Centro de Bachillerato Tecnológico Industrial y de Servicios Noº128

Práctica 6. Halos de inhibición (desinfectantes).

Sub módulo 3: Ejecuta técnicas de identificación de microorganismos con base en las normas.

Equipo 3. Integrantes: Cabral Brandon, González Lesly, Hernández Nayelli, Hernández Alan, Jiménez Fabiola, Lagunas Itzel, Lira Vanesa, Mata Lizbet.

Facilitadora: Ing. Acosta Jessica

Fecha: Inició 5 de Noviembre del 2014, 12 de Noviembre del 2014.

Introducción

Las bacterias presentan una gran adaptabilidad a los ambientes en los que se desarrollan y algunas pueden sobrevivir bajo ciertas condiciones inusua-les, pero a pesar de esto, existen compuestos que pueden ocasionar la relativa muerte de estos mi-croorganismos. Estos agentes actúan penetrando la membrana externa de las bacterias y destruyéndo-la.

Para medir la eficacia de estos agentes antibacte-riológicos, se emplea la técnica de los halos de inhibición, la cual ayuda a comparar diversos tipos de desinfectantes y antisépticos para identificar al agente más efectivo sobre las bacterias.

Los halos de inhibición son áreas circulares que se forman alrededor de las muestras de desinfectantes colocadas en un medio de cultivo, en estas áreas, se inhibe el crecimiento de algunas especies de bacterias.

Resumen

En esta práctica, se aplicó la técnica de halos de inhibición para determinar la eficacia de algunos desinfectantes y limpiadores comunes.

Primero, se prepararon una serie de placas de Petri con medio nutritivo y se tomaron muestras con hi-sopos, de distintos objetos: trapeador, manos, mesa, lavabo, baño, cocina y trapo.

Luego, se inocularon las muestras en las placas de Petri y en cada cuadrante de la caja se colocó un cuadrado de 5 cm2 empapado de desinfectante. Se colocaron 4 cuadrados con diversos desinfectantes en cada placa.

Luego, las placas fueron colocadas en la incubado-ra por 24 horas. Después de este lapso, se observó el crecimiento de algunas bacterias. Pero no se apreciaron los halos de inhibición. Se realizó el análisis morfológico de las colonias y la tinción de Gram para analizar la morfología de las bacterias.

Abstract

In this practice, the technique of inhibition halos was applied to determine the effectiveness of some co-mmon disinfectants and cleaners.

First, a serie of Petri dishes was prepared with nutri-tious medium and was taken samples with swabs of different objects: mop, hands, table, sink, bathroom, kitchen and cloth.

Then, the samples were inoculated on the Petri dishes and in each quadrant was placed a square of 5 cm2 of filter paper, wet with disinfectant. 4 squa-res with different disinfectants were placed in each dish.

Then, the dishes were placed in the incubator for 24 hours. After this period, the growth of some bacteria was observed. But the inhibition halos were not appreciated. Morphological analysis of colonies and Gram staining was performed to analyze the mor-phology of the bacteria.

Materiales y métodos

Preparación del agar y vaciado

Materiales

Matraz Erlenmeyer Agitador

Guante de asbesto Mechero de Bunsen Manguera de látex Espátula Balanza granataria Vidrio de reloj 7 placas de Petri Papel periódico

Reactivos

Agar Dextrosa papa Agar Nutritivo Agar Saboraud Agua

Procedimiento

Para cada agar:

1-Preparar la cantidad necesaria de solución de agar y agua para 42 cajas de Petri, tomando en cuenta el margen de error. Hacerlo en un matraz Erlenmeyer.

2-Tomar el matraz con el guante de asbesto y po-nerlo a calentar en el mechero, agitándolo suave-mente para diluir perfectamente el agar. Realizar esto hasta que se haya diluido correctamente y la solución presente un tono cristalino.

3-Envolver las placas de Petri con papel periódico y tapar el matraz con el agar con una cubierta de papel periódico.

4-Esterilizar en olla de presión las placas y los ma-traces con los agares, por 15 minutos, a 15 libras de presión.

5-Una vez esterilizados, desenvolver los instrumen-tos y prepararlos para el vaciado.

6-Colocar tres mecheros de Busen en forma de triángulo y vaciar 20 ml de agar en cada placa de Petri (hacerlo dentro de la figura).

7-Etiquetar las placas y dejarlas solidificar.

Inoculación y halos de inhibición

Materiales

7 placas de Petri (con medio nutritivo solidifica-do)

Hisopos para inocular 3 mecheros de Bunsen 3 mangueras de látex

Reactivos

Limpiadores:

Axion Pinol Ajax Cloro

Muestras de:

Trapeador Manos Mesa Lavabo Baño Cocina Trapo

Procedimiento

1-Tomar cada una de las 7 muestras con un hisopo (procurando darle vueltas para poder tomar mejor la muestra).

2-Inocular cada una de las muestras en cada una de las 7 placas. Emplear el método de estriado de crecimiento y realizarlo dentro de un triángulo de mecheros de Bunsen.

3-Una vez inoculadas, recortar cuadrados de 0.5 cm2 de papel filtro y empaparlos con cuatro limpia-dores o desinfectantes diferentes.

4-Colocar cuatro cuadros de papel filtro, cada uno con un desinfectante diferente en cada placa de Petri (colocar cada cuadro en cada cuadrante de la placa).

5-Una vez realizado lo anterior, etiquetar las placas de Petri correctamente y colocarlas en la incubado-ra a 35°C aproximadamente por 24 horas.

6-Una vez pasado el lapso, sacar las placas y reali-zar un análisis de la morfología de las colonias; la tinción de Gram a los cultivos y el análisis de la morfología de las bacterias; y medir los halos de inhibición que se formaron alrededor de cada cua-dro de papel filtro.

7-Anotar todos los resultados.

Resultados

En la práctica se obtuvieron los siguientes resulta-dos:

Se inocularon las muestras de la siguiente forma:

Medio Número Muestra ino-culada

Nutritivo

1 Trapeador2 Manos3 Mesa4 Lavabo5 Baño6 Cocina7 Trapo

Morfología de colonias

La mayoría de las cultivos no presentaron creci-miento de colonias, mientras que en las que se formaron colonias, solo se presentaron unas cuan-tas.

Medio Color Forma Su-perfi-cie

Borde Co-lo-nias

Nutritivo 1

Blanco Circu-lar

Plana Re-don-deado

1

Nutritivo 3

Blanco Punti-forme

Plana Re-don-deado

6

Nutritivo 6

Amari-llo

Circu-lar

Plana Re-don-

2

deadoNutritivo 6

Blanco Punti-forme

Plana Re-don-deado

4

Morfología de bacterias

Medio Bacteria Color TipoNutritivo 1 Bacilos Morado Gram positivo Nutritivo 3 Bacilos Morado Gram positivoNutritivo 6 (co-lonia amarilla)

Cocos Morado Gram positivo

Nutritivo 6 (co-lonia blanca)

Bacilos Morado Gram positivo

Los cultivos no crecieron adecuadamente, por lo que no se pudieron analizar los halos de inhibición.

Conclusión

Cabral Brandon: Aplicando esto podemos saber cuántas bacterias tienen los objetos y probar si el producto de limpieza sirve para ayudar a su limpie-za

González Lesly: En conclusión los halos de inhibi-ción son las zonas que se forman alrededor de un disco para saber qué calidad tiene un antibiótico, en este caso se utilizó para saber cuán bueno son los detergentes que utilizamos en la vida diaria, debido al mal empleo de la práctica y no seguir las instruc-ciones al pie de la letra la práctica no presentó los halos de inhibición creciendo diferentes bacterias en donde no se debería de haber crecido, sin tener la oportunidad de haber medido el diámetro que se presenta en los halos.

Hernández Nayelli: Como conclusión determina-mos que este se tiene que realizar en un cultivo puro y que es empleado para determinar la sensibi-lidad (Para realizar pruebas de sensibilidad e identi-ficación se debe partir de un cultivo primario en medio sólido y se debe procesar una colonia aisla-

das de cada tipo de microorganismo que pueda tener rol patógeno) de un agente microbiano, la limpieza como siempre muy importante ya que se está trabajando con hongos, el tener control acerca de este e inhibir.

Hernández Alan: Los antibiogramas permiten de-terminar la eficacia de los antibióticos para inhibir el crecimiento de algunas bacterias, por lo cual son muy empleados en medicina.

Una de las técnicas de los antibiogramas consiste en colocar círculos de papel empapados con anti-bióticos, luego son colocados en un medio de culti-vo y se espera a que crezcan las colonias para observar los halos que se forman.

El diámetro del Halo determinará la eficacia del antibiótico sobre las bacterias presentes en el me-dio analizado y permitirá establecer comparaciones con los halos de otros antibióticos.

En conclusión, las técnicas que involucran halos de inhibición son muy importantes, ya que permiten medir la eficacia de los desinfectantes y antibióti-cos, lo cual puede ayudar en la creación de medici-nas más potentes y que ayuden a combatir eficaz-mente a las bacterias patógenas que entran al or-ganismo.

Jiménez Fabiola: Se tiene como conclusión que los halos de inhibición es un antibiograma en el que no se produce crecimiento bacteriano en una placa de agar inoculada con el germen. Gracias a esta práctica se observó y se consideró la eficacia de algunos desinfectantes ante diferentes muestras, en los cuales en tales casos algunas de las bacte-rias hasta se formaron por encima de los halos de inhibición dando a observar y deducir que su efica-cia para dar algún tipo de limpieza o desinfección ante ciertas bacterias no es muy eficiente y dando a deducir cuales lo son y cuales no y así poder tomar en cuenta que tipo de desinfectantes podrías usar para la limpieza en tu hogar o hasta en otras partes.

Lagunas Itzel: Los halos de inhibición son una prueba importante para comprobar la efectividad de desinfectantes o antibióticos, el que presenta un mayor diámetro es el que se considera más eficaz,

teniendo en cuenta que los bordes no siempre son uniformes. Deben medirse con mucha precisión.Los desinfectantes que fueron analizados si presen-taron un funcionamiento adecuado mientras las bacterias se encontraban en su fase de latencia.

Lira Vanessa: Conforme se van realizando las practicas son cada vez nos vamos percatando más de lo importante que es observar cada tipo de creci-miento que se obtiene ya que no siempre será el mismo y pues de igual manera podemos extender nuestro conocimiento a todo lo que vamos apren-diendo cada día en las practicas por ejemplo en esta práctica respectivamente al hacer tareas como la de los halos de inhibición principalmente estudiar lo que es el tema y posteriormente aplicarlo en una práctica para así poder realizar mejor las cosas y no equivocarnos demasiado . Ya que de esa forma pues sabremos identificar con mayor facilidad lo que estamos trabajando debido a todos los procedi-mientos y métodos que hemos estado utilizando en el laboratorio y en si cada práctica tiene algo nuevo que mostrarnos y sobre esta se aprendió como es que crecen bacterias al rededor del halo de inhibi-ción y por qué crecen así. Como también hacer con facilidad la tinción y reconocer el tipo de bacteria que se observa al microscopio.

Mata Lucero: Al hablar de halos de inhibición esta-mos hablando de descubrimiento, ya que nos ayu-dan a identificar cual de en este caso desinfectan-tes de los que utilizamos es el más seguro e inhibe las bacterias en un mayor rango. Nos son de mu-cha utilidad principalmente a nosotros como labora-toristas químicos, ya que regularmente nos expone-mos a cosas muy contaminadas y al momento de la desinfección podremos usar el desinfectante ade-cuado.

También nos ayuda a saber cuál es el de menor inhibición y por lo tanto el más inseguro.

Meléndez Araceli: El estudio de la sensibilidad de los microorganismos a los antimicrobianos se reali-za principalmente por técnicas de dilución o de difusión.

Se entiende por halo de inhibición bacteriana a la zona alrededor de un disco de antibiótico en un antibiograma en el que no se produce crecimiento bacteriano en una placa de agar inoculada con el germen. Es una medida de la potencia del antibióti-co frente al germen

Discusión

Al momento de realizar esta práctica, algunos de los métodos o de las instrucciones indicadas fueron hechas mal, ya que a las 24 horas no se presentó ningún crecimiento de bacterias, ni la presencia de los halos de inhibición, pensamos en la teoría de que eran demasiado buenos los desinfectantes utilizados, rechazando este teoría ya que los demás equipos si presentaron cambio y los halos de inhibi-ción, a las 48 horas no se volvieron a ver cambios notorios, por lo cual la práctica no llego a su objeti-vo.

Bibliografía

Malibrán C., (2008). MANUAL DE PROCEDIMIEN-TOS Para la determinación de la sensibilidad a los antimicrobianos en bacterias aisladas de humanos. Noviembre 14, 2014, de INEI. Recuperado de: http://www.cdc.gov/ncidod/dbmd/gss/publications/documents/Argentina-LevelI/Manual_procedimientos.pdf

Cercanado E. & Saavedra J., (2009). El antibiogra-ma. Noviembre 19, 2014, de AEP. Recuperado de: http://www.apcontinuada.com/es/el-antibioigrama-interpretacion-del-antibiograma/articulo/80000504/

Anexos

Antibiogramas y los halos de inhibición

El estudio de la sensibilidad de los microor-ganismos a los antimicrobianos se realiza principalmente por técnicas de dilución o de difusión.

Las técnicas de dilución proporcionan resul-tados cuantitativos (concentración mínima inhibitoria, CMI) y las de difusión cualitati-vos (sensible, intermedio, resistente). Am-bos métodos son comparables ya que hay una correlación directa entre el diámetro del halo de inhibición con un disco y la CMI.

Las técnicas bioquímicas y genéticas per-miten detectar el mecanismo o el gen de resistencia en minutos u horas.

La realización de un antibiograma se basa en el patrón de resistencia de cada bacte-ria. Así, los antibióticos a los que esa bacte-ria es intrínsecamente resistente o cuya sensibilidad puede inferirse por otros, no suelen informarse en el antibiograma.

Los patrones de antibiograma poco fre-cuentes o imposibles requieren confirma-ción, ya que no responden a mecanismos de resistencia conocidos.

Técnicas de estudio de sensibilidad a los anti-microbianos

El estudio de la sensibilidad in vitro de las bacte-rias a los antimicrobianos se realiza mediante métodos fenotípicos (técnicas de dilución y de difusión), bioquímicos y genéticos.

Los métodos fenotípicos (antibiograma) son los más utilizados. Consisten en enfrentar un inóculo bacteriano estandarizado a una única o a diferen-tes concentraciones de antibiótico. La interpreta-ción de los resultados obtenidos permite clasificar a los microorganismos en categorías clínicas: sensibles, intermedios o resistentes. Hay que tener en cuenta que no siempre un valor de CMI más bajo indica mayor actividad de este antimi-crobiano, ya que las CMI que definen la sensibili-dad o resistencia son diferentes para cada espe-cie bacteriana y cada antimicrobiano. Si un mi-croorganismo es sensible indica que con las dosis habituales se espera una evolución favorable de la infección, siempre que se alcancen valores adecuados en el lugar de la infección, lo que en ocasiones no es posible (p. ej., en el sistema ner-vioso central). Por el contrario, si el microorganis-mo es intermedio o resistente, es probable que la evolución sea desfavorable. La interpretación de la sensibilidad predice mejor el fracaso (cuando es resistente) que el éxito de un tratamiento.

Entre los métodos fenotípicos, las técnicas de dilución determinan la CMI utilizando un medio líquido (dilución en caldo) o un medio sólido (dilu-ción en agar) para disolver las diferentes concen-traciones del antimicrobiano. El medio estandari-zado para la realización del antibiograma es el medio Mueller-Hinton, al que se le añade sangre u otros suplementos para bacterias que no crecen en él. La CMI es la dilución más baja de antimicro-biano en la que no se observa crecimiento bacte-riano. La dilución en caldo suele realizarse en micrométodo (microdilución), en paneles multipo-cillos, y es el sistema mayoritariamente adoptado por los sistemas automáticos comerciales para determinar la sensibilidad a los antimicrobianos. En estos sistemas, la lectura de los valores de CMI y la interpretación de resultados se realizan de forma automática.

Las técnicas de difusión emplean discos de papel impregnados con una solución estandarizada de antibiótico que se disponen sobre la superficie de un medio sólido previamente inoculado en su superficie con una suspensión bacteriana. Tras un período de incubación de 18 h, el diámetro del halo formado está en relación con el grado de sensibilidad del microorganismo. La carga del disco está ajustada para que los halos de inhibi-ción permitan diferenciar los microorganismos sensibles de los resistentes y pueda establecerse una correlación con los valores de CMI: halos pequeños se relacionan con valores altos de CMI (resistentes) y halos grandes con CMI bajas (sen-sibles) (fig. 1A). Otra técnica de difusión es el E-test, que además permite la determinación directa del valor de la CMI (fig. 1B). Utiliza tiras de plásti-co impregnadas con un antibiótico en concentra-ciones decrecientes. Al contacto de la tira con el agar, el antibiótico difunde e impide el crecimiento del microorganismo. Después de la incubación se observa una zona de inhibición en forma de elip-se: el valor de la CMI es el punto de intersección de la elipse con la tira y está indicado en la escala impresa sobre la superficie de la tira. Esta técnica puede utilizarse directamente sobre muestras clínicas para obtener resultados preliminares en menos de 24 h, que siempre deben confirmarse mediante pruebas de sensibilidad estandarizadas con bacterias en cultivo puro.