia-fragmas de Apertura y deCampo

Establezcamos las reglas que se han de seguirpara determinar cual diafragma es el de abertu-ra y cual es el de campo.

1. Se construyen todas las imagenes que sepueden tener de los diafragmas desde unpunto objeto sobre el eje optico (punto ax-ial), esto es, las imagenes que de los di-afragmas forman los elementos opticos que

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preceden a cada uno de ellos. Por elemen-tos que le anteceden se entienden los ele-mentos opticos que se hallan entre el pun-to objeto axial y el diafragma bajo consi-deracion. La imagen que interesa es la queforma el diafragma en el campo objeto.

2. La Pupila de Entrada corresponde a la im-agen del diafragma que subtiende el menorangulo desde el punto axial. El diafragma,del cual es imagen, se denomina Diafrag-ma de Abertura.

3. La Ventana de Entrada sera la imagen deldiafragma que subtiende el menor angu-lo a partir del centro de la Pupila de En-trada. El diafragma del cual es imagen sedenomina Diafragma de Campo.

Las imagenes de los diafragmas de Abertura yde Campo formadas por los elementos opticosque le suceden (que estan entre el diafragma yel espacio imagen) se denominan Pupila de Sa-lida y Ventana de Salida, respectivamente. Enun instrumento optico formador de imagenes sesuele construir de modo que la Ventana de Sal-ida coincida con el plano imagen del sistema.Ası ocurre, por ejemplo, en el ojo y en la camarafotografica. El analisis puede iniciarse en el es-pacio imagen a partir del punto imagen axial. Esevidente e importante saber que un diafragma,sea de apertura o de campo, en un instrumentooptico, depende de la posicion relativa del obje-to con respecto al instrumento [2, 3]

Todo lo anterior viene ilustrado en la secuen-cia que se presenta en la figura anterior para untıpico instrumento optico (ojo, camara fotografi-ca o CCD). La figura (a) muestra un esquemadel instrumento. En la figura (b) se presentanlos diafragmas o imagenes de ellos, tal y comose ven desde el punto objeto axial; igualmentese indican la pupila y la ventana de entrada.La figura (c) muestra como son vistos, desde elpunto imagen, los diafragmas; ademas, cual esla pupila de salida y la ventana de salida [4].

2.5. Microscopio de campo os-curo

El microscopio de campo oscuro utiliza un hazenfocado de luz muy intensa en forma de uncono hueco concentrado sobre el especimen.El objeto iluminado dispersa la luz y se haceası visible contra el fondo oscuro que tiene de-tras, como las partıculas de polvo iluminadaspor un rayo de sol que se cuela en una habitacioncerrada. Por ello las porciones transparentes delespecimen quedan oscuras, mientras que las su-perficies y partıculas se ven brillantes, por la

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luz que reciben y dispersan en todas las direc-ciones, incluida la del eje optico que conecta elespecimen con la pupila del observador. Estaforma de iluminacion se utiliza para analizar ele-mentos biologicos transparentes y sin pigmen-tar, invisibles con iluminacion normal, sin fijarla muestra, es decir, sin matarla. Tambien esbastante utilizado en la observacion de muestrasmetalograficas para la observacion de detallesen superficies con alta reflectancia. El objetivorecibe la luz dispersa o refractada por las estruc-turas del especimen. Para lograrlo, el microsco-pio de campo oscuro esta equipado con un con-densador especial que ilumina la muestra con luzfuerte indirecta. En consecuencia el campo visu-al se observa detras de la muestra como un fondooscuro sobre el cual aparecen pequenas partıcu-las brillantes de la muestra que reflejan partede la luz hacia el objetivo. El efecto es similara las partıculas de polvo que se ven en el hazde luz emanado de un proyector de diapositivasen una habitacion oscura. La luz reflejada porlas partıculas de polvo llegan hasta la retina delojo, lo que las hace visibles. La luz dispersa per-mite incluso distinguir partıculas mas pequenasque el poder separador del sistema optico usadopor transparencia [1].

3. Aspecto Experimental

3.1. Instrumentos

Para la realizacion de esta experiencia, se hizouso de los siguientes instrumentos opticos:

Bombilla como fuente de luz.

Lentes convergentes de 5 cm y 10 cm delongitud focal.

Diafragmas tipo iris.

Jinetas y soportes.

Banco optico.

3.2. Montaje y Procedimiento

En la figura (3.2) tenemos que L1 es la lente conlongitud focal de 5 cm; D1 es el diafragma 1; D2

el diafragma 2 y L2 es la lente con longitud fo-cal de 10 cm. Ubicamos sobre el banco optico laslentes y los diafragmas tal y como lo muestra lafigura (3.2), de tal forma que la imagen de labombilla por la primera lente se formara en elmismo plano del diafragma D2, y que sobre lapantalla la segunda lente formara la imagen dela primera.Con los diafragmas dispuestos en su maximaabertura,D1 = 3×10−2 m yD2 = 2,89×10−2 m,y con base en la teorıa, se procedio a averiguarcual de los elementos del montaje corresponde aldiafragma abertura, cual al diafragma de cam-po, y cuales son las pupilas y ventanas. Parahallar el diafragma de abertura calculamos losangulos subtendidos desde la bombilla, desde lalente desde las imagenes de los diafragmas D1 yD2 y desde la lente L2.

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Los angulos subtendidos fueron:

Angulo subtendido desde la bombil-la a la lente L1: tan θ1 = CO/CA,donde el cateto opuesto era la mitad deldiametro de la lente, es decir, 1,5 × 10−2

m, y el cateto adyacente era la distanciaa la bombilla, es decir, 7 × 10−2 m. Ası,tan θ1 ≈ θ1 = 0,214 .

Angulo subtendido desde la bombil-la a la imagen de D1: Para calcular laposicion de la imagen correspondiente aD1 y su respectivo aumento, hacemos usode las ecuaciones

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p− 1

q=

1

f; M =

q

p, (1)

donde q es la distancia imagen, p es ladistancia objeto y f es la longitud fo-cal de la lente [5]. Con p = 6,5 × 10−2

m y f = 5 × 10−2 m encontramos queq = −4,6 × 10−4 m. Es decir, la imagense forma al lado derecho de la imagen.Luego, el aumento M sera M = −4,6 ×10−4/6,5×10−2 = 7,07×10−3, lo cual sig-nifica que si el diametro de D1 era 3×10−3

m, su imagen quedo con un diametro deD′1 = 2 × 10−4 m. Ası obtenemos lossiguientes datos: CO = 1 × 10−4 m yCA = 7×10−2−4,6×10−4 = 6,9×10−2 mporque obtenemos que tan θ2 ≈ θ2 = 0,08.

Angulo subtendido desde la bombil-la a la imagen de D2: Como el diafrag-ma D2 fue ubicado de forma tal que enese mismo plano estuviera la imagen de labombilla debido a la lente L1, y por la re-versibilidad optica, la imagen de D2 estaen el mismo plano del objeto; es decir, θ3tiende a infinito.

Angulo subtendido desde la bombil-la a la imagen de L2: Dicha imagen esta,de manera similar que se calculo para D1,a 0,83×10−2 m de la bombilla. El aumen-to fue 0,0315, y puesto que el diametrode ambas lentes era de 6, 3 × 10−2 m, en-tonces el diametro de la imagen fue de0,2 × 10−2 m. Ası, CO = 0,1 × 10−2 my CA = 0,83 × 10−2 m. Por lo tantotan θ4 ≈ θ4 = 0, 12.

De los anteriores calculos vemos que el diafrag-ma D1 es el que subtiende el menor angulo,luego se denomina diafragma de apertura y portanto su imagen debido a L1 es la pupila de en-trada, ya calculada, y su imagen debido a L2 esla denominada pupila de salida. Realizando loscalculos respectivos, se mostro que la pupila desalida se encontro a 20 cm de la lente L2 conM = 1.Para hallar el diafragma de campo, nos ubi-camos sobre la pupila de entrada y calculamoshacia ambos lados, observando cual objeto sub-tiende el angulo menor. Procediendo de igualforma que para hallar el diafragma apertura,encontramos que θD2 = 0,134, θL1 = 0,46 yθL2 = 0,15. Ası, el diafragma D2 corresponde aldiafragma de campo. Con el diafragma de cam-po determinado, procedimos a hallar las ven-tanas de entrada y salida. La ventana de entra-da coincidio en el plano de la bombilla, con untamano de 1,2×10−2 m de diametro. La ventanade salida, es decir, la imagen de D2 debido a L2,se encontro a 0,9 m de L2 , con un diametro de0,3 m.Experimentalmente vimos que, efectivamente,D1 era el encargado del tamano de la pupila desalida, tal y como se esperaba ya que es el dia-fragma de apertura. Observamos tambien queD2 era el encargado de aumentar o disminuirla intensidad, es decir corresponde al diafrag-ma de campo. A 0,2 m de la lente L2 encon-

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tramos la imagen de D1 , y vimos que, efecti-vamente, el diametro de la pupila era exacta-mente el diametro del diafragma tal y como lopredicen los calculos realizados. Todo este mis-mo montaje se repitio para una nueva posiciondel diafragma D1, el cual se ubico mas cerca a lalente L1. Tal hecho se representa en la siguientefigura.

De nuevo, D1 sigue siendo el diafragma deabertura y D2 el diafragma de campo. Tantola ventana de entrada como la de salida per-manecieron iguales. La diferencia radica en quelas pupilas cambiaron de ubicacion y tamano,en especial, la pupila de salida; empleando laecuacion (1), deberıa estar a 6, 7× 10−2 m de lalente L2 en el lado opuesto a esta, y su aumen-to sera 0,68, a diferencia del montaje anteriordonde el aumento era 1. Experimentalmente ob-servamos, nuevamente, que D1 limito el tamanode la pupila de salida; D2 la intensidad, y enefecto, a 16,8 × 10−2 m encontramos la imagende D1 donde apreciamos que esta vez la pupilade salida fue mas pequena que el diametro deldiafragma abertura. A continuacion, mostramosel trazado de los rayos para este ultimo montaje.

4. Conclusiones

1. El diafragma en un sistema optico que ha-ga las veces de DA, va a limitar el tamanodel haz que sale de dicho sistema.

2. El diafragma en un sistema optico que ha-ga las veces de DC , va a limitar la inten-sidad del haz que sale de dicho sistema.

3. El movimiento del DA en un sistema opti-co que permanece estatico, altera unica-mente el tamano de las pupilas tanto deentrada como de salida, siempre y cuandodicho movimiento no sea tal que el angulosubtendido desde el objeto a dicho diafrag-ma sea mayor que el mismo angulo peropara otro objeto.

Referencias

[1] Dark field microscopy. (2013, 19 de Febrero).En Wikipedia, the Free Enciclopedia. Recu-perado el 3 de Marzo de 2013 a las 16:30de http://en.wikipedia.org/wiki/Dark_field_microscopy.

[2] Condensador. En Wikipedia, the Free En-ciclopedia. http://es.wikipedia.org/

wiki/Condensador.

[3] Hecht, Eugene. Optics. 4 ed., San Francisco,Pearson Education, 2002, p. 171-173.

[4] Gutierrez, Antoni. Optica Instrumental,Barcelona, Ediciones UPC, 1996, p. 53-60.

[5] Jenkins, F., White, H. Fundamentos deOptica, Madrid, Aguilar S. A. de Ediciones,1964, p. 102-109.

[6] Alzate, Hector. Fısica de las Ondas,Medellın, Editorial Ude@, 2005, p. 222.

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