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Red de Colaboradores
Aplicaciones en el laboratorio
Investigación
NoticiasAgenda del Sector Químico Clínico.
Contenido
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Contacto Químico, revista trimestral, enero -marzo 2008. Tiraje de 4000 ejemplares. Editor Responsable: Bernardo Taboada Cortina. No. de Certificado de Reserva otorgado por el Instituto Nacional del Derecho de Autor: 04-2006-063010492100-102. Certificado de Licitud de Título No. 13522. Certificado de Licitud de Contenido No. 11095 otorgados por la Comisión Calificadora de Publicaciones y Revistas Ilustradas. Domicilio de la publicación: Fuente de la Rana #58 Col. Fuentes de Morelia C.P. 58080. Morelia, Michoacán. Distribuido por Servicio Postal Mexicano. Registro Postal. Publicación Periódica. Registro No. PP16-0008. Autorizado por SEPOMEX.
Revista Indizada en:•Indice Mexicano de Revistas Biomédicas
Latinoamericanas (IMBIOMED)•LATINDEX UNAM. Sistema Regional de
Información en Línea para Revistas Científicas de América Latina, El Caribe,
España y Portugal.
01
Micosis en la Región Huasteca de San Luís Potosí
Desarrollo en el Laboratorio
Purificación de Vitronectina Humana para la Obtención de Antisuero Antivitronectina.
18
EditorBernardo Taboada Cortina
Consejo EditorialMicrobiología
M. en Microbiología Abilio Ubaldo Rodríguez Pérez (Cuba)
HematologíaDra. Nidia León Sicairos (México)
Inmunología y ParasitologíaDr. Javier Ambrosio Hernández (México)
Reproducción y genéticaBiol. Gerardo Cerezo Parra (México)
Consultores QFB María Bertha Ballesteros Silva
QFB. Arturo González VegaQFB Adrián Hernández Lagunas
QFB Gabriela Martínez Pérez
ColaboracionesMSP, Lilia Esperanza Fragoso-Morales
(México)Aránzazu Ronzón Fernández (España)
D. en C. Nelson Eduardo Alvarez Licona (México)
Mayra Rosa Ruiz Castillo (Venezuela) Ysabel Alejandra López Ramirez
(Venezuela) Dr.Jesús A. Osuna (Venezuela)
M. C. Gonzalo Garzón García (México)
Efectos De La Glicación No Enzimática En Pacientes Con Diabetes Mellitus Tipo 2.
Valores de referencia para fructosa, ácido cítrico y fosfatasas ácidas en plasma seminal en el Laboratorio de Andrología de la Universidad de Los Andes.
Impacto Clínico del Sistema de Activación del Plasminógeno en la Invasión y Metástasis del Tumor: Pronóstico y Terapia.
Lic. José Antonio López Espinosa
Red de Colaboradores
Nació el 14 de enero de 1949 en la Habana, Cuba. Se graduó en 1969 como traductor e intérprete del idioma alemán en el
Instituto Máximo Gorka de la Habana. En 1980 terminó sus estudios como Licenciado en Información Científica en la
Universidad de la Habana. Ha realizado un Diplomado sobre servicios de Información y varios cursos de postgrado en Cuba,
Alemania y Hungría. Actualmente se dedica a la investigación, en el área de humanidades médicas en la Universidad Virtual
de Salud de Cuba. Se encuentra catalogado como Investigador agregado del Centro Nacional de Ciencias Médicas.Es profesor instructor de la Escuela Nacional de Salud Pública de Cuba y Miembro fundador de la Cátedra Alexander und
Wilhelm von Humboldt de la Universidad de La HabanaEs miembro fundador de la Asociación Cubana de Traductores e Intérpretes, y miembro de las siguientes asociacones:
Sociedad Cubana de Historia de la Medicina, Sociedad Cubana de Historia de la Ciencia y la Tecnología, Asociación Cubana
de Bibliotecarios, representante de Cuba de la Red de Estudios Interdisciplinarios sobre Ciencia y Tecnología con sede en el
Instituto de Investigaciones Sociales de la Universidad Nacional Autónoma de México.
Lic. Victoria Ramos Alfaro
Licenciada en Microbiología, Química Clínica y Parasitología de la Universidad de Costa Rica, estudiante del programa de
posgrado en maestría en Microbiología, Química Clínica y Parasitología, con énfasis en Hematología.Investigadora del CIHATA (Centro de Investigación en Hematología y Trastornos Afines) que pertenece a la Universidad de
Costa Rica, en el área de genética humana (con énfasis en la detección de mutaciones en los genes relacionados a
trastornos de la coagulación sanguínea) y en el área de Hemostasia. Trabaja de forma periódica, en el Hospital Nacional
Geriátrico Dr. Raúl Blanco Cervantes.Ha colaborado como profesora de la Facultad de Microbiología de la Universidad de Costa Rica, en el curso de
Fisiopatología. Y profesora ad honoren del curso de Métodos de Investigación.
Red de Colaboradores
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M.C. Gonzalo Garzón García
Químico fármaco biólogo (Universidad Autónoma de Puebla) Maestro en Ciencias de Laboratorio Clínico (Universidad de la
Habana Cuba), Maestría en Salud Publica (Universidad Popular Autónoma del Estado de Puebla) Diplomado en
Hematología (Colegio de Químicos Clínicos del Estado de Puebla) Diplomado en Endocrinología (Colegio de Químicos
Clínicos) Diplomado en Células Sanguíneas (Centro de Estudios de Postgrado y Desarrollo Profesional A .C.) Diplomado en
Patología Clínica (Colegio de Químicos de Puebla) Diplomado en Gestión Ambiental (Instituto Mexicano de Ingenieros
Químicos SEMARNAP Puebla) Diplomado en Inmunología (Facultad de Medicina BUAP.) Diplomado en Hepatología
(Colegio de Químicos Clínicos de Puebla) Químico Clínico certificado (Colegio Mexicano de Químicos Clínicos AC.
CONAQUIC) Químico adscrito al Proyecto Laboratorio Comunitario Dr. Ismael Cosió Villegas (Facultad de Ciencias Químicas
BUAP.) Responsable de Trabajos de investigación y Tesis Laboratorio Comunitario Dr. Ismael Cosió Villegas (Facultad de
Ciencias Químicas HUP).Responsable del Laboratorio Móvil y Atención a Comunidades de la Sierra Nor-Oriental de Puebla
(Facultad de Ciencias Químicas- HUP.) Químico Adscrito al Proyecto Laboratorio de Investigación en Parasitología (Escuela
de Ciencias Químicas UAP- Secretaria de Salud) Miembro del Grupo Piloto en el HUP.(Escuela de Ciencias Químicas Hospital
Universitario de Puebla) Profesor medio tiempo “A”( Escuela de Ciencias Químicas UAP). Profesor tiempo completo B
(Facultad de Ciencias Químicas).Profesor Investigador Tiempo Completo Titular “A” (Facultad de Ciencias Químicas BUAP)
Asesor Científico de los Laboratorios Clínicos BILAB (Ciudad de Puebla) Jefe del Departamento de Análisis Clínicos (Facultad
de Ciencias Químicas BUAP). Director de 50 tesis de licenciatura, tutor académico.
INTRODUCCIÓNLa hiperglicemia es considerada en la actualidad como un factor causal clave en el desarrollo de las complicaciones vasculares diabéticas, pudiendo producir sus efectos nocivos por múltiples vías. Esto ha sido confirmado por el estudio Diabetes Control and Complication Trial de 1993, para la microangiopatía en el caso de la diabetes tipo 1 y corroborado por el United Kingdom Prospective Diabetes Study publicado a fines de 1998 para el caso de la diabetes tipo 2. En esta revisión se resumen las evidencias actuales en apoyo del rol de la hiperglicemia en las complicaciones vasculares del paciente con DM 2. Se profundiza en uno de los mecanismos bioquímicos protagónicos en esta enfermedad: la glicación o glicosilación no-enzimática. (2,15).La glicosilación se define como la reacción d e g r u p o s a m i n o s p r i m a r i o s d e aminoácidos, péptidos y proteínas con el grupo carbonilo de los azúcares reductores. Inicialmente se produce la de Schiff; la estructura de este compuesto se reordena hacia una forma más estable, denominada producto de Amadori. En proteínas de recambio rápido, el proceso de glucosilación no enzimática no supera, en general, las etapas iniciales (formación de la base de Schiff y eventualmente del producto de Amadori), mientras que las de vida media larga llegan a formar los productos de glucosilación avanzada. Una segunda fase de la ruta de la glicación (que es independiente de la glicemia), es una serie compleja de reordenamientos intramoleculares y reacciones oxidativas
04 05
conduce a la formación de compuestos múltiples, muy reactivos, l lamados "productos de glicación avanzada" (AGEs). Estos se pueden producir por la oxidación del producto de Amadori formando intermediarios dicarbonilo muy reactivos tales como la 3-deoxiglucosona. (15,20).
La glicación precoz de la Apo A, Apo B y Apo E, provoca un metabolismo alterado de las formas glicadas de LDL y HDL. La glicación puede tener efectos directos y puede también amplificar los efectos del estrés oxidativo en las lipoproteínas. La glicación no sólo aumenta la susceptibilidad de la LDL a la oxidación, sino que también, intensifica la propensión de las proteínas estructurales de la pared vascular a ligar las proteínas del plasma, incluyendo la LDL, contribuyendo así a una modificación oxidativa más marcada de dichas partículas. Las LDL gl icadas y/o ox idadas inducen la acumulación de ésteres de colesterol en macrófagos humanos y pueden también promover disfunción plaquetaria y endotelial. (6,10,11)
DIABETES MELLITUS TIPO 2• Se caracteriza por un complejo mecanismo fisiopatológico, cuyo rasgo principal es el déficit relativo de producción de insulina y una deficiente utilización periférica por los tejidos de glucosa (resistencia a la insulina), también se presentan alteraciones en el metabolismo de hidratos de carbono, lípidos y proteínas. Se desarrolla a menudo en etapas adultas de la vida, y es muy frecuente la asociación con la obesidad. (1)
• La diabetes tipo 2 tiene una alta agregación heredofamiliar; 90% de los diabéticos tipo 2 tiene un familiar de primer grado con la enfermedad. Se trata además de una enfermedad heterogénea tanto desde el punto de vista del fenotipo como del genotipo. En esta forma de diabetes las alteraciones g e n é t i c a s s e c o n s t i t u y e n e n f a c t o r e s predisponentes que interaccionan con factores ambientales desencadenantes tales como: obesidad, sedentarismo, dieta hipercalórica. Por otra parte, esta entidad, suele estar acompañada de morbilidades metabólico-vasculares (hipertensión arterial, dislipidemia, obesidad androide). (1,13)
Autores:Grado Académico:
Institución:País:
E-mail:
C.M.C. María Del Rocío Franco Rueda*, M. C. Gonzalo Garzón García**:*Laboratorio de Análisis Clínicos BILAB, Col. Ignacio Romero Vargas, Puebla. Candidata a Maestría en Ciencias de Laboratorio Clínico **Jefe de Departamento de Análisis Clínicos BUAP.Departamento De Análisis Clínicos, Benemérita Universidad Autónoma De PueblaMéxicocomentarios@contactoquimico.com
Planteamiento Del Problema¿Cuál será el comportamiento de los marcadores de glicación no enzimática en pacientes con DM2 con más de 10 años de evolución?
JustificaciónLos diabéticos presentan alteraciones cual i tat ivas y cuant i tat ivas en sus lipoproteínas que supone una modificación en su comportamiento metabólico y en ello la génesis de la placa de ateroma. Según estadísticas recientes mencionan que la enfermedad cardiovascular es la principal causa de morbi-mortalidad en las personas con DM2.
APLICACIONES ENEL LABORATORIO
APLICACIONES ENEL LABORATORIO
Por este motivo, es importante conocer en este tipo de pacientes el comportamiento de los productos de glicación no enzimática como marcadores de riesgo cardiovascular; y así de esta manera coadyuvar a la prevención del mismo y mejorar la calidad de vida del paciente. Además, se debe hacer hincapié, de lo significativos que son estos estudios para emitir un mejor diagnóstico para el paciente y por tanto, éste tendrá un tratamiento más adecuado.
Objetivo General• Estudiar el valor predictivo de los productos de glicación no enzimática como marcador
bioquímico de riesgo de accidentes cardiovasculares en pacientes con DM2.
Objetivos Particulares• A partir de los criterios bioquímicos de glucosa y hemoglobina glicosilada, caracterizar a los pacientes con DM2 con más de 10 años de evolución en controlados y no controlados.• Una vez caracterizados a los pacientes, evaluar la correlación de los niveles séricos de los productos de glicación no enzimática versus glicemia.• A partir del cálculo del índice aterogénico y coronario (colesterol total/c-HDL y c-LDL/c-HDL) determinar el riesgo aterogénico.
glicación no enzimáticaEfectos de laen pacientes con diabetes mellitus tipo 2
M E X I C O
MetodologíaDiagrama De Trabajo
Pacientes que no presenten
diabetes, quedan excluidos
Selección de especímenesa estudiar
Diabéticos tipo 2 con más de
10 años de evolución de enfermedad mayores de 35 años de
edad se incluyen
Toma de muestras sanguíneas100 sueros y sangre total
Determinaciones analíticas: Glu, Col, Tg, c-HDL, c-LDL,
fibrinógeno, albúmina, Hb-glicosilada, APO A-I y APO B
en sueros humanos y en suero control
Análisis teórico de resultados
Análisis estadístico de resultados y elaboración de gráficos
Conclusiones
Control de calidad
RANGO DE EDAD
40 – 4950 – 5960 – 6970 – 79
>80
TOTAL
53836147
100
FEMENINO
22721133
66
MASCULINO
3111514
34
ResultadosCuadro No. 1 RELACIÓN DE LA POBLA-CIÓN DIABÉTICA EN ESTUDIO (n=100) SEGÚN SEXO Y EDAD
GRÁFICA No. 1 NIVELES DE GLUCOSA Sérica De La Población En EstudioComo podemos observar, de los 100 pacientes, sólo 19 son diabéticos controlados y 81 están mal controlados, respecto a los niveles bioquímicos de glicemia; esto se debe principalmente a que éstos pacientes no llevan a cabo un dieta alimentaria correcta, son sedentarios y han tenido un mal manejo terapéutico.
Gráfica No. 2 Concentración De Hemo-globina Glicosilada En 100 Pacientes DiabéticosRespecto a los resultados observados, nos indica que aproximadamente el 80% de estos pacientes han sido mal manejados terapéuticamente en los 90 días precedentes a la realización del análisis, lo cual conlleva a la glicación de proteínas y consecuente-mente la generación de AGES.
Grá
fica
No.
1
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APLICACIONES ENEL LABORATORIO
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APLICACIONES ENEL LABORATORIO
Gráfico No. 3 Correlación De Los Niveles De Glucosa Versus Niveles De C-Ldl De La Población En EstudioEste gráfico nos muestra que el aumento del nivel plasmático de LDL, y/o cambios en sus s u b f r a c c i o n e s , s e a s o c i a n c o n l a hiperglicemia sostenida y por tanto hay un incremento del riesgo aterogénico.
Gráfico No. 4 Correlación De Los Niveles Séricos De Colesterol Con El Índice AterogénicoEn los pacientes diabéticos, se producen a l te rac iones en las subf racc iones componentes, de diámetro, de densidad y de composición lipídica, que las hacen más
DiscusiónEn cuanto al sexo de la población en estudió, el
66% es del género femenino y el 34% del
género masculino, y en cuanto a la edad, el 74%
de los pacientes estudiados tienen una edad
entre 50 – 70 años; rango de edad en el cual se
encontraron a los pacientes diabéticos mal
controlados respecto a los marcadores
bioquímicos: glucosa y hemoglobina
glicosilada.
Las concentraciones de colesterol están
elevadas en un 78% de los pacientes diabéticos,
al igual que los niveles de triglicéridos que se
encuentran elevados en un 98% y por último el
c o l e s t e r o l L D L q u e r e p r e s e n t ó
aproximadamente el 88%. Como era de
esperarse los resultados obtenidos de las
apolipoproteínas fueron sorprendentes ya que
los niveles de Apo B-100 salieron muy elevados,
sólo el 1% de los pacientes en estudio está
dentro de los niveles normales. Estos valores de
estos marcadores bioquímicos se encuentran
estrechamente relacionados, esto nos indica
una alteración en el metabolismo de los lípidos,
Gráfica No. 3 Gráfica No. 4 Gráfica No. 2
Gráfica No. 5 Gráfica No. 6
Gráfica No. 7 Gráfica No. 8
aterogénicas. A ellas se agrega la glicación no enzimática, que modifica cualitativamente a las LDL y afecta su metabolismo, pudiendo aumentar su potencial aterogénico. En este sentido, la glicación está directamente ligada a la oxidación de las LDL en la pared arterial.
Gráfica No. 5 Relación De Los Niveles Séricos De Colesterol Total Y LdlLas lipoproteínas LDL transportan la mayor parte del colesterol plasmático y lo distribuyen a los tejidos regulando la síntesis intracelular del mismo. Las LDL son catabolizadas en su mayor parte, por fijación a receptores de membrana (REC B/E) a través de la Apo-B. La glicación interfiere en el reconocimiento de la LDL por su
receptor específico de membrana (REC B/E) disminuyendo su fijación y degradación y favoreciendo el aumento del nivel plasmático de LDL y de colesterol.
GRÁFICA No. 6 CORRELACIÓN DE C- LDL CON LA APOLIPOPROTEÍNA B La apolipoproteína B es una proteína con gran peso molecular, presente en los quilomicrones, lipoproteínas VLDL y LDL y funciona como molécula ligando entre la LDL y su receptor. La glicación no enzimática interfiere en el reconocimiento de la LDL por su receptor provocando así un aumento plasmático de éstas lipoproteínas y por tanto de c-LDL.
mismo con el que cursan los pacientes
diabéticos.
La hiperglicemia sostenida es considerada hoy
como un factor protagónico en el desarrollo de
las complicaciones vasculares diabéticas,
pudiendo mediar sus efectos nocivos por
múltiples mecanismos, entre los cuales la
gl icación no enzimática juega un rol
preponderante.
Existe una clara evidencia a favor de que un
riguroso control en los valores de glicemia en el
p a c i e n t e d i a b é t i c o , d i s m i n u y a l a s
complicaciones crónicas vasculares, sobretodo
la microangiopatía.
Conclusiones-La hiperglucemia produce un incremento en el
nivel de glicación no enzimática de proteínas
estructurales y circulantes del organismo
generando simultáneamente un estrés
oxidativo, y a su vez producen en ellas
modificaciones fisicoquímicas y alteraciones en
su metabolismo.
-Los cambios generados por la glicación,
especialmente en las LDL, son en parte
responsables del desarrollo de la micro y
macrovasculopatía diabética. Este tipo de
complicaciones, es de difícil control y su
progresión muchas veces es inevitable por las
características de irreversibilidad de los procesos
de glicoxidación.
-Teniendo en cuenta que la glicación y/o
glicoxidación dependen de los niveles promedio
de glucosa circulante, la meta principal del
tratamiento de las personas con diabetes deberá
ser el mantenimiento de dichos promedios en
valores lo más cercanos posibles a los de
personas sin diabetes.
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS.
1)Alberti KG, Zimmet PZ, for the WHO Consultation: Definition, diagnosis and classification of diabetes mellitus and its complications. Part 1: Diagnosis and classification of diabetes mellitus, provisional report of a WHO consultation. Diabet Med 1998;15:539-53.
2)Actis Dato Sara M., Rebolledo Oscar R.; La glicación y glicooxidación de las lipoproteínas y su importancia en la diabetes mellitas; Buenos Aires Argentina; Vol. 60; No. 5; Enero 2000.
3)Allain CC, Poon LS, Chan CSG, Richmond W and Fu PC. Enzymatic determination of total serum cholesterol. Clin Chem 1974; 20: 470-475.
4)Assman G. Jabs HU, Kohnert U, Nolte W and Schriewer H. LDL-cholesterol determination in blood serum following precipitation of LDL with polyvinylsulfate. Clin Chem Acta 1984; 140: 77-83. 5)Azeredo P. Valeria; Barreto Sandhi; Diniz Leonardo M.; Type 2 diabetes: prevalence and associated factors in Brazilian community –the Bambuí heath and aging study; Sao Paulo Medical Journal; Vol. 123; No. 2; Marzo 2005.
6)Baynes JW, Thorpe SR. Role of oxidative stress in diabetic complications. Diabetes 1999; 48: 1-9.
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15) Gucliucci Alejandro; Glicación de la proteínas: rol protagónico de la hiperglucemia en la complicaciones crónicas de la diabetes mellitus; Revista médica de Uruguay; Vol. 16; No. 1; Mayo 2000.
16)GroveTH. Effect of reagent pH on determination of hight-density l i p o p ro te i n co l e s te ro l by p re c i p i t at i o n w i t h s o d i u m phosphotungstate-magnesium. Clin Chem 1979; 25: 560-564.
17)Henry RJ. Clinical Chemestry, Principles and technics. Harper &Row Publishers, New York, 1974.
18)Marcovina SM, Alberts JJ, Dati F, Ledue TB, Richitie RF. Internacional Federation of Clinical Chemestry Standaritation project for measurements of apolipoproteins A-I and B. Clin Chem 1991: 37: 1676-1682.
19)Meiattini F, Príncipe L, Bardelli F, Giannini G and Tarli P. The 4-hydroxybenzoate/4-aminophenazone chromogenic system used in the enzimatic determination of serum cholesterol. Clin Chem 1978; 24: 2161-2165.
20)Passarelli M, Catanozi S, Nakandakare ER, et al. Plasma lipoproteins from patients with poorly controlled diabetes mellitus and in vitro glycation of lipoproteins enhance the transfer rate of cholesteryl ester from HDL to apo-B-containing lipoproteins. Diabetologia 1997; 40: 1085-93.
21)Price CP, Spencer K and Whicher J. Light-scattering immunoassay of specific proteins: a review. Ann Clin Biochem 1983: 20: 1-14.
22)Terréz Speziale Arturo M., Durazo Quiroz Francisco, Carrillo Farga Joaquín; Programa Nacional de actualización y desarrollo académico para el médico general, tomo 5: Temas selectos de laboratorio en medicina; 2ª edición; 1999-2000; editorial Intersistemas.
23)Trinder P. Determination of glucose in blood using glucose oxidase with an alternative oxiygen aceptor. Ann Clin Biochem, 1969; 6: 24-27
24)Schleicher E, Deufel T, Wieland OH; Non-enzymatic glycosylation of human serum lipoproteins. FEBS Lett 1981; 129: 1-4.
GRÁFICA No. 7 CORRELACIÓN DEL ÍNDICE CORONARIO CON LOS NIVELES SÉRICOS DE C-LDLEn éste gráfico podemos observar la correlación directamente proporcional que existe entre las lipoproteínas LDL, que al estar glicadas y/o glicoxidadas modifican su catabolismo y por ende aumentan sus concentrac iones plasmáticas, provocando así un aumento de riesgo coronario al aumentar los niveles plasmáticos de c-LDL, mismos que están íntimamente ligados con la formación de células espumosas y ateromas, dañando así el endotelio vascular.
Gráfica No. 8 Correlación De Los Niveles Séricos De Apo-A Y Apo-BComo podemos observar en la población en estudio, una correlación inversamente proporcional entre los valores séricos de APO-A y APO-B, a medida que aumenta la APO-B, la APO-A va disminuyendo, por tanto, va aumentando el iesgo cardiovascular.
08 09
Posteriormente, se procedió al cálculo de los intervalos de referencia a través de la media y desviación estándar en el caso de fructosa y de los percentiles 5% y 95% para el ácido cítrico y fosfatasas ácidas
Resultados y discusiónAl efectuar el test de diferencias de medias (p< 0,05) para los grupos etarios estudiados, éste indicó que no existían diferencias de medias entre los mismos, por lo cual, se obtuvo los intervalos de referencia para el grupo poblacional sin distinción de edades.
Por otra parte, al aplicar la prueba de normal idad por e l es tad ígra fo de Kolmogorov Smirnov, se determinó un comportamiento normal solo para la fructosa.
Así, los intervalos de referencia obtenidos se muestran en la Tabla Nº 1, en la cual se aprecia los valores para fructosa, obtenidos con la media y desviación estándar, mientras que para el ácido cítrico y las fosfatasas ácidas resultaron de la utilización de los percentiles 5% y 95%.
Al comparar estos intervalos con los utilizados regularmente en el Laboratorio de
Valores de referencia para para fructosa, ácido cítrico y fosfatasas ácidas en plasma seminal en el Laboratorio de Andrología de la Universidad de Los Andes.
Resumen:Con el objetivo de determinar el intervalo de referencia para fructosa, ácido cítrico y fosfatasas ácidas en plasma seminal de pacientes que acuden al Laboratorio de Andrología del Centro de Microscopía Electrónica de la Universidad de Los Andes, se seleccionaron individuos sanos que acudieron a dicho laboratorio en un período de siete años, con edades comprendidas entre 15 y 47 años y cuyos valores de volumen eyaculado, concentración, motilidad y morfología espermática se encontraban dentro del rango de referencia establecido por la Organización Mundial de la Salud. Con los resultados obtenidos de la determinación de las concentraciones de fructosa, ácido cítrico y actividad de las Fosfatas ácidas en el plasma seminal se aplicó un análisis de normalidad y, luego, un análisis de varianza entre grupos etarios. Posteriormente, se calcularon los intervalos de referencia a través de la media y desviación estándar en el caso de fructosa y de los percentiles 5% y 95% para el ácido cítrico y fosfatasas ácidas. No se encontraron diferencias signifiactivas entre los grupos etarios para los tres parámetros estudiados. El inter valo de referencia para la concentración de fructosa resultó entre 179 y 373 mg/dL y entre 344 y 591 mg/dL para ácido cítrico; la actividad de fosfatas ácidas mostró un rango de 418 a 720 UI/mL. De ello se concluyó que los valores de referencia de los parámetros evaluados pueden ser empleados indistintamente en el grupo de edades estudiado y que los mismos presentaron variación con respecto a los anteriormente utilizados en el Laboratorio de Andrología de la Universidad de Los Andes.
IntroducciónEl plasma seminal es un medio rico y complejo que sirve de vehículo, medio nutritivo y protector de los esperma-tozoides; se encuentra constituido por minerales, esteroides, glúcidos, lípidos, p ros tag land inas , enz imas y ot ros componentes (Mlayes y col., 2006). Dentro de estos, marcadores bioquímicos, como: ácido cítrico, cinc, gamma glutamil transpeptidasa y fosfatasas ácidas son útiles en el estudio de la función prostática; así como, la fructosa y prostaglandinas para las vesículas seminales y l-carnitin libre, glicerofosforilcolina y alfa-glucosidasa para la función epididimaria (Organización Mundial de la Salud, 2001; Poirot y Cherruau, 2005). De allí que, su determinación en el laboratorio clínico es importante en la evaluación de la infertilidad masculina (Alvarez, 2003; Gurbuz y col., 2003).
No obstante, la utilidad que pueden tener los exámenes de laboratorio clínico, depende de su confiabilidad y de que se cuente con valores de referencia adecuados (Confederación Latinoamericana de Bioquímica Clínica, 2005). Dichos valores de referencia pueden variar en función del origen geográfico, del sexo y de la edad de los individuos, siendo recomendable que cada laboratorio cuente con sus respectivos intervalos de referencia (Cadenas y col., 2005; Confederación Latinoamericana de Bioquímica Clínica, 2005; Solbergh, 1986)
Así, el Laboratorio de Andrología del Centro de Microscopía Electrónica de la Facultad de Medicina de la Universidad de Los Andes, el cual se encarga no solo del estudio de la infer t i l idad mascul ina , s ino de la
preparación de muestras para inseminación artificial se ha planteado la necesidad de determinar sus valores de referencia para fructosa, ácido cítrico y fosfatasas ácidas prostáticas, siendo éste el objetivo del presente trabajo.
Materiales y métodosPara cumplir e objetivo propuesto se seleccionó un grupo de individuos sanos que acudieron al Laboratorio de Andrología del Centro de Microscopía Electrónica de la Universidad de Los Andes en un período de siete años, con edades comprendidas entre 15 y 47 años y cuyos valores de volumen eyaculado, concentración, motilidad (a+b) y morfología espermática se encontraban dentro del rango de referencia establecido por la Organización Mundial de la Salud (OMS) para dichos parámetros.
Las muestras fueron obtenidas por los pacientes luego de cumplir con las indicaciones establecidas por la OMS y una vez separado el plasma seminal se determinaron las concentraciones de fructosa por el método de Roe modificado, ácido cítrico por el método de Chambón modificado y actividad de las Fosfatas ácidas por el método de Kind y King (Organización Mundial de la Salud, 2001), utilizando un Spec tronic 601 M i l ton Roy como instrumento de medición. Con los resultados obtenidos se aplicó un análisis de normalidad por la prueba de Kolmogorov-Smirnov (p<0,05) y, luego, un análisis de varianza; esto último con el fin de verificar si existían diferencias entre las concentraciones de cada uno de los parámetros por grupos etarios.
APLICACIONES ENEL LABORATORIO
APLICACIONES ENEL LABORATORIO
V E N E Z U E L A
Autores:Institución:
País:E-mail:
Lic. Ibis Cruz1, Lic. Norys Rodríguez2, Dr.Jesús A. Osuna1, MSc.Jesús. Peña2.Centro de Microscopía Electrónica, Facultad de Medicina1, Departamento de Bioanálisis Clínico, Facultad de Farmacia y Bioanálisis2. Venezuelacomentarios@contactoquimico.com
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS.
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Andrología de la universidad de Los Andes (Tabla Nº 2), según el método utilizado, se
Tabla nº 1. Intervalos de referencia para parámetros bioquímicos en plasma seminal
Tabla nº 2. Comparación de los intervalos de referencia con los utilizados previamente
ANALITO
NMEDIA
DESV. ESTÁNDARPERCENTIL 5%
PERCENTIL 95%INTERVALO
FRUCTOSA (mg/dL)
105275,7948,63
--
179 - 373
ÁCIDO CÍTRICO (mg/dL)
96--
344591
344 - 591
FOSFATASAS ACIDASPROSTÁTICAS (UI/mL)
100--
418720
418 - 720
ANALITO
Intervalos de referencia determinados
Intervalos de referencia según el método
FRUCTOSA (mg/dL)
179 - 373
200 - 380
ÁCIDO CÍTRICO (mg/dL)
344 - 591
300 - 600
FOSFATASAS ACIDASPROSTÁTICAS (UI/mL)
418 - 720
400 - 740
10
Resumen Los factores proteolíticos del Sistema de
Activación del Plasminógeno están
asociados con la regulación y control del
cáncer y pronóstico. En pacientes con cáncer
el incremento de estos factores proteolíticos
está asociado con la progresión del tumor y
con una corta supervivencia y/o tiempo sin
enfermedad. Los componentes del sistema
de activación del plasminógeno son de
objetivo potencial para el desarrollo de una
terapia anti-invasiva y anti-metastásica, esta
terapia puede ser posible con componentes
de inhibición de la unión del u-PA a su
receptor, o con inhibidores específicos de su
actividad enzimática. Existen inhibidores
sintéticos de la actividad enzimática del
activador del plasminógeno tipo urokinasa
(u-PA) para prevenir la metástasis del cáncer,
los cuales previenen el crecimiento y la
invasión del tumor.
Palabras claves: Sistema de Activación del
Plasminógeno, cáncer, u-PA.
Introducción Los biomarcadores son herramientas muy
útiles para el diagnóstico y pronóstico de
riesgos en pacientes con cáncer, algunos de
estos biomarcadores son útiles en la
definición y seguimiento de la terapia. En
vista de recientes descubrimientos en la
biología del cáncer de que factores
proteolíticos del Sistema de Activación del
Plasminógeno no solo están asociados con
la regulación y control del cáncer
establecido sino también en el pronóstico,
varios investigadores han tratado de
elucidar el mecanismo celular mediado por
proteasas en la invasión y metástasis del
tumor.
Durante la invasión y metástasis del tumor,
ocurre entrecruzamiento de las células
tumorales, las células del hospedero y la
matriz extracelular por unión e interacción
con la membrana basal y la matriz
extracelular y proteólis is local. La
penetración de las células tumorales focaliza
la actividad proteolítica en la superficie
celular a través de receptores para la
plasmina y el activador del Plasminógeno
tipo uroquinasa (u-PA). El receptor de las
células tumorales para u-PA, denominado u-
PAR, une u-PA liberados de las células
tumorales cercanas, esta unión u-PA/u-PAR
focaliza la acción proteolítica de la superficie
de las células tumorales. El u-PA convierte al
plasminógeno en plasmina, la plasmina
degrada proteínas de la matriz extracelular
facilitando la proliferación de las células del
tumor, invasión y metástasis [1-3]. La acción
proteolítica del u-PA es controlada por sus
inhibidores el Inhibidor del Activador del
Plasminógeno tipo 1 (PAI-1) y el tipo 2 (PAI-
2) los cuales pueden unirse a la superficie de
la célula asociado al complejo u-PAR/u-PA
fo r m a n d o u n co m p l e j o t r i m é r i co
enzimáticamente inactivo receptor-
proteasa-inhibidor el cual es internalizado
por las células del tumor [4, 5].
Al parecer la proteasa u-PA y el inhibidor PAI-
1 están presentes en el tumor para lograr
limitar la proteólisis mediada por el receptor
del u-PA. La internalización y reciclaje del u-
PAR puede restaurar la actividad proteolítica
asociada a la superficie celular. Otras
proteasas conocidas como catepsinas y
metaloroteasas se han visto que están
involucrada en la invasión y metástasis
tumoral interactuando con el u-PA en una
cascada [1, 5].
Estudios clínicos han demostrado que en
general los tumores elevan los niveles
antigénicos de u-PA, u-PAR y/o PAI-1, pero
disminuye los niveles de PAI-2, esto está
asoc iado a empeoramiento de la
enfermedad y conduce a extensión y
metástasis del tumor. Determinación de los
factores proteolíticos son de importancia en
la clínica para definir pacientes de alto riesgo
afectados con tumores sólidos malignos [1].
Componentes del Sistema de Activación del
plasminógeno relevantes en la invasión y
metástasis del tumor:
El u-PA, una molécula central en la
proteólisis pericelular, convier te al
plasminógeno enzimáticamente inactivo a
V E N E Z U E L A
Impacto clínico del Sistema de Activación del Plasminógeno en la Invasión y Metástasis del Tumor: Pronóstico y Terapia.
Autores:Grado académico:
Institución:País:
E-mail:
Mayra Rosa Ruiz Castillo1, Ysabel Alejandra López Ramirez2. 1 Licenciada en Bioanálisis, Universidad de Oriente, Núcleo Sucre, Escuela de Ciencias, Departamento de Bioanálisis, Cumaná-Estado Sucre. 2 Médico Cirujano, PhD en Bioquímica, Universidad Central de Venezuela, Escuela José María Vargas. Venezuelacomentarios@contactoquimico.com
APLICACIONES ENEL LABORATORIO
15
plasmina serinoproteasa activa. El u-PA
media la conversión del plasminógeno a
plasmina esto es controlado por dos
inhibidores el PAI-1 y el PAI-2 los cuales
inactivan al u-PA por unión al u-PA libre en
solución o al u-PA unido a su receptor celular,
u-PAR. El u-PA, u-PAR y PAI-1 y 2 están
presentes en una variedad de células
normales y tumorales. El u-PA es expresado y
producido por células normales como las
células del túbulo renal, células fagocíticas,
neumocitos, queratinocitos, fibroblastos, y
células trofoblásticas de la placenta así como
también por células tumorales como una
pro-enzima (pro-uPA) con poca o ninguna
actividad enzimática intrínseca. Pro-uPA es
activada por una variedad de proteasas
como la plasmina, catepsinas B/L, calicreina,
termolisina convirtiéndola en u-PA una
forma enzimáticamente activa de alto peso
molecular de doble cadena (Figura 1) [1, 2,
6]. El u-PAR es una glicoproteína rica en cisteina,
descrita en 1985 por Vassalli y colaboradores
en mielocitos humanos y en una línea
celular de Leucemia promielocítica U937,
está unido a la membrana plasmática por
una unión covalente del carboxilo
aminoterminal de la proteína a una forma
glicosilada del fosfatidil inositol. La unión del
u-PA al u-PAR se observa en una variedad de
células incluyendo células de Leucemia,
migración de células endoteliales y
quimiotaxis de neutrófilos humanos entre
otros [1, 2]. La eficiente invasión de las células
tumorales, proteólisis focal y metástasis con
el crecimiento de un tumor secundario, está
basado en un crítico balance del u-PA, el
receptor de superficie celular u-PAR, y el
inhibidor PAI-1. Se ha observado en
modelos animales que la sobreexpresión de
u-PAR en células de cáncer de mama resulta
en un incremento en la invasión y metástasis
del tumor. El u-PAR no solo se une a u-PA sino
también a una proteína rica en la matriz
extracelular como lo es la vitronectina, así
puede regular la función de las células,
adhesión celular y directamente la
migración de las células adherentes [1-3, 5].
Significado clínico de los componentes del
Sistema Activador del plasminógeno: Ciertos componentes del sistema de
activación del plasminógeno pueden servir
como marcadores pronósticos en el cáncer
humano. Los pacientes con cáncer pueden
ser definidos como de bajo y alto riesgo
dependiendo de la cantidad de u-PA, u-PAR,
o PAI-1 en su tumor primario. Muchos
investigadores determinan estos factores en
los extractos de tejido de cáncer utilizando
ELISA, inmunohistoquímica o midiendo la
ac t iv idad de u-PA. Estos fac tores
proteolíticos como pronóstico de la
enfermedad del cáncer han sido observados
en una variedad de tumores, incluyendo
cáncer de mama, cuerpo uterino, ovario,
estómago, colon, pulmón, cerebro, hígado,
vejiga y tejido blando. Análisis estadísticos
de estos factores revelaron que u-PA, u-PAR y
PAI-1/2 son estadísticamente factores
pronóstico independientes con la facultad
de predecir si el paciente está libre de
enfermedad y/o la supervivencia del mismo
[5, 7, 8].
Cáncer de mama: En el mundo occidental, el cáncer de mama
afecta a una de cada 8 a 10 mujeres. Las
pacientes cuyos nódulos linfáticos axilares
están cargados de células tumorales (2/3 de
todas las pacientes con cáncer de mama) en
general reciben una misma terapia
adyuvante. El otro tercio cuyos nódulos
linfáticos axilares están libres de células
cancerígenas (llamadas cáncer de mama
nódulo negativo) antes de considerar la
terapia adyuvante se les estima la
probabil idad de recurrencia de la
enfermedad y el beneficio de la terapia, de
este modo las pacientes nódulo negativo
con alto riesgo pueden ser identificadas y
t ratadas. Los factores pronóst icos
tradicionales usados para identificar a las
pacientes nódulo negativos con alto y bajo
riesgo de recurrencia de la enfermedad, eran
parámetros histomor fológicos (por
ejemplo: grado nuclear y tamaño del tumor)
además de el estado del receptor de las
hormonas tiroideas. Otros factores
pronósticos como los factores de proteólisis
(u-PA, mataloproteasas, catepsinas, sus
inhibidores y receptores) han tenido gran
aceptación clínica, estos nuevos factores
biológicos se ha visto que son mejores que
los otros [1, 4, 5].
La determinación de los fac tores
proteolíticos u-PA, u-PAR y PAI-1 en el tejido
tumoral de las pacientes con cáncer de
mama, donde están elevados algunos de
estos factores en el tumor primario, indica
un alto riesgo de desarrollar metástasis. En
contraste al u-PA y PAI-1 el aumento de los
niveles del activador del plasminógeno tipo
tisular (t-PA) es indicador de buen
pronóstico. Duffy y colaboradores en 1988,
fueron los primeros en describir una
correlación significativa entre los niveles
enzimáticos elevados del u-PA en extractos
de tejido de cáncer primario de mama y la
progresión del cáncer [9]. Autores
confirmaron que la determinación
antigénica del u-PA es un factor pronóstico
e s t a d í s t i c a m e n t e s i g n i f i c a t i v o ,
independientes de los factores pronósticos
tradicionales [10-12].
Jänicke y colaboradores, 1989 reportaron
que altos niveles de PAI-1 en el tejido de
t u m o r p r i m a r i o d e m a m a e s t á
correlacionado con un pobre pronóstico de
las pacientes con cáncer de mama. La
elevación del u-PAR, en el tejido de un tumor
primario es de mal pronóstico [12]. En
contraste niveles elevados de PAI-2 indica
buen pronóstico. No es fácil de entender por
qué un elevado contenido de PAI-1 en el
tumor indica pobre pronóstico para una
paciente con cáncer de mama; una
explicación es que, por interacción del PAI-1
con el u-PA, se previene la degradación del
estroma del tumor (tejido conectivo o matriz
extracelular) y es posible la formación de
nueva matr iz extracelular. El u-PA
enzimáticamente activo se une a la
superficie de las células del tumor a través de
su receptor u-PAR, el PAI-1 puede unirse e
inactivar el u-PA, formando un complejo
APLICACIONES ENEL LABORATORIO
1716
ternario compuesto por u-PAR/u-PA/PAI-1 el
cual es rápidamente internalizado por la
célula tumoral. La inactivación y liberación
de la actividad proteolítica del u-PA de la
superficie de las células del tumor puede
prevenir la activación del plasminógeno y
proteger a la matriz extracelular [1, 2, 12].
Según observaciones de Kanse y col. y
Stefansson y col. (1996), indican que el PAI-1
puede estar también involucrado en la
modulación del u-PAR unido a los
componentes matriz extracelular. El efecto
del PAI-1 en la malignidad de las células
tumorales está relacionada con la co-
expresión del u-PA, su receptor y el PAI-1 es
necesario para focalizar y optimizar la
invasión así como para la actividad
angiogénica. El PAI-2 muy probablemente
actúa en las células tumorales en una vía
diferente al PAI-1. El complejo u-PA/PAI-2 no
es internalizado al unirse al receptor del u-PA
en las células tumorales. El ELISA se usa para
determinar u-PA, u-PAR, PAI-1 y PAI-2 en
tejido de cáncer de mama. La distribución
celular del u-PA, u-PAR y PAI-1/2 en tejido de
cáncer de mama ha sido documentado
además por inmunohistoquímica y RNA
mensajero en hibridización in situ por varios
autores [13, 14].
Los factores proteolíticos son de especial
interés en la clínica de enfermedades de
cáncer porque juegan un papel importante
en la invasión del tumor, angiogénesis y
metástasis. El alto riesgo de pacientes con
cáncer de mama puede ser identificado por
e s t o s f a c t o r e s p e r m i t i e n d o u n a
individualización de las pacientes tratadas
con terapia adyuvante. En cáncer de mama
nódulo negativo, generalmente se asume
que el pronóstico es bueno en un 70 % de las
pacientes con cirugía del tumor primario sin
recibir ninguna terapia adyuvante; 30 % de
estas pacientes nódulo negativas tienen un
riesgo silente de desarrollar metástasis [9,
11].
Se ha observado que las pacientes con
cáncer de mama nódulo negativos con altos
niveles de PAI-1 experimentan un
riesgoaumentado de desarrollar metástasis.
En comparac ión con los fac tores
pronósticos tradicionales la incidencia de
recurrencia de la enfermedad en 5 años
después de cirugía se estima en 39 % en el
grupo de alto riesgo definido por elevados
niveles de u-PA/PAI-1 versus 6 % en el grupo
de bajo riesgo, bajos niveles de u-PA/PAI-1
[2, 5, 9,11,12].
El poder del u-PA para predecir recurrencia
es fuerte en los primeros 3 años,
especialmente en pacientes nódulo
negativo. Existen posibles asociaciones
entre los niveles de u-PA o PAI-1 y la eficacia
de la terapia de reemplazo hormonal en 235
pacientes con cáncer de seno, han revelado
que los niveles de u-PA en el tumor primario
de mama podrían ser útiles en la predicción
de supervivencia en respuesta a la terapia
con Tamoxifen. Las pacientes con u-PA
negativo exhiben mejor respuesta al
Tamoxifen que las pacientes u-PA positivas;
por el contrario las pacientes con altos
niveles de u-PA y/o PAI-1 raramente
responden a terapia endocrina cuando
ocurre metástasis de la enfermedad [2, 9,
12].
Cáncer del tracto urogenital: Fuertes evidencias han demostrado que el
u-PA, u-PAR y/o PAI-1 o PAI-2 son predictores
de pobre pronóstico en pacientes con
cáncer de ovario, endometrio, cuello
uterino, vejiga o riñón. Kuhn y colaboradores
en 1994 y Konecny y colaboradores en 2001
determinaron la existencia de un fuerte
impacto pronóstico del u-PA y PAI-1 en
pacientes con cáncer de ovario en estado
avanzado, las pacientes con bajos niveles de
u-PA y PAI-1 en su tumor primario tienen
mucho mejor pronóstico (supervivencia)
que las pacientes con elevados niveles de
e s t o s f a c t o re s [ 1 5 , 1 6 ] . H a s u i y
colaboradores, en 1992 demostraron que el
u-PA es un marcador pronóstico en
pacientes con cáncer de vejiga; el u-PA
antigénico determinado por ELISA fue
significativamente menor en pacientes con
bajo grado y cáncer no invasivo que otros
tipos de cáncer de vejiga. Se ha observado
en estudios prospectivos de pacientes con
cáncer renal que elevados niveles de u-PA, u-
PAR y PAI-1 son predictores tempranos de la
enfermedad recurrente y metástasis a
distancia [17].
Cáncer del tracto gastrointestinal: Elevados niveles de u-PA y PAI-1 han sido
descritos en tumor primario de esófago,
estómago, colorectal y cáncer pancreático
en comparación con la mucosa normal. La
invasión tumoral y las metástasis dependen
de la destrucción de la matriz extracelular y
de la membrana basal de los vasos, con el
paso a la circulación de las células tumorales.
Los tumores con alto nivel proteolítico
tienen más capacidad invasiva. Uno de los
sistemas proteolíticos más importantes es el
activador del plasminógeno (u-PA), que
incluye una proteasa, el receptor de esta
proteína y el inhibidor del activador del
plasminógeno (PAI). El cáncer gástrico tiene
una sobreexpresión del sistema uPA. El
inhibidor PAI-1 se ha considerado un factor
pronóstico independiente de supervivencia
en algunas series. Se han descrito otras
proteasas en cáncer de estómago, como
metaloproteínas, cathepsina D, tripsina, etc
[18, 19].
El análisis de todos estos factores biológicos
permite tener un mejor conocimiento del
pronóstico de los pacientes para adecuar los
tratamientos. Además estos factores se
p u e d e n u t i l i z a r p a r a m e j o r a r l a
estadificación de la enfermedad mediante la
detecc ión precoz de enfer medad
diseminada, de otra forma no identificable
por métodos radiológicos o clínicos,
mediante el análisis molecular en sangre
periférica de PAI [18, 20].
El impacto pronóstico de elevados niveles
de u-PA y PAI-1 en pacientes con resección
completa de cáncer gástrico está asociado
con pobre pronóstico, además se ha
mostrado que pacientes con cáncer gástrico
con u-PA positivo/PAI-2 negativo tienen un
peor pronóstico que otros pacientes. El PAI-1
y u-PA positivos pueden servir como
factores pronósticos en el cáncer gástrico,
para predecir la corta supervivencia de los
pacientes lo cual es de gran importancia
clínica. También se ha observado que la
expresión del u-PA, u-PAR, PAI-1 y PAI-2
tienen importancia predictiva en el
desarrollo de cáncer colorectal, metástasis
hepática y supervivencia, independiente de
los parámetros de mejora cl ínico-
patológico. Además el u-PA, u-PAR y/o PAI-1
y PAI-2 son importantes en el pronóstico de
cáncer de cerebro y pulmón [18, 20, 21].
El Sistema de activación del plasminógeno y
su asociación con el tumor son de interés
para la terapia del cáncer:
Alrededor de 1947 Astrup y Permin
describieron la actividad del activador del
plasminógeno en tejido, en 1951 Williams
demostró la presencia de sustancias
(uroquinasa) capaces de activar al
plasminógeno en orina. Se ha demostrado
que los componentes del sistema de
activación del plasminógeno están
involucrados en la proliferación, invasión y
metástasis de las células tumorales. Se ha
sugerido que la invasión de estos factores
podría servir como objetivo para nuevos
tratamientos con el fin de prevenir la
invasión y metástasis del tumor [1, 6].
La estrecha correlación entre elevados
niveles de u-PA, u-PAR y/o PAI-1 y PAI-2 en el
tejido de cáncer primario y el fenotipo de
malignidad son puntos básicos para
explorar nuevos conceptos orientados a la
biología del tumor con el objeto de suprimir
la expresión del u-PA, u-PAR y PAI-1, inhibir la
actividad enzimática del u-PA o abolir la
interacción del u-PA con su receptor celular
(u-PAR) [1, 6].
Se ha observado que la interrupción de la
interacción del u-PA a su receptor reduce la
invasión y crecimiento del tumor; también la
prevención de la metástasis del cáncer por
inhibidores sintéticos de la actividad
enzimática del u-PA, además de la
capacidad de un inhibidor selectivo de la
actividad enzimática del u-PA para prevenir
el desarrollo del crecimiento y la invasión del
tumor. Estos estudios demuestran que
inhibidores específicos del u-PA pueden
disminuir el tamaño del tumor primario y la
invasión así como la metástasis en el cáncer
de mama y próstata donde el u-PA está
implicado como uno de los mayores
factores patogénicos. La interacción del u-
PAR con las integrinas, el receptor celular de
las proteínas de matriz extracelular, pueden
ser bloqueadas por un péptido sintético que
se une al u-PAR e interrumpe la interacción
matriz/célula tumoral [1, 6].
Conclusión Los factores proteolíticos u-PA, u-PAR, PAI-1 y
PAI-2 del sistema de activación del
plasminógeno están implicados en la
degradación y remodelación del tejido
normal, cancerígeno y de la matriz
extracelular. En pacientes con cáncer el
incremento de estos factores proteolíticos
está asociado con la progresión del tumor y
con una corta supervivencia y/o tiempo sin
enfermedad. Los componentes del sistema
de activación del plasminógeno son de
objetivo potencial para el desarrollo de una
terapia anti-invasiva y anti-metastásica, esta
terapia puede ser posible con componentes
de inhibición de la unión del u-PA a su
receptor, u-PAR; o con inhibidores
específicos de la actividad enzimática del u-
PA. Existen inhibidores sintéticos de la
actividad enzimática del u-PA para prevenir
la metástasis del cáncer, los cuales previenen
el crecimiento y la invasión del tumor.
APLICACIONES ENEL LABORATORIO
APLICACIONES ENEL LABORATORIO
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18 19
Resumen La vitronectina es una proteína adhesiva presente en el plasma y relacionada con la hemostasia al regular la coagulación y fibrinólisis. Entre sus funciones se encuentra la estabilización del inhibidor del activador tisular del plasminógeno tipo 1 (PAI-1). Para estudios funcionales de la vitronectina es necesario tener esta proteína adhesiva en forma purificada, para lo cual se estandarizó un método rápido, económico y de buen rendimiento, que faciliten el aislamiento de la vitronectina plasmática el cual servirá en futuros trabajos para aislar inmunoglobulina y IgG que servirán como ligando en una cromatografía de afinidad. Se purificó vitronectina a partir de 100 ml de plasma fresco humano obteniendo vitronectina con un alto grado de pureza, con la cual fue preparado un antisuero anti-vitronectina en conejos Nueva Zelanda blancos, por medio de inmunodifusión se mostró un título de 1/16 reaccionando con una mezcla de plasmas humanos y con vitronectina humana comercial.
Palabras claves: Vitronectina, antisuero anti-vitronectina, cromatografía.
Introducción La vitronectina (VN) es una glicoproteína plasmática y de matriz extracelular, que se encuentra circulando en plasma en una concentración de 0,2 ìg/ml, en dos formas moleculares, una de cadena simple de 75 kDa y otra formada por dos subunidades de 65 kDa y 10 kDa; es una proteína adhesiva
relacionada con la hemostasia al regular el sistema de la coagulación y el sistema fibrinolítico. Entre las funciones de la VN se encuentra la estabilización del inhibidor del activador tisular del plasminógeno tipo 1 (PAI-1), al formar con este inhibidor dímeros y multímeros estables mantenidos por enlaces disulfuros, lo que regula la actividad funcional del PAI-1 como serpina y su eliminación de la circulación, además la VN tiene un efecto antitrombótico al inhibir la agregación plaquetaria [1]. Existen trabajos que sugieren que la regulación de la actividad funcional del PAI-1 es importante en los fenómenos de trombosis vascular. Elevadas concentraciones de PAI-1 pueden constituir un importante factor de riesgo de infarto al miocardio [2]. El PAI-1 regula negativamente el funcionamiento del sistema fibrinolítico por lo que constituye uno de los principales objetivos de estudio en los tratamientos antitrombóticos actuales [3].
Para realizar estudios funcionales que relacionen la VN con la hemostasia, e s p e c í f i c a m e n t e s u p a p e l c o m o estabilizante del PAI-1, principal inhibidor del sistema fibrinolítico, es necesario tener en forma purificada esta proteína adhesiva. Considerando esto en el presente trabajo se aisló la VN a partir del plasma humano para así preparar un suero anti-vitronectina (anti-VN) en conejos Nueva Zelanda. Logrando obtener un método más rápido, económico y de buen rendimiento, que facilite el aislamiento de la VN, el cual servirá en
futuros trabajos para aislar inmunoglobulina y IgG que servirán como ligando en una cromatografía de afinidad.
Materiales y métodos Reactivos: Anticuerpo anti-VN humana comercial (American Diagnostica, USA); proteínas estándares de baja masa molecular para electroforesis (Bio Rad, USA); adyuvante completo de Freund's, los a nt i c u e r p o s s e c u n d a r i o s a nt i - I g G conjugados con peroxidasa, cloruro de bario, EDTA, PMSF, SDS, sulfato de amonio, TEMED, y demás reactivos químicos (Sigma Chemical Company, USA); BLUE-Sepharose, D E A E - S e p h a c e l , S e p h a c r y l S - 2 0 0 (Pharmacia, Suecia); mercaptoetanol, persulfato y sulfato de amonio (Merck, Alemania). Equipos: Colector de fracciones modelo Fracc 100 unidad óptica, bomba peristáltica, (Pharmacia Fine Chemicals, Suecia); Cámara de electroforesis “Mini-Protean II” (Bio-RAD, USA).
Las muestras de plasma fresco fueron donadas, antes de ingresar al estudio, dieron su consentimiento por escrito, que fue aprobado por el Comité de Ética del IVIC y por el Banco Municipal de Sangre, Caracas, Venezuela. Se usó conejos Nueva Zelanda blancos con una peso promedio de 1,5 – 2,0 kg. Se siguieron las normas establecidas por el Manual de la Sociedad Fisiológica Americana y el modelo animal del Subcomité de la Sociedad Internacional de Trombosis y Hemostasia, y respetando los derechos del animal [4].
DESARROLLO ENEL LABORATORIO
Mayra Rosa Ruiz Castillo1, Ysabel Alejandra López Ramirez2. 1 Licenciada en Bioanálisis, Universidad de Oriente, Núcleo Sucre, Escuela de Ciencias, Departamento de Bioanálisis, Cumaná-Estado Sucre. 2 Médico Cirujano, PhD en Bioquímica. Universidad Central de Venezuela, Escuela José María VargasVenezuelacomentarios@contactoquimico.com
Autor:Grado Académico:
Institución:País:
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Se utilizó una modificación del método de Bjorn Dahlback y Eckhard [5]; 100 ml de una mezcla de plasma fresco humano se centrifugaron a 3.000 rpm por 15 minutos, se agregaron inhibidores de proteasas: benzamidina/HC1 (10 mmol/l) y PMSF (1 mmol/l); y glutation reducido (1 mmol/l). Se precipitó el plasma con BaCl2 1 mol/l (80 ml/l plasma), agregándose lentamente por 1 hora; se centrifugó a 9.500 rpm por 15 minutos; se recogió el sobrenadante en el cual está la VN y se dializó durante toda la noche contra el tampón fosfato de sodio 20 mmol/l, EDTA 2 mmol/l, pH 7,0 conteniendo glutation reducido 1 mmol/l (tampón 1 o de equilibrio).
El dializado anterior se centrifugó a 9.500 rpm por 15 minutos, y el sobrenadante se pasó por una columna de DEAE-Sephacel (30 x 2 cm) equilibrada con el tampón 1, y con el tampón de equilibrio conteniendo NaCl 50 mmol/l (tampón 2). Con las fracciones obtenidas se realizó electroforesis en geles de poliacrilamida-SDS (SDS-PAGE) al 12%, en condiciones de redución y aquellas donde se encuentra una mayor proporción de bandas de peso molecular semejante a la VN (65-75 kDa), fueron agrupadas y precipitadas con (NH4)2SO4, hasta un 70% de saturación; la solución se agitó por 1 hora y se centrifugó a 9.500 rpm por 15 min. El precipitado se resuspendió y dializó toda la noche con tampón Tris-HCl 50 mmol/l, NaCl 0,15 mol/l; pH 7,4 conteniendo Benzamidina-HCl 2 mmol/l, glutation reducido 1 mmol/l y EDTA 2 mmol/l (tampón 3) y luego se centrifugó a 9.500 rpm por 15 minutos. El sobrenadante fue pasado por una columna de BLUE-Sepharose (20 x 2 cm) equilibrada con el tampón 3, se hizo elución con tampón de equilibrio conteniendo NaCl 1 mol/l. Con estas fracciones se realizaron SDS-PAGE al 12%, en condiciones de reducción y donde se encontraron en mayor proporción bandas con peso molecular semejante a la VN (65-75 kDa) fueron recogidas y precipitadas con (NH4)2SO4, hasta un 70 % de saturación; la solución se agitó por 1 hora y se centrifugó a 9.500 rpm por 15 minutos.
El precipitado anterior se resuspendió en tampón 3 y se pasó por una columna de Sephacryl S-200 (70 X 1,5 cm); las proteínas se eluyeron con el tampón de equilibrio. Según los resultados de SDS-PAGE, las fracciones que podían contener la VN fueron colectadas, precipitadas con (NH4)2SO4 y centrifugadas; el precipitado se resuspendió en un mínimo
volumen de tampón 3; y fue almacenada en alicuotas a –20ºC. La detección de la VN en la muest ra obtenida en cada paso de l procedimiento de purificación aplicado, se realizó por inmunotransferencia; la pureza de la preparación final de la VN obtenida se analizó por SDS-PAGE al 12% en condiciones reducidas, con la técnica de Laemmli [6].
La concentración de proteínas se determinó por el método de Lowry [7]. El análisis electroforético de las proteínas se realizó en geles de SDS-PAGE al 12%, y al 4% siguiendo la técnica descrita por Laemmli [(6]. Las proteínas se separaron a 100 voltios y 40 mA, a temperatura ambiente, en geles de SDS-PAGE al 12% en condiciones de reducción, por el método de Laemmli [6]. Las proteínas se transfirieron a membranas de nitrocelulosa, utilizando el tampón Tris-HCl 25 mmol/l, glicina 192 mmol/l, metanol al 20%, pH 8,3 a 4ºC por 2 horas, usando 100 voltios y 250 mA. Se reveló la presencia de VN, en la membrana de nitrocelulosa colocando la membrana en solución de bloqueo (leche descremada al 5% en tampón fosfato salino-PBS, pH 7,0; conteniendo azida de sodio al 10%). Durante toda la noche con agitación constante. Al día siguiente se agregó el anticuerpo primario anti-VN humano diluido 1/500 preparado en la solución de bloqueo, se incubó por 6 horas con agitación continua y luego se lavó con PBS, pH 7,0 durante 20 minutos; y se dejó la membrana toda la noche en PBS con agitación constante.
La membrana se lavó con Tris-HCl 50 mmol/l, pH 7,5; se agregó el anticuerpo secundario anti-IgG marcado con peroxidasa diluido 1/1.000 en solución bloqueadora libre de azida de sodio y fosfato, se mantuvo por 2 horas con agitación lenta; se lavó durante 20 minutos por 3 veces con tampón Tris-HCl 50 mmol/l, pH 7,5. El revelado se realizó utilizando una mezcla que contenía 6 mg de diaminobenzidina en 9 ml de tampón Tris-HCl 0,01 mol/l, pH 7,6; 1 ml de cloruro de cobalto al 0,3% y 10 ìl de H2O2 al 30%. Se detuvo la reacción lavando la membrana con agua destilada, se tapó con papel aluminio y se fotografió de inmediato. Con la muestra de VN aislada, se procedió a la obtención del suero anti-VN, siguiendo el método descrito por Carvajal [8], se utilizaron conejos Nueva Zelanda blancos, los cuales fueron inoculados por inyección subcutánea de 0,5 ml de la VN purificada (1 mg/ml), mezclados con 0,5 ml del adyuvante completo de FREUND'S. Después de 21 días se
administró una inyección intramuscular en diferentes lugares (patas, cuello), con 0,5 ml de VN (1 mg/ml) sin adyuvante.
A los 31 días los conejos fueron sangrados a través de la arteria central de la oreja, el suero obtenido se guardó en alícuotas a – 20ºC. Para detectar la presencia de anticuerpos anti-VN humana en el suero obtenido en los conejos, se utilizó la técnica de inmunodifusión radial descrita por Ouchterlony [9]. En placas de vidrio (2,6 x 7,6 cm) se agregaron 3 ml de agar al 1,1% preparado en tampón Veronal sódico (Veronal sódico 10,3 g/l, citrato trisódico 1,5 g/l, pH 8,8); se dejó solidificar el gel en una superficie nivelada, y se realizó orificios en la periferia. En los orificios periféricos se colocaron 5 ìl del suero (diluciones seriadas desde 1/1 hasta 1/32) y en el orificio central 5 ìl de la muestra de VN humana purificada, que se utilizó para la inmunización. La placa se colocó en una cámara húmeda por 24 horas a temperatura ambiente. Se comprobó la formación de bandas de precipitación y se tomaron fotografías. Para demostrar que el suero anti-VN preparado en conejos era específico para VN, se realizó una inmunodifusión.
Resultados La VN fue aislada a partir del plasma humano, realizando primero una adsorción de los factores dependientes de la vitamina K con cloruro de bario, posteriormente precipitaciones con sulfato de amonio y cromatografías de intercambio iónico, afinidad sobre BLUE-Sepharose y gel filtración; procedimiento que se realizó en una semana. A partir de 100 ml de una mezcla de plasma fresco, se lograron obtener un 2,5% de VN del contenido en plasma. De las 150 fracciones (7 ml) que se colectaron; en la columna de DEAE-Sephacel, se agruparon las fracciones donde se detectaron con mayor intensidad bandas proteicas con masas moleculares entre 65 y 75 D, donde se esperaba migraría la VN. De las 110 fracciones (4 ml) obtenidas por BLUE-Sepharose, según las electroforesis, se agruparon las fracciones 16 a la 20 y fueron concentradas por precipitación con sulfato de amonio y cromatografiada sobre Sephacryl S-200 mostró que según el perfil electroforético las fracciones 18 a 20, contenían en mayor proporción a la VN, las cuales fueron concentradas y almacenadas para futuros experimentos.
La muestra de VN humana aislada por el
Purificación de Vitronectina Humana para la obtención de Antisuero Antivitronectina.
V E N E Z U E L A
DESARROLLO ENEL LABORATORIO
20 21
Autor:
Grado Académico:
Institución:Puesto:
País:E-mail:
PQFB Rosalba Torres-Luna1, PQFB Diana Rodríguez García1, MC Alicia Zavala-Stiker2, MSP, Lilia Esperanza Fragoso-Morales21Pasantes de la Carrera de Químico Farmacobiólogo, 2Profesor de la Facultad de Ciencias Químicas UASLPLaboratorio de Micología. Facultad de Ciencias Químicas, Universidad Autónoma de San Luís Potosí.Méxicocomentarios@contactoquimico.com
INVESTIGACIÓN
Micosis en la Región Huasteca de San Luis Potosí
Objetivo. Determinar la frecuencia de las micosis de atención dermatológica, diagnosticadas en el laboratorio de Micología de la Facultad de Ciencias Químicas UASLP. De un núcleo poblacional de la Región Huasteca del Estado de San Luís Potosí en el periodo de marzo de 2006 a marzo de 2007.
Material y Métodos. Estud io prospec t ivo, desc r ipt ivo y observacional realizado en 100 pacientes que acudieron a consulta en la clínica "El buen Samaritano", localizada en el municipio de Tancanhuitz de Santos S.L.P. Fueron recolectadas 100 muestras de escamas cutáneas, pelo y exudados y sometidas a examen microscópico directo, se cultivaron en agar Saboraud dextrosa y en agar micobiotic. Resultados. De los 100 pacientes explorados, al 74% se le diagnosticó una micosis. De estos el 85% correspondía a micosis superficiales, el 11 % a oportunistas y el 4% a subcutáneas; de las superficiales la más frecuente fue la dermatofitosis (88.7 %) y la pitiriasis versicolor (11.3 %). El agente causal más frecuente de las tiñas fue Trichophyton rubrum. Se observaron dos casos de tiña de la cabeza por M. canis. De las subcutáneas se estudiaron tres casos de actinomicetoma por Nocardia sp. y una cromó micosis por Fonsecaea pedrosoi. Las oportunistas correspondieron principalmente a intertrigos por levaduras, predominando Trichosporon sp. sobre Candida sp. Conclusiones. Las tiñas fueron las principales micosis superficiales diagnosticadas en los pacientes atendidos. De las subcutáneas sobresale la presencia de actinomicetomas y cromomicosis y en las oportunistas la etiología predominante de
Trichosporon sp. en los intertrigos. Palabras Clave: Micosis, Huasteca, San Luís Potosí
IntroducciónLa Huasteca Potosina, una de las cuatro zonas que conforman el estado de San Luís Potosí, se encuentra enclavada en medio de la Sierra Madre. Colinda con los estados de Hidalgo, Veracruz y Querétaro y cuenta con 20 municipios. Está conformada por una vasta planicie con una suave inclinación hacia el oriente que se extiende al este y al norte de las estribaciones de la Sierra madre oriental. Goza de un clima tropical con abundantes lluvias en verano y temperaturas que oscilan durante el año entre los 25 y 47°C Esta paradisíaca región recibe su nombre por la presencia predominante de grupos indígenas huastecos, que en contraste con la generosidad de su tierra viven en su mayoría en condiciones de pobreza.1
En el municipio de Tancanhuitz de los Santos se localiza una pequeña clínica “El Buen Samaritano” en la que se brinda atención primaria para la salud de los pobladores y además se ha establecido atención de algunas especialidades a través de servicio social. Particularmente, se brinda atención dermatológica por medio de visitas bimensuales por parte del equipo de estudiantes y especialistas en Dermatología del Hospital “Dr. Ignacio Morones Prieto”, bajo la dirección del Dr. Benjamín Moncada, a ese equipo se ha unido el personal del laboratorio de Micología de la Facultad de Ciencias Químicas de la UASLP. para prestar apoyo diagnóstico de laboratorio.
Las micosis son infecciones causadas por hongos, la OMS las ha clasificado como superficiales, subcutáneas, profundas y oportunistas. Las micosis superficiales afectan piel y anexos, las más frecuentes son las dermatofitosis y la pitiriasis versicolor. Las subcutáneas inician por un traumatismo y afectan a hospederos inmunocompetentes, las más importantes son el micetoma, la cromomicosis y la esporotricosis. La primera de ellas es una patología que puede tener etiología micótica, en ese caso se le denomina Eumicetoma, o puede ser causada por bacterias superiores en ese caso se le denomina Actinomicetoma. Las micosis profundas se localizan regionalmente y afectan órganos y sistemas, por lo tanto suelen ser graves y de difícil diagnóstico, existen cuatro de ellas, la histoplasmosis, la coccidioidomicosis, la blastomicosis y la paracoccidioidomicosis. Las opor tun is tas dependen de fac tores predisponentes que favorezcan la infección por el agente etiológico, principalmente el grado de inmunocompromiso del hospedero; las más frecuentes son la candidosis y la criptococosis 2.
Las condiciones climatológicas, geográficas y socioeconómicas de la región Huasteca resultan ideales para la presencia de micosis en sus habitantes, y en este caso se pretende d e t e r m i n a r l a f re c u e n c i a d e e s t o s padecimientos en el núcleo poblacional que acude a las visitas periódicas de los especialistas en dermatología, mediante un análisis retrospectivo y longitudinal de los diagnósticos micológicos establecidos por el laboratorio de Micología, durante un periodo de un año, 2006 a 2007.
Material y métodos
procedimiento anterior, al ser analizada por electroforesis en geles de SDS-PAGE al 12%, en condiciones reducidas, mostró la presencia de una banda de masa molecular aproximada de 75 kDa, muy semejante a la VN humana comercial que se utilizó como referencia, sin la presencia de otras bandas proteicas contaminantes relevantes. La VN obtenida fue identificada por medio de una inmunotransferencia, utilizando un anticuerpo anti-VN humana comercial; se detectó una banda proteica similar a la observada en la muestra de plasma humano, que se utilizó como control positivo, (Figura 2). El suero anti-VN humano preparado en los conejos, al evaluarlo con el ensayo de inmunodifusión formó arcos de precipitación con una dilución 1/16, de la muestra de VN que se utilizó como inmunógeno.
Con el suero obtenido por medio de una inmunodifusión se mostró que el suero anti-VN humano obtenido formó un arco de precipitación bien definido, con una mezcla de plasmas humanos citratados (Figura 4); e igualmente con una muestra de VN humana comercial.
Discusión El procedimiento que aplicamos para la obtención de la VN humana fue una modificación del método reportado por Bjorn Dahlback y col. [5], en el cual se realizaron precipitaciones previas con cloruro de bario y polietilenglicol, seguido d e t r e s c r o m a t o g r a f í a s s o b r e DEAE–Sephacel, BLUE-Sepharose y Sephacryl S-200. Entre las modificaciones se encuentra que, previo a las cromatografías, n o s e p r e c i p i t ó e l p l a s m a c o n polietilenglicol, debido a que este procedimiento incrementó la densidad de la muestra, retardando el tiempo de aplicación de la misma sobre la columna de DEAE-Sephacel; pensamos que la presión que se genera en el tope de la columna se debe en parte a la presencia en la muestra inicial, el plasma, del fibrinógeno plasmático, el cual puede estar coagulándose, formando monómeros de fibrina, lo que aumenta la viscosidad del plasma; la omisión de la precipitación con polietilenglicol permitió pasar la muestra a través de la primera columna con mayor facilidad y en un menor
tiempo, evitando la degradación de la VN. La muestra de VN obtenida, presentó un alto grado de pureza, y un peso molecular de alrededor 75 kDa, valor que coincide con el reportado por otros autores [1, 2]. En la m u e s t r a o b t e n i d a s e c o m p r o b ó inmunológicamente la presencia de la VN por medio de una inmunotransferencia con un anticuerpo anti-VN humana comercial. La recuperación de VN en nuestro caso fue del 2,5%, la cual fue calculada según la concentración de proteínas en la muestra obtenida, tomando como referencia los niveles teóricos de esta proteína en plasma ( a l re d e d o r d e 0 , 2 u g / m l ) . O t ro s procedimientos de purificación de VN, tales como el desarrollado por Mimuro y Loskutoff [10] reportan una recuperación del 0,5 y 0,6 %, atribuido a la alta tendencia de esta proteína de agregarse.
La absorción de las proteínas dependientes de la vitamina K, con Cloruro de bario, evita la activación de la cascada de la coagulación, con la subsiguiente generación de trombina, que activa otras pro-enzimas de la hemostasia que pueden producir proteólisis de la VN. La adicción de inhibidores de proteasas desde el inicio del proceso de purificación: benzamidina (inhibidor de proteasas tipo serina) y EDTA (inhibidor de metaloproteasas); y la presencia de benzamidina evita la degradación de la VN por proteasas que pueden generarse durante el proceso; la inclusión del agente reductor “glutation reducido” evita la formación de agregados de VN, los cuales pueden dificultar el proceso de aislamiento y el rendimiento final.
Tomando como referencia la movilidad electroforética de la VN, reportada en la literatura, entre 65 y 75 kDa [1, 2], las electroforesis en geles de poliacrilamida-SDS al 12%, en condiciones reducidas, nos permitieron el rastreo de la VN en las diversas fracciones, para así poder agrupar aquellas donde había mas probabilidad de encontrar esta proteína. Con las diferentes muestras obtenidas en cada paso, por medio del reconocimiento inmunológico por inmunotransferencia con un anticuerpo anti-VN comercial, se avanzó en el procedimiento, de una manera más segura y a un costo razonable. La cromatografía de intercambio iónico sobre DEAE-Sephacel
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fue el paso crítico en relación con la recuperación; probablemente existan isoformas de la VN que pueden estar siendo eluidas a diferentes fuerzas iónicas.
Para la inmunización de conejos, es evidente que la metodología utilizada [8] resultó favorable para nuestro estudio, ya que para la inoculación se usaron cantidades muy pequeñas de VN purificada, lográndose una muy buena respuesta inmunológica; el título del suero obtenido, determinado por la técnica de inmunodifusión radial, resultó ser de 1/16. Con el suero preparado se lograron obtener bandas de precipitación por inmunodifusión, utilizando como antígeno muestras de plasma humano y VN humana comercial, lo que confirma la presencia en este suero de anticuerpos específicos contra VN humana.
La baja recuperación de la VN obtenida con p r o c e d i m i e n t o s d e p u r i f i c a c i ó n convencionales [5] justifica el desarrollo de una nueva metodología, aplicando nuestros recursos metodológicos y reactivos, tal como una cromatografía por afinidad con los anticuerpos anti- VN aislados del suero preparado en este trabajo. La incorporación de esta nueva herramienta permitirá aislar de forma rápida, económica y con una mayor recuperación la VN, para futuros estudios bioquímicos y funcionales relacionados con la hemostasia.
M E X I C O
DESARROLLO ENEL LABORATORIO
22 23
INVESTIGACIÓNINVESTIGACIÓN
Se realizó un estudio prospectivo, descriptivo y observacional de 100 pacientes de la zona Huasteca que acudieron a consulta dermatológica en el período marzo de 2006 a marzo de 2007. Se incluyeron todos los pacientes con diagnóstico presuntivo de m i c o s i s y s e r e c o g i e r o n d a t o s epidemiológicos generales como edad, sexo, ocupación y procedencia, algunos de ellos fueron analizados por métodos estadísticos descriptivos e inferenciales.
Los especímenes recolectados fueron escamas cutáneas, pelo y exudados. Las muestras fueron sometidas a examen microscópico directo con hidróxido de potasio al 15%. Los cultivos se efectuaron en agar Saboraud dextrosa y en agar micobiotic. Para las muestras de actinomicetoma, sólo se usó el medio ASD. La incubación se llevó a cabo a 27°C por periodos variables, dependiendo del agente causal (2 a 4 semanas) hasta observar desarrollo fúngico.
La identificación de los agentes etiológicos se estableció en la mayoría de los casos bajo criterios macro y micromorfológicos. En el actinomicetoma y en las micosis oportunistas por levaduras del género Candida se realizaron las pruebas fisiológicas y bioquímicas necesarias. Se analizaron los datos con el programa estadístico EPI INFO 6.
Resultados
En el laboratorio de Micología de la Facultad de Ciencias Químicas de la Universidad Autónoma de San Luis Potosí se analizaron las muestras de 100 pacientes que se atendieron en la clínica mencionada durante el periodo de estudio. Del total de la población atendida el 74% presentó algún tipo de micosis.
Respecto a la población, se registró un predominio de pacientes del sexo femenino, la edad promedio de los pacientes fue de 38 años, y una distribución de edades entre los 3 y 83 años. Ver Cuadro 1.
El tipo de muestra recolectado en un 97% se trató de escamas, 2% exudado y 1% pelo.
Cuadro 1. Características demográficas de los pacientes atendidos en la clínica "El Buen Samaritano, localizada en la región Huasteca del estado de San Luis Potosí Marzo 2006- Marzo 2007
El 80% de los pacientes provenían de la Huasteca Potosina, el 17% procedían de Hidalgo y de Querétaro y del 3% restante se desconoce su procedencia. Los municipios potosinos con mayor asistencia fueron: Aquismón (17.5%), Huehuetlán (17.5%) y Axtla de Terrazas (15%) Ver Cuadro 1.
En la distribución de las micosis encontradas hubo un predominio de las micosis superficiales, le siguieron las oportunistas y por último las subcutáneas (Figura 1). No se diagnosticaron micosis profundas. Evaluando dichos datos no se encontró diferencia estadísticamente significativa entre sexos y la micosis diagnosticada.
De acuerdo a las micosis superficiales hubo predominio de las tiñas, es interesante reconocer que la pitiriasis versicolor se presentó (85.7%) en mujeres, mientras que en las tiñas no se encontró una diferencia
Figura 3. Distribución de la variedad clínica en la tiña
Cuadro 2 Frecuencia del agente etiológico identificado en las micosis superciales
De acuerdo a la literatura, la frecuencia de la pitiriasis versicolor varía del 5 al 50% en lugares cálidos y húmedos, con una amplia distribución por edades, sin embargo,es poco frecuente antes de los 5 años y después de los 60, con un predominio entre los 15 y 30 años,13,14 dato que concuerda con los hallazgos de este estudio (71.4%).
Se registraron tres casos de micetoma que se observaron en pacientes masculinos de 34, 53 y 80 años, todo ellos de ocupación agricultor, lo cual es coincidente con los datos bibliográficos que reportan una mayor frecuencia en campesinos en edad productiva.16
En el presente trabajo de investigación no se halló ningún caso de micosis profunda y solo ocho casos de micosis oportunistas, lo que se contrapone con múltiples estudios realizados correspondientes a estas micosis en los que la Histoplasmosis es la micosis profunda más frecuente, seguida por la Criptococosis (Mogollón, Mora, Sierra y Ramos de Díaz, 1996). Lo que sucede es que la consulta es exclusivamente dermatológica y las micosis referidas se atienden preferentemente por otras especialidades como medicina interna y neurología.
Conclusiones
En nuest ro estudio, e l conjunto de procedimientos encaminados a detectar hongos capaces de conducir a una micosis ha permitido diagnosticar 74 casos de micosis de un total de 100 pacientes.
Las dermatofitosis fueron las principales micosis diagnosticadas, el sitio anatómico donde se presentaron con mayor frecuencia fueron los pies y las uñas de los pies. En general, hubo un predominio en el sexo femenino y la etiología aislada con mayor frecuencia fue T. rubrum. Sólo se identificaron dos casos de tinea capitis donde el agente etiológico fue Microsporum canis.
Dentro de las micosis superficiales la pitiriasis versicolor también tuvo una representación importante y se presentó mayormente en mujeres.
En el caso de las micosis subcutáneas predominó el micetoma causado por Nocardia sp. en pacientes adultos y un caso de cromomicosis en un paciente del sexo femenino.
De las micosis oportunistas se presentaron con mayor frecuencia los intertrigos en pies donde
estadísticamente significativa en cuanto al sexo. (Figura 2)
La distribución de las micosis por topografía se detalla en la figura 3. Cabe mencionar que se encontraron dos casos de tiña de la cabeza en niños, en ambos casos se aisló Microsporum canis..
Figura 1. Frecuencia de las micosis observadas en la región Huasteca (2006-2007)
Sexo %
m ascu lino 4 2
fem en ino 5 8
T o ta l gen era l 100
edad
<15 1 3
16-30 1 8
31-45 3 6
46-60 2 4
61-75 7
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to ta l gen era l 100
Proced encia
Aqu ism ón 1 4
Axtla de Terrazas 1 2
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to ta l gen era l 100
Figura 2. Distribución de las micosis superficiales
Figura 4. Frecuencia de las micosis subcutáneas
Figura 5. Etiología de las micosis oportunistas
De acuerdo a la edad, en los pacientes con tiñas hay un predominio entre los 31 y 45 años y en el sexo femenino.
De acuerdo al agente etiológico en el cuadro 2 se presenta la frecuencia en la que se aislaron en las micosis superficiales.
En las micosis subcutáneas se encontraron tres casos de actinomicetoma por Nocardia sp.en agricultores, dos de ellos en edad productiva. Sólo se encontró un caso de cromomicosis en una mujer de 53 años (Figura 4), No se identificó la esporotricosis en la población en estudio.
La etiología de las micosis oportunistas se detalla en la figura 5, la manifestación clínica más frecuente fue intertrigo en pies (62.5%). En cuatro casos, la presencia de levaduras oportunista estuvo asociado a un dermatofito.
Discusión
El sitio geográfico en estudio cuenta con un clima tropical donde se han llegado a registrar temperaturas de 52 °C 17. Las altas temperaturas, la humedad y las condiciones de vida desfavorables de sus habitantes pudieran ser los condicionantes en la aparición de estas patologías.
Las dermatofitosis son micosis superficiales muy frecuentes en México, constituyen del 70 al 80% de todas las micosis.6,7. Según Pereiro y Torres Rodríguez (1982), entre los millones de personas afectadas por micosis super ficiales las dermatofitosis, la pitiriasis versicolor y la candidiasis, son las más frecuentes3, de igual manera, en este estudio las micosis más comunes fueron las superficiales, con un predominio de las dermatofitosis, siendo Trichophyton rubrum el agente causal más importante, como han reportado otros autores 4-5. También se ha descrito un predominio de las dermatofitosis en el sexo masculino del 64%, (López-Mártínez, 1983, 1985)11-12, en este caso se encontró mayor frecuencia en el sexo femenino (59.5%).
La tiña de la cabeza es una enfermedad propia de la infancia, que desaparece en la pubertad debido a los cambios en la secreción sebácea y en el pH, que tienen efecto fungistático.10. En el período de estudio encontramos dos casos de tinea capitis en niños cuya etiología fue M. canis, dato que correlaciona con lo que refieren López Martínez (1972 y 1985) y Bonifaz (1998), quienes señalan una disminución en la población de esta patología.
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1 7 . D i s p o n i b l e e n h t t p : / / w w w . e -local.gob.mx/work/templates/enciclo/sanluispotosi/municipios/24012a.htm
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Cuadro 1.
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24
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