Producción de anticuerpos y su uso en investigación

diagnóstico y terapia.Alfredo Prieto Martín

Cuestionario on line enhttps://docs.google.com/forms/d/18-ysk1RqfSfiiHa-5yQry3nsaNv_54i7_RaWyM51ZIE/viewform?usp=send_form

1. Introducción estructura de la molécula de anticuerpo

2. Inmunización. Inducción de respuesta inmune (Anticuerpos, Abs.) frente a un antígeno o patógeno. Mediante estimulación con Antígenos (ags). Moléculas del patógeno

Adyuvantes, adyuvante de Freund. Asocian físicamente Ag con estímulos no ag específicos Carriers para la inmunización con moléculas pequeñas (haptenos). Asocian químicamente hapteno

a molécula mayor.

3. Producción y uso de anticuerpos policlonales (sueros anti-X muchos clones ) y monoclonales (por único clon inmortalizado hibridoma).

Tecnología de hibridomas.

4. Inmunoterapia. Problema para la inmunoterapia la inmunogenicidad del anticuerpo y su solución:

humanización del anticuerpo.

5. Inmunodiagnóstico (reactivo estandarizado, Ab. monoclonal lo resuelve). Inmunohistoquímica Inmunofluorescencia

Índice

1. Introducción

ISOTIPOS DE Ab ESTRUCTURA DELMONÓMERO de Ab

Genes

El anticuerpo es un receptor proteico de alta afinidad química por el antígeno 106 a 1011

secretado por las células BAunque afinidad muy es alta, la unión es reversibleDepende de pH esto implica que…

Ag.

*

2H +2L

Es la estimulación deliberada de una respuesta inmune frente a un antígeno.

Se inyecta antígeno acompañado de un adyuvante que forma partículas que son confundidas con microorganismos por las células fagocíticas. (células dendríticas)

El adyuvante estimula, la fagocitosis, activa la célula fagocítica que presentará el antígeno al linfocito Th que ayuda a la respuesta de células B antígeno especificas.

DC/Mf Th1 Bcell IgG1 El resultado final de esta reacción celular en cadena es la producción de

anticuerpos con alta afinidad y especificidad por el antígeno Ag. + Adyuvante = estímulo para producción de anticuerpos

2. Inmunización Ag +Ad = Ab

Producción de anticuerpos policlonales y monoclonales

1. Obtención de antisueros (anticuerpos policlonales) en animales inmunizados.

2. Aislamiento de clones productores. Inmortalización. Síntesis de anticuerpos monoclonales (mAb).

3. Reducción de la inmunogenicidad de los mAb. Síntesis de anticuerpos monoclonales, quiméricos humanizados y humanos

La inmunización puede hacerse en dos contextos

1. Para vacunar al individuo inmunizado (en seres humanos o animales a los que queremos proteger de agentes infecciosos, vacunación)

2. Para obtener anticuerpos o células productoras de ellos a partir del individuo inmunizado

Antisueros mezcla policlonal de anticuerpos ejemplos sueros antitoxina diftérica o tetánica Clones de células B específicas que serán nuestra «fábrica de anticuerpos

monoclonales»

Contextos para la inmunización

1. Obtención de antisueros (anticuerpos policlonales)

Uso como reactivo experimental o diagnóstico En terapia, antisueros antitetánicos,antidiftéricos.

• VENTAJAS: rápido y de bajo coste

• INCONVENIENTES: Reproducibilidad limitada, cantidad limitada de Ab.Extraemos sangre y obtenemos suero

del animal inmunizado

Inyección en la dermis produce una inmunización optima

¿Cuáles son los problemas de este reactivo?Contiene una mezcla policlonal de anticuerpos frente al antígenoLa cantidad es limitadaNo es reproducible

+ adyuvante

Los adyuvantes potencian la respuesta frente a los antígenos a los que acompañan.

El Adyuvante secuestra el material antigénico y forma partículas que lo llevan a los fagocitos a los que estimula para que inicien la activación de células T antígeno-específicas.

Se mezcla 1. solución acuosa con antígeno proteico con 2 un agente que incorpora el antígeno en micropartículas fagocitables:

◦ Emulsión de aceite mineral (Freund)◦ Partículas de gel de hidróxido de aluminio◦ Soluciones coloidales ISCOM

Se incorporan componentes bacterianos que estimulan al macrófago (receptores PAMP) para que presente antígeno y coestimule a los linfocitos T que lo reconozcan. Estos cooperarán con células B productoras de anticuerpos específicos

Adyuvantes

Los carriers (transportadores) son sustancias a las que unimos químicamente la molécula antigénica para que sea más inmunogénica.

Llamamos hapteno a una pequeña molécula que sólo puede provocar la respuesta inmune cuando esta unida a otra mayor como una proteína ej. Hemocianina de moluscos (KLH).

Debe preservarse la estructura tridimensional de la molécula pequeña.

De esta manera podemos inducir anticuerpos específicos frente a una molécula pequeña.

Una vez formados son capaces de unirse a ella cuando esta sola

¿Para qué puede servir? Test and therapy Breaking bad habits and aditions

Carrierscocaine

Adyuvante de Freund

Calmette y Guerin desarrollaron una cepa atenuada mediante cultivo in vitro de M. bovis llamada Baccillus CalmetteGuerin (BCG) que se usa como adyuvante en inmunización y como vacuna frente a la tuberculosis.

Los Glicolípidos de Mycobaterium son reconocidos por el SI innato y el Mycobacterium es un buen adyuvante en inmunización (Adyuvante completo de Freund aceite/agua + BCG)

Para preparar el adyuvante completo de Freund se añade BCG al aceite mineral (parafina)

Protocolo de inmunización

Generador de emulsiones

primero dosis inicial sensibilización con adyuvante completo (CFA),

después dosis de recuerdo con adyuvante incompleto (IFA sin BCG) para evitar producir una reacción de hipersensibilidad

Su uso como adyuvante esta prohibido en humanos por las autoridades reguladoras pues produce efectos tóxicos (DHT).

Micobacteria microareófila principal causante de la tuberculosis bovina. Relacionada con Mycobacterium tuberculosis, puede llegar a causar tuberculosis en humanos, principalmente por el consumo de leche sin pasteurizar.

Con cepas atenuadas de esta bacteria (BCG) se elabora la vacuna de la tuberculosis, la cual fue

elaborada por primera vez en 1921 en el Instituto

Pasteur.

Bacilo de Calmette-GuérinMycobacterium bovis / BCG

Es eficaz para prevenir infecciones fatales en niños, pero no previene la tuberculosis pulmonar en adultos

Vacuna actual (BCG vaccine) Cepa atenuada de M. bovis llamada Baccillus

Calmette-Guerin (BCG) que es utilizada como una vacuna viable:

◦ Previene la tuberculosis miliar en niños, diseminación mortal que produce innumerables nódulos en pulmones y otros tejidos (por diseminación hematógena). Bajó la mortalidad por tuberculosis en niños desde 25% al 1,8%

◦ Problema: Sin embargo, no protege de modo completo contra la tuberculosis pulmonar en los adultos

◦ BCG tiene muchas diferencias antigénicas con la M. tuberculosi (perdida de 100 genes 2,5% genoma). Le falta proteína de virulencia ESAT-6

◦ La inmunidad cruzada que proporciona es imcompleta

1. Vacunas vivas ◦ A partir de M. tuberculosi atenuados a los que se les

han desactivado genes de virulencia◦ A partir de M. bovis recombinantes al que se le

añaden genes perdidos de la cepa original 2. Vacunas de subunidades

◦ Antígenos seleccionados y adyuvantes◦ Introducción de genes en un virus atenuado

Se están desarrollando vacunas preventivas que puedan proteger con mayor eficacia frente a la tuberculosis pulmonar

Modelo experimental de artritis

Inyección de CFA con colágeno

También puede inducirse con Ab anti colágeno

CIA (collagen induced arthritis)

En este modelo podemos testar el efecto de posibles tratamientos para reducir la inflamación articular

Emulsiones y geles de aluminio

Adyuvantes para inmunización

AddaVax™ Squalene-Oil-in-water  Th1/Th2 response balanced

Alhydrogel® adjuvant 2% ALUM

Gel de hidróxido de aluminio respuesta de anticuerposAluminium hydroxide gel Th2 Response

CFA

Complete Freund’s Adjuvant paraffin oil in water Mycobacterium Ligandos para TLR2 TLR4 TLR9 y trehalose dimycolate that stimulates Mincle R (Macrophague inducible C-lectin Receptor) reconoce azucares bacterianosTh1 response IFNg IgG Mf first immunization (DTH)

IFA Incomplete Freund's adjuvant Th2 response recall

Quil-A® adjuvant

Saponin vaccine adjuvant. Combined with cholesterol and phospholipids to form ISCOMs (immunstimulatory complexes), can activate both the cell‑mediated and the antibody-mediated immune responses Induce anticuerpos Timoindependientes y timodependientes

Ligandos que estimulan receptores de reconocimiento de patrones (PRR)3’3’-cGAMP VacciGrade™ Dinucleotido ciclico segndo mensajero bacteriano

STING (STimulator of Interferon Genes ) ligand - Cyclic [G(3’,5’)pA(3’,5’)p]2’3’-cGAMP VacciGrade™ STING ligand - Cyclic [G(2’,5’)pA(3’,5’)p]2’2’-cGAMP VacciGrade™ STING ligand - Cyclic [G(2’,5’)pA(2’,5’)p]c-di-AMP VacciGrade™ STING ligand - CDS agonist - Cyclic diadenylate monophosphate Th1 / Th2

responsec-di-GMP VacciGrade™ STING ligand - CDS agonist - Cyclic diguanylate monophosphate Th1 / Th2

responseChitosan VacciGrade™ NLRP3 inflammasome inducer - Deacetylated derivative of chitin Th1/Th2

responseFlagellin FliC VacciGrade™ TLR5 Agonist - Recombinant flagellin Th1/Th2 response

Gardiquimod VacciGrade™ TLR7 agonist - Imidazoquinoline compound Th1 responseImiquimod VacciGrade™ TLR7 agonist - Imidazoquinoline compound Th1 responseLPS-EB VacciGrade™ Lipopolysaccharide from E. coli 0111:B4 strain - TLR4-based adjuvantMPLA-SM VacciGrade™ TLR4 agonist - Monophosphoryl lipid A Th1 response

MPLA Synthetic VacciGrade™ TLR4 agonist - Synthetic monophosphoryl lipid A Th1 response

N-Glycolyl-MDP VacciGrade™ NOD2 Agonist - N-glycolylated muramyldipeptide Th1 response

ODN 1585 VacciGrade™ TLR9 agonist - CpG ODN, class A  (murine) Th1 responseODN 1826 VacciGrade™ TLR9 agonist - CpG ODN, class B (murine) Th1 responseODN 2006 Vaccigrade™ TLR9 agonist - CpG ODN, class B (human)  Th1 responseODN 2395 VacciGrade™ TLR9 agonist - CpG ODN, class C (human/mouse) Th1 responsePam3CSK4 VacciGrade™ TLR1/2 agonist - Synthetic triacylated lipoprotein Th1 response

Poly(I:C) (HMW) VacciGrade™ TLR3 agonist - Polyinosine-polycytidylic acid Th1 response

R848 VacciGrade™ TLR7/8 agonist - Imidazoquinoline compound Th1 responseTDB VacciGrade™ Mincle agonist - Synthetic analog of the cord factor  Th1 responseTDB-HS15 VacciGrade™ Mincle agonist - Synthetic analog of the cord factor (trehalose dimycolate)

formulated with HS15 Th1 response

Anticuerpos monoclonales

Clonamos y seleccionamos

G Kohler

C Milstein1. 2.

3.

Síntesis de anticuerpos monoclonalesKohler G. Y Milstein C. (Nature, 1975).

- PROTEÍNA- PLÁSMIDO- CÉLULAS

Inmunización-3/4 inóculos Ag-ADYUVANTES Y CARRIERS.

CEPA: BALB/c, Y3

- CLONACIÓN 1DILUCIÓN2 AGAR3Sorting

Esplenocito resistente a HATAporta enzima HXGPRT

Inmortalizadas pero deficientes en enzima HXGPRTSensibles a HATAportan telomerasas que regeneran los telómeros de los cromosomas de las células híbridas

Hibridoma histocompatible

Medio selectivo HATHipoxantinaAminopterinaTimidina

Híbridos

HGPRT- HGPRT-/HGPRT+ HGPRT+

Comprueban que el fármaco es seguro para su uso en humanos

Comprueban sus efectos beneficiosos sobre la evolución de la enfermedad.

Estudios de seguridad y eficacia clínica