CUANTIFICACION DE CUANTIFICACION DE METABOLITOS METABOLITOS

VEGETALESVEGETALES

Fisiología vegetal:Fisiología vegetal: Romina ContrerasRomina Contreras Paula Coroseo Paula Coroseo Carla floresCarla flores Verónica Pantoja Verónica Pantoja

INTRODUCCIONINTRODUCCION

Existen muchos cambios metabólicos Existen muchos cambios metabólicos experimentados por los vegetales producidos experimentados por los vegetales producidos por condiciones ambientales extremas , que por condiciones ambientales extremas , que afectan los contenidos foliares de clorofila , afectan los contenidos foliares de clorofila , proteínas y aminoácidos ,por lo que estos son proteínas y aminoácidos ,por lo que estos son buenos indicadores del estado fisiológico de buenos indicadores del estado fisiológico de las plantas , utilizando diferentes métodos las plantas , utilizando diferentes métodos para cuantificar proteínas y clorofila y ver la para cuantificar proteínas y clorofila y ver la tolerancia al stress de cada muestra a estudiar.tolerancia al stress de cada muestra a estudiar.

Cuantificación de proteínas :Cuantificación de proteínas :

1-Método de Bradford1-Método de Bradford

Consiste en la formación de un compuesto de Consiste en la formación de un compuesto de adsorción de coloración azul entre los residuos de adsorción de coloración azul entre los residuos de aminoácidos básicos de las proteínas y el colorante aminoácidos básicos de las proteínas y el colorante Azul de Comassie. Azul de Comassie.

Absorbe luz a 595 nm.Absorbe luz a 595 nm. La intensidad de absorción depende del contenido La intensidad de absorción depende del contenido

de aminoácidos básicos y aromáticosde aminoácidos básicos y aromáticos

2-Método de Lowry 2-Método de Lowry Para aumentar la sensibilidad de la reacción Para aumentar la sensibilidad de la reacción

del biuret, el complejo proteína-Cu2+ se hace del biuret, el complejo proteína-Cu2+ se hace reaccionar con el reactivo de Folin-Ciocalteus,reaccionar con el reactivo de Folin-Ciocalteus,

Da una coloración azul, donde la intensidad Da una coloración azul, donde la intensidad varía con la composición de aminoácidos de la varía con la composición de aminoácidos de la proteína proteína

Con un máximo de absorción a 650 nm Con un máximo de absorción a 650 nm Presenta muchas interferencias Presenta muchas interferencias

Cuantificación dé clorofilaCuantificación dé clorofila

Desde el punto de vista cuantitativo, la Desde el punto de vista cuantitativo, la clorofilaclorofila es el es el pigmento más importante en las plantas superiores , pigmento más importante en las plantas superiores , se encuentra en las membranas tilacoidales de los se encuentra en las membranas tilacoidales de los cloroplastos y es responsable de la captación de luz cloroplastos y es responsable de la captación de luz en la fotosíntesis. en la fotosíntesis.

Esta en su estructura un anillo tetrapirrolico que es Esta en su estructura un anillo tetrapirrolico que es responsable de la absorción de la luz en la zona azul y responsable de la absorción de la luz en la zona azul y roja del espectro, por lo que los tejidos donde este roja del espectro, por lo que los tejidos donde este pigmento es muy abundante son de color verde.pigmento es muy abundante son de color verde.

Materiales Materiales Vegetales :hojas de mangoVegetales :hojas de mango MorteroMortero Tubo eppendorfTubo eppendorf EspátulaEspátulaQuímicos :Químicos : Pvp (metilfelinsulfonilfluorido)Pvp (metilfelinsulfonilfluorido) Reactivo de BradfordReactivo de Bradford Solución de albúmina Solución de albúmina Acetona al 100 %Acetona al 100 % InstrumentosInstrumentos espectrofotómetro espectrofotómetro centrifugacentrifuga

METODOSMETODOSPara la cuantificación de proteínas de utilizo el Para la cuantificación de proteínas de utilizo el

método de Bradfort , realizando los método de Bradfort , realizando los siguientes pasos:siguientes pasos:

macerar el vegetal fresco (mango )macerar el vegetal fresco (mango ) Al material se le agrega 1 ml de tampón de Al material se le agrega 1 ml de tampón de

extracción y una espátula de PVPextracción y una espátula de PVP Transferir el material a un tubo eppendorf Transferir el material a un tubo eppendorf Centrifugar Centrifugar

Para la cuantificación de clorofila se realizaron Para la cuantificación de clorofila se realizaron los siguientes pasoslos siguientes pasos

Pesar las muestrasPesar las muestras Macerar la muestra en 3ml de acetonaMacerar la muestra en 3ml de acetona Vaciar el contenido a un eppendorf c/ AlusaVaciar el contenido a un eppendorf c/ Alusa Centrifugar 15 min. a 3000 rpm.Centrifugar 15 min. a 3000 rpm. Sobrenadante se vacía en otro eppendorf, Sobrenadante se vacía en otro eppendorf,

desechando el precipitado.desechando el precipitado. Se lleva a EspectofotrometroSe lleva a Espectofotrometro

Curva de calibradoCurva de calibrado

y = 0,0196x + 0,1432R 2 = 0,9305

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

0 20 40 60 80

S erie1

L ineal (S erie1)

Albumina 0.25 mg/ml

Absor-bancia

(μL)

0 0

5 0,169

10 0,432

20 0,704

40 0,981

60 1,214

Abs.

albúmina

Resultados curva de calibrado Resultados curva de calibrado

Cuadro de resultados de absorbancia de la proteína a 595 nmCuadro de resultados de absorbancia de la proteína a 595 nm

..

Tubo Albumina0.25 mg/ml

Agua

μL

Reactivo de Bradford

(ml)

Concentración de

proteína μL/ml

Absorbancia

(μL) μg/ ml

1 0 100 900 -7,3 0

2 5 95 900 1,3 0,169

3 10 90 900 14,7 0,432

4 20 80 900 28,6 0,704

5 40 60 900 42,7 0,981

6 60 40 900 54,6 1,214

Concentración de Proteínas

muestra PF

(gr.)

área círculos (cm2)

ABS 595 nm

Concentración proteínas

(ug/ml)

Concentración proteínas (ug/g

PF)

Concentración proteina (ug/cm2)

Mango 0,3197 0,2800 0,58 22,28571429 69,70820859 79,59183673

Cuadro de resultados e absorbancia de clorofila a Cuadro de resultados e absorbancia de clorofila a

470 , 645, 662 y 750 nm :470 , 645, 662 y 750 nm :

longitud mango blanco

de onda    

750 nm0.012

0

645 nm 0,539 0

662 nm 1.283 0

470 nm 1.16 0

Factor de corrección de la clorofilaFactor de corrección de la clorofila

C = F ( absorbancia 750 nm -0.002 )C = F ( absorbancia 750 nm -0.002 ) donde F= 1 para 645nm y 662nmdonde F= 1 para 645nm y 662nm F=2 para 470 nmF=2 para 470 nm

Absorbancia : 645 c = 1(0.012-0.002) = 0.01Absorbancia : 645 c = 1(0.012-0.002) = 0.01 0.539(Abs. 645) – c0.539(Abs. 645) – c 0.539 - 0.01 = 0.529 * Absorbancia corregida de 0.539 - 0.01 = 0.529 * Absorbancia corregida de

645nm*645nm*

Absorbancia : 662nm c = 1 (0.012 – 0.002) = 0.01Absorbancia : 662nm c = 1 (0.012 – 0.002) = 0.01 1.283(Abs.662) – c1.283(Abs.662) – c 1.283 - 0.01 = 1.273 *Absorbancia corregida de 662nm*1.283 - 0.01 = 1.273 *Absorbancia corregida de 662nm*

Absorbancia : 470nm c = 2 (0.012 -0.002) =0.02Absorbancia : 470nm c = 2 (0.012 -0.002) =0.02 1.116(Abs470) – c1.116(Abs470) – c 1.116 - 0.02 = 1.096 *Absorbancia corregida de 470nm*1.116 - 0.02 = 1.096 *Absorbancia corregida de 470nm*

Clorofila a, b y carotenoides

Clorofila a Mas abundante

Verde oscuro o azulado

Clorofila b Menos abundante

Color verde amarillento

Carotenoides: Menos abundante que la clorofila (a y b)

Color: rojo, anaranjado y amarillo

Clorofila a (Clorofila a (µg/ml)µg/ml) = 11.24 X Abs.(662nm) – 2.04 X Abs(645nm) = 11.24 X Abs.(662nm) – 2.04 X Abs(645nm)

= (11.24 X 1.273) – (2.04 X 0.529)= (11.24 X 1.273) – (2.04 X 0.529) = 14.3 - 1.07 = 13.23/3= 14.3 - 1.07 = 13.23/3 = 4.41( µg/ml) Cantidad de clorofila que hay en = 4.41( µg/ml) Cantidad de clorofila que hay en

cada circulo.cada circulo.

Clorofila b (µg/ml)Clorofila b (µg/ml) = 20.13 X Abs(645nm) – 4.19 X Abs(662nm) = 20.13 X Abs(645nm) – 4.19 X Abs(662nm)

= (20.13X 0.529) – (4.19 X 1.273)= (20.13X 0.529) – (4.19 X 1.273) = 10.65 - 5.3 = 10.65 - 5.3 = 5.3 µg/ml Cantidad de clorofila que hay en cada = 5.3 µg/ml Cantidad de clorofila que hay en cada

circulo.circulo.

Determinacion de los contenidos de clorofila Determinacion de los contenidos de clorofila A y BA y B

4.41( µg/ml4.41( µg/ml

5.3 µg/ml5.3 µg/ml

Carotenoides (Carotenoides (µg/ml)=µg/ml)= 1000X Abs(470nm) – 1.90 Cl. a- 63.14Cl b 1000X Abs(470nm) – 1.90 Cl. a- 63.14Cl b 214214

= ((1000 X 1.096) - (1.90 X 4.41) –(63.14 X 5.3))= ((1000 X 1.096) - (1.90 X 4.41) –(63.14 X 5.3))214214

( 1096 - 8.4 - 334.6 )( 1096 - 8.4 - 334.6 )

214214Carotenoides Carotenoides = 753 = 3.52 µg /ml = 753 = 3.52 µg /ml

214214

Determinación del contenido de Determinación del contenido de CarotenoidesCarotenoides

ConclusionesConclusiones

Cuantificación de la proteína:Cuantificación de la proteína:

muestra PF (gr)

area circulos (cm2)

ABS 595 nm

Concentracion proteinas

(ug/ml)

Concentracion proteinas (ug/g

PF)

Concentarcion proteina (ug/cm2)

Mango 0,3197 0,2800 0,58 22,28571429 69,70820859 79,59183673

Palto 0,3105 0,2800 0,385 12,33673469 39,73183476 44,05976676

Maracuya 0,274 0,2800 0,962 41,7755102 152,4653657 149,1982507

Cuantificación de la clorofila: 4.41( µg/ml): Cantidad de clorofila A de4.41( µg/ml): Cantidad de clorofila A de

cada circulo.cada circulo. 5.3 µg/ml : Cantidad de clorofila B de cada 5.3 µg/ml : Cantidad de clorofila B de cada

circulo.circulo. Carotenoides = 3.52 µg /mlCarotenoides = 3.52 µg /ml