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UNIVERSIDAD PRIVADA AUTÓNOMA DEL SUR
FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD
ESCUELA PROFESIONAL DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA
TESIS
“DETERMINACIÓN DE FENOLES TOTALES Y LA
CAPACIDAD ANTIOXIDANTE DE LOS PÉTALOS DE
Caléndula officinalis L. (Caléndula), AREQUIPA-2018”
PRESENTADA POR:
BACH. YADIRA ELY ÁLVAREZ BUSTINZA
PARA OPTAR EL TÍTULO PROFESIONAL DE
QUÍMICO FARMACÉUTICO
ASESOR:
MG. CELIA CHOQUENAIRA QUISPE
AREQUIPA – PERÚ
2019
2
UNIVERSIDAD PRIVADA AUTÓNOMA DEL SUR
FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD
CARRERA PROFESIONAL DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA
TESIS
“DETERMINACIÓN DE FENOLES TOTALES Y LA
CAPACIDAD ANTIOXIDANTE DE LOS PÉTALOS DE
Caléndula officinalis L. (Caléndula), AREQUIPA-2018”
PRESENTADA POR:
BACH. YADIRA ELY ÁLVAREZ BUSTINZA
PARA OPTAR EL TÍTULO PROFESIONAL DE QUÍMICO
FARMACÉUTICO
APROBADO POR:
PRESIDENTE DEL JURADO Mg. Ing. Antonieta Calizaya Chiri
PRIMER MIEMBRO DEL JURADO Mg. Elvis G.Gonzales Condori
SEGUNDO MIEMBRO DEL JURADO Qf. Carlos A. Herrera Cáceres
I
DEDICATORIA
A Dios, por ser el inspirador y darme la fuerza para continuar en
este proceso de obtener uno de mis anhelos más deseados.
A mi madre, por su amor y sacrificio en todos estos años, gracias
a ella he logrado llegar hasta aquí y convertirme en lo que soy.
A mis hermanas(os) por estar siempre presentes, acompañándome
y por el apoyo incondicional, y también a mi hermanito que desde
el cielo me guía.
También al Qf. Rafael que aprendí muchas cosas buenas.
A mis asesores y docentes que me apoyaron y han hecho que el
trabajo se realice con éxito en especial a aquellos que me abrieron
las puertas y compartieron sus enseñanzas y conocimientos.
YADIRA ELY ÁLVAREZ BUSTINZA.
II
AGRADECIMIENTO
A Dios por bendecirme la vida, por guiarme a lo largo de mi
existencia, ser el apoyo y fortaleza en aquellos momentos de
dificultad y de debilidad en este camino.
Gracias a mi madre: Susana Hermelinda, por educarme y por
convertirme en una persona de bien, integra y honesta.
A mis hermanos por sus enseñanzas y su apoyo incondicional.
A Q.f Rafael por confiar en mí.
Agradezco a mis asesores docentes de la escuela de ciencias de la
salud de la universidad privada autónoma del sur, por haber
compartido sus conocimientos a lo largo de la preparatoria de mi
preparación profesional.
YADIRA ELY ÁLVAREZ BUSTINZA.
III
RESUMEN
Los radicales libres generados de forma exógena o endógena dentro del
cuerpo han sido implicados en la causalidad de varias enfermedades Estos
radicales libres o especies reactivas de oxígeno (ROS), son átomos o
moléculas que tienen uno o más electrones desapareados en su orbital más
externo, estos compuestos se generan durante el metabolismo normal en el ser
humano, especialmente en la cadena respiratoria, y comprende al anión
superóxido y al radical hidroxilo los cuales podrían desencadenar en
enfermedades en función del tiempo, por lo expuesto la presente investigación
tuvo por objetivo determinar los fenoles totales y la capacidad antioxidante de
los pétalos de Caléndula officinalis L. (Caléndula), en tal sentido, para la
extracción de principios activos se diseñó y construyó el percolador utilizando
etanol y propilenglicol como solventes, se identificó la presencia de taninos con
la aparición de una coloración verdosa tras la adición de cloruro de hierro(III) al
5% y flavonoides por el método Shinoda, en relación a la identificación de
quercetina,esta se realizó mediante cromatografía en capa fina utilizando dos
fases móviles compuestos por Tolueno: acetato de etilo: ácido fórmico
(5:4:1)obteniéndose un RF de 0.82 en el extracto etanólico y un RF de 0.84 en
el extracto con propilenglycol. La cuantificación de fenoles totales se realizó por
el método de Folin Ciucalteu hallándose 4.935±0.043 y 5.410±0.025mg/Kg
equivalente a ácido gálico en el extracto etanólico y con propilenglicol
respectivamente. Además, este último metabolito fue analizado por el
Laboratorio de Ensayo y Control de Calidad de la Universidad Católica de
Santa María determinándose 55 mg/kg de ácido tánico que expresado en ácido
gálico dio como resultado 5.51 mg de ácido gálico por Kg de caléndula, dicho
resultado no difiere significativamente con el resultado hallado en el laboratorio
hallado en la Universidad Privada Autónoma del Sur.
Finalmente, la capacidad antioxidante de la Caléndula officinalis L. (Caléndula)
fue 71.27 mmol de trolox/kg por el método de CUPRAC
Palabra clave: ROS, antioxidantes, caléndula officinalis, trolox.
IV
ABSTRACT
Free radicals generated exogenously or endogenously within the body have
been implicated in the causation of several diseases. These free radicals or
reactive oxygen species (ROS) are atoms or molecules that have one or more
unpaired electrons in their outermost orbital, these compounds are generated
during normal metabolism in humans, especially in the respiratory chain, and
include the superoxide anion and the hydroxyl radical, which could trigger
diseases as a function of time. Therefore, the present investigation aimed to
determine the total phenols and the antioxidant capacity of the petals of
Caléndula officinalis L. (Caléndula), in this sense, for the extraction of active
principles was designed and built the percolator using ethanol and propylene
glycol as solvents, the presence of tannins was identified with the appearance
of a greenish coloration after the addition of iron (III) chloride to l 5% and
flavonoids by the Shinoda method, in relation to the identification of quercetin,
this was done by thin layer chromatography using two mobile phases composed
of Toluene: ethyl acetate: formic acid (5: 4: 1) obtaining an RF of 0.82 in the
ethanol extract and an RF of 0.84 in the extract with propylene glycol.
Quantification of total phenols was carried out by the Folin Ciucalteu method,
finding 4,935 ± 0.043 and 5.410 ± 0.025mg / Kg equivalent to gallic acid in the
ethanolic extract and with propylene glycol, respectively. In addition, this last
metabolite was analyzed by the Laboratory of Testing and Quality Control of the
Catholic University of Santa Maria, determining 55 mg / kg of tannic acid that
expressed in gallic acid resulted in 5.51 mg of gallic acid per Kg of Caléndula,
said The result does not differ significantly with the result found in the laboratory
found at the Universidad Privada Autónoma del Sur.
Finally, the antioxidant capacity of the Caléndula officinalis L. (Caléndula) was
71.27 mmol of trolox / kg by the CUPRAC method
Keyword: ROS, antioxidants, Caléndula officinalis, trolox.
INDICE DE CONTENIDOS
DEDICATORIA I
AGRADECIMIENTO II
RESUMEN III
ABSTRACT IV
CAPÍTULO I
EL PROBLEMA DE INVESTIGACIÓN
1.1.- Descripción de la realidad problemática 1
1.2.- Formulación del problema 2
1.2.1.- Problema principal 2
1.2.2.- Problemas secundarios 2
1.3.- Objetivos 2
1.3.1.- Objetivo general 2
1.3.2.- Objetivos específicos 2
1.4.- Justificación 3
CAPÍTULO II
MARCO TEÓRICO
2.1.- Antecedentes de investigación 5
2.1.1.- A nivel internacional 5
2.1.2.- A nivel nacional 8
2.1.3.- A nivel local 8
2.2.- Base Teórica 9
2.2.1.- Caléndula (Caléndula Officinalis) 9
2.2.2.- Compuestos fenólicos 15
2.2.3.- Radicales libres 15
2.2.4.- Capacidad antioxidante 16
2.2.5.- Espectrofotometría 17
2.2.6.- Espectrofotómetro 17
2.3.- Hipótesis 18
2.3.1.- Hipótesis principal 18
2.3.2.- Hipótesis secundarias 18
2.4.- Variables 18
2.4.1.- Identificación de variables 18
2.4.2.- Definición conceptual de variables 19
2.4.3.- Operacionalización de variables 20
CAPÍTULO III
METODOLOGÍA DE LA INVESTIGACIÓN
3.1.- Tipo y nivel de investigación 21
3.1.1.- Nivel de la investigación 21
3.1.2.- Tipo de investigación 21
3.1.3.- Diseño de la investigación 21
3.2.- Descripción del ámbito de la investigación 21
3.2.1.- Ubicación espacial 21
3.2.2.- Ubicación temporal 22
3.3.- Población, muestra y muestreo 22
3.3.1.- Población de estudio 22
3.3.2.- Muestra 22
3.4.- Técnicas e instrumentos para la recolección de datos 22
3.4.1.- Materiales, equipos y reactivos 22
3.4.2.- Obtención de los pétalos de C. officinalis (caléndula) 23
3.4.3.- Clasificación taxonómica 25
3.4.4.- Preparación de la muestra 25
3.4.5.- Obtención de extractos por percolación 25
3.4.6.- Identificación de taninos 26
3.4.7.- Identificación de Flavonoides 26
3.4.8.- Identificación de Quercetina 27
3.4.9.- Determinación de Fenoles totales por el método de Folin Ciucalteu 27
3.4.10.- Linealidad 29
3.4.11.- Sensibilidad 29
3.4.12.- Determinación de la capacidad oxidante por el método de Cuprac 30
3.4.13.- Estrategia de recolección de datos 31
CAPÍTULO IV
RESULTADOS
4.1.- Identificación de C. officinalis 32
4.2.- Percolación 32
4.3.- Identificación de Flavonoides y Taninos 33
4.3.1.- Identificación de taninos 33
4.3.2.- Identificación de flavonoides 34
4.4.- Identificación de Quercetina 34
4.5.- Determinación de fenoles totales por el método de Folin Ciucalteu 36
4.5.1.- Soluciones patrón de calibración 36
4.5.2.- Linealidad 36
4.5.3.- Sensibilidad 37
4.5.4.- Cuantificación de fenoles totales 39
4.5.5.- Comparación estadística de fenoles totales en extractos etanólicos y con
propilenglicol 39
4.5.6.- Comparación del método de cuantificación de fenoles totales con
Laboratorio Acreditado 41
4.5.7.- Determinación de la capacidad antioxidante de Caléndula officinalis L.
(Caléndula) por el método de CUPRAC 42
CAPÍTULO V
DISCUSIÓN 44
CONCLUSIONES 48
SUGERENCIAS 49
BIBLIOGRAFÍA 50
APÉNDICES 53
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 1 Operacionalización de variables 20
Tabla 2 Clasificación taxonómica por el Hervarium Areqvipense de la
Universidad Nacional de San Agustín 32
Tabla 3 Se presentan los resultados de las lecturas obtenidas luego de leer
el espectrofotómetro concentraciones 36
Tabla 4 Valores de las variables implicadas en la determinación de los
límites de cuantificación y límites de detección 38
Tabla 5 Gastos obtenidos en el análisis de una muestra (6 repeticiones) 39
Tabla 6 Prueba F para varianza de dos muestras 40
Tabla 7 Prueba t para dos muestras suponiendo varianzas homogéneas 40
Tabla 8 Cuantificación de Fenoles totales por el método Folin ciucalteu 41
Tabla 9 Valores del gráfico de calibración de concentración promedio de
Trolox vs absorbancia promedio 42
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1 Caléndula officinalis 10
Figura 2 Triterpenos tetracíclicos presentes en C. officinalis L 11
Figura 3 Triterpenos pentacíclicos presentes en C. officinalis L 12
Figura 4 Carotenos presentes en C. officinalis L 13
Figura 5 Flavonoides presentes en C. officinalis 14
Figura 6 Flores de Caléndula officinalis L.provenientes del distrito de Pisac,
provincia de Calca, departamento de Cusco (Valle Sagrado) 23
Figura 7 Flores de Caléndula officinalis L.recolectadas con un color
anaranjado intenso en los pétalos. 24
Figura 8 Flores de Caléndula officinalis L.recolectadas con un color
anaranjado intenso en los pétalos. 24
Figura 9 Sistema de percolación que involucra recipiente que contiene la
muestra 25
Figura 10 Prueba de Shinoda 26
Figura 11 Reacción de reducción del reactivo de Cuprac en presencia de
antioxidantes (AOX) 31
Figura 12 Sistema de percolación de pétalos de C. officinalis L usada en la
investigación 33
Figura 13 Identificación de taninos con cloruro férrico al 5 %. Coloración
verde (positivo) 33
Figura 14 Identificación de flavonoides por el método de Shinoda Coloración
Rojo magneta (positivo para flavonoles) 34
Figura 15 Identificación de Quercetina por Cromatografía en Capa Fina
usando una fase móvil de tolueno 35
Figura 16 Identificación de Quercetina por Cromatografía en Capa Fina
usando una fase móvil de acetato de etilo 35
Figura 17 Gráfico de calibración entre concentración de ácido gálico (mg/L)
y absorbancias promedio 37
Figura 18 Ecuación de la recta entre concentración de ácido gálico (mg/L) y
desviación estándar de las absorbancias 38
Figura 19 Gráfico de calibración entre concentración de ácido gálico (mg/L)
y absorbancias promedio emitido por el Laboratorio de Ensayo y
Control de Calidad de la Universidad Católica de Santa María. 41
Figura 20 Gráfico de calibración para la determinación de la capacidad
antioxidante por el método de Cuprac 43
ÍNDICE DE APÉNDICES
Apéndice 1. Constancia de identificación taxonómica 54
Apéndice 2. Resultados de la Universidad Católica Santa María 55
Apéndice 3. Reconocimiento de la muestra Caléndula oficinales l 56
IX
INTRODUCCIÓN
“En las últimas décadas los polifenoles han sido sometidos a numerosas
investigaciones debido a su actividad antioxidante, capacidad de neutralización
de los radicales libres y otros beneficios para la salud. Muchos de ellos también
han sido implicados en la protección contra enfermedades como el cáncer y
patologías cardiovasculares, mientras que algunos se ha visto que presentan
una protección potencial contra la enfermedad de Alzheimer”. (1)
“Diversos estudios han demostrado que existe relación entre la composición
fenólica y la capacidad antioxidante” (1). “Se ha determinado que la actividad
antioxidante en especies vegetales tales como la caléndula se deben a la
presencia de los compuestos fenólicos, ácido ascórbico y los compuestos
carotenoides en el caso del sistema antioxidante químico”. (2)
“Las especies vegetales se someten una serie de cambios bioquímicos debido
a la maduración, la cosecha, el procesamiento y el almacenamiento. Estos
cambios son ocasionados por varios factores, incluyendo reacciones de pardea
miento, deterioro microbiano y autoxidación de lípidos, viéndose afectadas sus
propiedades antioxidantes, funcionales y nutricionales”.(2)
Tradicionalmente para la determinación de los compuestos fenólicos se utilizan
distintos tipos de métodos espectrofotométricos, alguno de los cuales están
basados en el aumento de intensidad de color sufrido por disoluciones de ellos
Por lo que, en el presente trabajo de investigación se buscó cuantificar los fenoles
totales y determinar la capacidad antioxidante de pétalos de C. officinalis L los
cuales fueron obtenidos de abono orgánico, en el mes de septiembre del año
2018del distrito de Pisac, provincia de Calca, departamento de Cusco (Valle
Sagrado).
1
CAPÍTULO I
EL PROBLEMA DE INVESTIGACIÓN
1.1.- Descripción de la realidad problemática
“Los radicales libres generados de forma exógena o endógena dentro del cuerpo
han sido implicados en la causalidad de varias enfermedades como la cirrosis
hepática(3), inflamación, aterosclerosis” (4), “diabetes, cáncer”(5), “enfermedad
neurodegenerativa” (6), etc. “Estos radicales libres o especies reactivas de
oxígeno (ROS), son átomos o moléculas que tienen uno o más electrones
desapareados en su orbital más externo, estos compuestos se generan durante el
metabolismo normal en el ser humano, especialmente en la cadena respiratoria, y
comprende al anión superóxido y al radical hidroxilo, entre otros”.(7), por lo cual
dichos radicales libres pueden desencadenar enfermedades en función del
tiempo.
“El vínculo entre los radicales libres y los procesos de la enfermedad ha llevado a
una considerable investigación sobre fármacos no tóxicos que pueden eliminar los
radicales libres. Se ha demostrado que varios extractos y productos vegetales
poseen un potencial antioxidante significativo” (8). Caléndula officinalis L.”Es
empleada en la medicina tradicional y se ha informado que tiene varias
actividades farmacológicas. Se encontró que la aplicación tópica de extracto de
Caléndula officinalis L. posee una actividad antiinflamatoria significativa“ (9).
“También poseía actividades cicatrizantes”(8).
“En ensayos clínicos, se encontró que el extracto de Caléndula officinalis L.posee
actividad preventiva contra la dermatitis aguda durante la irradiación”(10). “Se
informó que el extracto de flor de Caléndula officinalis L. posee un efecto antígeno
tóxico”(11).
“Hoy en día existen muy pocos informes sobre la actividad antioxidante del
extracto, por otro lado, estudios demuestran que las diferentes condiciones de
cultivo, humedad tipos de fertilizantes y época del año influyendo en la
composición de fenoles totales y capacidad antioxidante, considerando las
mejores fechas agosto y setiembre” (12).
2
1.2.- Formulación del problema
1.2.1.- Problema principal
¿Cuál es el contenido de fenoles totales y la capacidad antioxidante de
pétalos de Caléndula officinalis L. (Caléndula)?
1.2.2.- Problemas secundarios
¿Cuál es el resultado del ensayo de identificación de taninos y flavonoides
por el método del cloruro férrico y Shinoda respectivamente?
¿Cuál es el resultado de identificar Quercetina por cromatografía en capa
fina?
¿Cuál es la concentración de fenoles totales deextractos etanólicos y con
propilenglicol de los pétalos de Caléndula officinalis L. (Caléndula)?
¿Cuál es el resultado de comparar los fenoles totales en losextractos
etanólicos y propilenglicol pétalos de Caléndula officinalis L. (Caléndula)?
¿Cuál es lacapacidad antioxidante depétalos de Caléndula officinalis L.
(Caléndula) por espectrofotometría utilizando el método de Cuprac?
1.3.- Objetivos
1.3.1.- Objetivo general
Determinar la concentración de fenoles totales y capacidad antioxidante en
pétalos de Caléndula officinalis L. (Caléndula)
1.3.2.- Objetivos específicos
Identificar taninos y flavonoides por el método del cloruro férrico y Shinoda
respectivamente.
Identificar Quercetina por cromatografía en capa fina
Cuantificar los fenoles totales por espectrofotometría en el extracto
etanólico y con propilenglicol de los pétalos de Caléndula oficinales
(Caléndula)
Comparar el contenido de fenoles totales del extracto etanólico y con
propilenglicol de los pétalos de Caléndula officinalis L. (Caléndula).
3
Determinar la capacidad antioxidante del extracto de pétalos de Caléndula
officinalis L. (Caléndula) con mayor cantidad de polifenoles totales por el
método Cuprac.
1.4.- Justificación
“Los radicales libres o más propiamente “especies reactivas de oxígeno”
(ROS), son átomos o moléculas que tienen uno o más electrones
desapareados en su orbital más externo; este paramagnetismo les confiere una
alta reactividad química y la capacidad de sustraer electrones de otras
moléculas tornando a estas en radicales libres, generando así una reacción en
cadena. Estos compuestos se generan durante el metabolismo normal en el ser
humano, especialmente en la cadena respiratoria, y comprende al anión
superóxido y al radical hidroxilo, entre otros”.(2)
Los ROS tienen la propiedad de producir daño oxidativo a los lípidos, proteínas
y ADN, y han sido implicados en la patogenicidad de diversas enfermedades
como: cataratas, diabetes mellitus, cáncer, artritis reumatoide, infarto al
miocardio, etc. Diversos estudios epidemiológicos han mostrado la existencia
de una correlación inversa entre la ingesta de frutas y verduras con el cáncer
gastrointestinal, enfermedades cardiovasculares, inflamatorias, asma, cáncer
de pulmón, Parkinson, Alzheimer; “enfermedades asociadas al efecto de los
radicales libres que se generan en nuestro organismo a través de reacciones
metabólicas, factores ambientales, contaminación, radiaciones ionizantes,
drogas, alcohol, etc”.(2)
El ser humano dispone de un sistema antioxidante constituido por enzimas
como: catalasa,peroxidasa, superóxido dismutasa, glutatión peroxidasa y un
sistema antioxidante no enzimático que actúan impidiendo la acción nociva de
los ROS como: ácido úrico, vitamina C ,vitamina A, glutatión, vitamina E, etc.
Estos sistemas no son lo suficientemente eficientes para evitar el efecto dañino
que ejercen los ROS, por cuyo motivo, “es necesario ingerir alimentos que
contengan sustancias con efectos antioxidantes”.(7)
4
Diversas especies vegetales constituyen una excelente fuente de compuestos
antioxidantes, como: ácido ascórbico, carotenoides, tocoferoles, flavonoides y
polifenoles; así pues, la Caléndula, es muy usada como antiinflamatorio o
cicatrizante en el país, “ya que posee un alto contenido de polifenoles y otros
componentes que podrían ejercer un eficiente efecto antioxidante”(7). En el
presente trabajo se cuantificarán los fenoles totales y se determinará la
capacidad antioxidante de los pétalos de Caléndula officinalis L. (Caléndula)
5
CAPÍTULO II
MARCO TEÓRICO
2.1.- Antecedentes de investigación
2.1.1.- A nivel internacional
Domínguez(13), en su investigación titulada “Efecto de la aplicación del
extracto hidroalcohólico de flores de caléndula (Caléndula officinalis L)
en la estabilización del color y vida útil en pulpa de frutas realizada en
la Universidad Nacional de Colombia en el año 2012”. Este estudio
surgió debido a que la flor de caléndula tiene importantes propiedades que
pueden ser empleadas en la industria de alimentos. Entre los compuestos de
la caléndula con mayor interés se encuentran los antioxidantes, compuestos
que previenen el deterioro de los alimentos, adicionalmente se han
encontrado sustancias con una alta actividad antibacteriana. Por esta razón
se pretendió aplicar estas propiedades en beneficio de la industria de
alimentos, buscando un remplazo para los antioxidantes y conservantes
químicos que han sido utilizados tradicionalmente.
La caracterización química del extracto mediante ensayo fitoquímico
preliminar dio idea de la posible presencia metabólitos como; taninos,
quinonas, carotenoides y cumarinas. Posteriormente a través del espectro
infrarrojo se determinaron frecuencias características que pueden
relacionarse con grupos funcionales y enlaces químicos específicos que
tienen algunos de los compuestos antioxidantes y antifúngicos presentes en
la flor de caléndula.
La determinación de la capacidad antioxidante del extracto dio como
resultado un 74,33% en porcentaje de decoloración DPPH y 142,8mmol de
trolox/g extracto por ABTS. De esta manera los resultados de caracterización
señalan al extracto de caléndula como un posible antioxidante natural que
como gran valor agregado presenta propiedades terapéuticas beneficiosas
para la salud humana.
La evaluación del extracto como conservante y antioxidante en la pulpa, se
realizó mediante el control de los parámetros: pardeamiento enzimático,
6
calidad microbiológica y calidad sensorial, durante un periodo de 2 meses a
2 temperaturas de almacenamiento. “El extracto fue incluido en dos
concentraciones, el umbral de detección” ([1]) y el umbral de identificación
([2]); 8.26x10-3 y 1,90*10 2g de extracto en 100g de pulpa respectivamente.
Los resultados obtenidos demostraron que el pardeamiento enzimático no se
vio modificado por la adición del extracto en las concentraciones evaluadas.
Las variaciones en el cambio de color solo se vieron influenciadas por la
temperatura de almacenamiento, con menores cambios es el
almacenamiento a temperatura ambiente. En cuanto a la evaluación
microbiológica se concluye que la combinación entre la adición del extracto y
el almacenamiento en refrigeración es una buena opción para la
conservación de la pulpa de arazá en términos de hongos y levaduras, en
este caso los recuentos muestran que la pulpa permanece con una buena
calidad durante todo el periodo de almacenamiento. Por otra parte, la
evaluación sensorial mostró que la adición del extracto disminuye la calidad
en los parámetros sabor y aroma, sin verse modificados los parámetros de
color y textura. “Concluyéndose de esta manera que, aunque el extracto
presenta importantes propiedades para la industria de alimentos debe
emplearse algún tratamiento previo que disminuya el sabor amargo del
mismo, posibilitando el uso de concentraciones más altas y así poder
aprovechar el poder antioxidante y antifúngico de manera más efectiva”.
(13)
En cuanto a la metodología, Espinal (2), en su investigación titulada
“Capacidad Antioxidante y ablandamiento de la Guayaba Palmira ICA I
(Psidium guayava) realizada en la Universidad Nacional de Colombia en
el 2012” desarrolló un estudio con la finalidad de contribuir al
conocimiento de los fenómenos químicos y bioquímicos relacionados con la
capacidad antioxidante y el proceso de ablandamiento de los frutos de
guayaba (Psidium guajava L.) variedad Palmira ICA I a lo largo de su
maduración. Para cumplir con este objetivo, se realizó la cuantificación de la
capacidad antioxidante por métodos hidrofílicos (ABTS, DPPH y FRAP) y
lipofílico (decoloración del βcaroteno) del fruto de guayaba en los estados
de maduración verde, pintón, maduro y senescente. Con el fin de atribuir la
7
capacidad antioxidante química del fruto de guayaba a diferentes
compuestos específicos, se realizó la cuantificación de los compuestos
fenólicos, ácido ascórbico y carotenoides totales. Se identificaron y
cuantificaron por HPLC-DAD los principales compuestos fenólicos y
carotenoides que podrían contribuir significativamente a la capacidad
antioxidante del fruto de guayaba variedad Palmira ICA I.
Para esto, se puso a punto una metodología de extracción y medida de
actividad de estas enzimas y se evaluó su comportamiento en los frutos en
estados verde, pintón, maduro y senescente. El efecto protector de los
compuestos antioxidantes extraídos de la guayaba (carotenoides) en los
estados verde, pintón, maduro y senescente fue evaluado mediante la
medida de la supervivencia de una cepa de levadura (Saccharomyces
cervisiae) sometida a un estrés oxidativo inducido con H2O2(2).
Por otro lado, Domínguez (14),en su investigación titulada “Utilización de
flores de caléndula (Caléndulae flos) en salsa de Carnes realizada en la
Universidad Nacional de Colombia en el 2009” se basó en el desarrollo
de un producto comestible tipo salsa para carnes con la adición de flores de
caléndula con el fin de incluir sus propiedades como antioxidante natural.
Para esto se realizaron análisis químicos y sensoriales, en donde se
determinó la actividad antioxidante de la flor de caléndula, “la salsa estándar
para carnes y la salsa para carnes con adición de flores de caléndula
1%p/p, mediante los métodos FRAP y OXIDACIÓN LINOLEICO-β-
CAROTENO y el contenido total de fenoles, mediante el método de FOLIN-
CIOCALTEU”.(14)
“Sensorialmente se determinó la concentración adecuada de la flor de
caléndula en la salsa para carnes, que sea aceptada por el consumidor.
Mediante pruebas de discriminación o diferencia; prueba triangular,
diferencia del sabor amargo y determinación de umbrales de aceptación;
detección e identificación, pruebas que fueron realizadas con panelistas
semientrenados y entrenados de la Universidad Nacional de Colombia”. (14)
8
2.1.2.- A nivel nacional
En cuestión a la generación de radicales libres para la determinación de la
capacidad antioxidante de Palomino (7), en su investigación titulada
“Propiedades antioxidantes de la guayaba (psidium guajava) publicada
en la revista “Sociedad Química del Perú en el 2009”“evaluó las
propiedades antioxidantes de la variedad amarilla de la guayaba (L.)
Utilizando un sistema generador de radicales hidroxilos constituidos por
ascorbato/Cu-II; asimismo, se ha estudiado el efecto que ejercería la
presencia en el mencionado sistema de antioxidantes como: EDTA, tiourea
y manitol, efecto que decrece cuando se adiciona a los medios de ensayo
tiourea, manitol o EDTA. El efecto inhibitorio que ejerce la guayaba sobre
los radicales hidroxilos generados por el sistema ascorbato/Cu-II, depende
de la concentración de la guayaba”.(7)
2.1.3.- A nivel local
En cuestión al método de extracción y solvente, Morgrovejo (8), en su
investigación titulada “Determinación del efecto cicatrizante de un gel
estandarizado de Caléndula officinalis L (Caléndula) en animales de
experimentación publicada en la Universidad Católica de Santa María en el
año 2014” expone que su trabajo de investigación tuvo como objetivo
principal “evaluar el efecto cicatrizante de un gel estandarizado de
Caléndula officinalis L.(Caléndula) en heridas producidas en animales de
experimentación.”(8)
“Con tal fin, se procedió a la recolección de la planta medicinal en el
departamento de Ayacucho, luego los pétalos fueron extraídos del cáliz, y
cortados en pequeños trozos, se siguió con la elaboración del extracto
mediante el método de percolación, obteniéndose un extracto glicólico al
20% límpido, aromático y de color anaranjado característico. Este extracto
fue estandarizado mediante el análisis cuantitativo del flavonoide quercetina
por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), utilizando como fase
móvil metanol: agua (50:50), una longitud de onda de 254 nm con un flujo
de 1.0 mL.min-1, evaluándose los parámetros de linealidad, precisión,
exactitud y límites de detección y de cuantificación, obteniéndose que; para
9
la linealidad del método, usando un estándar con pureza ≥ 99% en un rango
de concentraciones de 0.15 a 1.50 mg.L-1, el coeficiente de correlación fue
de 0.997, para la precisión se determinó por repetibilidad y la precisión
intermedia en la que el resultado de los coeficientes de variación porcentual
no excedía del 8 y el 16%”(8).
2.2.- Base Teórica
2.2.1.- Caléndula (Caléndula Officinalis)
A. Descripción
“La Caléndula officinalis L.es una planta anual de la familia Asteraceae que
se cultiva en todo el mundo, nativa de Europa Central y el Mediterráneo;
creciendo en cantidad en lugares cálidos de Norte América y Europa,
floreciendo entre los meses de mayo y octubre”(15)
B. Nombre Común
“A Caléndula officinalis L.se le distingue con diversos nombres como
azucena, caldo, caléndula, caléndula oficinal, calta, caléndula, clavel, clavel
de huerto, clavelina, clavellinas, clavel silvestre, corona de rey, coronas de
rey, mercadela, mercaderes, mercaderes dorados, mercaderes melados,
mercaderes reales, mercaderes rizados, mexicanas, reineta, reinita, rosa
de muerto, rosa de muertos, tarántula, tudescas, entre otros”(14).
10
Figura 1.Caléndula officinalis L
Fuente.Adaptado de deposiphotos(16)
C. Usos tradicionales
“Curación de heridas, en el tratamiento de las gastritis, úlceras, hepatitis y
otras”
“Enfermedades gastrointestinales; en el tratamiento de la hipertensión,
taquicardia y arritmias; en el tratamiento de diversas afecciones del sistema
urinario, sistema nervioso central y periférico”(15,17,18)
D. Composición química
“C. officinalis presenta en su composición triterpenos tetracíclicos como
campestrol, stigmasterol, sitosterol, sitostanol, isofucosterol, cycloartanol,
24-metilnenocycloartanol, stigmasta-3,6-diona”(19). Ver Figura 2
11
Figura 2.Triterpenos tetracíclicos presentes en C. officinalis; campestrol (1),
stigmasterol (2), sitosterol (3), sitostanol (4), isofucosterol (5), cycloartanol (6),
24-metilnenocycloartanol (11), stigmasta-3,6-diona (17)
Fuente. Adaptado de Bartoszet al.(19)
Por otro lado “C. officinalis presenta triterpenos pentacíclicos como β-
amirin, α-amirenona, , α-amirina, lupeol, ѱ-tazasterol, tazasterol,
friedelinol, friedilina, faradiol, arnidiol, ácido oleanolico metil ester y
ácido 3-acetiloxi oleanolico metil ester como se muestra en la Figura
3”(19).
12
Figura 3. Triterpenos pentacíclicos presentes en C. officinalis; β-amirin
(7), α-amirenona(8), α-amirina (9), lupeol (10), ѱ-tazasterol (12),
tazasterol (13), friedelinol (14), friedilina (15), faradiol (19), arnidiol (20),
ácido oleanolico metil ester (16) y ácido 3-acetiloxi oleanolico metil ester
(18).
Fuente. Adaptado de Bartosz et al.(19)
13
“El contenido de carotenoides comprende flavoxantina, luteina,
rubixantina, β- caroteno, γ-caroteno y licopeno”(20)
Figura 4. Carotenos presentes en C. officinalisflavoxantina (1), luteina
(2). Rubixantina (3). β- Caroteno (4). γ-caroteno (5). y licopeno (6).
Fuente. Elaboración propia segúnPinteaet al.(20)
14
“En cuanto a flavonoides se C. officinalis presenta quercetina, rutina,
isohamnetina y kaempferol”(21), como se observa en la Figura 5.
Figura 5. Flavonoides presentes en C. officinalis quercetina (1), rutina
(2), isohamnetina (3) y kaempferol (4).
Fuente. Elaboración propia según Neukirchet al.(21)
15
2.2.2.- Compuestos fenólicos
“Desde el punto de vista químico, los compuestos fenólicos son caracterizados
por un núcleo bencénico que lleva uno o varios grupos hidroxilos y una cadena
lateral funcional. Por otro lado, los no flavonoides se caracterizan por presentar
solo un anillo de 6 carbonos. Los más importantes corresponden a los ácidos
fenólicos (benzoico y cinámico) y otros derivados fenólicos como los
estilbenos.” (13)
Por otra parte, “los flavonoides se caracterizan por presentar dos anillos de 6
carbonos unidos por un heterociclo central de 3 carbonos (C6-C3-C6). En este
grupo se distinguen los flavonoles, flavonas, antocianos y flavanoles”.(14)
“Los compuestos fenólicos se relacionan fuertemente con la capacidad
antioxidante (CA) de una especie vegetal. No existe un único compuesto
fenólico responsable de la actividad antioxidante, sino que ésta se explica por
el conjunto de todos ellos. Los principales compuestos asociados a la CA son:
derivados de ácidos benzoicos, ácidos cinámicos, estilbenos y flavonoides.
Estos compuestos debido a su estructura química, pueden neutralizar radicales
libres, a través de la donación del átomo de hidrógeno del grupo hidroxilo del
anillo aromático”. (14)
“En la práctica los fenoles totales se analizan principalmente por el método
propuesto por Singleton (1965), el cual utiliza el reactivo de Folin-Ciocalteu,
que se reduce al oxidar los fenoles formando una coloración azul, lo cual puede
ser medido a una λ onda750 nm. Otro método de análisis de los fenoles totales
(IPT) muy utilizado, simple, rápido y fiable corresponde a la medición de la
absorbancia de 280 nm”.(22)
2.2.3.- Radicales libres
“Los radicales libres o más propiamente “especies reactivas de oxígeno”
(ROS), son átomos o moléculas que tienen uno o más electrones
desapareados en su orbital más externo; este paramagnetismo les confiere una
alta reactividad química y la capacidad de sustraer electrones de otras
moléculas tornando a estas en radicales libres, generando así una reacción en
16
cadena. Estos compuestos se generan durante el metabolismo normal en el ser
humano, especialmente en la cadena respiratoria, y comprende al anión
superóxido y al radical hidroxilo, entre otros”.(7)
“Los ROS tienen la propiedad de producir daño oxidativo a los lípidos,
proteínas y ADN, y han sido implicados en la patogenicidad de diversas
enfermedades
Diversos estudios epidemiológicos han mostrado la existencia de una
correlación inversa entre la ingesta de frutas y verduras y cáncer
gastrointestinal, enfermedades cardiovasculares, inflamatorias, asma, cáncer
de pulmón, Parkinson, Alzheimer; enfermedades asociadas al efecto de los
radicales libres que se generan en nuestro organismo a través de reacciones
metabólicas, factores ambientales, contaminación, radiaciones ionizantes,
drogas, alcohol, etc.”(7)
“El ser humano dispone de un sistema antioxidante constituido por enzimas
como: catalasa,peroxidasa, superóxido dismutasa, glutatión peroxidasa y un
sistema antioxidante no enzimático que actúan impidiendo la acción nociva de
los ROS como: ácido úrico, vitamina C, Vitamina A, glutatión, vitamina E, etc.
Estos sistemas no son los Suficientemente eficientes para evitar el efecto
dañino que ejercen los ROS, por cuyo motivo, es necesario ingerir alimentos
que contengan sustancias con efectos antioxidantes”.(7)
2.2.4.- Capacidad antioxidante
“El estudio de la actividad antioxidante en flores, hojas y frutas ha permitido la
identificación de los compuestos fenólicos, carotenoides y vitamina C de los
frutos como los responsables de la protección del fruto contra las sustancias
oxidantes. La actividad química de los polifenoles que definen sus cualidades
antioxidantes es producto de su capacidad de donar electrones y átomos de
hidrógeno, así como su alta estabilidad y baja reactividad química en su forma
oxidada. Anteriormente ya ha sido estudiada la alta capacidad de los
polifenoles de reducir sustancias oxidantes como el radical hidroxilo (OH•),
anión radical superóxido (O2•-), radicales peroxil (ROO•) y peróxido de
17
hidrógeno (H2O2), así como los intermediarios oxidados altamente reactivos”.
(2)
“Los distintos métodos para medir la actividad antioxidante son consecuencia
de la alta capacidad antioxidante que tienen los polifenoles, donde cada
método de medida de actividad antioxidante es sensible a las distintas
características redox del compuesto polifenólico polifenol. Los métodos ABTS y
DPPH actúan sobre polifenoles donores de átomos de hidrógeno a radicales
oxidantes, estabilizándolos y disminuyendo así su poder oxidante, el método
FRAP actúa sobre los polifenoles capaces de donar electrones reduciendo
intermediarios oxidados, mientras que el método de decoloración del β-
caroteno actúa deslocalizando y estabilizando los electrones recibidos de un
radical libre. Entonces, para poder determinar la capacidad antioxidante total de
un fruto, debe medirse la actividad antioxidante con cada uno de los métodos
para poder determinar tanto el efecto de neutralización de radicales libres,
como su capacidad de reducción”.(2)
2.2.5.- Espectrofotometría
“La espectrofotometría es uno de los métodos de análisis más usados, y se
basa en la relación que existe entre la absorción de luz por parte de un
compuesto y su concentración. Cuando se hace incidir luz monocromática (de
una sola longitud de onda) sobre un medio homogéneo, una parte de la luz
incidente es absorbida por el medio y otra transmitida, como consecuencia de
la intensidad del rayo de luz sea atenuada desde Po a P, siendo Po la
intensidad de la luz incidente y P la intensidad del rayo de luz transmitido.
Dependiendo del compuesto y el tipo de absorción a medir, la muestra puede
estar en fase líquida, sólida o gaseosa”. (23)
2.2.6.- Espectrofotómetro
“Un espectrofotómetro es un instrumento que mide la cantidad de fotones (la
intensidad de la luz) absorbida por la muestra líquida después de pasar un haz
de luz a través de la solución. Espectrofotómetro UV-visible utiliza luz sobre el
rango de ultravioleta (185 – 400 nm) y rango visible (400 – 700 nm) de espectro
de radiación electromagnética”. (24)
18
2.3.- Hipótesis
2.3.1.- Hipótesis principal
Dado que existen referencias bibliográficas que los pétalos de Caléndula
officinalis L. (Caléndula) presenta en su composición química metabolitos como
carotenos, terpenos y flavonoides, es probable determinar la presencia de
fenoles totales y su capacidad antioxidante en los pétalos de Caléndula
officinalis L. (Caléndula).
2.3.2.- Hipótesis secundarias
Es probable identificar taninos y flavonoides por el método del cloruro
férrico y Shinoda respectivamente en los Caléndula officinalis L.
(Caléndula)
Es probable encontrar Quercetina por cromatografía en capa fina en los
extractos de pétalos de Caléndula officinalis L. (Caléndula).
Es probable cuantificar fenoles totales por espectrofotometría en extractos
etanólicos y con propilenglicol en los pétalos de Caléndula officinalis L.
(Caléndula).
Es probable comparar el contenido de fenoles totales en extractos
etanólicos y con propilenglicol en los pétalos de Caléndula officinalis L.
(Caléndula).
Es probable determinar la capacidad antioxidante de los pétalos de
Caléndula officinalis L. (Caléndula) por espectrofotometría por el método
de Cuprac.
2.4.- Variables
2.4.1.- Identificación de variables
Variable independiente:
Extracto de pétalos de Caléndula officinalis L. (Caléndula)
19
Variable dependiente:
Concentración de fenoles totales y /
Capacidad antioxidante
2.4.2.- Definición conceptual de variables
Extracto de pétalos deCaléndula officinalis L. (Caléndula)
Extractos obtenidos por percolación a partir de pétalos de Caléndula
officinalis L. (Caléndula), recolectados en los meses de agosto y
setiembre del 2018.
Concentración de fenoles totales Caléndula officinalis L.
(Caléndula)
Son compuestos bioactivos que pueden estar presentes en pétalos de
Caléndula officinalis L. (Caléndula).
Capacidad antioxidante Caléndula officinalis L. (Caléndula)
“Los antioxidantes previenen daño a moléculas biológicas por parte de
los radicales libres; son fuertes agentes reductores debido a las
propiedades de óxido reducción de sus grupos hidroxilo y las relaciones
estructurales entre diferentes partes de su estructura química. La
capacidad antioxidante de un alimento o especie vegetal depende de la
naturaleza y concentración de los compuestos antioxidantes”.(25)
20
2.4.3.- Operacionalizacion de variables
En la Tabla 1 se observa la Operacionalización de variables
involucradas en la presente investigación
Tabla 1. Operacionalización de variables
VARIABLE
INDEPENDIENTE INDICADOR Subindicador
Pétalos de Caléndula officinalis
L. (Caléndula)
Extracto de
pétalos Porcentaje
VARIABLE DEPENDIENTE INDICADOR Subindicador
Concentración de polifenoles Polifenoles
totales mg de ácido gálico
Capacidad antioxidante Método de
Cuprac
Actividad antioxidante en
mmol /Kg Trolox.
Fuente: Elaboración propia
21
CAPÍTULO III
METODOLOGÍA DE LA INVESTIGACIÓN
3.1.- Tipo y nivel de investigación
3.1.1.- Nivel de la investigación
Experimental
3.1.2.- Tipo de investigación
Según manipulación de variables: Experimental
Según número de mediciones: Transversal
Según la temporalidad: Prospectivo
Enfoque: Cuantitativo
Por el propósito o finalidad: Aplicada
Paradigma: Positivista
3.1.3.- Diseño de la investigación
Experimental
3.2.- Descripción del ámbito de la investigación
3.2.1.- Ubicación espacial
El presente trabajo de investigación se desarrolló en los laboratorios de la
Universidad Privada Autónoma del Sur y los análisis de capacidad
antioxidante se llevó a cabo en el laboratorio de Ensayo y Control de
Calidad de la Universidad Católica de Santa María.
22
3.2.2.- Ubicación temporal
El presente trabajo de investigación fue desarrollado entre los meses de
setiembre de 2018 a Enero del 2019.
3.3.- Población, muestra y muestreo
3.3.1.- Población de estudio
La población corresponde a flores de C. officinalis L (caléndula) del distrito
de Pisac, provincia de Calca del departamento de Cusco.
3.3.2.- Muestra
La muestra consistió en 5 Kg de pétalos de caléndula
3.4.- Técnicas e instrumentos para la recolección de datos
3.4.1.- Materiales, equipos y reactivos
A. Reactivos e insumos
Ácido gálico p.a.
Ácido clorhídrico concentrado p.a.
Carbonato de sodio p.a.
Etanol 96°
Reactivo de Folin Ciucalteu
Propilenglicol
B. Materiales
Algodón
Baguetas
Buretas de 25 mL
Goteros
Matraces de 250 mL
papel filtro
Pipetas de 5, 10 y 20 mL
Tubos de ensayo
23
C. Equipos
Espectrofotómetro
D. Software
El presente estudio se realizó usando diversos softwares como
Microsoft Excel 2016y Minitab 17para el diseño de gráficos y
aplicación de estadística para la comparación de grupos.
3.4.2.- Obtención de los pétalos de C. officinalis L (caléndula)
Las flores de C. officinalis L. (Caléndula) empleadas en el estudio fueron
obtenidas en el mes de septiembre del año 2018 del distrito de Pisac,
provincia de Calca, departamento de Cusco (Valle Sagrado) región que
presenta una altitud de 3600 m.s.n.m. y temperatura máxima de 22°C y una
mínima de 6 °C.
Figura 6. Flores de Caléndula officinalis L Provenientes del distrito de Pisac,
provincia de Calca, departamento de Cusco (Valle Sagrado)
Fuente. Elaboración propia
24
Las flores recolectadas exhibían un color naranja fuerte en los pétalos como
se observa en la Figura 7.
Figura 7. Flores de Caléndula officinalis L.recolectadas con un color
anaranjado intenso en los pétalos.
Fuente. Elaboración propia
Una vez recolectadas estas Fueron acondicionadas en papel Kraft para ser
transportadas a los laboratorios de la Universidad Privada Autónoma del Sur
del departamento de Arequipa para su estudio.
Figura 8. Flores de Caléndula officinalis L. recolectadas con un color
anaranjado intenso en los pétalos.
Fuente. Elaboración propia
25
3.4.3.- Clasificación taxonómica
Las flores frescas fueron llevadas a la Universidad Nacional de San Agustín,
facultad de ciencias biológicas, departamento académico de biología al
herbarium areqvipense (HUSA) para su reconocimiento respectivo.
3.4.4.- Preparación de la muestra
Una vez identificada la especie, los pétalos fueron retirados de las flores
cuidadosamente para no dañarlos.
Para la estabilización de la muestra los pétalos estos fueron lavados con
agua y alcohol, posteriormente secados a temperatura ambiente por 20
días. Los cuales fueron almacenados en papel Kraft para estudios
posteriores.
3.4.5.- Obtención de extractos por percolación
Los extractos fueron preparados a partir del método de percolación, dicho
procedimiento se realizó pesando 20 g de pétalos de caléndula triturados
para luego poner en contacto con los solventes (etanol y propilenglicol) en
un sistema de percolación que consistió en un recipiente (Botella) invertido
que contendrá la muestra acondicionado con algodón y papel filtro para
evitar el paso de los pétalos al momento de recuperar el solvente con los
metabolitos a 30 gotas por minuto, el diseño se observa a continuación en
la Figura 9.
Figura 9.Sistema de percolación que involucra recipiente que contiene la
muestra (1), Algodón (2), Colector de extracto (3) con control de flujo (30 gotas
/min) y canicas para evitar que la muestra se suspenda (4).
Fuente. Elaboración propia en ChemScketch
26
3.4.6.- Identificación de taninos
Los taninos fueron identificados realizando el ensayo en tubo por adición
de extracto etanólico obtenido de la extracción por percolación, con 20
gotas de cloruro férrico al 5 %. Resultado positivo cuando se observa un
cambio de coloración a verde.
3.4.7.- Identificación de Flavonoides
A. Fundamento
La reacción de Shinoda es típica para la identificación de flavonoides
que se basa en la oxidación de limadura de magnesio en medio ácido. El
hidrógeno liberado produce por reducción el ion flavilio de color rojo
escarlata que vira de un rosa pálido hasta escarlata. Esta reacción
distingue a todos los flavonoides excepto chalconas, auronas e
isoflavonas(26).
Figura 10.Prueba de Shinoda
Fuente. Barrios y Quispe (26)
B. Procedimiento
En un tubo de ensayo se colocó una cantidad de 0.1ml de extracto de
caléndula y luego una pequeña porción de limaduras de magnesio y dos
gotas ácido clorhídrico concentrado(26).
27
C. Interpretación
La coloración de naranja al rojo indica la presencia de flavonas, la
coloración rojo carmesí, purpura y azul indican presencia de
flavononas, el color amarillo pálido o incoloro indica presencia de
flavonas y flavonoles, finalmente una coloración de amarillo rojizo
indica presencia de isoflavonas (26).
3.4.8.- Identificación de Quercetina
Los extractos se analizarán por cromatografía en capa fina usando una
fase móvil de acetato de etilo: metanol (100:10) v/v y una fase
estacionaria de Sílica gel F 234 siendo el factor de retención esperado de
0.80 según investigaciones realizadas por Toso y Skiliar. (27)
Se probaron otras fases móviles como n-butanol:ácido
acético:agua:ácido fórmico (7:1:1:0.25) estudiadas por Patil et al.(28)Con
un Rf de 0.82, así como, Tolueno:acetato de etilo: ácido fórmico (5:4:1)
estudiadas por Soareset al.(29) Obteniendo un Rf de 0.82 estudiadas
por Goswami y Srivastava(30) con un Rf de 0.84.
3.4.9.- Determinación de Fenoles totales por el método de Folin
Ciucalteu
A. Fundamento del método
“El reactivo está compuesto por una mezcla de ácidos fosfowolfrámico y
fosfomolíbdico en medio básico, los que sufren reducción al oxidar los
compuestos fenólicos, originando un complejo wolframio-molibdeno de
color azul cuya absorbancia es dependiente de la concentración de los
polifenoles de la muestra y se midió en un espectrofotómetro a 765 nm.
Los resultados se expresan como mg equivalentes de ácido gálico/100 g
de muestra fresca”. (13),(14).
28
B. Procedimiento
“Los compuestos fenólicos libres fueron cuantificados mediante el
método espectrofotométrico de Folin-Ciocalteu. A 750 µL del reactivo de
Folin Ciocalteu diluido al 10% en agua, se le adicionó 100 µL de la
solución de compuestos antioxidantes (patrones de diferentes
concentraciones y muestras) y se incubó a temperatura ambiente
durante 5 min, luego se adicionarán 750 µL de una solución de
carbonato de sodio (Na2CO3) al 6% en agua, se agito y se dejó en
reposo durante 90 min a temperatura ambiente en condiciones de
oscuridad y se midió la absorbancia a 765 nm. La curva de calibración
se realizó con patrones de ácido gálico con concentraciones finales
entre 0 y 6 µg/mL.”(31), (32).
29
3.4.10.- Linealidad
Para la evaluación de la linealidad se midieron en el espectrofotómetro
soluciones de ácido gálico de 1, 2, 3, 4, 5, y 6 mg/L.
“Posteriormente se calculó el valor de R2 que es el coeficiente de
correlación lineal y para ello fue necesario usar la siguiente fórmula”(33)
n
YY
n
XX
n
YXYX
r
ii
ii
ii
ii
2
2
2
2
Ecuación. 1
“El valor r = 1 indica una recta perfectamente lineal, r = -1 una recta
perfectamente lineal de pendiente negativa y r = 0, la no correlación
entre X e Y. En la práctica, r es generalmente mayor de 0,99 y los
valores menores de 0,90 son raros”.(34),(33)
3.4.11.- Sensibilidad
“La sensibilidad de un método analítico corresponde a la mínima
cantidad de analito que puede producir un resultado significativo Los
parámetros a definir al evaluar la sensibilidad de un método son los
límites de detección y de cuantificación”.(34),(33)
Límite de detección corresponde, “según la USP, a la menor
concentración de analito que puede detectarse, pero no
necesariamente cuantificarse en una muestra, en las condiciones
establecidas”.(34),(33)
Límite de cuantificación corresponde, “según la misma referencia, a
la menor concentración de analito que puede determinarse
con”(34),(33) precisión y exactitud razonables en las condiciones
establecidas.
30
Posteriormente se usaron las siguientes fórmulas
Límite de Detección
'
13
nb
SblYblLD
Ecuación. 2
Límite de Cuantificación
'
110
nb
SYblLC bl
Ecuación. 3
3.4.12.- Determinación de la capacidad oxidante por el método de
Cuprac
El método espectrofotométrico Cuprac fue desarrollado por Apak para
determinar la capacidad total de antioxidantes en alimentos. Se basa en
la medida de la absorbancia del quelato Cobre(II)-Neucuproína
[Cu(Nc)2+] formado como resultado de la reacción Rédox de los
antioxidantes con cadenas rotas junto con el reactivo Cobre(II)-
Neocuproína (CUPRAC), donde la absorbancia se mide a una longitud
de onda de 450 nm.
El método comprende en mezclar la solución antioxidante con cloruro de
cobre (II), neocuproína diluida en metanol y acetato de amonio acuoso a
un pH 7, y medir subsecuentemente la absorbancia a 450 nm después
de 30 min de reacción.
31
Figura 11. Reacción de reducción del reactivo de Cuprac en presencia de
antioxidantes (AOX)
Fuente. Elaboración propia
3.4.13.- Estrategia de recolección de datos
Para el análisis estadístico y estructural se utilizaron diversos softwares
como Microsoft Excel 2016y Minitab 17 para el diseño de gráficos y aplicación
de estadística para la comparación de grupos.
32
CAPÍTULO IV
RESULTADOS
El presente estudio cuyo objetivo general fue cuantificar los fenoles totales y
determinar la capacidad antioxidante dieron los siguientes resultados.
4.1.- Identificación de C. officinalis
Las flores recolectadas fueron identificadas como C. officinalis L. en el área de
biología de la Universidad Nacional de San Agustín y la clasificación realizada
se presenta en la Tabla 2
Tabla 2. Clasificación taxonómica por el Hervarium Areqvipense de la
Universidad Nacional de San Agustín
REINO Plantae
DIVISIÓN Magnoliphyta
CLASE Magnoliphyta
ORDEN Asterales
FAMILIA Asteraceae
GÉNERO Calédula
ESPECIE Caléndula officinalis L.L.
Fuente. Elaboración propia
Es importante mencionar que tras la estabilización de las flores de caléndula de 5 kilos
de flores frescas, se obtuvo 300gramos de pétalos de caléndula, y con ellos se
realzaron los extractos y ensayos fitoquimicos.
4.2.- Percolación
Se diseñó y construyó el percolador donde se colocaron aproximadamente 50 g
de pétalos de C. officinalis, fue necesario cubrir el sistema con papel aluminio
para evitar el contacto con la luz, luego de 24 horas de contacto con 2
solventes y una extracción a 30 gotas por minuto se obtuvieron 50ml de
extracto etanólico y 50 ml de extracto con propilenglycol. Los extractos
obtenidos se almacenaron en frascos ámbar como se observa en la Figura 12.
33
Figura 12.Sistema de percolación de pétalos de C. officinalis usada en la
investigación
Fuente. Elaboración propi
4.3.- Identificación de Flavonoides y Taninos
4.3.1.- Identificación de taninos
En la Figura 13, tras la adición de cloruro de hierro (III) al 5%, se observa una
coloración verdosa correspondiente a presencia de Taninos.
Figura 13. Identificación de taninos con cloruro férrico al 5 %. Coloración
verde (positivo)
Fuente. Elaboración propia
34
4.3.2.- Identificación de flavonoides
En la Figura 14 se observa el resultado de la identificación de flavonoides el
cual se caracteriza por la aparición de un color rojo magneta característico tras
ser tratado con limaduras de magnesio en medio acido.
Figura 14. Identificación de flavonoides por el método de Shinoda Coloración
Rojo magneta (positivo para flavonoles)
Fuente. Elaboración propia
4.4.- Identificación de Quercetina
Para la identificación de Quercetina se usaron fases móvilesTolueno: acetato
de etilo: ácido fórmico (5:4:1) con un Rf esperado de 0.82.
Luego de realizar los ensayos usando placa de Sílicagel F234y la fase móvil de
Tolueno: acetato de etilo: ácido fórmico (5:4:1) se obtuvieron los resultados de
la Figura 15 donde se nota la existencia de una banda de color verde con un Rf
de 0.82 dando positivo a la presencia de Quercetina según Oliveira et al.(29).
35
Figura 15. Identificación de Quercetina por Cromatografía en Capa Fina del extracto etanólico.
Fuente. Elaboración propia
Así mismo, usando una fase móvil de acetato de etilo: ácido fórmico: (5:4:1) se
obtuvieron los resultados de la Figura 16 donde se observa una banda de color
con un Rf de 0.84, por lo que es probable que la caléndula officinalis l tenga
Quercetina dando positivo a la presencia de Quercetina en el extracto con
propilenglicol cuyos resultados son iguales a los encontrados .Goswami y
Srivastava (30)
Figura 16. Identificación de Quercetina en el extracto de propilenglycol por
Cromatografía en Capa Fina. Resultado Presencia de Quercetina con un Rf de
0.84.
Fuente. Elaboración propia
36
4.5.- Determinación de fenoles totales por el método de Folin Ciucalteu
4.5.1.- Soluciones patrón de calibración
En la Tabla 3 se observan los resultados de las absorbancias correspondientes
a las concentraciones de ácido gálico de 1, 2, 3, 4, 5 y 6 mg/L.
Tabla3.Resultados de las lecturas obtenidas luego de leer el espectrofotómetro.
Concentración
de ácido gálico
(mg/L)
Absorbancia
1
Absorbancia
2 �� s DSR (%)
1 0.125 0.119 0.122 0.004 3.48
2 0.275 0.260 0.268 0.011 3.97
3 0.422 0.432 0.427 0.007 1.66
4 0.578 0.565 0.572 0.009 1.61
5 0.718 0.732 0.725 0.010 1.37
6 0.887 0.878 0.883 0.006 0.72
*,��=Absorbancia promedio, s=desviación estándar, DSR=desviación estándar relativa Fuente. Elaboración Propia
4.5.2.- Linealidad
En la Figura 17 se observan el resultado de graficar la Tabla 3 donde se
comparan las concentraciones de ácido gálico (mg/L) versus absorbancias
promedio dando como resultado un coeficiente de correlación lineal R2 de
0.9998 siendo este superior a 0.995 concluyendo que el método para la
cuantificación de fenoles totales es lineal.
Por otro lado, la ecuación de la recta que describe la relación entre
concentraciones de ácido gálico (mg/L) versus absorbancias es:
𝑦 = 0.152 𝑥 − 0.0327
Dicha fórmula fue usada para la cuantificación reemplazando en las variables
como se muestra a continuación:
𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 = 0.152 [𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛 𝑑𝑒 á𝑐𝑖𝑑𝑜 𝑔á𝑙𝑖𝑐𝑜 (𝑚𝑔
𝐿)] − 0.0327
37
1 2 3 4 5 6
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
Absorb
ancia
pro
medio
Ácido gálico (mg/L)
y = 0.152 x - 0.0327
R2 = 0.9998
Figura 17.Gráfico de calibración entre concentración de ácido gálico (mg/L) y
absorbancias promedio
Fuente. Elaboración propia
4.5.3.- Sensibilidad
Para determinar la sensibilidad del método se calculó gráficamente la ecuación
de la recta de la concentración de mg AG/L y la desviación estándar de la
absorbancia de la Tabla 3 dando como resultado la Figura 18 donde se observa
que la ecuación de la recta es
𝑦 = 0.0003𝑥 + 0068
La sensibilidad determinada en términos de límites de detección y
cuantificación expresadas en la ecuación 2 y 3 (Ec. 2y Ec.3) del apartado
3.4.9.2. Reemplazando los siguientes datos de la Tabla 4
38
1 2 3 4 5 6
0.004
0.005
0.006
0.007
0.008
0.009
0.010
0.011D
esvia
ció
n e
stá
nd
ar
Ácido gálico (mg/L)
y = 0.0003x + 0.0068
Figura 18. Ecuación de la recta entre concentración de ácido gálico (mg/L) y
desviación estándar de las absorbancias
Fuente. Elaboración propia
Tabla 4. Valores de las variables implicadas en la determinación de los límites de cuantificación y límites de detección
Variable Interpretación Fuente Valor
B Pendiente Figura 17 0.152
Ybl Intercepto Figura 17 0.0327
Sbl Intercepto Figura 18 0.0068
N 6
*b=pendiente, Ybl=intercepto, Sbl=desviación estándar del blanco, n=cantidad
de puntos de calibración
Fuente. Elaboración propia
El límite de detección y cuantificación fue de 0.143 mg/L y 0.966 mg/L de
ácido gálico respectivamente.
39
4.5.4.- Cuantificación de fenoles totales
Los resultados de los análisis del extracto con propilenglicol expresados en
equivalente de ácido gálico dieron como resultados promedio de5.410 ± 0.025
mg de AG/ kg de pétalos de caléndula.
En relación al extracto etanólico el promedio fue de 4.935 ± 0.043 mg de AG/
kg de pétalos de caléndula.
Tabla 5. Gastos obtenidos en el análisis de una muestra (6 repeticiones)
N Concentración (EAG
mg/Kg) extracto etanólico
Concentración (EAG
mg/Kg) extracto con
propilenglicol
1 4.930 5.391
2 4.891 5.443
3 5.009 5.417
4 4.904 5.404
5 4.917 5.430
6 4.957 5.376
�� 4.935 5.410
s 0.043 0.025
DSR (%) 0.87 0.46
*��= Promedio, s= Desviación estándar, DSR= Desviación estándar relativa.
Fuente. Elaboración propia
4.5.5.- Comparación estadística de fenoles totales en extractos
etanólicos y con propilenglicol
Se realizó la prueba F para varianzas de dos muestras dando como resultado
que F experimental es menor al F de tablas (2.978>5.05) por lo tanto las
varianzas son homogéneas.
Con dichos resultados, se procedió a realizar una prueba t suponiendo
varianzas iguales o homogéneas.
40
Tabla 6. Prueba F para varianza de dos muestras
Concentración (EAG
mg/Kg) extracto etanólico Concentración (EAG mg/Kg) extracto con propilenglicol
GL 5 5
F 2.978
P una cola 0.1280
Valor crítico para F (una cola)
5.05
*EAG=equivalente a ácido gálico
Fuente. Elaboración propia
Posteriormente aplicando la prueba t para dos muestras suponiendo varianzas
homogéneas dio como resultado que el estadístico t experimental es mayor al t
de tablas (23.30>2.57) por lo que se concluye que la concentración de fenoles
totales es superior en el extracto de propilenglicol que en el extracto etanólico
al 95 % de confianza.
Tabla 7. Prueba t para dos muestras suponiendo varianzas homogéneas
Concentración (EAG
mg/Kg) extracto etanólico Concentración (EAG mg/Kg) extracto con propilenglicol
GL 10
Estadístico t 23.30
p dos colas 4.43 x 10-10
Valor crítico de t (dos colas)
2.228
*EAG= equivalente a ácido gálico
Fuente. Elaboración propia
Dicha conclusión se corrobora con la probabilidad p de 4.43 x 10-10 que es
menor a 0.05 lo cual indica que la concentración de fenoles totales es diferente
al usar ambos solventes en tal sentido para la presente investigación se utilizó
el extracto con propilenglicol para la determinación de su capacidad
antioxidante.
41
4.5.6.- Comparación del método de cuantificación de fenoles totales
con Laboratorio Acreditado
En la Tabla 8 se muestran los resultados del análisis de fenoles totales
realizados en el Laboratorio de Ensayo y Control de Calidad de la Universidad
Católica de Santa María.
Tabla 8. Cuantificación de Fenoles totales por el método Folin ciucalteu
N Concentración ácido
gálico (ppm) Absorbancia
1 0.625 0.050
2 1.250 0.093
3 1.875 0.156
4 2.500 0.219
5 3.125 0.277
Fuente. Adaptado del informe del Laboratorio de Ensayo y Control de Calidad
de la Universidad Católica de Santa María.
El resultado de graficar los valores de la Tabla 8 da como resultado la Figura
19 donde se observa que el coeficiente R2 es de 0.9962 Lo que indica que el
método es lineal al igual que el método realizado en la presente investigación.
0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5
0.1
0.2
0.3
Abso
rbanci
a
Concentración (ácido gálico) (mg/L)
y = 0.0928 x - 0.015
R2 = 0.9962
Figura 19. Gráfico de calibración entre concentración de ácido gálico (mg/L) y
absorbancias promedio emitido por el Laboratorio de Ensayo y Control de
Calidad de la Universidad Católica de Santa María.
Fuente. Elaboración propia.
42
La cantidad de fenoles totales cuantificado por el Laboratorio de Ensayo y
Control de Calidad de la Universidad Católica de Santa Maríadio como
resultado 55 mg/kg de ácido tánico que expresado en ácido gálico da como
resultado 5.51 mg de AG por Kg de caléndula, dicho resultado no difiere
significativamente con el resultado hallado en el laboratorio hallado en la
UPADS.
4.5.7.- Determinación de la capacidad antioxidante de Caléndula
officinalis L. (Caléndula) por el método de CUPRAC
En la Tabla 9 se observan los resultados de lectura de diferentes
concentraciones de Trolox 0.06, 0.1, 0.2, 0.03 y 0.4 mmol/L siendo sus
absorbancias resultantes de 0.010, 0.015, 0.026, 0.037 y 0.049nm.
Tabla 9. Valores del gráfico de calibración de concentración promedio de Trolox vs absorbancia promedio
Trolox (mg/L) Trolox (mmol/L) Absorbancia
15 0.06 0.010
25 0.1 0.015
50 0.2 0.026
75 0.3 0.037
100 0.4 0.049
Fuente. Elaboración Propia
Posteriormente graficando los datos de la Tabla 9 se obtiene la Figura 20
donde se observa un coeficiente R2 de 0.9997, el cual es mayor a 0.995,
siendo por lo tanto el método lineal.
43
0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.35 0.40 0.45
0.02
0.04
Absorb
ancia
y = 0.1137 x + 0.0033
R2 = 0.9997
Trolox (mmol/L)
Figura 20. Gráfico de calibración para la determinación de la capacidad
antioxidante por el método de Cuprac
Fuente. Elaboración propia
El laboratorio de Ensayo y Control de Calidad de la Universidad Católica de
Santa María, según el método Cuprac determinó que la capacidad antioxidante
es de 71.27 mmol /kg trolox.
44
CAPÍTULO V
DISCUSIÓN
La presente investigación tuvo por objetivo determinar los fenoles totales y la
capacidad antioxidante en pétalos de C. officinalis L. dado que existen reportes
sobre los efectos benéficos para la salud de diversos extractos metanólicos y
etanólicos, los cuales podrían atribuirse a los metabolitos secundarios de dicha
flor.
El ensayo de identificación de taninos por el método del cloruro férrico dio
como resultado positivo tras observarse el viraje de color verde, por otro lado,
la determinación de flavonoides por el método de Shinoda, dio positivo al
tornarse de color rojo magneta característico de flavonoles. Kumar,et al.(35),
realizó pruebas de Shinoda y Pew que resultaron positivas por la aparición del
color verde lo que indica que dichos resultados confirman que el compuesto
aislado es un flavonoide, además al igual que la presente investigación, Kumas
buscó identificar quercetina por ser uno de los flavonoles conocidos presentes
en C. officinalis L.
En cuanto a la identificación de quercetina por Cromatografía en Capa Fina
(CCF) Kumar,et al.(35), desarrolla una metodología de identificación de
quercetina usando marcadores o estándares de referenciaevaluando solventes
como n-butanol: ácido acético: agua (BAW - 4: 1: 5) y cloroformo: ácido acético:
agua (CAW-10: 9: 1) obteniendo Rf de 0.856 y 0.88 respetivamente,
En la presente tesis se identificaron bandas correspondientes a quercetina con
Rf de 0,82 y 0,84utilizando fases móviles de Tolueno: acetato de etilo: ácido
fórmico (5:4:1).
Por Soareset al. (29), Quienes realizaron ensayos de identificación con
estándares auténticos de quercetina (Rf = 0,82) ycanferol (Rf = 0,89) usando
como fase móvil acetato de etilo: metanol (100:10), así mismo, Tolueno:
acetato de etilo: ácido fórmico (5: 4: 1), Por otro lado Patil, et al.(28)Probaron
diferentes fases móviles y se confirmó la fase móvil que comprende n-butanol:
ácido acético: agua: ácido fórmico (7: 1: 1: 0,25) para la estimación simultánea
45
de rutina, quercetina y liquiritina. Logrando una migración de puntos con
valores de Rf entre 0,47, 0,63 y 0,82 respectivamente.
En la extracción asistida con propilenglicol dio como resultado que el extracto
de Caléndula officinalis L.presenta una concentración de fenoles totales de
5.410 ± 0.025 mg de ácido gálico/ kg de pétalos de caléndula yde 4.935 ±
0.043 mg de ácido gálico/ kg de pétalos de caléndula en el extracto etanólico.
Los valores hallados fueron comparados con los resultados del Laboratorio de
Ensayo y Control de Calidad de la Universidad Católica de Santa María que dio
como resultado para la misma muestra 55 mg/kg de ácido tánico que
expresado en ácido gálico da como resultado 5.51 mg de ácido gálico por Kg
de caléndula, Siendo los resultados similares a los obtenidos, se concluye que
el método empleado en la presente investigación fue comparable a los de un
laboratorio acreditado. Por otro lado, se pudo determinar que la concentración
de fenoles totales es superior en el extracto con propilenglicol que en el
extracto etanólico al 95 % de confianza ya que el t experimental es mayor al t
de tablas (23.30>2.57).
En relación a la determinación de la capacidad antioxidante de los pétalos de
caléndula, es importante mencionar que Kundu y Surth (36), expone que, los
flavonoides y carotenoides son potentes antioxidantesa muy
bajasconcentraciones. En general, se cree que las propiedades
quimiopreventivasde los flavonoides reflejan su capacidad para eliminar las
ROS (Especies Reactivas de Oxigeno) endógenas, así mismoMatysiket al.
(37)Describe que al inhibir o estimular varias vías de señalización, los
flavonoides a bajaconcentración podrían afectar la función celular. Se ha
informado que laCaléndula officinalis L.contiene cumarinas, flavonoides que
incluyen quercetina, ácido protocatechuic, etc., triterpenoids-faradiol, ácido
oleanólico, beta-amirina, Calénduladiol, etc. y la narcisina alcaloide, en tal
sentido ,para el análisis de la capacidad antioxidante, se trabajó con el extracto
de pétalos de caléndula en propilenglycol obteniéndose 71,27 mmol /kg trolox,
estos resultados difieren con lo reportado por Domínguez en cuyo trabajo de
investigación se menciona que el extracto hidroalcohólico de las flores de
caléndula presenta una capacidad antioxidante de 148,8 mmol /de trolox (13)
46
esta diferencia se puede atribuir a diferentes factores como al tipo de solvente
que se utilizó para la extracción de los metabolitos secundarios, a la
procedencia de las flores de caléndula ya que según investigaciones el tipo de
suelo ,las condiciones climáticas ,las diferentes especies y el método de
recolección podrían afectar la producción y por lo tanto la concentración de los
metabolitos secundarios en una especie vegetal.
Otros investigadores comoKishimotoet al.(38), explica que las flores también
son ricas en carotenoides, de los cuales se ha informado que la flavoxantina
está presente en el 28,5% del total de carotenoides seguidos de la
luteoxantina. Nishinoet al.(39), indican -que los ingredientes de C. officinalis
como la luteína poseen un potencial quimiopreventivo y Bohm et al.(40),
comentan que se ha informado que el caroteno bloquea las especies reactivas
de oxígeno, además Herzog et al.(41), da como resultado que el licopeno
reduce constantemente los niveles de transcripción de las citoquinas
proinflamatorias. Por lo tanto,Korengathet al. (9), explica que la acción
combinada de los ingredientes activos presentes en C. officinalis a través de su
eliminación de radicales libres y la inhibición de los mediadores de la
inflamación, especialmente las citoquinas y prostaglandinas, puede ejercer la
actividad antiinflamatoria.
Preethi et al. (42), indica, queen su estudio el extracto de Caléndula officinalis
L.eliminó eficazmente los radicales superóxido, hidroxilo y óxido nítrico in vitro,
dichas afirmaciones refuerzan el cumplimientode nuestra hipótesis y los
resultados hallados en el laboratorio por el consumo de caléndula para la
eliminación de radicales libres los cuales se generan dentro del cuerpo durante
el metabolismo normal o en presencia de xenobióticos, sería una buena
alternativa.
Finalmente es importante mencionar que podría existir diferencia de resultados
en la misma especie de caléndula debido a las condiciones geográficas, el
abono y tipo de suelo, tal como lo expone Onofrei et al. (12)En su estudio,
donde encontró diferencia en general en cuanto a la producción de compuestos
fenólicos y de flavonoides comparando plantas fertilizadas con las no
fertilizadas, de manera consistente durante dos años consecutivos,
47
encontrando que la capacidad de eliminación de radicales libres de los
extractos de caléndula se incrementó como resultado de la fertilización
ecológica. Los fertilizantes más efectivos contenían altas cantidades de
nitrógeno, pero también bio humus y aceites vegetales que actúan como
bioestimulantes. Por lo tanto, la fertilización ecológica es la recomendada para
el cultivo de plantas de caléndula con un mayor valor de producto y
propiedades Fito-medicinales potenciales.
48
CONCLUSIONES
Primera: En los extractos de Caléndula officinalis L.se ha identificado
taninos, lo cual se evidencia con una coloración verde al reaccionar con el
FeCl3 al 5% y flavonoides al dar coloración rojo magneta con la prueba de
Shinoda.
Segunda: A través de la Cromatografía en capa fina, se identificó
quercetina con un Rfs de 0.82 (extracto etanólico) y 0.84 (extracto con
propilenglicol) usando como fase móvil tolueno: acetato de etilo: ácido
fórmico (5:4:1).
Tercera: La concentración de fenoles totales en Caléndula officinalis L Fue
de 5.410 ± 0.025 mg de AG/L de pétalos de caléndula en el extracto con
propilenglicol y de 4.935 ± 0.043 mg de AG/ L de pétalos de caléndula en el
extracto etanólico.
Cuarta: El extracto de propileglicol presentó mayor concentración de
fenoles totales en comparación con el extracto etanólico al 95 % de
confianza.
Quinta: La capacidad antioxidante del extracto con propileglicol de
Caléndula officinalis L.fue de 71.27 mmol/kg trolox.
49
SUGERENCIAS
Realizar estudios de la capacidad antioxidante de la Caléndula officinalis L.
(caléndula) utilizando otras partes de la planta (raíz, tallo, hoja, etc.)
Realizar estudios para identificar otras propiedades benéficas de los pétalos
Caléndula officinalis L. (Caléndula).
50
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53
APÉNDICES
54
Apéndice 1. Constancia de identificación taxonómica
55
Apéndice 2. Resultados de la Universidad Católica Santa María
56
Apéndice 3. Reconocimiento de la muestra Caléndula oficinales
Una vez que se clasifico taxonómicamente se prepara la muestra
estabilizando con agua y etanol, para posteriormente utilizarlos.
Una vez bien secados los pétalos de Caléndula officinalis L. (Caléndula)
se tritura para obtener un mayor rendimiento del soluto en el solvente.
57
Peso de los pétalos triturados de Caléndula officinalis L. (Caléndula) en
balanza analítica
Extracción de los pétalos de Caléndula officinalis L. (Caléndula) en
etanol y propilenglicol
58
Filtración de los pétalos de Caléndula officinalis L. (Caléndula) en etanol
30 gts por min.
Protección de la muestra Caléndula officinalis L. (Caléndula) de la luz.
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