Reactantes de fase aguda

Prof.Cristian Salinas

Respuesta hepática de fase aguda

• El hígado es uno de los principales blancos de la acción endocrina de los agentes liberados desde el foco inflamatorio y la glándula suprarrenal. La respuesta hepática de fase aguda se caracteriza por una alteración radical en el patrón biosintético de los hepatocitos. Así, los hepatocitos incrementan enormemente la síntesis de una serie de proteínas, cuya concentración plasmática se eleva consecuentemente (reactantes positivos de fase aguda)

• Al destinar el aparato biosintético a la síntesis de estos reactantes positivos, los hepatocitos disminuyen la síntesis de algunas otras proteínas, cuya concentración plasmática disminuye, y son denominadas por ello reactantes negativos de fase aguda

• Es importante considerar que, en realidad, el hígado no es la única fuente de proteínas de fase aguda, aunque la síntesis extrahepática (llevada a cabo principalmente por monocitos, fibroblastos, adipocitos y células endoteliales) es cuantitativamente poco importante.

Principales reactantes fase aguda

• RFA Positivos• Proteína C Reactiva • Proteína A sérica del amiloide• Haptoglobina• Fibrinógeno• Factores del complemento• Ceruloplasmina• Glicoproteína ácida 1• Alfa-1-antitripsina• Alfa-1-antiquimiotripsina

• RFA Negativos

• Albúmina

• Prealbúmina

• Transferrina

• Apo-A1

• Fibronectina

Mediadores de la respuesta hepática de fase aguda

• El incremento o disminución de la síntesis de los reactantes de fase aguda son fenómenos inducidos principalmente por citoquinas liberadas desde el foco inflamatorio

• Las citoquinas involucradas en la respuesta hepática de fase aguda pueden ser divididas en 2 grupos: el grupo de la IL-1 y el grupo de la IL-6

• Citoquinas tipo IL-1

• Interleucina -1 alfa (IL-1 alfa)

• Interleucina - 1 beta (IL-1 beta)

• TNF-alfa

• TNF-beta

• La IL-1 es liberada por los macrófagos, monocitos y células dendríticas en respuesta al factor de necrosis tumoral alfa (TNF alfa). Se conocen tres formas:

• IL-1α. Es mayormente intracelular y termina adherida a la membrana celular con ciertos efectos paracrinos en el entorno de la célula secretora.

• IL-1β. Es secretada a la circulación e interacciona con dos tipos de receptores: – - Tipo I: se encuentran sobre la mayoría de

las células del cuerpo y parece ser el mediador de las respuestas clásicas de la IL-1.

– - Tipo II: se encuentran sobre linfocitos B, neutrófilos, monocitos y células de la medula ósea.

• La interleucina-1 tiene acciones estimuladoras, así como inhibitorias, sobre diversos tipos celulares e incluso promueve la apoptosis de otras. Entre sus funciones principales están:

• Efectos pro inflamatorios producto de la liberación de histamina por mastocitos, causando vasodilatación y los signos de inflamación localizada.

• Tiene actividad quimotáctica sobre los granulocitos • Junto con IL-6 causa elevación de las proteínas

hepáticas de fase aguda (por ej., fibrinógeno y proteína C reactiva).

• Actúa sobre el sistema nervioso central produciendo sueño y anorexia durante procesos infecciosos por el efecto del oxido nítrico. Ese mismo efecto inhibe la contracción de la musculatura lisa de las arterias y del músculo cardiaco.

• Estimula la liberación de hormonas de la hipófisis.

• Incrementa el número de células precursoras de la medula ósea.

• Citoquinas tipo IL-6

• Interleucina-6 (IL-6)

• Factor inhibitorio de leucemia (LIF)

• Interleucina-11 (IL-11)

• Factor neurotrófico ciliar (CNTF)

• Oncostatina M (OSM)

• La IL-6 es una glicoproteína segregada por los macrófagos, células T,celulas endoteliales y fibroblastos., su liberación está inducida por la IL-1 y se incrementa en respuesta a TNFalfa.

• Es un pirógeno endógeno que estimula en la hipófisis la producción de ACTH.

• Interviene en la producción de inmunoglobulinas, en la diferenciación de linfocitos B, activa a los linfocitos T citotóxicos, células plasmáticas, modula la hematopoyesis y es la responsable, junto con la IL-1, de la síntesis de proteínas de fase aguda en el hígado, en especial fibrinógeno.

Hormonas en la respuesta hepática de fase aguda

• Las hormonas involucradas en la respuesta hepática de fase aguda son los glucocorticoides y la insulina. Los glucocorticoides per se estimulan solo levemente la síntesis de la mayoría de proteínas de fase aguda, pero potencian de manera importante la acción inductora de las citoquinas. La insulina ejerce un efecto contrario, ya que inhibe la acción de las citoquinas sobre la síntesis de la mayoría de proteínas de fase aguda.

• las citoquinas producidas en el foco inflamatorio actúan directamente sobre los receptores de los hepatocitos para inducir la síntesis de proteínas de fase aguda. Sin embargo, esta acción directa está regulada por hormonas clásicas. Si se recuerda que las mismas citoquinas inflamatorias estimulan la síntesis de glucocorticoides, se podrá comprender que la repuesta hepática depende en gran parte del componente neuroendocrino de la respuesta de fase aguda.

• La síntesis aumentada o disminuida de los reactantes de fase aguda resulta al menos de dos mecanismos de regulación intracelular:

• 1) Mecanismos transcripcionales: mediados por la acción de factores de transcripción que se unen a determinadas secuencias de los promotores de los genes correspondientes. Los factores de transcripción son activados o inducidos por las citoquinas mencionadas anteriormente.

• 2) Mecanismos post-transcripcionales: que hacen referencia a

• 2.a) La alteración de la vida media de las moléculas de RNAm que codifican para las proteínas de fase aguda. Por ejemplo, el factor de crecimiento transformante alfa (TGF-alfa) disminuye el tiempo de vida media de los RNAm de la Apo-AI y la albúmina, en tanto que la IL-1, la IL-6 y los glucocorticoides estabilizan los mensajeros de reactantes positivos de fase aguda.

• 2.b) Modificaciones post-translacionales (del producto proteico). Así, los glucocorticoides y las citoquinas tipo IL-1 o IL-6 modulan la poliadenilación de la proteína A sérica del amiloide. Además, las citoquinas pueden modular la glicosilación de las proteínas de fase aguda, lo que probablemente modula su actividad biológica.

Cinética reactantes positivos fase aguda

• La magnitud del incremento de la concentración de los reactantes positivos de fase aguda varía según la proteína en cuestión; asimismo, la velocidad del ascenso de las proteínas tras el estímulo inflamatorio es variable. Con estos criterios, se puede clasificar a las proteínas de fase aguda en tres grandes grupos

• 1) Proteínas cuya concentración aumenta de 100-1000 veces sobre el nivel basal (reactantes principales de fase aguda), también llamadas proteínas con cinética de evolución rápida. Su elevación sérica es medible a las 4-6 horas de la agresión tisular, su vida media biológica es breve (de ocho a doce horas) y en ausencia de complicación, el retorno a los valores básales ocurre en 3 o 4 días. Las dos proteínas de esta categoría son la proteína C reactiva y la proteína A sérica del amiloide.

• 2) Proteínas cuya concentración aumenta de 2 a 4 veces sobre el nivel basal. Estas proteínas pueden ser a su vez divididas en dos grupos de acuerdo al patrón temporal de su elevación en el plasma:

• 2.a) Proteínas con cinética de evolución media (alfa1 antitripsina y alfa1-antiquimiotripsina), que aumentan su concentración a las 10 horas de la agresión; su vida media es de 2 días y sus valores retornan a niveles basales en 6-8 días.

• 2.b) Proteínas con cinética de evolución lenta (glicoproteína ácida alfa1, fibrinógeno, haptoglobina): que alcanzan su máxima concentración sérica a los 3-4 días; su vida media biológica es de 3-6 días, y retornan a niveles basales a los 10-15 días.

• 3) Proteínas cuya concentración aumenta 50% sobre el nivel basal (ceruloplasmina, C3). Su cinética es de evolución lenta.

Proteína C Reactiva

• La proteína C-reactiva debe su nombre a su capacidad de interactuar con el polisacárido C de la cápsula del neumococo. .

• Esta proteína es una holoproteina pentamérica de subunidades idénticas que se organizan como discos pentagonales simples (PCR) , por lo que se denomina pentraxina.

PCR

• La PCR es una Beta globulina de fase aguda con una masa molecular de 118.000 daltons.

• Es una proteína no glicosilada de simetría cíclica.

• Estable en suero >20 años a -70 ºC

• Niveles elevados de PCR en suero o plasma los encontramos como respuesta no específica a infecciones, inflamaciones no infecciosas, AR ,ECV …

• Encontramos:

-Respuesta intensa (>1 mg/dL) en :

Infección: bacterias > hongos > virus

( meningitis, neumonía,…)

Inflamación aguda ( AR , pancreatitis )

Tumores sólidos, traumatismos, cirugía

-Respuesta moderada (<1 mg/dL) en :

Leucemias

Autoinmunidad: DM, C.ulcerosa/Crohn, …• La PCR es sintetizada en el hígado y normalmente sólo se detectan

trazas en circulación.• Cuando se produce algún daño al tejido:

-Aumento detectable a las 6-8 horas

-Pico en 48 horas

-Descenso a partir de las 48 horas

• En los humanos, la proteína C-reactiva se encuentra normalmente a concentraciones de ~1mcg/ml, valor que se eleva hasta 1000 veces durante la respuesta de fase aguda

Funciones Proteína C Reactiva

• 1) Se une a la cromatina liberada del tejido necrótico durante la inflamación, y promueve su depuración, probablemente para prevenir reacciones autoinmunes contra antígenos nucleares.

• 2) Actúa per se como una opsonina para bacterias, parásitos y complejos inmunes. Además, la PCR se une a C1q y activa la vía clásica del sistema de complemento, favoreciendo por estas propiedades la fagocitosis y destrucción de microorganismos por parte de los macrófagos y neutrófilos.

LISIS

• 3) Potencia la actividad de las células asesinas naturales, favoreciendo así también la inmunidad antitumoral.

• 4) Finalmente, la PCR es capaz de modular la activación plaquetaria.

CÉLULA ASESINA NATURALCÉLULA ASESINA NATURAL (NATURAL KILLER)(NATURAL KILLER)

15% de los linfocitos sanguíneos

No expresan receptores TCR ni BCR.

Las células NK activadas por IL-2 adquieren propiedades citotóxicas inespecíficas y se les conoce como células asesinas activadas por linfocinas (LAK)

Reconocen y destruyen determinadas células tumorales y células infectadas por virus.

Las células propias se protegen de la acción de los NK, mediante ligandos de la familia p58, productos del gen HLA-C.

Es decir la asociación de moléculas HLA-C con el receptor de los NK inhibe la autotoxicidad y protege a las células portadoras de esta molécula.

Cuando son activadasCuando son activadas liberan liberan interferón-interferón-ϒϒ (IFN- (IFN- ϒϒ) y otras) y otras citocinas (IL-1 y GM-CSF),citocinas (IL-1 y GM-CSF), que que pueden ser importantes en lapueden ser importantes en la regulación de la hematopoyesis y en regulación de la hematopoyesis y en las respuestas inmunitariaslas respuestas inmunitarias

CÉLULA ASESINA NATURALCÉLULA ASESINA NATURAL (NATURAL KILLER)(NATURAL KILLER)

Técnicas Serológicas

• Los exámenes serológicos son aquellos en que se busca la presencia de anticuerpos producidos en respuesta a la presencia de un agente patógeno o antígeno.

• Dentro de los procedimientos inmunológicos, los más útiles y prácticos son aquellos que se basan en la especificidad de la unión Ag-Ac. La propiedad que tienen las Igs de unirse a un Ag, la especificidad de esta unión y el hecho de que pueda ser visualizable por los fenómenos de precipitación, aglutinación y otros mecanismos indirectos (marcaje con fluoresceína, con radioisótopos o con enzimas) hacen que estos métodos se empleen ampliamente.

• Técnica de precipitación

• El complejo Ag-Ac precipita espontáneamente o por centrifugación cuando la proporción de Ags y Acs de la mezcla es equivalente en tubos de ensayo, soluciones con diferentes cantidades de antígenos a los que se añaden igual cantidad de un anti suero

• La precipitación es máxima allí donde la proporción entre ambos es óptima (parte central de la curva), pero va disminuyendo a medida que predomine el Ac o el Ag (izquierda y derecha de la curva respectivamente) Este tipo de reacción no es muy utilizado al requerirse grandes concentraciones de antígeno y de anticuerpo para poder medir el precipitado formado.

• Técnicas de aglutinación. Cuando el antígenos e encuentra unido o formando parte de células, bacterias o partículas, la reacción Ag-Ac se puede detectar y cuantificar por el aglutinado celular o bacteriano formado.

• En estas técnicas se hacen visibles los complejos Ag-Ac por la aglutinación que producen los anticuerpos cuando el Ag forma parte o se ha unido artificialmente a la superficie de glóbulos rojos, plaquetas, leucocitos, partículas de látex, etc. Normalmente se utilizan glóbulos rojos (hemaglutinación) o partículas de látex. 

• Técnicas de fluorescencia y citometría de flujo.

• Para la realización de estas técnicas el anticuerpo se marca con un fluorocromo detectándose la formación del complejo Ag-Ac por la fluorescencia emitida.

• La fluorescencia es una propiedad de ciertas moléculas que, al ser irradiadas con energía electromagnética de longitud de onda adecuada, emiten radiación de longitud de onda característica permitiendo su cuantificación.

• Las moléculas de un colorante fluorescente absorben luz en una longitud de onda y convierten la luz absorbida de alta energía (longitud de onda más corta) en luz de menor energía (longitud de onda más larga). Cada fluorocromo tiene un espectro de emisión y excitación característicos; si se utilizan dos con el mismo espectro de excitación pero distinto espectro de emisión, se pueden medir dos características al mismo tiempo (fluorescencia de dos colores).

• La inmunofluorescencia se utiliza esencialmente en la detección de autoanticuerpos y anticuerpos contra antígenos de superficie de células y tejidos. Para ello se emplean anticuerpos preparados frente a la proteína que se desea detectar marcados con moléculas fluorescentes

• Se aprecia si hubo unión del anticuerpo con el antígeno por la fluorescencia emitida, que se observa bajo microscopio de luz ultravioleta. Este procedimiento (Inmunofluorescencia directa) tiene la limitación del marcaje con un fluorocromo de cada uno de los anticuerpos necesarios para cada una de las sustancias a investigar

• Para evitar esto, lo que se hace es tratar el tejido o células con antisueros anti-antígeno producidos, por ejemplo, en conejo y secundariamente anti-inmunoglobulinas marcadas con un fluorocromo (Inmunofluorescencia indirecta)

• Citometría de flujo

• Se realiza el análisis de una suspensión de células vivas marcadas con un fluorocromo. Se utiliza principalmente en el estudio de poblaciones de células de sangre periférica

• Técnicas de radioinmunoensayo. En estas técnicas al anticuerpo se une un isótopo radiactivo siendo posible la cuantificación del complejo Ag-Ac a través de la radiactividad emitida.

• El radioinmunoensayo (RIA) se basa en la competencia que se establece, para unirse a anticuerpos específicos, entre la sustancia a cuantificar y cantidades conocidas de la misma sustancia marcada con un isótopo. Al establecerse esta competición resulta que a mayor cantidad de sustancia a cuantificar, menor será la cantidad de sustancia radiactiva que se une al anticuerpo y viceversa

• Técnica inmunoensayo

• Esta técnica, también se conoce como test de ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay). La identificación de los complejos Ag-Ac, se hace mediante el empleo de enzimas, bien unidas al antígeno, o bien unidas al anticuerpo.

• El test de ELISA puede ser directo o no competitivo, constando de los siguientes pasos: a) Se tapiza la placa con el anticuerpo específico frente al antígeno a determinar. b) Se añade la muestra con el antígeno. c) Se adiciona el anticuerpo secundario marcado con la enzima que en presencia de su sustrato da un producto coloreado soluble, este producto es cuantificado mediante el lector de ELISA

• e indirecto o competitivo,  se diferencia del caso anterior en que se añaden los anticuerpos, previamente incubados con la muestra, los anticuerpos que no se han unido a los antígenos de la muestra lo harán a los antígenos de los pocillos. Como enzimas se suelen utilizar la peroxidasa, la galactosidasa o la glucosa oxidasa.

• Técnicas nefelométricas• Estas técnicas se basan en la detección de los

complejos Ag-Ac, por la refracción que dichos complejos producen sobre rayos de luz que se hacen pasar por el tubo con el antígeno y el anticuerpo correspondiente. Habitualmente se utilizan rayos láser y se establece una relación entre la cantidad de luz que llega y la cantidad de complejos formados