Seminario: Reprogramación de Células Madre

Células Madre

Alberto Torcello

Lemia Mohatar

Patricio Gabarrón

Francisco Jiménez

Rafael Diego Macho

- 3º Grado en Bioquímica (2º Cuatrimestre) Bases Celulares y Moleculares del Desarrollo -

Índice• 1.Introducción.

▫ Definición▫ Tipos▫ Descubrimientos asociados

• 2.Genética de las células madre.• 3.Patologías tratadas con células madre• 4.Investigación

▫ Aislamiento y mantenimiento▫ Inducción de la diferenciación▫ Reprogramación celular▫ Investigación básica

• 5.Aplicaciones clínicas▫ Regeneración de tejidos por células madre adultas▫ Crohn▫ Insuficiencia cardiaca y reparación

• 6.Células madre y sociedad▫ Principales polémicas▫ Comités de Bioética▫ Legislaciones

• 7.Conclusiones

Conceptos básicos

• Células totipotentes

• Células pluripotentes

• Células multipotentes

1. Introducción

Introducción

“Aquellas células con la capacidad para dividirse simultáneamente; para mantener por una parte su autorenovación y por otro lado generar células hijas comprometidas en distintos linajes celulares, que finalmente se diferenciaran en células especializadas, no solo morfológicamente, sino también funcionalmente.”

Tipos de células madre

Células madre embrionarias

Células madre somáticas adultas

Hematopoyéticas

Mesenquimales

Otros tipos

• Células sidepopulation

• Células progenitoras multipotenciales adultas

Descubrimientos asociados

• http://www.preceden.com/timelines/55536-history-of-stem-cells

¡¡ Atención Actividad !!

Poner en google:

Preceden stem cells timeline

Picar en el primer enlace.

http://www.preceden.com/timelines/55536-history-of-stem-cells

Genes ES: Factores de Transcripción

Regulación Cis.

• Promotores colocados corriente arriba.

-Caja CAATC: 50-130pb delante, y C/EBP proteína de unión.

-TATA: 20-30pb delante, y proteínas TF IIA, B, C.

Regulación Trans

• Ayuda de proteínas

• No interacción ADN polimerasas y ADN.

• Se unen al surco mayor.

• Transcripción basal y histoespecífica

• ADN, ADN polimerasa y factores generales

Shinya Yamanaka y Kazutozhi Takahashi

2. Genética de las Células Madre

Inducción de la pluripotencialidad

• Factores que mantienen la identidad de célula madre.

• ¿Podrían servir para inducir la pluripotencialidad en células somáticas?

• 24 factores “candidatos”.

Diseño del ensayo

• Selección por resistencia a G418

• Construcción a insertar:

-B- galactosidasa

-resistencia a neomicina

• Factor candidato

• Target gen: Fbx15

• Trasnducción retroviral

Primeros resultados y conclusiones

• En ninguna de las inserciones de factores individualmente se obtenían colonias.

• El tratamiento con los 24 factores conseguía:

-22 colonias

- Morfología similar a las de las células madre.

- Mismo tiempo de división de células madre.

- Marcadores de cel. Madre

- metilación diferencial de promotores.

Reducción de factores imprescindibles

• Retirada de factores uno a uno:

- 10 factores imprescindibles:

Mayor proporción de células madre.

Reducción de los factores

imprescindibles

• Retirada del pool de 10 factores:

- Oct 4 y Kfl4 retirada No crecimiento

-Sox retirada Pocas colonias

- C-myc retirada se perdía la morfología de células madre

- La sustracción de los demás factores no afecta al nº de colonias

¿iES son idénticas a las células madre?

• RT-PCR, fosfatasa alcalina y actividad telomerasa:

Similares pero no idénticas a las ES.

• MEF 3 es sustancialmente diferente de MEF 4 y MEF10.

Pluripotencialidad in vivo

• Inyección subcutánea de iES

• Resultado formación de teratomas

• MEF10 produce 5 tumores 2 (3 capas germinales)

• MEF4 produce 3 tumores2(3 capas germinativas)

No todas las células producen pluripotencia.

Regulación de la pluripotencia

• OCT4 interactúa BMP4 y determina 4 destinos:- (+)OCT4,(-)BMP4: autorrenovación- (+)OCT4,(+)BMP4: mesodermo-(-)OCT4, (+)BMP4: extraembrionarios-(-)OCT4, (-)BMP4: Ectodermo

• Nanog reprime la diferenciación en ectodermo• SOX3 y SOX 4 son redundantes e inhiben la formación

de mesodermo.LOS FACTORES NO SON PANREPRESORES DE

LA DIFERENCIACIÓN CADA FACTOR CONTROLA EL DESTINO ESPECÍFICO DE CADA CÉLULA

C-myc

• Es un factor de trasncripción

• 15% genoma: enhancers box y histonas acetiltransferasas.

• Hélice giro hélice/ cremallera de leucina.

• E box: Secuencia consenso CANNTG.

• Histonas aciltransferasas: acetilación de lisinas.

3. Patologías tratadas con células madre

• Leucemia:

– Afecta a los glóbulos blancos principalmente o a precursores de los mieloides .

– Transfusión de sangre por goteo a través de un catéter

– Suministro de antibióticos y alimentación a través de un catéter.

– La leucemia desaparece a los 2 años.

Patologías tratadas con células madre

• Síndromes mielodisplásicos:

– También denominada preleucemia.

– Perdida de la síntesis de glóbulos rojos normales

– Quimioterapia y radiación total destruir las células de la medula ósea.

– Trasplante de células madre de la medula ósea:

– Alotrasplante

– Autotrasplante


• Parálisis cerebral:– Daño en el cerebro durante el

embarazo, parto o después del nacimiento

– Las células madre del cordón umbilical:• Estimula la angiogénesis

• Reparación de la materia blanca y gris

• División en nuevas neuronas

• Fortalecimiento muscular

• Respuesta inmune potenciada

– Mejorías en el 85% de los pacientes tratados.


• Retinopatía diabética:

▫ Perdida de visión provocada por elevados niveles de glucosa en sangre

▫ Bloque del riego sanguíneo ocular

▫ Células madre por inyección que regeneran los vasos sanguíneos de la retina

Patologías tratadas con células madre• Enfermedad de Crohn:

– Origen desconocido y base genética que tiene un componente autoinmune

– El sistema inmunitario del individuo ataca su propio intestino produciendo inflamación

– El trasplante autólogo de células madre :• Primera quimioterapia• Migración de células madre a

la sangre• Aislamiento de las células

madre mediante aféresis• Crioconservación de las

células madre• Segunda quimioterapia• Trasplante autólogo de células

madre:

1. Aislamiento y mantenimiento de las células madre

• Determinación del origen de la célula: tejido embrionario adultos o somáticos

• Eliminar células ‘contaminantes’:▫ Unión de anticuerpos

específicos

▫ Destrucción con células del complemento

▫ Adhesión de membrana

4. Investigación

Métodos de obtención de células

madre• Embriones

crioconservados:

– Originados de la reproducción asistida

– Nitrógeno liquido -196ºC

– Duran 5 años

– Problema al descongelar: método de vitrificación

– 90% de supervivencia a la descongelación


madre• Blastómeros individuales:

– Fecundación de óvulos– 8 o 10 células– Extracción de una célula y cultivo.– Obtención de dos líneas celulares: pluripotencialidad y

cariotipo normal– El embrión cultivado no es destruido


madre

• Partenogénesis.

– Inducida por métodos químicos y físicos in vitro

– No existe material genético masculino.

– Desarrollo anormal: improntas genéticas

– Uso solo en producción de células madre y no en reproducción.

– Masa de células: partenote de la que se obtienen las células madre


madre• Donantes cadavéricos:

▫ Congelación de células musculares.

▫ Mantienen propiedades y sobreviven.

▫ Tratamiento con fibrina

▫ Pueden convertirse en piel


madre

• Clonación de embriones:

– A partir de una célula de la piel

– Blastocisto de 70 a 100 células del que se obtienen las células madre

– Carga de material genético excesiva

– Uso en regeneración de tejidos y prueba de fármacos

Fase final del aislamiento de células

madre• Se cultivan en un caldo de

cultivo

• Alcance de densidad celular medida por cartometría de flujo o inmunoanálisis

• Identificación cultivos puros de células madre especificas

4. Investigación.

2. Inducción a la Diferenciación

2. Inducción a la Diferenciación

Protocolo de obtención de CTPA

Marcadores presentes en CTPA

2. Inducción a la diferenciación.

2. Inducción a la diferenciación

• CPTA hacia osteocitos.

Crecimiento en medio específico

Β-glicerofosfatoAscorbato-fosfato

(durante 2 semanas recambio cada 2 días)

Aparición de Osteocalcina(marcador de tejido óseo)


• CPTA hacia hepatocitos

Transfección

FXO A1- A2SOX17GATA4HFNa

2. Inducción a la diferenciación• CPTA hacia Isletas β.

InsulinaTransferrinaSelectinaActivina AΒ mercaptoetanol

Taurina

Pdx-1

2. Inducción a la diferenciación• CPTA hacia células Neuronales

AzacitidinaB27Neuronal Growing Factors


• CPTA hacia cardiomiocitos.

Cultivo en medio con factores

5-azacitidinaTricostatina A

Aparición de ActinaCapacidad contráctilMetabolismo Ca2+ asociado

4. Investigación.

3. Reprogramación

4. Investigación.3. Investigación básica andaluza y actual

4. Investigación3. Investigación básica andaluza y actual

Líneas de Investigación del grupo del DrPeter Askjaer

4. Investigación.3. Investigación básica andaluza y actual.

4. Investigación3. Investigación básica andaluza y actual

5. Aplicaciones clínicas1. Regeneración de tejidos por células madre adultas

2. Insuficiencia cardíaca y reparación

5. Aplicaciones clínicas

“La preocupación con la que la sociedad

esté viendo una aplicación científica

puede acabar necesitando el

posicionamiento de los poderes públicos y,

por tanto, acabar convirtiéndose en una

cuestión política”

Dr. Pere Puigdomènech

6. Células Madre y Sociedad

Preguntas para la reflexión…

• ¿A partir de cuándo un ser humano es un serhumano?

• ¿Sería lícito crear embriones a partir de seres adultoscon fines terapéuticos?

• ¿Se deben considerar los criterios de la iglesia en estascuestiones?

• ¿Hay que restringir la investigación con célulasembrionarias sólo a embriones sobrantes actualmentealmacenados?

6. Células Madre y Sociedad1. Principales polémicas

2.Comités de Bioética

• Comité normativo y/o consultivo

• Comité de ética de la investigación

• Comité asistencial/hospitalaria

• Comité de asociaciones de profesionales de la salud


3.Legislaciones

• Ley 14/2006 del 26 de mayo

• Real Decreto 1301/2006, del 10 de noviembre

• Ley 14/2007, del 3 de julio

• Convenio de derechos humanos y biomedicina de Oviedo, 1997

• Legislación de EEUU


7. Conclusiones• Las células madre están presentes en todas las fases del

crecimiento de un ser vivo.• Diversos factores genéticos y su regulación marcan la

diferenciación de las células.• En la actualidad muchas patologías son tratables con

células madre con resultados menos perniciosos para los pacientes que los tratamientos más convencionales.

• La investigación con células madre es un campo muy atractivo para la obtención de aplicaciones clínicas y como investigación básica.

• El empleo y estudio de estas células es un tema de candente actualidad con posiciones muy opuestas a nivel social, político y religioso.

¡¡ Muchas gracias por vuestra atención !!

ACTIVIDAD

• http://www.elalumnodebq.blogspot.com.es/

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Science

Seminario: Reprogramación de Células Madre