- 1. UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS MICROSCOPIA y
Tcnicas Microscpicas Semestre Acadmico - 2011 PROFESOR: Segundo
T.Caldern Pinillos Bilogo-Maestra en Fisiologa Humana UNMSM-FMH San
Fernando FACULTAD DE MEDICINA SAN FERNANDO DPTO. DE CIENCIAS
DINAMICAS Escuela Acadmico Profesional deTecnologa Mdica BIOLOGIA
CELULAR Y MOLECULAR
2. ESTUDIOGENERAL DE LA CELULAMTODOS DE ESTUDIO DE LA CLULA Y
LOS TEJIDOS
- I. Tcnicas preparatorias utilizadas en microscopa ptica.
- La correcta observacin del material biolgico con el microscopio
ptico requiere una serie de procesos previos que, son los
siguientes:
- 1. Fijacin. Las clulas de los rganos y tejidos mueren y se
descomponen cuando son extradas de su medio sino se las mantiene en
condiciones especiales.
- El proceso de fijacin no evita la muerte celular, pero preserva
de la descomposicin manteniendo la estructura morfolgica.
- Entre los muchos lquidos fijadores utilizados, como el alcohol
y el cido actico, el formaldehdo o formol es el ms habitual.
3.
- Los organismos unicelulares y las clulas aisladas pueden
observarse con facilidad al microscopio, los rganos y tejidos, son
demasiado gruesos para que sean traspasados por la luz; de ah que
se necesite cortarlos en finas lminas.
- Para ello se utiliza un aparato, llamado microtomo, que permite
la realizacin de cortes de tan slo algunas micras de espesor.
4.
- El material biolgico resulta de ordinario extremadamente blando
para poder efectuar los cortes; por ello, a la fijacin sigue un
proceso de endurecimiento del material y su inclusin en una
sustancia plstica, generalmente parafina o resina.
- Una alternativa rpida a la inclusin, aunque con resultados de
menor calidad, es congelar el tejido y realizar los cortes en un
microtomo especial para esta finalidad (criotomo).
5.
- 3. Tincin. Una dificultad en la observacin microscpica es el
escaso contraste que presenta el material biolgico, debido a su
alto contenido en agua.
- Para mejorar el contraste se utilizan las tinciones, que
permiten colorear artificialmente los distintos componentes
tisulares. Son muchos y variados los colorantes empleados.
- La tincin ms usada esHEMATOXILINAyEOSINA , otros colorantes son
combinacionesTRICROMICAS ,TETRACROMICAS , coloraciones PAS para la
demostracin de hidratos de carbono, etc.
6. LA LUZ
- Es una forma de energa que se propaga en lnea recta y en forma
de ondas.
- La distancia entre los mximos o mnimos de las ondas que
describen es la medida del a que determina del color.
- La altura por encima o por debajo del eje da la medida de la
amplitud que viene a ser la intensidad.
- Interferencia: Cuandodos ondas o rayos se encuentran en un
punto, pueden producir diferentes resultados, segn lleguenfasadas o
desfasadas.
7. II) TECNICAS DE MICROSCOPA
- A) El microscopio ptico de campo claro
- Caractersticas. Bsicamente, el microscopio ptico compuesto es
un tubo provisto de lentes (una en cada extremo) que amplan
sucesivamente la imagen del objeto (preparacin histolgica), el cual
est intensamente iluminado.
8.
- Se encuentra prxima al objeto y se denominalente objetivo;la
otra lente se sita junto al ojo del observador, en cuya retina se
forma la segunda imagen aumentada, y recibe el nombre delente
ocular.
- Este esquema simple inicial se perfecciona aadiendolentes
intermediasy otros dispositivos, como elcondensador,que concentra
la luz emitida por la fuente luminosa sobre el objetivo,
dispositivos para aumentar el contraste, etc.
9. MICROSCOPIA DE CAMPO CLARO
- El objeto recibe luz desde abajo por una superficie
uniformemente iluminada, la cual es concentrada por el objetivo en
el plano imagen de la fuente luminosa.
- Parte de la luz procedente de la superficie iluminado es
dispersada y reflejada por el objeto, actuando este como una fuente
de luz secundaria.
- Esta luz del objeto es concentrada por el objetivo en el plano
imagen del objeto situado por encima del plano imagen de a fuente
luminosa.
- Cuando estos planos imagen se observan por el ocular , el
objeto se ve contra un fondo claro. Si el objeto es transparente no
seren el fondo cloro
10. 11.
- OCULAR : Lente situada cerca del ojo del observador. Ampla la
imagen del objetivo.
- OBJETIVO : Lente situada cerca de la preparacin. Ampla la
imagen de sta.
- CONDENSADOR : Lente que concentra los rayos luminosos sobre la
preparacin.
- DIAFRAGMA : Regula la cantidad de luz que entra en el
condensador.
- FOCO : Dirige los rayos luminosos hacia el condensador
12.
- SOPORTE : Mantiene la parte ptica. Tiene dos partes: el pie o
base y el brazo.
- PLATINA : Lugar donde se deposita la preparacin.
- CABEZAL : Contiene los sistemas de lentes oculares. Puede ser
monocular, binocular.
- REVLVER : Contiene los sistemas de lentes objetivos. Permite,
al girar, cambiar los objetivos.
- TORNILLOS DE ENFOQUE : Macromtrico que aproxima el enfoque y
micromtrico que consigue el enfoque correcto.
13.
- Colocar el objetivo de menor aumento en posicin de empleo y
bajar la platina completamente. Si el microscopio se recogi
correctamente en el uso anterior, ya debera estar en esas
condiciones.
- Colocar la preparacin sobre la platina sujetndola con las
pinzas metlicas.
- Comenzar la observacin con el objetivo de 4x (ya est en
posicin) o colocar el de 10 aumentos (10x) si la preparacin es de
bacterias.
MANEJO Y USO DEL MICROSCOPIO PTICO 14.
- Para realizar el enfoque:
- Acercar al mximo la lente del objetivo a la preparacin,
empleando el tornillo macromtrico.
- Esto debe hacerse mirando directamente y no a travs del ocular,
ya que se corre el riesgo de incrustar el objetivo en la preparacin
pudindose daar alguno de ellos o ambos.
- Mirando, ahora s, a travs de los oculares, ir separando
lentamente el objetivo de la preparacin con el macromtrico y,
cuando se observe algo ntida la muestra, girar el micromtrico hasta
obtener un enfoque fino.
15.
- Pasar al siguiente objetivo. La imagen debera estar ya casi
enfocada y suele ser suficiente con mover un poco el micromtrico
para lograr el enfoque fino.
- Si al cambiar de objetivo se perdi por completo la imagen, es
preferible volver a enfocar con el objetivo anterior y repetir la
operacin desde el paso 3.
- El objetivo de 40x enfoca a muy poca distancia de la preparacin
y por ello es fcil que ocurran dos tipos de percances: incrustarlo
en la preparacin si se descuidan las precauciones anteriores y
mancharlo con aceite de inmersin si se observa una preparacin que
ya se enfoc con el objetivo de inmersin.
16.
- Lo importante del microscopio no son los aumentos en s mismos,
sino elpoder de resolucin.
- Este se define corno la capacidad de distinguir como imgenes
distintas dos cercanas.
- El poder de resolucin se mide utilizando como unidad la inversa
dellmite de resolucin(poder de resolucin = 1/lmite de
resolucin).
- El lmite de resolucin se define corno la distancia mnima entre
dos puntos para que puedan distinguirse como tales. Se calcula por
la frmula de Abbe:
Lmite de resolucin = = 0.61 x longitud de onda/apertura numrica
17.
- Lalongitud de ondadepender de la luz empleada; si se usa luz
natural blanca, la longitud de onda es 550 nm.
- Laapertura numricaes igual a:nxseno ;siendonel ndice de
refraccin (cambio en la velocidad de la luz difractada) del medio
situado entre el objeto y la lente, yel ngulo de semiapertura de la
lente.
- Si el medio es aire,n =1. Si se utiliza aceite de inmersin.n
=1.51.
- El valor de seno a es siempre menor que uno (0.93 como mximo
.en los microscopios actuales). En estas condiciones:
Lmite de resolucin = 0.61 x 550/(1.51 x 0.93) = = 335.5/1.4 =
240 nm 18.
- Si se tiene en cuenta que el lmite de resolucin del ojo humano
es 0.23 nm, con la utilizacin del microscopio ptico se ha
multiplicado unas 1000 veces su capacidad de resolucin
- Este lmite de resolucin obtenido con el microscopio de luz es
muy difcil de mejorar.
- Los aumentos finales se obtienen multiplicando los del objetivo
por los del ocular.
- Hay que tener en cuenta que la resolucin de la imagen es la del
objetivo, puesto que el ocular no ampla el poder de resolucin.
- Sin embargo, el ocular es muy til, porque con slo el objetivo
quedara la imagen demasiado pequea.
19.
- MANTENIMIENTO Y PRECAUCIONES
- Al finalizar el trabajo, hay que dejar puesto el objetivo de
menor aumento en posicin de observacin, asegurarse de que la parte
mecnica de la platina no sobresale del borde de la misma y dejarlo
cubierto con su funda.
- Cuando no se est utilizando el microscopio, hay que mantenerlo
cubierto con su funda para evitar que se ensucien y daen las
lentes. Si no se va a usar de forma prolongada, se debe guardar en
su caja dentro de un armario para protegerlo del polvo.
- Nunca hay que tocar las lentes con las manos. Si se ensucian,
limpiarlas muy suavemente con un papel de filtro o, mejor, con un
papel de ptica.
- No dejar el portaobjetos puesto sobre la platina si no se est
utilizando el microscopio.
20.
- B) Medios de aumentar el contraste en diversas modalidades de
microscopa ptica.
- Para estudiar el material vivo, en el que no pueden aplicarse
las tinciones convencionales pues las clulas mueren en la fijacin,
se emplea el microscopio decontraste de fases.
- C) El microscopio deinterferencia
- Se basa en principios similares, pero tiene la ventaja de
proporcionar resultados cuantitativos. Con este microscopio se
pueden determinar cambios en el ndice de refraccin, y las
variaciones de fase se pueden reflejar en cambios de color tan
acentuados que una clula viviente es capaz de aparecer
coloreada.
21.
- D) Otro microscopioutilizado es el depolarizacin.Se basa en la
propiedad de ciertas sustancias ( anistropas ) que tienen un
distinto ndice de refraccin segn la direccin que se considere. Las
sustancias que siempre mantienen el ndice de refraccin se llaman
istropas.
- E) Otro microscopio ,denominadocitofotomtrico,se basa en el
hecho de que diversos componentes celulares absorben especficamente
determinadas bandas de luz.
- As, mientras que los cidos nucledos absorben la banda de 260 nm
(ultravioleta), las protenas absorben la de 280 nm.
22.
- Asimismo, algunas reacciones histoqumicas dan bandas de
absorcin especficas en el espectro visible y pueden analizarse
cuantitativamente con estos microscopios.
- As, mientras la citofotometra con luz ultravioleta permite
detectar los cidos nucledos (DNA y RNA) sin distinguir entre ambos,
si se realizan tinciones especficas para el DNA (como la reaccin
deFeulgen),el microscopio citofotomtrico puede cuantifiar el
contenido en DNA, sin confundirlo con el de RNA.
23. MICROSCOPIO DE LUZ POLARIZADA
- Luz Polarizada : La luz es una forma de energa que se transmite
en en lnea recta , pero formando ondas en ngulo recto con la
direccin de transmisin. Vibra en todos los planos simultneamente,
esta es la luz normal o no polarizada.
- Luz polarizada: Luz que vibra en un solo plano la que al pasar
por un polaroide con barras y ranuras paralelas , que se interponen
en el eje de transmisinde luz y que las ranuras estn verticales
entonces las ondas verticales pasarn a su travs pero las
horizontales no.
24. MICROSCOPIA DE FLUORESCENCIA
- Fluorescencia : caractersticas de ciertos cuerpos que cuando se
les ilumina o radia con luz de onda corta(ultravioleta) son capaces
de convertir la luz de onda corta que no es visible en otra de onda
larga visible. En la verdadera fluorescencia la visibilidad de la
luz dura solo mientras dura la radiacin. Fosforescencia dura despus
que se retira la fuente de rayos ultravioletas.
- Fluorescencia primaria : presentan fluorescencia natural.
Vegetales, minerales.
- Fluorescencia secundaria : Cuando los cuerpos generalmente
biolgicos presentan fluorescencia luego de haberles teido con
Fluorcromos.
25. MICROSCOPIA DE FLUORESCENCIA
- Microscopio de luz ultravioleta : solo puede utilizar lentes de
cuarzo.
- M. De fluorescencia : Dentro del gran espectro de rayos
ultravioletas sea aplican solo de gran mayores longitudes de unos
3500 , a los cuales los colorantes y sustancias fluorescentes son
muy activos.
- Que se necesita : Lmpara de mercurio de 250W, condensador de
lentes de cristal y reflector metlico.Filtro de absorcin para
eliminar el calor, para eliminar la luz visible, (Wood) o un filtro
de interferencia, produce un fondo negro.
26.
- F)Para el anlisis de clulas y tejidos con fluorescencia propia,
o que han sido tratados con colorantesfluorescentes( fluorocromos )
se utiliza el microscopio defluorescencia .La caracterstica
fundamental de este microscopio es la incorporacin de una lmpara:
que acta excitando el fluorocromo, y de un filtro especial, que
presenta altos valores de transmisin para las ondas emitidas por el
colorante fluorescente.
27.
- Estos microscopios son grandes y complejos. Utilizan electrones
en vez de luz y aumentan los objetos hasta 250.000 veces.
- Las imgenes que se producen son en blanco y negro y muchas
veces tienen colores falsos.
- El microscopio electrnico de barrido (MEB) sirve para examinar
la superficie de los objetos. Produce imgenes de gran aumento (ms
de cien mil veces) y muestra la forma real de los objetos.
- Adems de mostrar increbles figuras, el microscopio electrnico
investigador muestra detalles que pueden ser de vital importancia
para cientficos en muchas reas, como la medicina. Trabaja
examinando la superficie de un objeto con un delgado haz
electrnico.
Microscopios electrnicos : 28.
- El Microscopio Electrnico De Transmisin (MET)
- El microscopio electrnico de transmisin ( MET ) trabaja
iluminando , un ejemplar en la platina con un haz de electrones y
enfocando y aumentando la imagen con lentes magnticas.
- Esta imagen electrnica, que es invisible, se transforma en una
imagen normal, visible mediante una pantalla especial.
29.
- G) El microscopio electrnico de transmisin
- El microscopio electrnico supone un considerable aumento en el
poder de resolucin al emplear y cuya longitud de onda es unas l00
000 veces menor.
- Al ser de pequea longitud de onda pueden contornear muy bien
los objetos, lo que proporciona un gran poder de resolucin.
- Para desviar los electrones de un modo controlado, se utilizan
lentes que no son pticas sino electromagnticas.
- Unfilamento(ctodo) en un tubo de vidrio a alto vaco es
calentado emitiendo electrones que tienden a seguir una trayectoria
rectilnea, una lente electromagntica (que hace las veces
decondensador)los electrones son concentrados en el objeto.
30.
- Una segunda lente electromagntica funciona como
lenteobjetivo,dando una imagen ampliada del objeto.
- La tercera lente es elproyector,que acta de ocular, volviendo a
ampliar la imagen y proyectndola sobre una pantalla fluorescente o
sobre placas fotogrficas.
- Entre ambas lentes hay unalente intermedia,tambin
electromagntica, que ampla una vez ms la imagen.
- Igual que en el microscopio de luz, los aumentos del
microscopio electrnico se obtienen multiplicando los del objetivo,
lente intermedia y proyector.
31.
- Tcnicas preparatorias usadas en microscopa electrnica de
transmisin.
- Al igual que en la microscopa ptica, la observacin del material
biolgico al microscopio electrnico requiere de unas tcnicas
preparatorias que incluyen la fijacin, inclusin, corte y contraste
de ese material.
- Puesto que se van a observar las estructuras con mayor detalle
que en la microscopa ptica (a nivel ultraestructural), estas
tcnicas son an ms delicadas.
- La fijacin se realiza generalmente en glutaraldehdo, que
consigue una mejor preservacin de los tejidos que el formol,
seguida de posfijacin con osmio, que impregna muchas estructuras
con diversa afinidad proporcionando un contraste al chocar los
electrones con la muestra.
32.
- La inclusin se realiza en resinas plsticas, de epxido o
metacrilatos, que proporcionan una mayor dureza. Los cortes han de
ser extremadamente finos (cortes ultrafinos entre 20 y 80 nm de
espesor), lo que slo se consigue con un aparato de alta precisin,
denominado ultramicrtomo.
- Para contrastar el material no se emplean colorantes sino tomos
de metales pesados, como el plomo y el uranilo, que acentan el
contraste proporcionado por el osmio.
33. PROCESAMIENTO PARA MET
- La muestra apenas tomada, debe ser cortada en cubitos de 1mm de
lado.
34. PROCESAMIENTO PARA MET
- La muestra debe ser cortada con una hoja de afeitar
desengrasada y ayudndose con un mondadiente.
35. PROCESAMIENTO PARA MET
- Luego de ser cortadas deben ser fijadas con glutaraldehido al
2.5 a 3%, pH 7.2 y O.1 M a 4 C.
- Post-fijadas en Tetraxido de Os. En las mismas
condiciones.
36. PROCESAMIENTO PARA MET
- Deshidratar con una batera de alcohol etlico de grado
ascendente desde 30 al absoluto
37. PROCESAMIENTO PARA MET
- El embebidose har con cambios sucesivos de resina: acetona en
varias proporciones.
- La inclusin con resina Epoxy.
38. PROCESAMIENTO PARA MET
- Los cortes se realizan en un ultramicrtomo
39.
- Los cortes se pueden hacer tambin con una cuchilla de
diamante.
PROCESAMIENTO PARA MET 40.
- Se recogen cortes de 1 a 2 m y se tien con Azul de toluidina,
los que son observados al ML. para su identificacin.
PROCESAMIENTO PARA MET 41. Detalles ultraestructurales del mismo
parsito revelado por el MET 42.
- H) El microscopio electrnico de barrido
- El microscopio de barrido o descanningse utiliza para el
estudio de superficies de clulas y orgnulos celulares.
- Como en el microscopio electrnico de transmisin, se trabaja con
alto vaco, pero el haz electrnico no es fijo y de superficie amplia
sino puntual y mvil, de modo que rastrea punto por punto la
muestra.
- No se hacen cortes ultrafinos de la muestra. La muestra se
recubre de tomos opacos (oro y platino) mediante sombreado
metlico.
- Su principal utilidad es la observacin de la superficie de las
clulas y componentes de los tejidos, para obtener una visin
tridimensional de su forma externa y organizacin espacial.
43. 44. 45. 46. Trichomona vaginalis 47. LA MEB EN EL ESTUDIO
BACTERIOLGICO
- La identificacinde bacterias patgenas o no ; mejoran el
conocimiento de ellas y su importancia en el ecosistema.
48. Estudiando las Bacterias
49. III) DIFRACCIN DE RAYOS X
- Esta tcnica instrumental proporciona una mayor resolucin que
las tcnicas ms perfeccionadas de microscopa electrnica. Consiste
esencialmente en, hacer atravesar un haz fino de rayos X sobre el
material que va a ser analizado, y colocar detrs una placa,
fotogrfica que recoge el espectrograma.
- La tcnica se basa en que las radiaciones se difractan al
encontrarse pequeos obstculos.
- Sabiendo el ngulo de incidencia de un punto del. espectrograma
y la longitud de onda del haz incidente se puede calcular el
espacio que produce la difraccin.
- Los rayos X tienen un poder de penetracin mucho mayor que el de
los electrones y pueden utilizar con materiales muy gruesos.
50. IV) INMUNOHISTOQUMICA
- Las tcnicas de inmunohistoqumica utilizan anticuerpos corno
reactivos especficos para demostrar una multitud de sustancias
diferentes, supongamos que se quiere estudiar la distribucin de la
actina en clulas o tejidos de rata.
- Se obtiene actina purificada de rata y se usa como antgeno al
inyectarla a un conejo. Este forma anticuerpos frente a la actina
de rata:
- Estos anticuerpos antiactina los unimos a un colorante
fluorescente, y los anticuerpos unidos al colorante se ponen en
contacto con las clulas de rata que se quieren estudiar.
51.
- Donde hay actina se unirn a ella los anticuerpos, que se harn
visibles en el microscopio de fluorescencia gracias al colorante al
ser observados En vez de un colorante fluorescente se puede unir al
anticuerpo una enzima como laperoxidasa,que se pone de manifiesto
mediante ladiaminobenzidina,formndose un precipitado pardo donde
hay peroxidasa y, por consiguiente, donde hay anticuerpo.
- A veces, una sustancia es tan escasa que apenas se pone de
manifiesto con la tcnica inmunohistoqumica descrita. En estos casos
puede ampliarse el efecto utilizando lainmunohistoqumica
indirecta.
- En esta tcnica, anticuerpos de conejo se usan, a su vez, como
antgenos al inyectarlos en la cabra. Los anticuerpos de cabra son
los que se unen al colorante fluorescente o a la peroxidasa.
52.
- De esta manera se consigue que a las molculas de la sustancia
en estudio (actina, por ejemplo) se unan molculas del primer
anticuerpo (obtenido en el conejo), al cual, a su vez, se unen
varias molculas del anticuerpo obtenido en la cabra, que es el
visible.
- Las tcnicas de inmunocitoqumica son tambin aplicables a la
microscopa electrnica con las modificaciones pertinentes.
53. Ag rata + Ac conejo + Ac cabra + colorante fluorescente (o
peroxidasa) Ag rata Inyeccin en conejo INMUNOHISTOQUMICAAg
conejo-anti Ag rata Ag rata + Ac conejo Ac cabra-anti Ac conejo+
colorante fluorescete o peroxidasaIncubacn con clulas de
rataInyeccin en cabraAg rata + Ac conejo + Ac cabra + colorante
fluorescente (o peroxidasa) Ag rata Inyeccin en conejo
INMUNOHISTOQUMICAAg conejo-anti Ag rata Ag rata + Ac conejo Ac
cabra-anti Ac conejo+ colorante fluorescete o peroxidasaIncubacn
con clulas de rataInyeccin en cabraAg rata + Ac conejo + Ac cabra +
colorante fluorescente (o peroxidasa) Ag rata Inyeccin en conejo
INMUNOHISTOQUMICAAg conejo-anti Ag rata Ag rata + Ac conejo Ac
cabra-anti Ac conejo+ colorante fluorescete o peroxidasaIncubacn
con clulas de rataInyeccin en cabraAg rata + Ac conejo + Ac cabra +
colorante fluorescente (o peroxidasa) Ag rata Inyeccin en conejo
INMUNOHISTOQUMICAAg conejo-anti Ag rata Ag rata + Ac conejo Ac
cabra-anti Ac conejo+ colorante fluorescete o peroxidasaIncubacn
con clulas de rataInyeccin en cabraAg rata + Ac conejo + Ac cabra +
colorante fluorescente (o peroxidasa) Ag rata Inyeccin en conejo
INMUNOHISTOQUMICAAg conejo-anti Ag rata Ag rata + Ac conejo Ac
cabra-anti Ac conejo+ colorante fluorescete o peroxidasaIncubacn
con clulas de rataInyeccin en cabra 54. V) FRACCIONAMIENTO
CELULAR
- Es una tcnica bioqumica utilizada para separar los distintos
orgnulos y componentes celulares para su estudio bioqumico y al
microscopio electrnico.
- La tcnica se inicia con lahomogeneizacin. El tejido se tritura
en un homogeneizador (mbolo que gira mediante un motor, y que
ajusta a la pared de un vaso), de manera que las clulas se
comprimen entre el mbolo y el vaso, destruyndose lo suficiente como
para que sus orgnulos queden libres, pero no para que stos se
rompan. Unos 20 minutos de homogeneizacin bastan para obtener este
efecto.
55.
- Se somete a la 1centrifugacin,que se realiza a unas 1000 veces
la fuerza de la gravedad (1000 G) durante unos 20 minutos.
- El resultado es que los ncleos se sedimentan, mientras que los
dems orgnulos celulares quedan en el sobrenadante.
- Este se somete a la2 centrifugacin(10 000 G durante 20
minutos). El sedimento formado est compuesto por mitocondrias,
lisosomas y peroxisomas.
56.
- Esquema del procedimiento utilizado en la tcnica de
inmunohistoqumica.
- El sobrenadante se somete a la 3centrifugacin(105 000 G durante
2 horas). El sedimento consiste en retculo endoplasmtico rugoso y
ribosomas libres (la denominadafraccin microsomal).
- El sobrenadante consiste en citoplasma fundamental con
microtbulos y filamentos, retculo endoplasmtico liso, complejo de
Golgi y membrana plasmtica(fraccin citoslica).
- Para separar el retculo endopla.smtico de los ribo-somas se
resuspende la fraccin microsomal, que se trata con un
detergente(desoxicolato),y se centrifuga a 105 000 G durante 20
minutos. En el sedimento quedan los ribosomas y en el sobrenadante
las membranas de retculo endoplasmtico.
57.
- Del sedimento de la 2 centrifugacin puede resuspenderse en
gradiente de sacarosa y en el sobrenadante las mitocondrias. A su
vez, las mitocondrias pueden romperse por tumefaccin mantenindolas
durante 20 minutos en una solucin de albmina y fosfato 0.2 M,
apH7.2.
- A continuacin las mitocondrias rotas se centrifugan a 38 000 G
durante 20 minutos.
- En el sobrenadante queda la matriz mitocondrial, y en el
sedimento las membranas mitocondriales.
- Se resuspende el sedimento y se centrifuga a 1900 G durante 15
minutos, obtenindose como sedimento la membrana interna, y como
sobrenadante la membrana externa.
58.
- Tambin, en ultracentrfugas analticas, pueden separarse
partculas an ms pequeas, como virus o macromolculas (cidos
nucleicos, protenas, etc.).
- Mediante ventanas transparentes en el tubo de centrifugacin, y
empleando tcnicas pticas y electrnicas, puede observarse el
desplazamiento de las partculas y determinarse la velocidad a la
que se sedimentan(coeficiente de sedimentacin).
- Este coeficiente depende del peso molecular, tamao y forma de
la partcula y se expresa en la forma deunidades S (Svedberg).
59. Tratamiento con desoxicolato de sodio al 0.26% y
centrifugacin a 105 000 g 20 min. Representacin esquemtica de los
sucesivos pasos en el fraccionamiento celular 60. VI) CITOQUMICA E
HISTOQUMICA
- Las tinciones empleadas comnmente en microscopa ptica nos
indican por s mismas acerca de la naturaleza qumica de los
componentes de las clulas y tejidos, la tincin de rutina ms comn
(la hematoxilina y eosina) utiliza un colorante bsico
(hematoxilina) y un colorante cido (eosina).
- Las sustancias de naturaleza cida (como los cidos nucleicos)
tienen afinidad por la hematoxilina y, en general, por todos los
colorantes bsicos, con los que se tien, y por eso estas sustancias
se denominan sustancias basfilas.
- Por el contrario, las sustancias de naturaleza bsica (la mayor
parte del citoplasma) tienen afinidad por la eosina y, en general,
por los colorantes cidos, con los que se tien, y por eso se les
denomina acidfilas o eosinfilas.
61.
- Existen muchos otros colorantes que se emplean usualmente en la
histologa convencional. No siempre se utilizan dos colorantes;
pueden emplearse tres o ms en las tinciones denominadas tricrmicas,
tetracrmicas,
- Estos usos combinados de colorantes permiten mayores
distinciones entre los diversos tipos celulares y componentes
tisulares. Por ejemplo, existen colorantes especialmente indicados
para la demostracin de carbohidratos (PAS)DNA (Feulgen) o lpidos
(rojo grasa)
62. 63. El camino es arduo, persevera en el estudio y logrars tu
formacin profesional... Biocalpi !BIENVENIDOS INGRESANTES 2011!
GRACIAS