Ingeniería de anticuerpos

Ingeniería de Anticuerpos Inmunogenética, tema 4.

Daniel Pérez-Witzke, MSc

Laboratorio de Patología celular y molecular,

Centro de Medicina Experimental, IVIC

Inmortalización de células productoras de anticuerpos

Producción de anticuerpos: tecnología de hibridomas

von Behring y Kitasato antisueros, 1890Köhler y Milstein MoAb, 1975

Importante: calidad, integridad y plegamiento del Ag

Péptidos sintéticosProteínas purificadas

CélulasCélulas transfectadas

P3X63Ag8.653ATCC

PEG-1500

Producción de anticuerpos: Transformación con EBV

Biología de la producción de anticuerpos

IGH locus 14q32.33 (1250kb)

82-88 (123-129) genes

7 subgrupos c/u 27 genes

6 genes

9 genes

Repertorio: 77-84 (170-176) genes

IGK locus 2p12 (1820 kb) IGL locus 22p11.2 (1050 kb)

35 (76) 29-32 (70-71) genes

5 4-5 (11) genes

1 4-5 ( 7-11) genes

Dis

tal c

lust

er4

00

kb 3

6 g

enes

Pro

xim

al c

lust

er6

00

kb 4

0 g

enes

IGK IGL

Recombinación VDJ – DJ (Edición Lambda-Kappa)

Hipermutación somática (maduración de la afinidad)

UNSWIg germ line repertoirehttp://www.ihmmune.unsw.edu.au/unswig.php

Inmortalización de Genes de Ig

Anticuerpos recombinantes:

Evolución in vitro

¿Cómo obtener proteínas?

1. Fuente orgánica original: células, tejidos, órganos

2. Técnicas del ADN recombinante

Células expresan proteínas

Extracción ARNm

RT-PCR= ADNc

PCRamplificación gen!

Clonación: Vectores – B. competentes

Expresión en sistemas biológicos

Producción a gran escala [Bioreactor]

Consumo Humano

Elaboración de Anticuerpos recombinantes y proteínas de fusión

Diseño

Construcción y transfección

Producción a escala de laboratorio

Purificación

Caracterización estructural

Caracterización funcional

DiseñoTipos de anticuerpos recombinantes

Clases e isotipos de Ig (humanas)

DVD-Ig

Péptidos de unión (linkers)

Modificaciones en Fc



Banco de datos en línea

• Protein Data Bank-RSCB http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do

RCSB PDB - Query Results.pdf

RCSB Protein Data Bank - RCSB PDB - 4L4J Structure Summary.pdf

• Uniprot www.uniprot.org

Ig gamma-2 chain C region - Homo sapiens (Human).pdf

• The European Bioinformatics Institute (EMBl-EBI) http://www.ebi.ac.uk/

http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do

RCSB PDB - Query Results.pdf

RCSB Protein Data Bank - RCSB PDB - 4L4J Structure Summary.pdf

http://www.uniprot.org/

Ig gamma-2 chain C region - Homo sapiens (Human).pdf

http://www.ebi.ac.uk/


Diseño



Purificación



Anticuerpos terapéuticos

Mutagénesis sitio dirigida

SOEing

Phage display

PCR (convencional)

Abatacept (CTLA4-Fcγ1): Artritis Reumatoide (pacientes refractarios)

Etanercept (TNFR-Fcγ1): Artritis Reumatoide, artritis psoriatica, psoriasis “plaque”, artritis reumatoide poliarticular juvenil.

Belatacept (CTLA4-Fcγ1): Lupus E.S. (pacientes refractarios)

Insulinas recombinantes:(Diabetes mellitus)

1. Insulin aspart2. Insulin glulisine3. Insulin lispro

Rituximab (αCD20 MoAb): Linfomas B

Herceptin (αHER2 MoAb): Cáncer de mama (adenocarcinoma)

Cetuximab (αEGFR MoAb): Cáncer colorectal, cáncer de cabeza y cuello

Humulin (insulina recombinante): diabetes

Aldesleukin (rIL-2): cáncer renal metastásico, melanoma

Eritropoyetina (rEPO): anemia crónica, mileodisplasia, anemia causada por falla renal o el uso de quimioterapia, preparación preoperatoria

Filgrastim (rG-CSF): neutropenia en SIDA, neutropenia en post-trasplante de médula ósea y post-quimioterapia, neutropenia crónica severa

Oprelvekin (rIL-11): prevención de trombocitopenia severa especialmente antes de recibir quimioterapia

Genotecas de anticuerpos

Selección de la especificidad

Maduración de la afinidad in vitro

Producción en CHO DHFR-/-


Diseño



Purificación



Paso 1 Descongelación

T-25 T-75 T-150

Paso 2 cultivo

estacionario

Paso 3 Botella rodante

Producción

Paso 2 Spinner 250 ml

Paso 3 Expansión 500ml – 1lt

Paso 4:Cosechar Sobrenadante

Monitoreo Producción

ELISA


Diseño



Purificación



Paso 1. Cromatografía

Paso 3 Diálisis en PBS

Paso 2 recolección fracciones

Lecturas 260/280nm

Paso 4 Determinación concentración

Purificación

Fracción

(dilución)μg/ml Abs280nm

E1 2.14

(1:225) 30,776

E2 1.176

(1:200) 60,855

E3 0.155

(1:225) 27,176

E4 0.042

(1:25) 10,32


Diseño



Purificación



CAR T cells

Fin

Literatura

• Fuenmayor J, Perez-Vazquez K, Perez-Witzke D, Penichet ML, Montano RF. (2010). Decreasedsurvival of human breast cancer cells expressing HER2/neu on in vitro incubation with an anti-HER2/neu antibody fused to C5a or C5a desArg. Mol Cancer Ther. 9(8): 2175

• Fields C, et. Al. (2013). Creation of recombinant antigen-binding molecules derived fromhybridomas secreting specific antibodies. Nature Protocols 8(6): 1125

• Presta L. (2008). Molecular engineering and design of therapeutic antibodies. Current Opinion inImmunology 20: 460

• Wu C, et. Atl. (2007). Simultaneous targeting of multiple disease mediators by a dual-variable-domain immunoglobulin. Nature Biotechnology 25(11): 1290

• Almagro J, Fransson J. (2008). Humanization of Antibodies. Frontiers in Bioscience 13: 1619• Kito M, et. At. (2002). Construction of engineered CHO strains for high-level production of

recombinant proteins. Appl Microbiol Biotechnol 60:442

• Hennie Hoogenboom (2005). Selecting and screening recombinant antibody libraries. NatureBiotechnology 23(9): 1105

• Gabriele Proetzel, Hilmar Ebersbach. Methods in Molecular Biology: Antibody Methods and Protocols. © Springer Science+Business Media (2012)

Technology

Ingeniería de anticuerpos