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La increíble identificación de bacterias.
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Centro de Bachillerato Tecnológico Industrial y de Servicios Noº128
Práctica 3. Pruebas Bioquímicas.
Sub módulo 3: Ejecuta técnicas de identificación de microorganismos con base en las normas.
Equipo 3. Integrantes: González Lesly, Hernández Nayeli, Hernández Alan, Herrera Jazmín, Jiménez
Fabiola, Lagunas Itzel, Lira Vanesa, Mata Lizbet.
Facilitadora: Ing. Acosta Jessica
Fecha: Inició el lunes 13 de Octubre del 2014, terminó el jueves 16 de Octubre del 2014.
Introducción
Un medio selectivo es utilizado para
favorecer el crecimiento de cierta bacteria
contenida en una población poli microbiana,
facilitando nutricionalmente el crecimiento
de una población específica de
microorganismos.
Mediante las técnicas te tinción podemos
determinar la morfología bacteriana, en este
caso, primero se identifican las bacterias
gramnegativas para después realizar las
pruebas bioquímicas, que son un conjunto
de reacciones que determinan la actividad
de una vía metabólica de la bacteria a partir
de un cultivo puro obtenido en el
aislamiento, subcultivado de una colonia
bien aislada. Las pruebas bioquímicas son
una serie de análisis clínico que sirven a la
medicina como apoyo a la hora de
diagnosticar infecciones por bacterias.
Resumen
Se prepararon medios de cultivo McConkey,
Nutritivo y VBB en placas de Petri. En el
McConkey y el Nutritivo se inocularon
muestras de agua sacada de un excusado y
en el VBB se inoculó una muestra de tierra
contaminada. Los medios fueron colocados
en la incubadora por 24 horas, después de
este tiempo, crecieron diversas colonias a
las que se les aplicó la tinción de Gram, esto
con el fin de encontrar colonias de Gram
negativas.
Posteriormente, se prepararon otros medios
(VP, MIO, SIM, LIA y Kligger) y se vaciaron
en tubos de ensayo. Luego se dejaron
solidificar, y se emplearon para realizar las
pruebas bioquímicas de muestras
procedentes de colonias de bacterias Gram
negativas encontradas en los medios
Nutritivos.
Los tubos fueron colocados en la
incubadora por 24 horas, luego de este
lapso, se observaron cambios en los medios
que ayudaron a identificar la bacteria
presente en la colonia de la que se obtuvo la
muestra.
Abstract
The McConkey, Nutritious and VBB media
were prepared in Petri dishes. In the
McConkey medium and the Nutritious
medium were inoculated water samples
taken from toilet, and in the VBB was
inoculated a sample taken from
contaminated soil. The media were placed in
the incubator for 24 hours, after this time,
grew various colonies to which is applied the
Gram stain, this with the purpose to find
Gram negative colonies.
Subsequently, were prepared other media
(VP, MIO, SIM, LIA and Kligger) and these
were emptied in the test tubes. Then, are
allowed to solidify, and were employed to
perform the biochemistry tests of samples
taken from colonies of Gram negative
bacteria, which were find in the Nutritious
media.
The test tubes were placed in the incubator
for 24 hours, after this lapse, changes were
observed in the media, which helped to
identify the bacteria present in the sample’s
colony.
MATERIALES Y MÉTODOS
Materiales
Tubos de ensayo
Asas de platino
Gradilla
Matraz Erlenmeyer
Cajas Petri
Mechero de Bunsen
Mangueras de látex
Agar VBB
Agar Mc Conkey
Agar nutritivo
Cubre objetos
Porta objetos
Microscopio
Rojo de metilo
MIO
LIA
KLIGGER
UREA
VP
SIM
H2O del baño
Tierra húmeda que esté
contaminada
Métodos
Preparar agares para pruebas
bioquímicas: Se prepararon diversos
agares empleados en pruebas bioquímicas;
MIO, LIA, KLIGGER, UREA, VP y SIM;
fueron vaciados en tubos de ensayo, para
luego llevarlos a esterilizar y dejarlos
solidificar
Técnicas de vaciado: Fueron preparados y
esterilizados algunos agares (Nutritivo,
McConkey y VBB) para vaciarlos en las
placas de Petri y dejarlos solidificar.
Métodos de estriados: Una vez listas las
placas con el medio, se inocularon dos
muestras; una procedente de agua del
excusado, la cual fue inoculado en los
medios Nutritivo y McConkey, y otra de tierra
contaminada, la cual fue inoculada en el
medio VBB. Se inoculó empleando el
método de estriado cuadriculado, se
colocaron las placas en la incubadora por 24
horas y se observaron las cambios.
Morfología de colonias: Después de sacar
las placas de la incubadora, se realizó un
análisis de las colonias que crecieron en
cada medio, tomando en cuenta el color, la
forma, la superficie, el borde y el número de
colonias de cada tipo.
Tinción Gram: Una vez que se realizó la
morfología, se realizó la tinción de Gram de
la siguiente forma: con un asa de platino se
tomó una muestra de una de las colonias
para luego colocarla en un portaobjetos con
una gota de agua destilada y se dejó secar.
Luego de esto se fija sobre la llama de un
mechero de Bunsen, se le agrega 1 gota de
cristal violeta, se deja reposar por 1 minuto
y se enjuaga; se vierte 1 gota de Yodo-Lugol
y se deja reposar por 1 minuto y se enjuaga;
se vierte 1 gota de alcohol-cetona, se deja
reposar por 30 segundos y se enjuaga;
finalmente se vierte 1 gota de safranina, se
deja reposar por 30 segundos y se enjuaga.
Para poder observar la muestra, se le
agrega una gota de aceite de inmersión y se
le coloca un cubre objetos. Una vez que la
muestra esté lista, se pone en el
microscopio enfocada x100, esto con el fin
de observar la coloración de las bacterias e
identificar si se trata de Gram negativas o
Gram positivas.
Pruebas bioquímicas: Se retoman los
medios preparados en tubos de ensayo y se
inocula en cada uno, una muestra de una
colonia de Gram negativas. Para inocular se
sigue el siguiente proceso: en el medio VP,
se coloca una muestra con un asa de platino
y se agita hasta disolver, luego se esteriliza
la boca del tubo; en el medio SIM, se pica
con un asa con muestra hasta llegar casi al
fondo, luego se saca de forma vertical y se
esteriliza la boca del tubo; en el medio MIO,
se realiza el mismo procedimiento que en el
medio SIM; en el medio LIA, se realiza el
mismo procedimiento que en el medio SIM,
solo que antes de sacar el asa del medio, se
realiza una especie de “cola” dentro del
tubo; en el medio Kligger se realiza de la
misma forma que en el SIM, solo que hay
que inclinar el tubo. Luego de inocular todos
los tubos, es necesario colocarlos en la
incubadora y observar los cambios después
de 24 horas.
Lectura de bioquímicas: Algunos
símbolos empleados en los resultados de
las pruebas bioquímicas son los siguientes.
A/A (acido/acido) (-) negativo
K/A (base/acido) (+) positivo
K/K (base/base) +++ muy positivo
V variable
Resultados
En la mayoría de los medios (Nutritivo, VBB
y Mac Conkey), se formaron colonias con
distintas características:
Luego de analizar las colonias, se colocaron
muestras de algunas de estas en
portaobjetos para aplicarles la tinción de
Gram. Se obtuvieron los siguientes
resultados:
-El medio Nutritivo 1 contiene Bacilos Gram
Negativos (color rosa).
-El medio Nutritivo 3 contiene Bacilos Gram
Negativos (color naranja).
-El medio Nutritivo 4 contiene cocos Gram
positivos (morados).
-El medio Nutritivo 5 contiene Bacilos Gram
negativos (rojos).
Se realizó una serie de pruebas bioquímicas
empleando una muestra de una colonia
procedente del medio Nutritivo 1 y se
obtuvieron los siguientes resultados:
VP: Se presentó turbidez, las colonias se
asentaron en el fondo del tubo, lo cual indica
que se trata de anaeróbicas facultativas.
Medio SIM: Movimiento variable. Se formó
un anillo con rojo de metilo.
MIO: K/A (morado/amarillo)
LIA: No hubo cambios.
Kligger: K/A (rojo/amarillo). No se presentó
coloración negra o acumulamiento de gas.
En base a los resultados anteriores, se
puede deducir que la colonia contiene
Escherichia Coli.
Morfología de colonias
Medio Número Color Forma Superficie Borde Colonias
Nutritivo
1 Blanco Puntiforme Plana Redondeado 603
Blanco Irregular Plana Rizoide 3
2
3 Blanco Irregular Umbilicada Rizoide 1
4 Blanco Circular Plano convexa
Rizoide 1
5
6 Blanco Puntiforme Plana Redondeado 1
Blanco Filamentosa Plana Filamentoso 2
7 Blanco Filamentosa Plana Filamentoso 3
Blanco Irregular Plana Ondulado 2
VBB
1 Rosa intenso
Irregular Plana Rizoide 2
2 Rosa intenso
Circular Plana Redondeado 2
3 Morado claro
Fusiforme Plana Rizoide 11
4 Morado
claro
Fusiforme Plana Redondeado 1
5 Morado claro
Fusiforme Plana Redondeado 24
Mac Conkey
1 Rosa Puntiforme Plana Redondeado 7
2 Rosa Puntiforme Plana Redondeado 7
3
4 Rosa Puntiforme Plana Redondeado 15 5 Rosa Puntiforme Plana Redondeado 43
Conclusiones
González Lesly
La práctica comenzó como la anterior
preparando los medios de cultivo en las
cajas Petri solo que hora se prepararon
pruebas bioquímicas se dejaron en la
incubadora durante 24 horas, solo los
medios de cultivo nutritivos presentaban
crecimiento que variaban desde 3 hasta 82,
a las 48 horas se volvieron a tomar la
morfología y el número de colonias dando
como resultado mayor crecimiento ahora en
todos los medios de cultivo, el más alto fue
de 682, después de eso se empezó a
preparar la seria de pruebas bioquímicas en
tubo, se estrió una pequeña muestra de un
medio de cultivo, para así poder encontrar si
las bacterias encontradas eran positivas o
negativas, así como que bacterias eran. Las
bacterias encontradas fueron Eschericha
Coli y Shigella. En conclusión las pruebas
bioquímicas son utilizadas para la
identificación de las bacterias.
Hernández Nayelli
Hernández Alan
Existen una gran cantidad de técnicas que
permiten analizar los diversos tipos de
bacterias que pueden crecer en un medio de
cultivo determinado. La tinción de Gram
permite conocer la morfología de las
bacterias presentes en los medios de
cultivo, mientras que las pruebas
bioquímicas son utilizadas para identificar el
género de bacteria presente en una colonia.
Estas técnicas, en conjunto, permiten saber
exactamente que bacteria está presente en
un medio, por lo cual, son indispensables en
la microbiología para analizar los distintos
tipos de bacterias.
Herrera Jazmín
Jiménez Fabiola
Las pruebas bioquímicas convencionales,
generalmente determinan la actividad de
una vía metabólica (conjunto de reacciones
químicas) a partir de un sustrato que se
incorpora en un medio de cultivo y que la
bacteria al crecer transforma o no.
A partir de las pruebas bioquímicas de
identificación bacteriana, mediante
estándares establecidos, podemos conocer
que bacteria tenemos en una muestra
problema basándonos en sus reacciones
metabólicas las cuales son características
de cada microorganismo. Y el cómo cambia
la tonalidad de cada una de las muestras.
Las interacciones que cada tipo bacteriano
establece con el entorno son propias y
características. Esta especificidad depende
del tipo de la bacteria y se expresa en un
determinado equipo enzimático. Por ello, la
caracterización de dichas enzimas es una
herramienta útil para clasificación
bacteriana.
Lagunas Itzel
Las pruebas bioquímicas permiten un
estudio más profundo del comportamiento
bacteriano, hacen énfasis en las
características metabólicas específicas de
una bacteria. Existen muchas de ellas y
cada una se enfoca en algo, por decir la
prueba MIO permite identificar bacterias de
acuerdo a su motilidad a la reacción de Indol
a la descarboxilación de la ornitina.
Vanesa Lira
Una de las cosas más importantes y de las
cuales se puede aprender cada día más es
por medio de la identificación bacteriana ya
que se puede realizar mediante las
características morfológicas y las
bioquímicas de los microorganismos que
estamos manejando en el laboratorio.
La identificación bioquímica se caracteriza
por los metabolismos específicos de cada
microorganismo. Como también logramos
percatarnos de que las bacterias son
capaces de modificar el ambiente que las
rodea, utilizando sustancias o medio
necesarios para su crecimiento o
multiplicación. Lo que define a cada tipo
bacteriano son sus propiedades y
características.
Mata Lizbet
Las pruebas bioquímicas son muy
importantes ya que nos ayudan a identificar
casi con exacta precisión que tipo de
microorganismos han crecido en cada uno
de nuestros cultivos. Identificamos si tiene
movilidad, si existe turbidez o la existencia
de gas en cada una de ellas.
También debemos de tomar en cuenta que
los resultados que son tomados deben ser
los obtenidos en un plazo de 24 horas
después de la siembra en las bioquímicas,
cualquier resultado obtenido después de
este plazo es falso.
Melendez Araceli
Realizamos una investigación sobre lo que
eran las pruebas bioquímicas para después
llevarlas a cabo en el laboratorio, a lo largo
de esta práctica pude comprender de una
manera más exacta la elaboración de una
prueba bioquímica, sus procedimientos, etc.
Para terminar empleando más mi
conocimiento de algunas cosas básicas que
hemos estando llevando acabo como lo es
la limpieza de nuestra área de trabajo antes
de empezar la practica entre otras cosas
obtuve conocimientos nuevos con esta
práctica.
Discusión
En esta práctica igual que en las anteriores
se aprendieron nuevos conocimientos,
aplicando así algunos ya conocidos, se
aprendió a preparar y utilizar los medios de
cultivo selectivos así como las bioquímicas,
se entendió y llego a la conclusión de que
las pruebas bioquímicas son las que
determinan la actividad metabólica de una
cepa pura así como la identificación y
clasificación de las bacterias y hongos. Así
como se aprendió a estriar en los tubos,
utilizando diferentes bioquímicas inoculando
agua del baño y tierra contaminada. Por
ultimo al tomar los resultados se
encontraron escherichia coli y Shigella en
los cultivos, esta series contenía la muestra
de una colonia del medio de cultivo A1,
mientras que en el V.P si se encontró la
turbidez y las colonias asentadas en el tubo.
Bibliografía
MacFaddin J. F. (2003). Pruebas
bioquímicas para la identificación de
bacterias de importancia clínica.
América: Editorial Médica
Panamericana.
Anexos.
Pruebas bioquímicas
E + S ↔ ES
↔ E + P
Se pueden resumir en los siguientes puntos:
•Sustrato (contenido en el medio de cultivo)
•Enzima o vía metabólica (secretada o en el
interior del
Microorganismo)
•Producto
•Revelador y/o indicador (aunque algunas
no los emplean)
Ejemplo: Hidrólisis del Almidón
El almidón es producido principalmente por
plantas superiores, está compuesto de
amilosa y amilopectina. Diversas enzimas
amilolíticas hidrolizan almidón y sus
productos.
Las pruebas bioquímicas consisten en
distintos test químicos aplicados a medios
biológicos
, los cuales, conocida su reacción, nos
permiten identificar distintos
microorganismos presentes.
Su sistema de funcionamiento
generalmente consiste en determinar la
actividad de una vía metabólica a partir de
un sustrato que se incorpora en un medio de
cultivo y que la bacteria al crecer incorpora
o no.
Se realizan:
Para realizar las pruebas bioquímicas se
dispone de múltiples medios, los cuales se
deben aplicar de acuerdo a las exigencias
del microorganismo en estudio.
De la amplia variedad de pruebas
bioquímicas, nosotros en laboratorio
Utilizaremos 10, aplicados a 5 especies de
microrganismos.
Además estudiaremos los resultados que
estos test arrojan, comparando resultados
experimentales entre los distintos grupos de
trabajo de nuestro laboratorio.
Prueba Negativa
Prueba positiva
Con frecuencia, la identidad de una especie
requiere que se conozca de manera
detallada su actividad bioquímica, porque
otras características no son suficientemente
distintivas o diferenciales.
En el laboratorio disponemos de numerosas
técnicas para la caracterización bioquímica
de una especie. En general el
microorganismo se cultiva en medios que
contienen una sustancia nutritiva específica
o sustrato y después de la incubación del
cultivo se examina para ver los cambios
químicos que hayan ocurrido. Además de
los productos finales de los procesos
metabólicos, también se necesita conocer
con detalle cómo se producen estos
cambios, como ocurren paso a paso las
reacciones químicas, cuáles enzimas
intervienen, cuales son los productos
intermediarios además de que se deben
reconstruir las secuencias de las reacciones
bioquímicas que tienen lugar dentro de la
célula.
EJEMPLO
Fermentación de la lactosa (Mc Conkey)
El agar Mc Conkey es un medio sólido,
diferencial y selectivo. Se usa para la
discriminación de bacterias con capacidad
de fermentar la lactosa (Lac + y -
).Composición g/l:
- Peptona 20.0: fuente de nitrógeno y
carbono para las Lac -.
- Lactosa 10.0: fuente de carbono para las
Lac +.
- Sales biliares 2.5: le confiere carácter
selectivo, inhibiendo el crecimiento de Gram
+.
- Cloruro sódico 5.0: para mantener la
tonicidad del medio (evitar osmosis).
- Rojo neutro 0.05: indicador que va hacer
que el medio vire de coloración. Si las
bacterias son Lac +, producirán ácidos
derivados de la fermentación que darán al
medio un aspecto rosáceo; si por el contrario
son Lac -, el medio se basificará por el uso
de la peptona y se tornará amarillo.
- Cristal violeta 0.001: interfiere junto con las
sales biliares en la selectividad del medio.
- Agar-agar 15.0: da consistencia al medio.
IMVIC
El IMVIC se compone de cuatro pruebas:
Indol, Rojo de metilo, Voges-Proskauer y
Citrato. Su finalidad es identificar un
organismo del grupo de los coliformes. La
presencia de estos indica contaminación
fecal.
Resultados de una prueba IMViC
Indol
La prueba del indol estudia la capacidad de
degradar el triptófano con producción de
Indol y metabolitos indólicos.
Rojo de Metilo
Estudia la fermentación ácido mixta con
producción de ácidos estables en el tiempo.
Voges Proskauer
Estudia la fermentación butanodiólica con
formación de un metabolito intermediario
neutro.
Técnica: Sembrar la muestra en el medio e
incubar de 24 a 48h a 37 °C. Según el
volumen del medio añadir a partes iguales el
volumen de los reactivos, agitar para
exponer el medio al O2. VP POSITIVO:
Color rojo-rojizo en menos de 1h. VP
NEGATIVO: Amarillo en superficie.
Citrato
Estudia la capacidad de utilizar el citrato
como única fuente de carbono
Enzimáticas Oxidasa: La oxidasa estudia la presencia del
enzima citocromo c oxidasa que actúa en la
cadena respiratoria del organismo.
Catalasa Estudia si el microorganismo posee el
enzima catalasa que actúa
descomponiendo el peróxido de hidrógeno.
Reacción de la catalasa
Coagulasa
Coágulos formados por la reacción de la
coagulasa en un tubo de ensayo.
Estudia la producción del enzima coagulasa,
capaz de coagular el plasma. Diferenc ia
Staphylococcus aureus de otras especies.
Ureasa
Prueba de ureasa
Estudia si el microorganismo posee el
enzima ureasa que cataliza la hidrólisis de la
urea.
Reducción Nitratos
Estudia la capacidad de los
microorganismos para reducir los nitratos
por la presencia de un conjunto de enzima
denominado nitrato reductasa
β - D - Galactosidasa
Estudia la capacidad de producir β - D -
galactosidasa, enzima necesario para
metabolizar la lactosa.
Descarboxilasas
Estudia si el microorganismo produce los
enzimas que descarboxilan los aminoácidos
presentes en el medio.
Otras
Hidrolisis Gelatina
Estudia la capacidad proteolítica (la
capacidad de degradación de proteínas) del
microorganismo por degradación de la
gelatina.
Óxido - Fermentativa o de Hugh-Leifson
Estudia si el microorganismo es capaz de
metabolizar un hidrato de carbono por vía
oxidativa o por vía fermentativa.
Ácidos y gases
Estudia la capacidad de utilizar un hidrato de
carbono con la producción de ácidos y la
formación de gas.
Agar TSI
El agar TSI estudia la utilización de la
glucosa y lactosa, la producción de gas y
ácido sulfhídrico (como producto metabólico
final de los aminoácidos azufrados).
