CULTIVO CELULAR APLICACIONES EN MEDICINA Centro Comunitario de Sangre y Tejidos del Principado de...

CULTIVO CELULAR APLICACIONES EN MEDICINA

Centro Comunitario de Sangre y Tejidos del Principado de

Asturias.

Unidad de Ingeniería Tisular

Sara Llames

CULTIVO CELULARCULTIVO CELULAR: mantenimiento, proliferación y/o diferenciación de células in vitro en un medio artificial.

REQUERIMIENTOS MÍNIMOS DE UN LABORATORIO REQUERIMIENTOS MÍNIMOS DE UN LABORATORIO DE CULTIVO:DE CULTIVO:

Asepsia: cabina de flujo, esterilizador

Incubador

Nevera/congelador

Baño agitador

Centrifuga

Microscopio Invertido

MEDIO DE CULTIVOMEDIO DE CULTIVO:

proporciona a las células los nutrientes necesarios.

BASAL: medio definido, adecuado al tipo celular.

SUERO: fuente de proteínas, minerales, lípidos, hormonas, mitógenos.

ANTIBIÓTICOS

ADITIVOS: hormonas, factores de crecimiento, etc.

MEDIO DEFINIDO: sin suero, componentes conocidos, reproducible.

MEDIO INDEFINIDO: con suero, variación entre lotes.

CONDICIONES DE CULTIVOCONDICIONES DE CULTIVO:

pH: 7.4, tamponamiento 5% CO2

temperatura: 37ºC humedad: 90-95%

INCUBADORINCUBADOR

CONTAMINACIÓN BIOLÓGICA:CONTAMINACIÓN BIOLÓGICA:

Bacteriana Fúngica MICOPLASMA

CULTIVO DE CONDROCITOSCULTIVO DE CONDROCITOS

Britterg y colaboradores 1994, condrocitos humanos autólogos cultivados para el tratamiento

de lesiones completas de cartílago articular.

Desde 1997 condrocitos comerciales. Elevado coste.

Unidades hospitalarias de cultivo celular.

PROCESAMIENTO Y CULTIVO:PROCESAMIENTO Y CULTIVO:

Fragmentación mecánica (bisturí)

Digestión enzimática (colagenasa)

Cultivo en presencia de suero autólogo

CONTROLES:CONTROLES:

Bacteriológicos

Micoplasma: ELISA, PCR, Fluorocromo

Cultivo infectado por micoplasma

Cultivo negativo

Producción de matriz cartilaginosaProducción de matriz cartilaginosa

Tinción Safranina

Tinción Azul Alcián Inmunodetección de Colágeno II

Estudio de normalidad celularEstudio de normalidad celular

Cariotipo Bandas G Hibridación Genómica Comparada.

Viabilidad CelularViabilidad Celular

Azul Tripán

TRANSPLANTE Y/O CONGELACIÓNTRANSPLANTE Y/O CONGELACIÓN

Transplante: suspensión celular en DMEM sin rojo fenol.

Congelación para uso posterior.

CULTIVO DE QUERATINOCITOSCULTIVO DE QUERATINOCITOS

PIEL ARTIFICIALPIEL ARTIFICIAL

CULTIVO DE EPITELIO AISLADOCULTIVO DE EPITELIO AISLADO

Digestión enzimática

Biopsia del paciente Fragmentación

mecánica

Células aisladas de piel + 3T3

radiados

Cultivo primario de queratinocitos

Células del cultivo primario + 3T3

radiados

Cultivo secundario de queratinocitosTransporte y trasplante

LIMITACIONES DEL EPITELIO CULTIVADO:LIMITACIONES DEL EPITELIO CULTIVADO:

Fragilidad

Dispasa daña la membrana basal

Formación de ampollas

Infección

Antisépticos

Resultados clínicos pobres

Escasa disponibilidad

Coste elevado

Modelo de piel artificial completacompleta destinado al tratamiento definitivo de grandes lesiones

epiteliales

Epidermis

Dermis

INGENIERÍA TISULARINGENIERÍA TISULAR

Biopsia de piel

Fragmentación mecánica

1ª Digestión T/E

Células aisladas de piel + 3T3 radiados

Cultivo de Cultivo de queratinocitosqueratinocitos

2ª Digestión colagenasa

Cultivo de Cultivo de fibroblastosfibroblastos

Cultivos PrimariosCultivos Primarios

Cultivo de fibroblastos

Cultivo de queratinocitos

Plasma humano

Dermis artificial basada en plasma humano Piel cultivada

Cultivo SecundarioCultivo Secundario

PREPARACIÓN DE LA PIEL ARTIFICIAL PARA PREPARACIÓN DE LA PIEL ARTIFICIAL PARA TRASPLANTETRASPLANTE

Biopsias procesadas Biopsias procesadas (patologías)(patologías)

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Nº

de

pa

cien

tes

Año 2000 Año 2001 Año 2002 Año 2003 Año 2004(agosto)

Quemados Nevus Úlceras CutáneasEICH Neurofibromatosis EpidermolisisTx familiar Retracción Fascitis Necrot.Mucosa oral