Practica inmovilización de células (levaduras) 2015

2015

INMOVILIZACIÓN DE CÉLULAS ( LEVADURAS)

AUTORES:

Aroni Lucana ,Gino

Domínguez Mendoza ,Fernanda

Palomino Torres, Ronald.

Pérez Prada ,Greicy

Sandoval Junes, Juan.

BIOTECNOLOGÍA INMOVILIZACIÓN DE CÉLULAS ( LEVADURAS)

Universidad Nacional San Luis Gonzaga de Ica 1

PRÁCTICA: INMOVILIZACIÓN DE CÉLULAS

I. INTRODUCCIÓN:

Los países desarrollados en la actualidad experimentan grandes avances en el campo

científico y particularmente en el campo de la biotecnología. En el Perú existen pocos

trabajos al respecto. No obstante, el interés de muchos investigadores en el estudio de

inmovilización celular como técnica de aplicación de la biotecnología ha permitido

desarrollar nuevos métodos que han vuelto rentables a muchos procesos y productos

industriales por su simpleza y rendimiento (1).

Dentro de la industria alimentaria, la inmovilización de microorganismos en soportes

naturales o sintéticos proporciona estabilidad a las funciones celulares. Esta técnica

permite alcanzar altas concentraciones celulares en volúmenes reducidos, así como la

reutilización como biocatalizador y la implantación de sistemas de continuos de

producción (2).

En este caso, el uso de células inmovilizadas dentro de procesos continuos para la

producción de bebidas fermentadas representa una línea de investigación de elevado

interés debido a las ventajas económicas y técnicas que presenta en comparación a los

sistemas discontinuos con células libres. En ese sentido, los procesos que utilizan

levaduras inmovilizadas en soportes gelificantes, proporcionan la oportunidad de superar

los largos tiempos de fermentación y maduración encontrados en las industrias

cerveceras tradicionales (3) ; dichos geles que contienen levaduras inmovilizadas en su

estructura, se utilizan para controlar el pardeamiento de bebidas que se produce con el

paso del tiempo. Los geles comprenden una matriz de polisacárido natural como base del

gel, y células de levaduras inmovilizadas en la estructura de dicha matriz. Los geles así

constituidos permiten tanto corregir el color de una bebida que ya ha pardeado, como

para prevenir el desarrollo de color en una bebida susceptible de pardear con el paso del

tiempo. En el presente informe se desarrolla uno de los diversos métodos de inmovilizar

levaduras con capacidad de reutilización, a fin de valorar su importancia en procesos

industriales.



OBJETIVOS:

Conocer la técnica de inmovilización de levaduras en perlas de agar agar.

Evaluar y comparar la producción de alcohol de las células inmovilizadas y de las

células libres.

II. ANTECEDENTES:

- MATIZ A. (2002) realizo un estudio de producción de etanol con células inmovilizadas

de Zymomonas mobilis spp. Cuyo objetivo principal fue para aumentar la eficiencia en la

producción de etanol y encontrar organismos que representen una alternativa de

producción frente a S. cerevisiae (4).

- SOSSA-URREGO D. et al (2008). Realizo estudios de inmovilización de Bacillus

licheniformes y Sacharromyces cerevisiae para la producción de etanol a partir de

almidón de papa. Donde evaluó un sistema discontinuo secuencial compuesto por ambas

células a trabajar en la producción etanol y en la segunda fase utilizo un hidrolizado

almidón de papa. Ambos microorganismos fueron inmovilizados con alginato de calcio (5).

- PUIG A. et al (2010). Realizó un estudio de las levaduras inmovilizadas y su potencial

enológico donde trabajaron S. cerevisiae y con mosto de xarel-lol y moscatel para la

obtención de vinos tranquilos de alta y muy alta graduación. Este trabajo también

demuestra un buen comportamiento del nuevo sistema de inmovilización en bicápsulas

(6).

- SALAZAR U. (2012). Realizo un estudio en la inmovilización de levaduras S.

cerevisiae en materiales lignocelulosicos para la producción de etanol en biorreactor de

lecho empacado obteniendo resultados positivos (7).

III. MATERIALES Y EQUIPOS

MATERIALES

EQUIPOS

MEDIOS DE

CULTIVO

Tubos de ensayo,

tubos de penicilina y

placas Petri.

Microscopio.

Baño María.

Microondas.

Caldo Sabouraud

Agar PDA O

sabouraud.



Frascos Shop

Vaso de precipitación

de 1L.

Pipetas (de punta

ancha).

Micropipeta y

Cámara de New

Bauer.

Colador metálico.

Embudo de vidrio.

Varilla de vidrio.

Porrones de

vino/pisco de 2 L de

capacidad.

Solución Salina

Fisiológica.

Mosto de uva

quebranta y moscatel

(debidamente

homogenizado.



IV. PROCEDIMIENTO:

4.1. Reactivación del cultivo Saccharomyces sp.

Se sembró por estría en tubos de agar PDA + cloranfenicol la cepa de levadura y

se incubó a temperatura ambiente por 48 – 72 h. Luego se sembró en superficie

por agotamiento y estría.

4.2. Proliferación celular.

A partir de la cepa reactivada se cogió una colonia aislada y se sembró por

superficie en una placa de agar PDA + cloranfenicol con la ayuda de un hisopo

estéril (de manera que cubra toda la superficie de la placa) y se incubó a

temperatura ambiente por 48 – 72 h

Cultivo proliferado.



4.3. Cosecha de células y obtención del inóculo.

a) Se colocó 3 ml de caldo glucosado o caldo Sabouraud en la placa sembrada y 5

perlas de vidrio estéril, se movió suavemente la placa hasta obtener la suspensión

celular, se colocó la suspensión en un matraz estéril de 100 ml. Y se enrazó a 50

ml. con caldo Sabouraud.

b) Se colocó en agitación a 180 rpm por 18 horas a temperatura ambiente.

Suspensión celular.



c) Se realizó el recuento celular utilizando la cámara de New bauer (a partir de la

dilución: 105/ml).

4.4. Inmovilización de células.

a) La suspensión celular se mezcló con 100 ml. de agar- agar al 3% fundido a

42ºC, (concentración celular final 106cél/ml).Cálculo del volumen del inóculo: 108

cel/ml. Para el biorreactor de células libres se colocó 1 ml del inóculo directamente

en 1 ½ de mosto pasteurizado.

Diluciones a partir del

inóculo

Cámara New Bauer cargada. Tinción con Azúl de

Metileno.

Observación al microscopio.



b) Con ayuda de pipetas estériles con puntas rotas se tomó agar- agar con

levaduras (mantenido en baño maría a 42ºC) y se dejó caer gota a gota en forma

rápida en aceite vegetal, contenido en un frasco de vidrio sumergido en un

recipiente con hielo en forma permanente.

Cálculo de la concentración celular por perla:

- Número de perlas por mililitro: 6

- Concentración: 106 / 6 perla.

c) Las perlas fueron lavadas con agua corriente estéril y destilada estéril en forma

sucesiva para desprender el aceite de su superficie.

Perlas siendo lavadas con agua

corriente estéril.

Formación de perlas en el aceite frío.



4.5. Producción de alcohol utilizando las células inmovilizadas.

Se preparó un mosto de uva de 1500 ml con una concentración de azucares

reductores de 22.8° (en tres frascos: A, B y libre).

Se agregó las células de levaduras inmovilizadas en agar – agar (perlas) y se

dejó fermentar por espacio de 8 días. Se realizó las evaluaciones después de este

tiempo y se determinó el consumo de sustrato (azúcares reductores) utilizando un

refractómetro (realizar la curva consumo de sustrato/tiempo). Para la

determinación de alcohol se puede utilizar la tabla de conversión de Gravedad

Específica ºBrix, ºAlcohol o el vinómetro. Ver anexo.

A

B L A: Mosto + Células inmovilizadas

en agar agar 3%.Grupo A.

B: Mosto + Células inmovilizadas

en agar agar 3%.Grupo B.

L: Mosto + 1ml de Células Libres

(inóculo).



V. RESULTADOS:

Se realizó la evaluación de la producción de alcohol por levaduras inmovilizadas y por

levaduras libres, los resultados se detallan en la Tabla 1.

TABLA 1. Evaluación de la producción de alcohol de los tres biorreactores del ensayo.

Así mismo se realizó un Análisis Organoléptico del fermento, los resultados se detallan en

el Cuadro 1.

CUADRO 1. Resultados del Análisis organoléptico del fermento

CARACTERÍSTICAS OBTENIDAS

SABOR Agrio

ACIDÉZ Elevado

ASPECTO Mas turbio que al inicio

COLOR Guinda

GRUPO CÉLULAS º BRIX INICIAL

º BRIX FINAL

AR Consumidos

% ALCOHOL

A Inmovilizadas 22.8 7.8 15.0 8.9

B Inmovilizadas 22.8 6.5 16.5 9.5

L Libres 22.8 7.8 16.5 8.9

Observación en el

refractómetro del ° BRIX.



VI. DISCUSIÓN:

Al realizar el ensayo se inició con las siguientes condiciones en los 3 frascos por igual; la

concentración de azúcar del mosto (22.8º brix), volumen de trabajo (1 ½ L), tamaño de

biorreactor (2L), la disponibilidad de oxígeno, temperatura ambiental, misma

concentración de inóculo (levaduras).Esperando recrear las mismas condiciones para los

tres frascos y evaluar la producción de alcohol. Los biorreactores “A” y “B” corresponden

al de las células inmovilizadas y el biorreactor “L” al de las células libres.

Sin embargo al realizar las evaluaciones de producción de alcohol a los 7 días en los 3

biorreactores (frascos); A, B y L, estos tuvieron los siguientes porcentajes; 8.9%, 9.5% y

8.9% respectivamente. Estos resultados difieren a lo esperado ya que se suponía un valor

parecido entre el biorreactor “A” y “B” ya que estaban en las mismas condiciones (células

inmovilizadas), en cambio el valor del Biorreactor “L” es normal.

Las diferencias de producción de alcohol entre el biorreactor “A” y “B”, se deben a que al

momento de ejecutar el ensayo en el biorreactor “A” se tuvo problemas en el corrimiento

de agar agar - inoculado a través de las pipetas durante la formación de la perlas,

perdiendo cierta cantidad de agar agar-inoculado lo que se traduce en pérdida de perlas.

Esto no sucedió con el biorreactor “A” donde se desarrolló el ensayo con normalidad.

Aunque también se deduce que hubo diferencias en el tamaño de las perlas ya que este

parámetro es manejado por el personal que realizó el ensayo, en la concentración de agar

agar entre otros.

Así mismo en los biorreactores “A” y “B” se observó un sedimento que corresponde a: 1)

proteínas del mosto precipitadas, 2) células y 3) las perlas de agar agar las cuales han

precipitado, debido al crecimiento de las células y entrada de sustrato. Esto también se

observó en el biorreactor “L” (sólo 1 y 2).

Al realizar el ensayo se ha optimizado el proceso normal de fermentación de mosto de

uva debido a la utilización de un inóculo de células (levaduras) comprobando una mayor

producción en un corto tiempo (7 días), lo que no se obtendría en procesos normales.

Al comparar específicamente la producción de alcohol de las células inmovilizadas (9.5%

alcohol) con el de las células libres (8.9% alcohol) esta resultó ser mayor debido a que

las células se encuentran protegidas de las variaciones de pH y oxígeno cuando están



dentro de una matriz porosa optimizando así su rendimiento. La inmovilización de

levaduras disminuye la mayoría de los problemas que plantea la fermentación utilizando

células libres. Este sistema tiene la ventaja de poder manejar la densidad celular, previa al

inicio de la fermentación. Además, facilita el sistema de operación del proceso de

fermentación continua, evitando el paso de eliminar las levaduras del fermentador. La

inmovilización celular separa el crecimiento microbiano de los procesos metabólicos de

interés industrial. Es así, que diversos grupos de investigación han empleado este sistema

de levaduras inmovilizadas especialmente del género Saccharomyces para la obtención

de variados productos de interés industrial como el vino por ejemplo.

Con respecto a la separación del producto (fermento - alcohol), esta es fácil cuando las

células están inmovilizadas evitando pérdida de tiempo y dinero que si se gastaría al

recuperar el producto de un biorreactor (como el biorreactor “L”) donde las células están

libres.

Del mismo modo se comprueba que en el caso de las células inmovilizadas la reutilización

es posible, debido a que las perlas que contienen a las células (levaduras) se pueden

retirar de un biorreactor y colocar en otro biorreactor con medio de fermentación nuevo e

iniciar otro proceso de fermentación, siempre y cuando se le suministre una fuente

carbonada que les permita estar viables para ese fin.

VII. CONCLUSIONES:

o La producción de alcohol es mayor cuando en el proceso de fermentación se usan

células inmovilizadas.

o Al optimizar el proceso de fermentación normal es posible recuperar mayor

cantidad de producto en un corto tiempo.

o Las células inmovilizadas en las perlas de agar agar pueden ser reutilizadas en otro

proceso de fermentación.

o EL aceite común utilizado fue un buen formador de perlas de agar-agar, debido a

su propiedad hidrofóbica.

o El Agar-Agar al 3% resultó ser un eficaz inmovilizador celular

o La separación del producto es fácil cuando las células están inmovilizadas.



VIII. BIBLIOGRAFÍA:

1. EDWIN BALDEON CH, VICTOR MEZA C, JULIO GIRALDO H. (2004) .Evaluación

de un fermentador conlevaduras (S. cerevisiae) inmovilizadas en perlas de

cerámica. Anales Científicos. Vol LVIII.

2. DURAN-PARAMO. (1997). PhD. thesis, Universite de Thecnologie de Compiegne,

France.

3. DEBOURG, A. (1993). The developments of brewery fermentations .The impact of

new technologies. Cerevisia and Biotechnology, v.18, p.25-30,

4. MATIZ A. (2002). Producción de etanol con células inmovilizadas de Zymomonas

mobilis. Revista MVZ Córdoba, vol. 7, núm. 2, 2002, pp. 216-223 Universidad de

Córdoba Montería, Colombia. Fecha de visita: 13-05-15 (on line):

http://www.redalyc.org/pdf/693/69370204.pdf

5. SOSSA-URREGO D. et al (2008). Immovilization of Bacillus licheniformis and

Saccharomyces cerevisiae for ethanol production from potato starch.Pontificia

Universidad Javeriana, Bogotá. Fecha de visita: 12-05-15 (on line):

http://revistas.javeriana.edu.co/index.php/scientarium/article/view/1419/html

6. PUIG A. (2010).Levaduras inmovilizadas: Evaluación de su potencial Enológico.

Estación de viticultura. Spain. Fecha de visita: 12-05-15 (on line):

http://incavi.gencat.cat/web/.content/or_organismes/or01_incavi/or01_11_documen

tacio_tecnica/documents/2010/fitxers_estatics/2010_levaduras_bioinmovilizadas_f

oro_logrono.pdf

7. SALAZAR U. (2012). Inmovilización de levaduras Saccharomyces Cerevisiae en

materiales lignocelulosicos para la producción de etanol. Universidad De Antioquia

– Udea. Fecha de visita: 11-05-15 (on line):

http://190.242.114.26:8081/cvlac/visualizador/generarCurriculoCv.do?cod_rh=0001

339424

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ANEXOS:

Anexo 1. Esquema general del ensayo.





Anexo 2. Tabla de conversión de gravedad específica a ºBaumé,ºBrix y ºAlcohol.

DENSIDAD ºBAUMÉ ºBRIX ºALCOHOL

1012 1.70 0.20 0.11

1013 1.84 0.47 0.23

1014 1.98 0.73 0.43

1015 2.12 1.10 0.59

1016 2.27 1.26 0.70

1017 2.41 1.53 0.88

1018 2.55 1.80 1.06

1019 2.68 2.06 1.18

1020 2.82 2.33 1.35

1021 2.91 2.59 1.47

1022 3.10 2.86 1.65

1023 3.24 3.13 1.82

1024 3.37 3.39 1.94

1025 3.51 3.66 2.21

1026 3.65 3.92 2.30

1027 3.79 4.19 2.41

1028 3.92 4.46 2.69

1029 4.06 4.72 2.77

1030 4.20 5.00 2.95

1031 4.33 5.27 3.06

1032 4.47 5.54 3.24

1033 4.60 5.80 3.42

1034 4.74 6.07 3.54

1035 4.88 6.33 3.71

1036 5.01 6.6 3.7

1037 5.15 6.9 4.0

1038 5.28 7.2 4.2

1039 5.41 7.4 4.4

1040 5.50 7.6 4.5

1041 5.68 8.0 4.7

1042 5.81 8.2 4.8

1043 5.95 8.4 5.0

1044 6.08 8.7 5.1

1045 6.21 9.0 5.3

1046 6.34 9.2 5.4

1047 6.48 9.5 5.6

1048 6.61 9.8 5.7

1049 6.74 10.0 5.9

1050 6.87 10.3 6.0

1051 7.00 10.6 6.2

1052 7.13 10.8 6.3

1053 7.26 11.1 6.5



1054 7.39 11.4 6.7

1055 7.52 11.6 6.8

1056 7.65 11.9 7.0

1057 7.78 12.2 7.2

1058 7.91 12.4 7.3

1059 8.03 12.7 7.5

1060 8.16 13.0 7.6

1061 8.29 13.2 7.8

1062 8.42 13.5 7.9

1063 8.55 13.8 8.1

1064 8.67 14.0 8.2

1065 8.80 14.3 8.4

1066 8.93 14.6 8.6

1067 9.06 14.8 8.7

1068 9.18 15.1 8.9

1069 9.31 15.4 9.0

1070 9.43 15.6 9.2

1071 9.56 15.9 9.3

1072 9.68 16.2 9.5

1073 9.81 16.4 9.6

1074 9.93 16.7 9.8

1075 10.06 17.0 10.0

1076 10.18 17.2 10.1

1077 10.31 17.5 10.3

1078 10.43 17.8 10.5

1079 10.56 18.0 10.6

1080 10.68 18.3 10.8

1081 10.80 18.6 10.9

1082 10.93 18.8 11.0

1083 11.05 19.1 11.2

1084 11.18 19.4 11.4

1085 11.30 19.6 11.5

1086 11.42 19.9 11.7

1087 11.55 20.2 11.9

1088 11.67 20.4 12.0

1089 11.79 20.7 12.2

1090 11.91 21.0 12.3

1091 12.03 21.2 12.5

1092 12.15 21.5 12.6

1093 12.27 21.8 12.8

1094 12.39 22.0 12.9

1095 12.52 22.3 13.1

1096 12.64 22.6 13.3

1097 12.76 22.8 13.4

1098 12.87 23.1 13.6



1099 12.99 23.4 13.8

1100 13.11 23.6 13.9

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