E fisiológicos dE - Coordinación de Estudios de Posgrado · Efectos genómicos de la...

Universidad Nacional Autónoma de México

Dr. José Narro RoblesRector

Dr. Eduardo Bárzana GarcíaSecretario General

Dr. Francisco José Trigo TaveraSecretario de Desarrollo Institucional

Dr. Juan Pedro Laclette San RománCoordinador de Estudios de Posgrado

Dra. Aurea Orozco RivasCoordinadora del Programa de Doctorado en Ciencias Biomédicas

Dra. María Imelda López VillaseñorSubdirectora Académica de la Coordinación

de Estudios de Posgrado

Lic. Lorena Vázquez RojasCoordinación Editorial

Biomédicas-0.indd 2 26/10/15 10:55

Estudios fisiológicos y molEcularEs

para dilucidar la función

dE las hormonas tiroidEas

El mEcanismo dE acción dE la

3,5-diyodotironina (t2)En tElEóstEos

Universidad Nacional Autónoma de México

Coordinación de Estudios de Posgrado

Programa de Doctorado en Ciencias Biomédicas

La Colección Posgrado publica, desde 1987, las tesis de maestría y doctorado que presentan, para obtener el grado, los egresados de los programas del Sistema Universitario de Posgrado de la unam.

El conjunto de obras seleccionadas, además de su originalidad, ofrecen al lector el tratamiento de temas y problemas de gran relevancia que contribuyen a la comprensión de los mismos y a la difusión del pensamiento universitario.

Arturo Mendoza Cisneros

Estudios fisiológicos y molecularespara dilucidar la funciónde las hormonas tiroideas

El mecanismo de acción de la3,5-diyodotironina (T2)

en teleósteos

univErsidad nacional autónoma dE méxico

México, 2015

Primera edición, 28 de agosto de 2015

D.R. © Universidad Nacional Autónoma de México Coordinación de Estudios de Posgrado Ciudad Universitaria, 04510, Coyoacán, México, D.F.D.R. © Arturo Mendoza Cisneros

ISBN: 978-607-02-7108-3

Prohibida la reproducción total o parcial por cualquier medio sin la autoriza-ción escrita del titular de los derechos patrimoniales.

Impreso y hecho en México

Diseño, corrección de estilo y formación tipográfica: Julio Gustavo Jasso Loperena

Lectura de pruebas: María del Consuelo Yerena Capistrán

Diseño de portada: Columba Citlali Bazán Lechuga

Mendoza Cisneros, Arturo, autor.

Estudios fisiológicos y moleculares para dilucidar la función de las hormonas

tiroideas : el mecanismo de acción de la 3,5-diyodotironina (T2) en teleósteos /

Arturo Mendoza Cisneros. –- Primera edición. –- México, D.F. : Universidad

Nacional Autónoma de México, Coordinación de Estudios de Posgrado, 2015.

92 páginas ; 21 cm. –- (Colección posgrado)

Bibliografía: páginas 73-86

Programa de Doctorado en Ciencias Biomédicas

ISBN 978-607-02-7108-3

1. Glándulas tiroides – Fisiología. 2. Pruebas de función de la glándula

tiroides. 3. Hormonas tiroides. I. Universidad Nacional Autónoma de México.

Coordinación de Estudios de Posgrado. II. Título. III. Serie.

612.44-scdd21 Biblioteca Nacional de México

agradEcimiEntos

A mi tutora, doctora Aurea Orozco Rivas, por su apoyoy guía en la realización de mi doctorado.

Al doctor Valverde, por la revisión crítica de mi tesis doctoral.

A los miembros de mi comité tutor, doctoras Brenda Anguianoy Luz Navarro, por su apoyo y la revisión crítica de mi

desempeño durante el desarrollo de mi doctorado.

A los miembros del jurado de examen de grado,doctores Ignacio Camacho Arroyo, Jean Louis Charli,

Alfonso León del Río y Susana Castro Obregón.

A mis compañeros de laboratorio en la UNAM: Paty, Gaby,Pamela, Aurora y Miguel, por su apoyo en el desarrollo

de los experimentos.

A la UNAM y al Programa de Doctorado en CienciasBiomédicas por crear la oportunidad para

seguir con mi desarrollo académico.

A la Coordinación de Estudios de Posgrado, particularmenteal Departamento de Producción Editorial, por su apoyo en la publica-ción de este libro en la Colección Posgrado, UNAM y por permitirme

combinar mi gusto por la ciencia y el arte en este libro.

A mi compañera de vida y esposa, Adriana Guadalupe Martín Mozqueda.

A mi familia y amigos por el apoyo emocional y camaradería:mi mamá, Jesús María; mi papá, Arturo; mis hermanos: Laura, Julissa, Janet, César; y a mis amigos: Jimena, Juan Carlos, Pepe, David, Dany,

Silvia, Mario, Alex, Franco, Aida, Ángeles Edith, Minerva, Ismaely Francisco.

Al doctor Herbert Samuels, por su apoyo durante mi estancia en NYU Langone Medical Center.

Al doctor Anthony N. Hollenberg, por su apoyo para la realización de mi estancia posdoctoral en la Universidad de Harvard.

A mis colaboradores en Harvard: doctores Inna Astapova, Kristen Vella, Anita Kurmann, Hiroaki Shimizu, Rodrigo Rorato, Hyo-Jeong Kim, y a Felix Ye

También agradezco a mis lectores, por el tiempo que invirtieron en este libro.

Agradecimientos por apoyo técnico a: Patricia Villalobos Aguilera,técnico en el laboratorio; Leonor Casanova Rico, administrativo; Lourdes Lara, videoconferencia; Ramón Martínez, sistemascomputacionales; Anaid Antaramian, unidad de proteogenómica; Michael Jeziorski, unidad de proteogenómica; Miguel Maqueda, laboratorio.

Este trabajo se realizó con los apoyos del Conacyt: beca doctoral núm. 31950; y beca del Programa de Estancias Posdoctorales en el Extranjero para la Consolidación de Grupos de Investigación, núm. de registro 250095.

8 Entre el polvo del mundo

ÍndicE

Resumen ..............................................................................................11Abstract ...............................................................................................13Abreviaturas .........................................................................................15Introducción ......................................................................................... 17

1. Receptores nucleares. Sus orígenes y sus ligandos .......................19

2. Receptores de hormonas tiroideas ...............................................23Importancia fisiológica ..................................................................23

Funciones gen-específicas ........................................................24Metamorfosis ............................................................................26Neurogénesis .............................................................................28Metabolismo energético ............................................................29

Regulación de los TR ....................................................................30Resistencia a hormonas tiroideas ................................................. 31

3. Arreglo estructural y funcional de los TR ...................................35Estructura primaria de los TR, arreglo general .............................35

Dominio amino terminal (NTD) ............................................36Dominio de unión al DNA (BDD) .........................................37Región de bisagra .....................................................................38Domino de unión al ligando (LBD) .........................................39El dominio F .............................................................................40

Dimerización de los TR................................................................. 41Modificaciones post-traduccionales de los TR ..............................42Elementos de respuesta a hormonas tiroideas ..............................43

10 Estudios fisiológicos y moleculares para dilucidar la función de las hormonas tiroideas

4. Mecanismo de acción de las hormonas tiroideas ........................ 47Correguladores .............................................................................. 51Coactivadores ................................................................................52Correpresores ................................................................................55

5. Antecedentes específicos ..............................................................59La 3,5-diyodotironina (T2) es una TH bioactiva...........................59La T2 tiene efectos extranucleares ...............................................60Efectos genómicos de la 3,5-diyodotironina ................................. 61

6. Planteamiento del proyecto .........................................................63Justificación ...................................................................................63Hipótesis ........................................................................................63Objetivo general ............................................................................64

Objetivos particulares ...............................................................64Materiales y métodos .....................................................................64

Clonación de los TR de tilapia .................................................64Ensayos de transactivación usando transfección transitoria .....65

Resultados .....................................................................................65

7. Discusión .......................................................................................67 El LBD del TRβ1 del pez y del humano, y su rol en la unión de T2 ..............................................................................................68 El NTD y su importancia en la activación del L-TRβ1 mediada

por T2 ............................................................................................70 La T2 también es activa en el TRβ1 en humanos ........................70 ¿De dónde viene la T2? .................................................................71

Conclusiones .................................................................................72

Fuentes consultadas ..............................................................................73Referencias de figuras ............................................................................87

rEsumEn

a unión de la triyodotironina (T3) a los receptores de hormonas tiroideas (TR) es el paso crucial en la regulación de la expresión de los genes modulados por esta hormona. Los TR se encuentran uni-dos al promotor de los genes cuya expresión se modula positivamente por T3; en ausencia de este ligando reclutan correpresores, mientras que en su presencia unen coactivadores, los cuales regulan la tasa de síntesis de RNA de los genes blanco. Estudios recientes en nuestro grupo de traba-jo han mostrado que la 3,5-diyodotironina (T2), hormona que se pro-duce por medio de la desyodación del anillo externo de la T3, es capaz de conservar la expresión eutiroidea de distintos genes T3-dependientes. Además, la T2 induce la formación de un complejo de proteínas nucleares sobre un elemento de respuesta a hormonas tiroideas canó-nico distinto al que induce T3, sugiriendo que T2 y T3 interactúan con TR distintos. Más aún, la T2 estimula el crecimiento de teleósteos. Juntos, estos resultados indican que la T2 es una hormona tiroidea con un rol fisiológico, al menos en teleósteos que ejerce sus efectos sobre la transcripción de genes TH-dependientes mediante su interacción con un TR alternativo. El objetivo del presente trabajo fue identificar las TR que se expresan en el hígado de tilapia para su posterior caracterización molecular. Así, identificamos dos isoformas del TRβ1 que difieren entre sí por la presencia de un inserto de nueve aminoácidos en el dominio de unión al ligando presente en la isoforma L-TRβ1 pero no en la isoforma S-TRβ1. Además, ambas isoformas son 75 aminoácidos más cortas en el dominio N-terminal (NTD) con respecto al TRβ1 de hu-mano. El L-TRβ1 fue capaz de activar un gen T3-reportero en presencia de T3 y T2, mientras que el S-TRβ1 sólo lo activó en presencia de T3.

También observamos que la activación del L-TRβ1, mediada por T2 pero no por T3, requiere del NTD del L-TRβ1. Más aún, el L-TRβ1 activa al gen reportero a concentraciones de T2 menores que las de T3, lo cual indica que T2 es un ligando más eficiente para este TR en parti-cular. Dadas estas características, proponemos que T2 podría aumen-tar la afinidad del TR por ciertos coactivadores o bien podría reclutar coactivadores distintos a los que se reclutan en presencia de T3, lo cual podría contribuir a comprender mejor la pleyotropia funcional de las hormonas tiroideas.

Introducción 13

abstract

he binding of triiodothyronine (T3) to the thyroid hormone receptors (TRs) is the critical first step for gene expression modu- lation by thyroid hormones (THs). TRs are bound to the promot-er of positively T3-modulated genes and in the absence of T3 recruit corepressors, while in the presence of the hormone; they bind coactivators, which modulate the rate of RNA synthesis. All biological effects of TH are attributed to T3. However, recent studies in our work group have shown that 3,5-diiodothyronine (T2) is able to maintain euthyroid expression of different T3-regulated genes. Furthermore, T2 induces the formation of a nuclear protein complex to the canonical TH respon-se element distinct from the one induced by T3, suggesting that T2 and T3 interact with different TRs. Moreover, T2 administered in sub- physiological concentrations stimulates growth of teleosts. Together, these results indicate that T2 is a TH with a physiological role in teleosts and exerts its effects upon transcription of T3-regulated genes through in-teracting with an alternative TR in teleosts. The interest of the present book was to identify and molecularly characterize the TRs expressed in the liver of tilapia. Two isoforms of the TRβ1 were identified; both differ by the presence or not of an insert of nine amino acids in the ligand binding domain of the L-TRβ1 isoform but not the S-TRβ1 isoform. Additionally, both isoforms are 75 amino acids shorter in the N-terminal domain (NTD) as compared to the human-TRβ1. L-TRβ1 was able to activate a T3-reporter gene in the presence of T2 while the S-TRβ1 only activated the reporter gene in the presence of T3. We also observed that the activation of L-TRβ1 mediated by T2 but not T3 requires of the NTD of the L-TRβ1. Furthermore, L-TRβ1 activated

the reporter gene at lower concentrations of T2 than those of T3, which indicates that T2 is a more efficient ligand for this particular TR. Given these characteristics, we propose that T2 could increase the affinity of the TR for certain coactivators or could recruit different coactivators from those recruited in the presence of T3, explaining in part the functional pleyotropia of THs.

Introducción 15

abrEviaturas

3βdiol 3β-androstanediolABCD2 ATP binding cassette sub-family D2AF1 Función de activación 1AF2 Función de activación 2apo-TRa1 Receptor de hormonas tiroideas a1 no ligadoBAT Tejido adiposo pardocAMP Adenosina monofosfato cíclicoCARM Metil transferasa de arginina asociada a coactivadoresCBP Proteína de unión a CREBCKI Caseína cinasa 1cMyc Miembro de la familia de protoncogenes Myc cCoR CorrepresoresCre Tirosina recombinasaCREB Proteína de unión a elementos de respuesta de cAMPCTE Extensión carboxilo terminalD1 Desyodasa tipo 1D2 Desyodasa tipo 2D3 Desyodasa tipo 3DAD Dominio de actividad desacetilasaDBD Dominio de unión al DNADio1 Desyodasa tipo 1DR4 Repetido directo 4EMSA Ensayo de retardo de la movilidad electroforéticaGC-1 Tiromimético selectivo para TRβGRTP1 Growth hormone regulated TBC proteinGsta Glutation S transferasa alfaHAT Acetil transferasa de histonaHDAC Desacetilasa de histonaHMT Metil transferasa de histonaHolo-TR Receptor unido a la hormonahTFIIB Factor de transcripción humano IIBIP6 Palíndrome invertido 6

KI Knock innKO Knock outLBD Dominio de unión al ligandoLBP Saco de unión al ligandoNCoR Correpresor de receptores nuclearesNLS Secuencia de señalización nuclearNR Receptor nuclearNTD Dominio amino terminalnTRE Elemento de respuesta a hormonas tiroideas negativoMAPK Proteína cinasa activada por mitógenosMMI MetimazolmRNA RNA mensajerop160 Proteína 160PAL PalindrómicoPAS-B Dominio PAS-BPKA Proteína Cinasa APRMT Proteína arginina metil transferasaPol II RNA polimersa IIPTM Modificaciones postraduccionalesRAR Receptor de ácido retinoicoRNA Ácido ribonucleicoRTH Resistencia a hormonas tiroideasRXR Receptor de retinoides XSMRT Mediado de silenciamiento de receptores de hormonas tiroideas y ácido retinoicosiRNA Silenciador de RNASRC Coactivador de receptores a esteroidesSUMO Small Ubiquitin Related ModifierSWI/SNF SWItch/Sucrose Non FermentableT2 3,5-diyodotironinaT3 TriyodotironinaT4 TiroxinaTBL1 Transducin b-like 1TH Hormonas tiroideasTHRA Receptor de hormonas tiroideas alfaTHRB Receptor de hormonas tiroideas betaTRAP Thyroid Hormone Receptor Associated ProteinTRE Elemento de respuesta a hormonas tiroideasTRH Hormona liberadora de tirotropinaTRs Receptores de hormonas tiroideasTSH Hormona estimulante de la tiroidesUCP1 Proteína desacoplante 1WD40 Proteína presente en los complejos correpresores

Introducción 17

as hormonas tiroideas (TH) son mensajeros endocrinos yodados esenciales para el desarrollo y funcionamiento normal de los vertebrados. Las TH son sintetizadas y secretadas a la circulación por la glándula tiroides. La tiroxina (T4) es el principal producto de secre-ción de esta glándula, sin embargo, la T3 es la hormona a la que se le reconocen los efectos nucleares debido a que es hasta 100 veces más afín a los receptores de hormonas tiroideas (TR) que la T4. Los TR modulan la expresión de los genes T3-responsivos en ambos sentidos, positiva o negativamente, según el gen blanco, el tejido y la etapa del desarrollo del organismo, además de ser responsables de la pleiotropía funcional de las TH.1-4 Recientemente se ha planteado que algunos ligandos no canónicos pueden ejercer funciones específicas por medio de receptores nucleares; así, el ácido litocólico y el 3βdiol son ligandos de receptores a vitamina D y estrógenos, respectivamente, y realizan funciones de importancia fisiológica.1,5,6 En este contexto, nuestro grupo de trabajo propone que la 3,5-diyodotironina (T2), una TH ge-nerada por la desyodación de T3, es un ligando de los TR. Diversos estudios han mostrado que la T2 tiene efectos sobre la regulación de la tasa de respiración mitocondrial en mamíferos y que su efecto es más rápido que el observado con T3, además no requiere de síntesis de proteínas de novo. Por lo anterior, varios autores han concluido que el efecto de la T2 es no-genómico, posiblemente por su unión a la subu-nidad Va del citocromo-c.7-9

En nuestro grupo de trabajo se ha demostrado que la T2 modula la expresión de genes T3-dependientes en teleósteos. En conjunto, nues-tros datos indican que la T2 es una TH bioactiva con un papel fisioló-

introducción

gico que ejerce sus efectos mediante un TR. Aquí se estudió el meca-nismo de acción por medio del cual la T2 regula la transcripción de genes T3-dependientes. Para este fin, inicialmente identificamos dos isoformas del receptor de hormonas tiroideas β1 en el hígado de te-leósteos las cuales se caracterizaron en ensayos de transactivación en cultivos celulares para analizar el efecto de T3 o T2 sobre la expresión de un gen T3-reportero. Posteriormente realizamos estudios de estructura-función para analizar la importancia de distintos dominios funcionales del TR en la activación de la transcripción mediada por T2.

1 M. Ferreira Azevedo, et al., 2008: 1304-1312.2 A. Orozco y C. Valverde-R, 2005: 799-813.3 A. Muñoz y J. Bernal, 1997: 433-445.4 J.D. Fondell, 2013: 3867-3875.5 M. Makishima et al., 2002: 1313-1316.6 Z. Weihua, et al., 2001: 6330-6335.7 A.Q. Hassan y J.T. Koh, 2008: 7280-7283.8 F. Goglia, 2005: 164-172.9 M. Moreno et al., 2002: 504-510.

Capítulo 1

Receptores nucleares.Sus orígenes y sus ligandos

os receptores nucleares (NR) son una superfamilia de proteínas que funcionan como factores de transcripción activados por ligando. Los NR se expresan en los principales grupos de metazoarios y tienen un amplio espectro de actividad biológica regulando la expre-sión de sus genes blanco positiva o negativamente. Los NR están invo-lucrados en diversos procesos asociados a la diferenciación y desarrollo de los vertebrados, además de artrópodos y posiblemente en platelmintos (véase figura 1).1,2 Hasta ahora se han identificado 48 NR en el geno-ma humano, los cuales incluyen receptores ligados —con un ligando endógeno identificado—, huérfanos —sin un ligando endógeno identi-ficado—, y huérfanos adoptados —con uno o varios ligandos endógenos o exógenos más recientemente identificados—.

Todos ellos juegan un papel central en la capacidad del organismo para transducir la señal de las hormonas endocrinas lipofílicas y retinoi-des además de esteroides y tiroideas, entre otros mensajeros.3,4

La habilidad para unir ligandos con alta especificidad es una de las principales características de los NR. Hasta ahora, el origen del bi-nomio receptor-ligando se comprende como un proceso de evolución adaptativa concertada o coevolución. Se considera que, en el caso de los mensajeros que se producen por medio de una ruta metabólica —neurotransmisores, hormonas tiroideas—, los genes de la ruta de sín-tesis y los de los receptores han coevolucionado. En contraste, en el

caso de otras vías de señalización en las que no están involucrados los NR, como es el caso de las hormonas de naturaleza proteínica, se ha propuesto que los genes que codifican para el receptor y la hormona han evolucionado de manera conjunta.5

Los ligandos de los NR se caracterizan por lo siguiente: i) no es- tán codificados en el genoma; son moléculas lipofílicas pequeñas [200-1 000 ångströms (Å)]; ii) ingresan directamente a la célula, pasiva o activamente; iii) provienen de la dieta o bien, del medioambiente, y/o de precursores metabólicos; y iv) generalmente, se absorben en el tracto gastrointestinal. Los registros fósiles indican que los ligandos conocidos de los NR surgieron billones de años antes que los mismos receptores. Además, las enzimas que participan en la síntesis y metabolismo de algunos ligandos como la citocromo P450 se expresan en todos los organismos vivos, incluyendo eubacterias y arqueobacterias. Estas evi-dencias sugieren que los ligandos de los NR preceden a los receptores nucleares.6 Se ha propuesto que los ligandos primordiales pudieron ser moléculas que los organismos más antiguos utilizaron para “sensar” las condiciones del medio ambiente por conducto de un receptor nuclear ancestral. Dado que los NR son ubicuos en todos los metazoarios, es posible que esta característica haya jugado un papel crucial en su evolu-ción.6,7 Así, la regulación genética ligando-dependiente es posiblemente un mecanismo fisiológico muy antiguo y/o “primitivo” presente en los ancestros comunes de procariontes y eucariontes.8-10 La capacidad para producir ligandos con alta afinidad y especificidad para un NR pudo haber evolucionado gracias a la selección de rutas de síntesis para molé-culas que tenían un fuerte efecto positivo en la fisiología animal y así se convirtieron en hormonas sintetizadas endógenamente.9-11 Es posi-ble que el NR ancestral haya sido un sensor de lípidos, una molécula que unía con afinidad micro molar diferentes tipos de compuestos hidrofóbicos que pudieron ser componentes de la dieta de los prime-ros metazoarios. Por medio de su interacción con una amplia variedad de ligandos, este sensor habría sido capaz de transferir como actividad transcripcional el sutil balance metabólico en las respectivas cantida-des de varios compuestos.10,12

Receptores nucleares. Sus orígenes y sus ligandos 21

1 B.A. Asadi, P.A. Torjesen, E. Haug y J.P. Berg, 2008: 563-567.2 R.L. de Mendonca et al., 2000: 3208-3219. 3 E. Bochukova et al., 2012: 243-249.4 P. Germain, B. Staels, C. Dacquet, M. Spedding y V. Laudet, 2006: 685-704.5 G.V. Markov, M. Paris, S. Bertrand y V. Laudet, 2008: 5-16.6 F.M. Sladek, 2011: 3-13.7 J.P. Renaud y D. Moras, 2000: 1748-1769.8 C. Helsen, et al., 2012: 411-417.9 G.V. Markov, F. Bonneton y V. Laudet, 2010: 15-29.10 G.V. Markov y V. Laudet, 2011: 21-30.11 L. Jin y Y. Li, 2010: 1218-1226.12 M.M. Aagaard, R. Siersbæk y S. Mandrup, 2011: 824-835.

Capítulo 2

Receptores de hormonas tiroideas

Importancia fisiológica

l origen de los receptores de hormonas tiroideas (TR) puede ras- trearse hasta los metazoarios más antiguos de los cuales se conoce la secuencia del genoma. Se han identificado ortólogos de los TR en platelmintos, moluscos, crustáceos, equinodermos y anfioxos, lo cual sugiere que estos receptores se originaron de un TR ancestral común de los Bilateria (véase figura 2).1-4 Sin embargo, la información disponible hasta ahora sugiere que la capacidad para unir hormonas tiroideas (TH), particularmente T3 —la TH bioactiva—, es exclusiva de los TR de vertebrados. No obstante, las TH tienen efectos sobre la diferenciación, maduración y metabolismo en distintas especies de inver- tebrados, incluyendo cnidarios, equinodermos y artrópodos, aun cuando estas especies no tienen la capacidad para sintetizar a estas hormo-nas.5,6 En efecto, la capacidad para sintetizar TH se ha identificado principalmente en vertebrados. Sin embargo, en urocordados —Ciona intestinalis—, cephalocordados —anfioxo— e incluso en no-cordados como el erizo de mar se ha observado síntesis de TH y el metabolismo activo de las mismas semejante a lo observado en vertebrados.7 Si el sistema tiroideo es una innovación de los vertebrados aún se desconoce, princi-palmente debido a que su estudio está limitado a unas cuantas especies.

En vertebrados existen dos genes para TR: THRA y THRB.4,8 Am-bos genes derivan de un solo TR ancestral, y se generaron durante los

dos eventos de duplicación del genoma descrito en vertebrados. Es- tos dos genes se han mantenido prácticamente sin cambios y presen-tan una identidad superior a 60% en todas las secuencias de nucleóti-dos disponibles hasta ahora (Ensembl).4,9 Cada gen de TR genera dos isoformas principales: TRa1, TRa2, TRb1 y TRb2, cuyo patrón de expresión es específico para cada tejido, etapa del desarrollo e historia de vida del organismo. Además, y dependiendo del contexto en el que regulan la expresión de genes TH-responsivos, cada isoforma tiene una relevancia fisiológica particular. Estas conclusiones están sustenta-das principalmente por estudios en animales transgénicos, en los que se observan fenotipos distintos para el knock-out (KO) del THRA y el THRB, o el doble KO. Mientras que el TRa es crucial en el desarrollo posnatal y la función cardiaca, el TRb controla principalmente el desa-rrollo del oído interno, la retina, el metabolismo en hígado y los nive-les de TH. Sin embargo, a la fecha existen dificultades para disociar los efectos de uno y otro gen, ya que ambos juegan un papel crucial en la regulación del eje hipotálamo-hipófisis-tiroides y, en consecuencia, en los niveles circulantes de TH.

De hecho, los perfiles de expresión tejido-específica sugieren roles funcionales para cada gen, estando el THRA asociado a procesos de metabolismo energético y funcionamiento normal del sistema nervioso central;8,10 mientras que el THRB participa principalmente en procesos de maduración y diferenciación celular. Si los dos genes para TR desem-peñan roles redundantes y más aún, si los dos son imprescindibles para la supervivencia del organismo, es un asunto controvertido ya que existen evidencias que respaldan todas las posibilidades sin excluir ninguna.

Cada una de las funciones en las cuales participan los TR sería por sí sola material de una tesis doctoral completa. Sin embargo, aquí sólo se mencionan algunas de ellas a fin de proveer un contexto fisiológico y facilitar la comprensión conceptual de la importancia funcional de contar con un mecanismo molecular modulado por múltiples factores.

Funciones gen-específicas

Independientemente de su similitud estructural, las funciones de los TR son muy diferentes. Esta divergencia funcional puede obedecer a los

Receptores de hormonas tiroideas 25

distintos patrones de expresión de uno y otro gen; o a las diferentes propiedades intrínsecas de los receptores. Así, estudios en células C17.2 transfectadas con TRa1 o TRb1 muestran repertorios diferentes de genes diana que no se explican por la ocupación diferencial de promo-tores TH-responsivos.5,11

No obstante, la modulación diferencial de genes, TRa1 y TRb1 pueden tener efectos antagónicos sobre la expresión de un mismo gen en función de la etapa del desarrollo. Así, el gen ABCD2, que codifica a una proteína asociada a la adrenoleucodistrofia neonatal, se regula a la alta en etapas tempranas del desarrollo por niveles elevados de T3 y TRa1, mientras que en la etapa adulta disminuye la T3 y aumenta la expresión de TRb1 lo cual reprime la expresión del gen ABCD2 en el hígado de rata.5,12 La potencia de cada isoforma de TR para regular la expresión de un gen blanco también juega un papel importante en la modulación de la respuesta a hormonas tiroideas. Así, estudios en células HepG2 transfectadas con TRa1 o TRb1 muestran una respuesta transcripcional específica para cada isoforma sobre un gen T3-reportero y también sobre distintos genes T3-responsivos identificados utilizando micro-arreglos.5,13 Estos resultados sugieren que la intensidad de la res-puesta a T3 puede adaptarse individualmente a los requerimientos del organismo. La ingeniería genética ha permitido dilucidar varias de las funciones gen-específicas para los TR. Utilizando el sistema CRE/loxp para insertar un TRa1 modificado que no permite la unión de coacti-vadores con actividad de acetilasa de histonas (véase capítulo 4), se repro-ducen varios efectos del hipotiroidismo en tejidos que principalmente expresan TRa1, sugiriendo que en ausencia de ligando el TRa1 es responsable de gran parte de los efectos de este estado tiroideo. En contraste, animales KO para THRB muestran un fenotipo distinto caracterizado principalmente por niveles altos de TSH, ceguera al color, sordera y metabolismo del colesterol alterado.14,15 Por lo tanto, el hipotiroidis-mo y la falta de expresión de TR en el doble KO generan fenotipos distintos.

Metamorfosis

Debido a su expresión tiempo y tejido específica, los TR y las TH juegan un papel fundamental en la historia de vida de todos los vertebrados. La metamorfosis es sin duda uno de los procesos biológicos más espec-taculares en los cuales participan los TR. Este proceso se ha descrito en teleósteos y anfibios y se ha documentado extensamente en los peces lenguado (Hippoglossus hippoglossus y Epinephelus coioides), el atún (Thun-nus orientalis) y las ranas (Xenopus tropicalis y Xenopus laevis). En todos los casos, los perfiles de expresión de los TR se modifican de manera tejido-específica en función de las distintas etapas de la historia de vida de cada especie. En X. laevis, y como se ilustra en la figura 3, la expresión del TRa1 aumenta después de la eclosión y alcanza su punto máximo des-pués de la etapa 45 del renacuajo en tejidos metamórficos como: cola, branquias y cerebro.16,17 En contraste, la expresión del TRb1 aumenta significativamente a partir de etapas pre-metamórficas en estos mismos tejidos y de manera paralela con el incremento en la concentración de T3 circulante (véase figura 3).17,18 Estudios en animales transgénicos que expresan constitutivamente al TRb1 activo mostraron que este TR per-se induce cambios morfológicos similares a los inducidos por el trata-miento con TH en ranas pre-metamórficas, por lo que los TR parecen ser suficientes para iniciar y mantener el programa de metamorfosis en ranas.18,19

Aun en el mismo tejido, los TR responden de manera distinta al tratamiento con T3.20,21 El uso de ligandos sintéticos selectivos para TRa1 o TRb1 ha permitido disecar sus efectos en el mismo tejido. En X. laevis la neurogénesis en los núcleos ventricular y subventricular del hipo-tálamo es dependiente de THs hasta la etapa media-pre-metamórfica, posteriormente se vuelve refractaria a T3. Este proceso puede ser induci-do de forma experimental con ligandos sintéticos selectivos del TRa1 pero no del TRb1, lo cual indica que es un proceso dependiente de TRa1.1-4,22

En contraste con otros vertebrados, algunos peces expresan dos ge-nes para el THRA generándose dos isoformas del TRa1, que se conocen como TRaa y TRab, respectivamente. En el pez lenguado (Epine-phelus coioides) se clonaron tres isoformas de los TR que exhiben un patrón de

expresión característico —niveles de mRNA— durante las distintas etapas del desarrollo. Al final de la embriogénesis aumentan TRaa y TRb1 mientras que TRab permanece constante. Además, el incremento de TRb1 es significativamente mayor. Este incremento al final del desarro-llo embrionario coincide con la extensa organogénesis y neurogénesis del pez y precede al desarrollo de la segmentación corporal; la apari-ción de las cápsulas ópticas y la subsecuente formación de la cápsula auditiva y del tubo neural. Los TR juegan un papel crítico durante estos procesos mediando los efectos de las TH de origen materno, ya que, como en otros vertebrados, la glándula tiroides de los embriones aun no es funcional.5,6,23 En el pez Thunnus orientalis, se detectaron T3 y T4 en embriones justo antes de la eclosión que subsecuentemente aumen-tan en la postflexión —último estadio larval o juvenil temprano—. En este pez el cambio de larva a juvenil es un proceso de metamorfosis que al igual que en anfibios implica distintos cambios morfo-funcionales que le permiten al organismo adaptarse y sobrevivir en determinados ambientes. A partir del día cinco post-eclosión o etapa E —la noto-corda aún no esta flexionada— en T. orientalis se observan folículos tiroideos funcionales, pero los niveles de T3 y T4 permanecen igual a los del embrión hasta que aumentan en la etapa N —los rayos en las aletas dorsal, caudal y anal están completos— con una cantidad mayor de T4 que T3. Simultáneamente ocurre un aumento en la expresión de TRb1 y TRab en la etapa N, mientras que TRaa permanece constante a excepción de un aumento durante la preflexión o etapa E.4,8,24 Estos datos sugieren que, al igual que en anfibios, en los teleósteos las hor-monas tiroideas son importantes para iniciar y culminar el proceso metamórfico entre la etapa larval y juvenil.

La larva pelágica del H. hippoglossus sufre una extensa remodelación durante la metamorfosis que incluye la pérdida de la simetría bilateral externa y genera un juvenil bentónico con ambos ojos en el mismo lado pigmentado del cuerpo. Estos cambios fenotípicos se acompañan de diferentes modificaciones bioquímicas y funcionales entre las que des- tacan el intercambio de los tipos de globina y queratina, y la produc-ción de nuevas isoformas de proteínas musculares.4,9,25 En el organismo completo se ha observado un incremento en los niveles de T4, T3, y en la expresión de TRa1, TRb1 y de la desyodasa tipo 2 (D2: cataliza la

activación de T4 a T3) durante las etapas tempranas de la metamor-fosis; mientras que la expresión de la desyodasa tipo 3 (D3: cataliza la inactivación de las THs) decae al final de la metamorfosis. En ambos periodos los niveles de expresión de D2 y D3 correlacionan directa-mente con la actividad enzimática y el aumento en los niveles de T3. Estos cambios son paralelos al aumento en la expresión de TRb1 y TRa1 lo cual muestra nuevamente la relación del sistema tiroideo con la metamorfosis en el lenguado.8,10,26 En Senegalese sole se encontró una isoforma más del TRb1 que incluye 60 pb en dirección 5’ del inserto de 27 pb en el dominio de unión al ligando, ambas isoformas se incre-mentan de forma paralela al aumento de T4 durante la metamorfosis (véase figura 4).5,11,27

Neurogénesis

Las hormonas tiroideas son esenciales para el desarrollo y diferencia-ción celular del cerebro en todos los vertebrados y su ingreso al encé-falo está finamente regulado por su transporte a través de distintas barreras. De manera sobresimplificada, la TH circulante tiene que cruzar las regiones luminal y abluminal de la membrana plasmática de las células endoteliales —microcapilar cerebral—. Recuérdese que la barrera hematoencéfalica está formada no sólo por el apretado epitelio de la microvasculatura cerebral, también por astrocitos que envuelven los microcapilares. Así, una vez que abandona el lecho vascular, la TH tiene ahora que ingresar al astrocito pasando a través de su membrana plasmática. Ya en el astrocito, la T4 puede ser desyodada para producir hormona activa y esta T3 abandonará al astrocito e ingresará ahora a las neuronas o los oligodendrocitos donde se une al TR y ejerce sus funciones reguladoras de la transcripción (véase figura 5).5,12,28 Los TR pueden modular la proliferación y diferenciación de los precursores neuronales y también afectan la neurogenesis en el adulto. Igualmen-te, los TR regulan la proliferación, maduración y desarrollo del linaje de oligodendrocitos, por medio de la represión de c-Myc y ciclina-D1 junto con un incremento de caseína cinasa 1 (CKI).5,13,29

En la retina de los mamíferos, específicamente en los conos, el TRb2 controla el patrón de expresión del foto pigmento opsina a partir del

día 10 embrionario y decae después del nacimiento.14,15,30 En ratones THRB-/- sólo se observa síntesis de opsina de baja longitud de onda en los conos. Además, los ratones KO para el factor de transcripción NeuroD1 no expresan TRb2 y esta inhibición se revierte al inducir la expresión de NeuroD1 que interactúa con una región intergénica del THRB y modula la expresión de TRb2.16,17,31 Recientemente se identi-ficó una mutación del TRa1 que reduce diez veces su afinidad por T3 y genera un TRa1 con un potente efecto dominante negativo que pre-viene la inducción de genes T3-responsivos y resulta en un hipotiroi-dismo cerebral parcial. Los animales con esta mutación muestran un patrón normal de desarrollo, pero en la etapa adulta exhiben conducta ansiosa-depresiva que mejora al tratarlos con T3, sin embargo, el défi-cit locomotor no responde al tratamiento. Estos resultados revelan dis-tintos mecanismos fisiopatológicos inducidos por el TRa1 dominante negativo17,18,32 y que la proporción entre las isoformas que unen o no T3, TRa1 y TRa2, respectivamente, juegan un rol crucial en la modu-lación del efecto final de T3. Al evaluar la expresión de distintos genes T3-responsivos en el estriado y la corteza de ratones TRa-/- o b-/- o ab-/-, se corroboró el papel del TR no ligado durante la maduración del sistema nervioso central, además de que se observó una mayor poten-cia del TRa1 en la regulación negativa de genes T3-responsivos.10,18,19

Metabolismo energético

El metabolismo energético está estrechamente relacionado con la fun-ción tiroidea. El exceso de TH (hipertiroidismo) se caracteriza por un estado metabólico acelerado que incluye, entre otras alteraciones, lipólisis exagerada, pérdida de peso, incremento en la síntesis y excre-ción de colesterol hepático y niveles bajos de colesterol circulante. En contraste, el déficit de TH —hipotiroidismo— se acompaña de los efectos opuestos.20,21,33

La homeostasis térmica es una de las principales funciones meta-bólicas de las TH en los mamíferos e implica la generación de calor o activación de la termogénesis facultativa o adaptativa en el tejido adi-poso pardo (BAT). Esta activación está mediada por la respuesta con-certada o sinérgica de los sistemas simpatoadrenal y tiroideo que por

medio de receptores adrenérgicos y TRa1 y TRb2, respectivamente, estimulan la actividad de la D2, así como la lipólisis y la expresión de la proteína desacoplante 1 (UCP1) en las mitocondrias del BAT.33 Los ratones TRa-/- son incapaces de activar este mecanismo y además son intolerantes al frío. Más aún, estos animales son hiperfágicos y su ingesta calórica está aumentada. Sin embargo, y en contraste con rato-nes silvestres, no aumentan de peso en respuesta a la dieta alta en grasa. Además, las concentraciones circulantes de T3 están elevadas debido al aumento en la expresión de D1 y D2.34 Por el contrario, los animales que expresan el TRa1 dominante negativo que no une T3 muestran reducción significativa del tejido adiposo blanco y menor tamaño del hígado; así como decremento en la expresión de enzimas lipogénicas y del receptor activado por proliferadores de peroxisomas gamma. Mien-tras que los animales que expresan el TRb1 modificado dominante positivo (TRb1PV KI) muestran el fenotipo contrario.35 Estos datos su-gieren que los apo-TRa1 y b1 tienen roles distintos en el metabolismo normal de lípidos y que ambas isoformas contribuyen a la patogénesis del metabolismo de lípidos en el hipotiroidismo.

En este contexto, recientemente se han identificado una isoforma corta del TR en mitocondria. Este TR se ha asociado con un incremento en el metabolismo mitocondrial, además de prevenir la apoptosis en un proceso independiente de transcripción de novo.36 Los TR se unen a elementos de respuesta a hormonas tiroideas en el genoma de la mi-tocondria y modulan la expresión de las proteínas de la cadena respira-toria. Así se explica la mayor parte de los efectos de las TH en el metabo-lismo energético y la fosforilación oxidativa, no obstante también se han identificado efectos biológicos de estas hormonas independientes de los TR, por ejemplo mediante el receptor membranal integrina alfa V beta 3.37

Regulación de los TR

La regulación de los genes que codifican para los TR está dada por múlti-ples factores que modulan la expresión de cada isoforma. Sin embargo, el principal modulador de su expresión es el propio ligando. Durante la ontogenia de distintos vertebrados se ha observado un incremento

de T4 y/o T3 circulante acompañado paralelamente con un aumento en la expresión de los TR. Como se mencionó antes, el desarrollo de los vertebrados está estrechamente relacionado con la presencia de las TH y su depleción farmacológica [metimazol (MMI)] impacta la expre-sión de los TR, afectando el funcionamiento normal del organismo tanto en la ontogenia como en la vida adulta. Estudios en peces mues-tran que el tratamiento con dosis suprafisiológicas de TH reprimen la expresión de los TR, mientras que el hipotiroidismo farmacológico (MMI) aumenta su expresión y el cotratamiento con MMI+THs previe-ne el efecto del hipotiroidismo farmacológico inducido por el goitro-geno.19,25,38-40 En humanos se han caracterizado elementos de respuesta a hormonas tiroideas en el gen de THRB lo cual explica el efecto del ligando sobre la expresión del receptor.41

Resistencia a hormonas tiroideas

La principal causa de la resistencia a hormonas tiroideas (RTH) es una mutación en el gen THRB la cual genera un TR con afinidad menor por T3 o con una habilidad dañada para interactuar con correguladores. Los perfiles tiroideos de los pacientes con RHT junto con la caracteri-zación molecular de los TR mutados han permitido aumentar el cono- cimiento a cerca del mecanismo de acción de los TR. Hasta ahora se han identificado 123 mutaciones en el gen THRB en pacientes con RTH generalmente asociado a un incremento en los niveles circulantes de T3 y T4. La RTH puede ser generalizada o exclusivamente pituitaria en función de la región del THRB mutada, ya que la hipófisis expresa principalmente TRb2.42 Todas las mutaciones descritas a la fecha se en-cuentran en el dominio de unión al ligando (véase capítulo 3). Además de no ser funcionales, los TRb mutados inhiben la activación de las otras isoformas de TRs. El efecto dominante negativo resultante de los receptores mutados explica en parte la resistencia a la acción de la hormona.43 Por ejemplo, el TRb1 con la mutación I431V tiene una afi-nidad 2.6 veces menor por T3 en comparación con el TRb1 silvestre, lo cual genera alteración en la liberación de correpresores en respuesta a T3, así como un aumento en la concentración efectiva media de T3 necesaria para activar la transcripción de un gen T3-reportero.43 Dada

la naturaleza de los TRb1 mutados en la RTH es posible el diseño y ad- ministración de ligandos sintéticos específicos para los TRb1 mutados. Así, la mutación H435Y puede ser rescatada con ligandos derivados del GC-1, un ligando TRb1-selectivo.44 Sin embargo, la variedad de mutaciones que causan la RTH representa un reto para la clínica y la farma- cología, ya que cada mutación genera un fenotipo diferente en el TRb1 y requiere de su caracterización independiente para generar tratamien-tos efectivos.45

Las mutaciones en el THRA son poco frecuentes en comparación con el TRHB debido a que generalmente son embrionariamente leta-les. Sin embargo, recientemente se identificó un individuo con una mutación que genera el TRa1 E403X; esta modificación impide la ac-tivación por medio de T3 y convierte al TRa1 mutado en un potente dominante negativo, el individuo tiene síntomas de hipotiroidismo, sin embargo, tiene niveles bajos de T4 y T3 elevada, lo cual indica que el TRa1 no ligado está asociado a la fisiopatología del hipotiroidismo.46 Hasta ahora no ha sido posible caracterizar el fenotipo de mutaciones en el THRA usando animales de experimentación debido a la dificultad para generar animales transgénicos viables, lo cual indica que el THRA es esencial para el desarrollo embrionario.47 Los estudios en animales transgénicos han permitido conocer las funciones contrastantes de THRA y THRB, y sugieren que éstas están dictadas por la abundancia relativa de las isoformas del receptor, el tipo celular y las diferencias en las propiedades intrínsecas de los receptores.

1 Estebanez-Perpina et al., 2007: 2919-2928.2 Lecroisey, Laudet y Schubert, 2012: 156-166.3 Carosa et al., 1998: 11152-11157.4 Wu, Niles y LoVerde, 2007.5 Renaud y Moras, 2000: 1748-17696 Flatt, Moroz, Tatar y Heyland, 2006: 777-794.7 Paris et al., 2010: 63-74.8 Jin y Li, 2010: 1218-1226.9 Martínez et al., 2010: 1529-1540.10 Gil-Ibanez, Morte y Bernal, 2013: 1940-1947.

11 Chatonnet, Guyot, Benoit, Flamant, 2013: E766-775.12 Weinhofer et al., 2008: 933-945.13 Chan y Privalsky, 2009: 1758-1775.14 Araujo, Martínez, Paula Nicoluci, Skaf y Polikarpov, 2010: 1523-1536 15 Flamant y Quignodon, 2010: 117-120. 16 Martínez, Polikarpov y Skaf, 2008: 10741-10751.17 Wang, Matsuda y Shi, 2008: 5610-5618.18 Helsen et al., 2012: 411-417.19 Das et al., 2010: 174-180.20 Chen y Young, 2010: 1650-1664.21 Johnson y Lema, 2011: 505-517.22 Denver, Hu, Scanlan y Furlow, 2009: 155-168.23 Tang, Liu, Zhang, Zhu, y Lin, 2008: 117-124.24 Kawakami, Nozaki, Seoka, Kumai y Ohta, 2008a: 597-606.25 Galay-Burgos, Power, Llewellyn y Sweeney, 2008: 56-63.26 Isorna et al., 2009: 231-246. 27 Manchado, Infante, Rebordinos y Cañavate, 2009: 139-147.28 Schweizer y Kohrle, 2013: 3965-3973.29 Pascual y Aranda, 2013: 3908-3916.30 Ng, Ma, Curran y Forrest, 2009: 627-631. 31 Liu et al., 2008: 749-756.32 Pilhatsch et al., 2010: 187-192.33 Liu y Brent, 2010: 166-173.34 Pelletier, Gauthier, Sideleva, Samarut y Silva, 2008: 6471-6486.35 Araki, Ying, Zhu, Willingham y Cheng, 2008: 308-315.36 Saelim, Holstein, Chocron, Camacho y Lechleiter, 2007: 1781-1794.37 Psarra y Sekeris, 2008: 210-223.38 Williams, 2008: 784-794. 39 García, López-Bojorquez, Nunez, Valverde y Orozco, 2007: R877-R883.40 Kawakami, Yokoi, Kumai y Ohta, 2008b: 112-116.41 Sakurai, Miyamoto y DeGroot, 1992: 78-84.42 Kim et al., 2007: 560-563.43 Ferreira Azevedo et al., 2008: 1304-131.44 Hassan y Koh, 2008: 7280-7283.45 Asadi, Torjesen, Haug y Berg, 2008: 563-567.46 Bochukova et al., 2012: 243-249.47 Nishiyama et al., 2003: 561-570.

Arreglo estructural y funcional de los TR 35

Estructura primaria de los TR, arreglo general

a organización estructural de los TR es común a todos los NR y consiste de cinco a seis dominios funcionales referidos con las le- tras de la A a la F (véase figura 6).1 El dominio amino-terminal (NTD) que comprende a los dominios A/B, es variable y alberga una función de activación independiente de ligando (AF1).2 Los dominios más conservados son el C y el E. El C se conoce como el dominio de unión al DNA (DBD; 70 aa), y el E como el dominio de unión al ligan-do (LBD; 250 aa). El dominio D, también llamado “región bisagra”, es variable, confiere flexibilidad espacial y vincula el DBD con el LBD y contiene la señal de localización nuclear. El dominio F no siempre está presente y su función es poco comprendida.1

El DBD es el “dominio firma” característico de la superfamilia de receptores nucleares. Este dominio está altamente conservado y confie-re a estas proteínas la habilidad de interactuar específicamente con las secuencias de DNA presentes en las regiones promotoras de los genes blanco de las TH y que se conocen como elementos de respuesta a hor-monas tiroideas (TRE).3 El dominio LBD juega un papel crucial en la regulación de la actividad del receptor nuclear mediada por ligando.

Capítulo 3

Arreglo estructuraly funcional de los TR

Adicionalmente a su papel en el reconocimiento del ligando, el LBD contiene un subdominio con función de activación (AF2), cuya con-formación es altamente dependiente de la unión al ligando. La región bisagra D, junto con la N-terminal y la C-terminal de la región E, están menos conservadas y muestran distintas características estructurales entre las diferentes isoformas de TR. Por ejemplo, la longitud del NTD en el TRβ1 es más corta que en el TRβ2. También, la estructura secun-daria del AF1 consiste principalmente en espirales no estructuradas en vez de α-hélices o β-láminas para el LBD y el DBD. Así, el plegamiento del AF1 es muy flexible, lo que dificulta su determinación estructural y, consecuentemente, aún no hay modelos estructurales del AF1 en con-traste con los cientos de estructuras del DBD y LBD disponibles.1,4

Dominio amino terminal (NTD)

La estructura tridimensional del NTD (dominios A/B) de los TR no se conoce a la fecha y aunque en solución permanece no-plegada, se cree que adquiere una estructura secundaria ordenada como resultado de interacciones inter e intra-moleculares. Además, su estructura se modula por medio de comunicación alostérica como resultado de la unión al DNA o al ligando. No obstante, experimentalmente se ha mostrado que el NTD confiere la capacidad de transactivación gen-específica mediante interacciones con proteínas también receptor-específicas.2,5 El NTD del TRα1 es importante para la represión independiente de ligando, posiblemente por su rol en la formación de heterodímeros con el receptor de retinoides X (RXR); además, su depleción disminuye la activación de un gen T3-reportero.1,6 Ensayos de inmunoprecipitación de la cromatina mostraron que este papel singular del NTD del TRα1 se debe a su capacidad para interactuar de forma específica con el factor de transcripción hTFIIB (véase abreviaturas).3,7 En el NTD de TRα1 se identificaron diez aminoácidos (aa 21 a 30) asociados a la interacción con hTFIIB.8 Además, el NTD del TRα1 juega un papel importante en la localización subcelular del receptor. La deleción de esta región del TR provoca su localización en el citoplasma mientras que el receptor nativo se encuentra exclusivamente en el núcleo aun cuando no esté ligado.9

Más aún, los aminoácidos 89 a 116 en el NTD del TRβ2 son necesarios para la activación del gen que codifica para la hormona liberadora de tirotropina (TRH) en ausencia de ligando y para su represión en pre-sencia de T3.10 Igualmente, el NTD del TRβ2 es necesario para su in-teracción con la proteína que une CREB (CBP).11 También se ha obser-vado su participación en la interacción con el dominio PAS-B (véase abreviaturas) de la familia de coactivadores p160.12 En conjunto, estas observaciones podrían explicar las propiedades transcripcionales parti-culares del TRβ2 el cual tiene actividad en ausencia de ligando; recluta coactivadores a concentraciones de T3 significativamente menores, e induce la expresión de genes T3-reporteros con mayor potencia que TRα1 y TRβ1.12 Otros estudios han mostrado que la RHT hipofisiaria se debe a la pérdida de interacciones entre el NTD y el LBD del TRβ2, sin afectar la función normal de TRβ1 (véase figura 7).13 Además, se observó que TRβ2 interactúa con una serie de proteínas distintas a las que interactúan con TRβ1, las cuales aumentan la actividad transcrip-cional de TRβ2 sobre un gen T3-reportero.14

Dominio de unión al DNA (BDD)

En la superfamilia de los NR, el DBD tiene el mayor grado de con-servación con respecto a su secuencia y arquitectura estructural. En los miembros de la superfamilia la región central o “núcleo” del DBD contiene 66 aminoácidos con más de 40% de identidad. Esta secuen-cia “núcleo” comprende dos α-hélices y dos “dedos” o motivos de unión al zinc, cada uno coordinado por cuatro residuos de cisteína conservados. Estos dedos de zinc se pliegan uno hacia el otro para for-mar un dominio globular con dos α-hélices localizadas en el extremo C-terminal de los dedos y que se orientan perpendicularmente entre sí para formar la base del núcleo hidrofóbico.3

La primer α-hélice se posiciona en la ranura principal de la hélice de DNA donde varios aminoácidos hacen contactos base-específicos que permiten el reconocimiento del medio sitio hexamérico.3 Seguido de la región núcleo está la extensión C-terminal (CTE), menos conser-vada y altamente cargada, que adopta una conformación de α-hélice

en los TR. La caja T, localizada al inicio de la CTE, incorpora los resi-duos que contribuyen a la interfaz de heterodimerización al unirse al elemento de respuesta conformado como repetido directo espaciado por cuatro nucleótidos (DR4) que establece la posición río abajo del TR-DBD en el complejo heterodímero-DNA. La CTE también puede formar contactos extensivos con la columna vertebral de fosfatos en el espaciador, especificando así la dimensión requerida entre los medios sitios reconocidos por el DBD.15 Los residuos críticos para la unión secuencia-específica al DNA dentro de la primer α-hélice se denomi-nan caja P.5

Región de bisagra

El dominio D está pobremente conservado entre los TR y se cree que comprende una estructura no plegada que facilita la rotación entre el LBD y el DBD. Sin embargo, se ha observado que en el TRα1, el domi-nio D puede plegarse en un α-hélice (H0) anfipática o formar un asa no estructurada. La formación de H0 requiere del contacto entre la ranu-ra de unión a coactivadores formada por la AF2 y un motivo parecido a LxxLL del dominio D. La mutación o deleción de este motivo inhibe la activación de un gen T3 reportero16 y la unión del TR a un TRE palindrómico.17 Además de estas funciones, el dominio D alberga múl-tiples elementos funcionales incluyendo la secuencia de localización nuclear (NLS), secuencias requeridas para la unión eficiente al DNA, una función de activación Tau, y funciones de represión. También juega un papel en la unión a T3 y en la unión y liberación de correpreso-res.5,17 En este contexto, las mutaciones A234T, R243Q y R243W en el dominio D del TRβ1 de pacientes con RTH generan un TR in-capaz de liberar correpresores en presencia de T3 a concentraciones fisiológicas (véase capítulo 4).18 Con respecto a la señal de localización nuclear en el dominio D, estudios de estructura-función muestran que la secuencia KRVAKRKLIEQNRERRRK del dominio D del TRa1 es suficiente para inducir la traslocación al núcleo de la proteína G3 co-nocida por ser exclusivamente citosólica.19

Dominio de unión al ligando (LBD)

Como en todos los receptores nucleares, la estructura terciaria del LBD de los TR consiste en un “sándwich” de tres capas distintas formadas por 12 α-hélices y 4 β-láminas cortas con el respectivo ligando encerrado en el núcleo hidrofóbico.20 El plegamiento de α-hélices antiparalelas se forma por las hélices (Hs) 4, 5, 8, 9 y 11 emparedadas entre las Hs 1, 2 y 3 por un lado y las Hs 6, 7 y 10 por el otro. En esta estructu-ra, la hélice 12 de activación C-terminal se ubica lejos del núcleo del LBD.1 La capa intermedia formada por las Hs 4, 5, 8, 9, sólo está presente en la parte media superior del dominio y falta en la parte media inferior. Este arreglo crea una cavidad llamada “bolsa (pocket) de unión al ligando” (LBP) que, como su nombre lo indica, permite la unión del ligando en el receptor.4 La unión del ligando estabiliza la conformación del receptor mediante contactos directos con múltiples elementos estructurales del receptor incluyendo las Hs 3, 5, 6, 7, 10 y al asa precedente de la hélice AF2.21 La región C-terminal también forma un α-hélice (AF2), la cual puede adoptar conformaciones múlti-ples dependiendo de la naturaleza del ligando unido. Las hélices 3, 4 y 12 encierran una ranura hidrofóbica poco profunda que es el sitio de unión de los correguladores.4

El LBP del TRα y el TRβ está compuesto de varios aminoácidos hidrofóbicos y de dos regiones polares. Sólo una histidina —la héli-ce11— forma una de esas interacciones polares formando un puente de hidrógeno con el hidroxilo fenólico del anillo externo de la tironina. La mayoría de las interacciones polares, sin embargo, se forman con tres residuos de arginina localizados en la H3 y en las β-láminas, y por una serina en el TRα y una asparagina en el TRβ. La alta afinidad del ligando depende principalmente de su hidrofobicidad, ya que los anillos de benceno de las tironinas se estabilizan por una serie de inte-racciones no polares. El LBP es prácticamente idéntico en los TRα y TRβ excepto en que la Ser277 en TRα corresponde a Asp331 en TRβ (véase figura 8).22 Al ingresar a la “bolsa”, el ligando remodela el LBD y se convierte en parte integral de su núcleo hidrofóbico.1,10 Este cam-bio conformacional se ha explicado mediante el modelo “trampa de ratón”, el cual propone que la unión del ligando reposiciona la hélice

de activación como si entrara en la bolsa y crea así una nueva superfi-cie donde los coactivadores pueden unirse.1,11 Por otro lado, el cambio conformacional inducido por el ligando en la H12 también provoca la liberación de los correpresores (CoR). De hecho, esta liberación de CoR por ligando, no ocurre cuando el receptor está truncado en la hélice 12.1,12

El proceso fundamental que subyace en el control de la transcrip-ción de genes regulados por NR es el de unión/disociación del ligan-do. El LBP de los NR está inmerso o enterrado en el núcleo hidrofó-bico del receptor y no presenta ninguna entrada o salida obvia para el ligando. Este proceso de unión/disociación del ligando se simuló usando técnicas de dinámica molecular basadas en la estructura tercia-ria del TR obtenida por difracción de rayos X.

Así, el ligando puede seguir tres vías distintas tanto para unirse como para disociarse del NR: la vía 1 involucra el desplazamiento de la H12 desde la H3; la vía 2 involucra la separación de las H8 y H11 y el asa-omega móvil; en la vía 3, el ligando pasa a través de la cavidad hidrofóbica formada por el re-arreglo en la horquilla-β y el asa entre las H1 y H2. Entonces, sólo pequeñas fluctuaciones, no mayores a las observadas durante las simulaciones control en equilibrio, son sufi-cientes para permitir la entrada y salida del ligando en el LBD de los receptores de hormonas tiroideas.13,23

El dominio F

La extensión C-terminal de la H12 denominada dominio F es común en varios miembros de la superfamilia de NR. En el pez cebra se expre-sa una isoforma del TRα1 denominada TRaA1 que tiene un dominio F de 17 aminoácidos C-terminal. El dominio F es importante en la regulación de la respuesta a T3 por medio de la modulación de la interacción con coactivadores, sin embargo, su relevancia funcional durante el desarrollo y crecimiento en el pez cebra aún no se ha deter-minado.14,24

Dimerización de los TR

Los TR se unen al DNA como monómeros, homodímeros, oligóme-ros, o bien como heterodímeros con el RXR. Prácticamente todos los dominios funcionales del TR se han asociado con su habilidad para formar dímeros. La superficie de interacción del LBD para la dimeriza-ción se encuentra en las H10 y H11,3,25 la mitad de la H9 y el asa entre las H8 y H9.14,26 En este contexto, estudios de mutagénesis dirigida y de cristalografía mostraron que esta superficie de dimerización es la misma para formar homodímeros y heterodímeros. Además de inhibir la dimerización, las mutaciones realizadas sobre la superficie de dime-rización del TR también afectan la activación de un gen T3-reportero y la interacción con el DNA.3,25 La conformación del LBD es distinta cuando se encuentra como monómero o formando homodímeros o heterodímeros, lo cual tiene un impacto en la afinidad por T3. Así también, estudios de dinámica molecular indican una cinética de diso-ciación de T3 distinta en cada caso, lo cual puede explicar la diferencia en la actividad transcripcional del receptor como monómero, homo-dímeros o heterodímero.15,27 Además, ensayos de unión han mostrado una disminución en la afinidad por T3 cuando TRα1 forma un he-terodímero con RXR en presencia de su ligando 9 cis-ácido retinoico, indicando que este último es un inhibidor alostérico del heterodímero TR:RXR.5,26 Más aún, la formación de homodímeros o heterodímeros está estrechamente relacionada con la presencia o ausencia de T3. Así, la T3 interfiere con la formación de homodímeros TR:TR y favorece la formación de monómeros; además, inhibe la interacción entre homo-dímeros TR:TR con algunos TRE, mientras que no la afecta en la in-teracción del heterodímero TR:RXR.16,28 Sin embargo, también se ha mostrado que homodímeros TR:TR y heterodímeros TR:RXR activan la transcripción mediante diferentes elementos de respuesta en leva-duras y células de mamíferos indicando que cada forma es funcional-mente importante (véase figura 9).17,29 Finalmente, estudios de unión por competencia indican que la cinética de unión de la hormona al receptor varía en función del estado oligomérico del receptor. Así, T3 se une y se disocia más rápidamente a monómeros y heterodímeros TR:RXR que a homodímeros TR:TR.5,17,30

Modificaciones post-traduccionales de los TR

Los TR son objeto de modificaciones post-traduccionales (PTM) que impactan la conformación del receptor, su afinidad por el ligando y su capacidad de transactivación y transrepresión. En el TRa1, la re-gión CTE del DBD puede ser acetilada en los residuos de lisina del motivo equivalente a KLKK de otros receptores nucleares, el cual está conservado en el DBD y se asocia al reconocimiento del espaciador en el TRE. Esta modificación está mediada por la CBP y se sabe que es dependiente de T3. Además de incrementar la unión al DNA, la acetilación del TRa1 también es importante para la interacción con coactivadores y correpresores. Los TRa1 mutados en el motivo KLKK son incapaces de mediar la activación de un gen T3-reportero, lo cual muestra la importancia de este motivo en la transactivación.19,31

Los TR también pueden ser modificados por small ubiquitin related-modifiers (SUMO) específicos. La sumoilación desencadena un plétora de eventos moleculares que pueden alterar tanto el destino como la función de los TR modificados a nivel genómico, no genómico y epi-genético.20,32 La relevancia funcional de la sumoilación de los TRα1 y TRβ1 aún no se ha determinado, sin embargo, estudios in vitro in-dican que la sumoilación de los TR es importante para la regulación génica mediada por T3.1,33

La fosforilación de los TR es una de la PTM con mayor impac-to sobre la modulación transcripcional mediada por T3. Estudios in vitro muestran que la activación de las mitogen activated protein kinase (MAPK) por medio de un receptor membranal de tiroxina (T4) induce la fosforilación de residuos de serina en el primer dedo de zinc del TRβ1, esta modificación induce la liberación del SMRT unido al TR y facilita la interacción con coactivadores sin la necesidad de unirse a T3.4,34 En contraste, la fosforilación mediada por PKA (protein ki-nasa A) en los residuos de serina 28/29 del TRa1 de pollo impide la interacción entre monómeros pero no entre homodímeros del TRa1 con el TRE.21,35 En este contexto, la fosforilación del TRa2 también previene la interacción con el TRE, sugiriendo que la fosforilación es un mecanismo de modulación de la actividad dominante negativa de TRa2.4,36 Además, en células COS-1 —células de riñón de mono verde

transformadas con SV40— se observó que la fosforilación del TRβ1 puede estabilizar y aumentar su vida media.22,37

Elementos de respuesta a hormonas tiroideas

Los TR se unen a secuencias específicas del DNA en las regiones regu-ladoras de los genes blanco. Estas regiones, conocidas como elementos de respuesta a hormonas tiroideas o TRE, normalmente contienen al menos dos medios sitios compuestos de secuencias hexaméricas de nucleótidos derivadas de la secuencia consenso AGGT(C/A)A.1,38 Es-tos medios sitios pueden tener diferentes arreglos y/o orientaciones que determinan las diferencias en la unión al ligando.1,39 Los TRE más comunes pueden encontrarse en los siguientes arreglos: i) repetido di-recto separado por cuatro nucleótidos (DR-4); ii) palíndroma invertido separado por seis nucleótidos (IP6 o F2); y iii) dos hexámeros en arre-glo palindrómico sin espaciador (PAL) (véase figura 10).1,40

La orientación relativa del espaciador entre los motivos de recono-cimiento juega un papel esencial en la especificidad de la unión del TR al TRE y en la activación de la transcripción. Los TRE palindrómicos se consideran los elementos de respuesta primarios de los TRs homodi-méricos. En contraste, los DR4 se unen y activan preferencialmente a los heterodímeros TR:RXR.23,39 Adicionalmente, la secuencia espaciadora presente entre los dos medios sitios también puede influenciar la unión y afinidad entre los TR y los TRE; así un cambio de un solo par de bases en el espaciador puede cambiar el tipo de receptor nuclear que se una y active al elemento de respuesta.24,41,25,39 En este mismo contexto, los ensayos de transactivación muestran que la unión de monómeros u homodímeros TR-TRE seguida de la activación transcripcional tiene el siguiente orden de preferencia: F2 o IP6 > IP4 > PAL > DR4.26,41 Por otro lado y como se ha mencionado, los TR son capaces de hete-rodimerizar con RXR en presencia de T3 y esta hormona desestabiliza la unión de homodímeros TR:TR a un subconjunto de TRE, promo-viendo la disociación de dímeros hacia monómeros, en consecuencia facilitando la heterodimerización. Por lo tanto, T3 en concentraciones fisiológicas, modifica el balance entre homodímeros y heterodímeros

unidos al DNA. Los homodímeros TR:TR se unen con alta afinidad a los elementos palindrómicos evertidos que contienen los motivos del medio sitio separados por 4, 5 o 6 pares de bases. Un efecto coope-rativo fuerte se observa entre homodímeros TR:TR y un palíndrome inverso (F2 o IP6), pero no con elementos de respuesta repetidos di-rectos (DR4). Esta unión cooperativa es similar a lo observado para la interacción de heterodímeros TR:RXR con todos los TRE.25,40 Las constantes de unión —afinidad— de homodímeros TR:TR se encuen-tran en el intervalo de concentración de 0-100 nM y aumentan en el orden: IP6 < PAL < DR4.27,40

1 Renaud y Moras, 2000: 1748-1769.2 Livet, Rochel y Moras, 2012: 466-473.3 Helsen, 2012: 411-417.4 Jin y Li, 2010: 1218-1226.5 Aagaard, Siersbæk y Mandrup, 2011: 824-835.6 Hollenberg, Monden y Wondisford, 2001: 14274-14280.7 Tomura, Lazar, Phyillaier y Nikodem, 1995: 5600-5604.8 Hadzic, 1995: 4507-4517. 9 Andersson y Vennstrom, 1997: 291-296.10 Langlois et al., 1997: 24927-24933.11 Tian, Mahajan, Wong, Habeos y Samuels, 2006: 2036-2051.12 Privalsky, 2009: 19554-19563.13 Lee, Young, Wan, Chan y Privalsky, 2011: 1111-1125.14 Hahm y Privalsky, 2013: 840-859.15 Chen y Young, 2010: 1650-1664.16 Miyamoto, 2001: 229-238.17 Nascimento, 2006: 586-598.18 Safer, 1998: 30175-30182.19 Mavinakere, Powers, Subramanian, Roggero y Allison, 2012: 31280-31297.20 Estebanez-Perpina, 2007: 2919-2928.21 Martínez et al., 2010: 1529-1540.22 Araujo, Martínez, Paula Nicoluci, Skaf y Polikarpov, 2010: 1523-1536.23 Martínez, Polikarpov y Skaf, 2008: 10741-10751.24 Takayama, Hostick, Haendel, Eisen y Darimont, 2008: 176-189.25 Ribeiro, 2001: 14987-14995.26 Putcha, Wright, Brunzelle y Fernandez, 2012: 6084–6087.27 Zhuang, Bao, Linhananta y Liu, 2013: 155-160.28 Togashi, 2005: 25665-25673.

29 Velasco et al., 2007: 12458-12466.30 Cunha Lima y Rodrígues, 2011: 125-134.31 Sanchez-Pacheco, Martinez-Iglesias, Mendez-Pertuz y Aranda, 2009: 5143-5152.32 Treuter y Venteclef, 2011: 909-918.33 Liu, Kogai, Schultz, Mody y Brent, 2012: 36499-36508.34 Davis, 2000: 38032-38039.35 Tzagarakis-Foster, 1998: 10926-10932.36 Katz, Reginato y Lazar, 1995: 2341-2348.37 Ting, Bhat, Wong y Cheng, 1997: 4129-4134.38 Brent et al., 1989: 1996-2004.39 Umesono, Murakami, Thompson y Evans, 1991: 1255-1266.40 Figueira et al., 2010: 893-904.41 Piedrafita, Bendik, Ortiz y Pfahl, 1995: 563-578.

Mecanismos de acción de las hormonas tiroideas 47

os TR pueden regular la transcripción al estar unidos a los TRE en presencia o no de T3. Así, uno de los mecanismos de acción de las TH involucra la regulación positiva de la trascripción basal acti-vada por el complejo TR-T3, la cual es reprimida cuando el TR no está unido a la hormona. En otros casos, la unión de la T3 a su receptor puede reprimir la transcripción. A la fecha, los mecanismos de regula-ción transcripcional por TH mejor comprendidos son aquellos en los que estas hormonas regulan positivamente al gen blanco. Numerosos estudios han mostrado que en la ausencia de TH, los TR se unen a los TRE y reprimen la transcripción basal de los genes regulados positivamente por estas hormonas. Dicha represión basal está mediada por proteínas correpresoras que interactúan con los TR, tales como NCoR —del in-glés: nuclear receptor corepressor— y SMRT —del inglés: silencing mediator for RAR and TR—, las cuales interactúan preferencialmente con TR no ligados. Los NTD de ambos NCoR y SMRT reclutan una variedad de complejos de desacetilasas de histonas (HDAC), lo que resulta en hipoac-teilación de las histonas locales y una cromatina con estructura repre-sora de la transcripción.1 Al unir T3, el motivo helicoidal conservado (α-hélice 12) localizado en el dominio de activación (AF2) C-terminal sufre un cambio conformacional significativo. El domino AF2 realinea-

Capítulo 4

Mecanismo de acciónde las hormonas tiroideas

do crea una superficie de unión hidrofóbica específica para el reclutamiento de los coactivadores que contienen los motivos canónicos LxxLL. Para la mayoría de los NR, son esenciales tres distintos tipos de coac-tivadores para la activación de la transcripción: a) los complejos remo-deladores de la cromatina dependientes de ATP, los cuales facilitan la accesibilidad al promotor por la acción de otros factores de transcripción; b) las acetilasas y metilasas de histonas —HAT y HMT respectivamente— que marcan de forma covalente la cromatina; y c) el complejo media-dor, que es una interfaz funcional con la maquinaria basal de la trans-cripción. La familia de proteínas P160/SRC interactúa con los NR. Estos coactivadores contienen múltiples motivos LxxLL cruciales para la unión al TR dependiente de T3. Así, P160/SRC actúan como superficies de acoplamiento para el reclutamiento de HAT —por ejemplo p300/CBP—; HMT —CARM1 y PRMT1—, y los complejos remodeladores de la cro-matina dependientes de ATP —SWI/SNF—. Adicionalmente, el recluta-miento inicial de los complejos p160/SRC-p300/CBP al TR unido al promotor de los genes blanco puede facilitar el subsecuente reclutamien-to del complejo SWI/SNF. El complejo coactivador mediador, al con-trario de los coactivadores modificadores de la cromatina, forma un puente funcional entre los NR unidos al DNA y otros factores activa-dos con la maquinaria basal de la transcripción. De este modo, se facilita el ensamblaje y la activación de la RNA polimerasa II (Pol II) y sus facto-res generales asociados en los promotores blanco (véase figura 11).2

Como ya se mencionó, los TR modulan la expresión de los genes T3-responsivos positiva y negativamente en respuesta al ligando. El me-canismo de acción positivo es el que mejor se comprende hasta ahora; sin embargo, el mecanismo de acción negativo, es decir, la represión inducida por el TR unido a T3 aún permanece pobremente compren-dido no obstante la mayor parte de los genes T3-responsivos, incluyendo los genes moduladores del eje hipotálamo hipófisis tiroides TSH y el TRH, se regulan negativamente en presencia de T3.3 Dada su relevancia funcional, las cadenas α y β de la hormona estimulante de la tiroides (TSH) y la TRH son los genes sobre los cuales se han generado la mayo- ría de los hallazgos sobre el mecanismo de regulación negativa T3-depen-diente. En este contexto, se ha observado que el TRβ2, es el principal modulador de la expresión de ambos genes in vivo. Estudios estructura-

función muestran que la activación en ausencia de ligando y represión en presencia de T3 está asociada al NTD único del TRβ2, y requiere particularmente de los aminoácidos 89-120 de este dominio para am-bos efectos.4

La noción de que los TR interactúan con el DNA para modular la expresión de genes T3-responsivos es un hecho muy bien fundamentado en los genes regulados positivamente; sin embargo, en los genes regu-lados negativamente aún es un tema en debate. Existen varios estudios que respaldan la interacción de los TR con secuencias de DNA en el promotor de TRH y TSH a los cuales se les denomina genéricamente como TRE negativos (nTRE). Utilizando un TR mutado en el dominio de unión al DNA se observó que el TR pierde su capacidad para unirse al nTRE del gen de la TRH o el de las cadenas α y β de TSH, y en consecuencia no reprime su expresión en presencia de T3. Así, los autores concluyen que se requiere de la interacción TR-DNA para la acción de T3 en este caso.5 En este contexto, también se han observado sitios de unión para los TR y otros factores de transcripción como el SP1 sobrepuestos en las regiones promotoras de los genes blanco. Así, se encontró que sólo el TR unido a T3 puede unirse al nTRE del pro-motor del gen que codifica para la proteína β-amiloidea, y así desplazar al SP1, el cual activa este gen de forma constitutiva; sin embargo, los autores fallaron en proponer una explicación a la represión de este gen en presencia de T3.6 En contraste, el promotor del gen de la desyodasa tipo 1 (Dio1) muestra una regulación diferente en función de la matriz celular. En células JEG-3 y a diferencia de lo que ocurre en el resto de las células que expresan este gen, el tratamiento con T3 reprime su ex-presión. En este caso se observó que la T3 induce la expresión del factor de transcripción JTF específico de JEG-3, el cual se une al promotor de Dio1 y así reprime su expresión, concluyendo que el mecanismo de regu-lación negativa de Dio1 específico de células JEG-3 no requiere de la unión del TR al promotor pero sí depende de la presencia de T3.7 De esos estudios, la evidencia de la interacción de TR con el DNA para el mecanismo de regulación negativa proviene de ensayos de retardo de la movilidad electroforética, usando segmentos de DNA de los promo-tores asociados a la regulación negativa por T3. Dichos segmentos se identificaron usando genes reporteros —luciferasa— y la mutación del

DBD interfiere con la regulación negativa dependiente de T3.4,7 Sin embargo, la interacción del TR con los nTRE es débil en contraste con la de los TRE positivos y la deleción del nTRE no abate la represión inducida por T3. Es importante notar que el correpresor NCoR pue-de actuar como un coactivador en genes regulados negativamente por T3.8 En contraste, animales transgénicos con la mutación E457A en el TRβ1 muestran niveles altos de TSH, T4 y T3, así como de los niveles hepáticos de mRNA de Gsta y Dio1 (véanse abreviaturas) elevados y bajos, respectivamente. La mutación E457A sólo altera la interacción con coactivadores, sin cambiar la afinidad por T3 o por los correpreso-res, lo cual indica que tanto para la regulación positiva como negativa T3-dependiente se requiere de una interacción normal con los coacti-vadores.9 Los resultados de la inmunoprecipitación de la cromatina indican una pobre o nula interacción con el aporeceptor TR o con el TR unido a T3 en promotores de genes regulados negativamente por esta hormona. Sorprendentemente, se observó un efecto positivo del NCoR sobre la activación de este tipo de genes en ausencia de T3.10,11 El requerimiento de la interacción del TR con correpresores para la activación en ausencia de T3 se confirmó también en el promotor de SOD1 —superóxido dismutasa 1—.12 Se ha descrito que las mutaciones en el DBD del TR interfieren con la modulación negativa T3-dependiente lo cual sugiere la interacción TR-DNA en estos genes; sin embargo, en la regulación de la expresión del gen de la cadena β de TSH se observó que la interacción se da entre el DBD del TR y el factor de trans-cripción GATA2. Éste sí interactúa con el DNA pero lo hace en una región distinta al nTRE reportado y además, la regulación negativa T3-dependiente se mantiene en ausencia del nTRE.1,13 Más aún, se ha observado que la acetilación de la H3 en el promotor de α-TSH, que generalmente se asocia a la activación, también reprime de manera T3-dependiente, sugiriendo que la acetilación de H3 puede inducir represión en genes regulados negativamente.1,11 En este contexto, la T3 promueve un incremento en la acetilación en H3K9 y H3K18 y una disminución en la acetilación en H3K27 en el promotor de α-TSH, mientras que la activación de este gen mediada por cAMP a través de p-CREB incrementa la acetilación de H4K5 y H4K8. Juntos, estos datos indican que las modificaciones postraduccionales modulan de manera

especifica la activación/represión de este gen en particular. Más aún, sugieren que en cada vía participan correguladores distintos.2,14

Correguladores

La unión del ligando induce cambios en la conformación del receptor de los cuales el efecto sobre la H12 es funcionalmente crucial. En au-sencia de ligando, la H12 adopta una conformación que favorece la interacción con correpresores mientras que al unirse el ligando la confor- mación de la H12 cambia de forma que permite la interacción con coac-tivadores. Así, la dinámica y conformación de la H12 son factores clave que modulan la transcripción dependiente de ligando. En los TR, las interfases de correpresores y coactivadores están sobrepuestas y se forman por los residuos V284, K288, I302 y K306 de las hélices 3, 5 y 6 de acuerdo con la isoforma TRβ. La superficie de unión a correpresores incluye además los residuos T277, I280, T281, V283 y C309, que tam-bién pertenecen a las hélices 3, 5 y 6 pero están espacialmente más cercanos a H12 en el holo-TR, donde los coactivadores requieren los residuos L454 y E457 de la H12 para interactuar con el TR.3,15 La H12 está acoplada sobre los residuos I280, V283 y C309 en estructuras del holo-TR, de forma que la unión de correpresores requiere un cambio conformacional de H12 desde esta posición. El rol de estos tres residuos (I280, V283 y C309) en la unión de coactivadores y correpresores es esencial para la comprensión del equilibrio conformacional y la diná-mica de la H12. Dado que la unión de los coactivadores pero no de los correpresores es dependiente de la interacción directa con la H12, la deleción de ésta bloquea la interacción con coactivadores pero incrementa la asociación de correpresores al exponer su superficie de interac-ción.4,15 Además de la H12, el NTD es importante para estabilizar la interacción con coactivadores. En este contexto, el NTD del TRβ2, pero no del TRβ1, interactúa con dominios ricos en glutamina de los coac-tivadores de la familia p160, interacción que aumenta el efecto de T3 sobre la activación de la transcripción aún en ausencia del ligando.5,16

Los TR inducen la remoción de las histonas facilitando el recluta-miento de la RNA polimerasa II. Las histonas, particularmente en su cola N-terminal, son objeto de un gran número de modificaciones pos-

traduccionales incluyendo acetilación, metilación, fosforilación y ubiqui-tinación. En particular la di y trimetilación de la lisina 9 en la histona 3 (H3K9me2, H3K9me3) y la trimetilación de H3K27 (H3K27me3) pueden promover la formación de heterocromatina compacta que pre-viene la transcripción por medio del reclutamiento de la proteína 1 de heterocromatina y grupos de proteínas polycomb —complejos remode-ladores de la cromatina—. En contraste, las modificaciones de histonas que se asocian con transcripción activa, como la acetilación de las his-tonas 3 y 4 o la di o trimetilación de H3K4 (H3K4me2, H3K4me3), son comúnmente referidas como modificaciones propias de cromatina laxa —eucromatina—.6,17 Adicionalmente a las modificaciones postra-duccionales (PTM) de las histonas, los TR ligados a T3 inducen la remoción de los nucleosomas que contienen al TRE mediante un meca-nismo aún no determinado en el cual podrían participar las proteínas remodeladoras de la cromatina Brg1 y BAF57.4,7,17 Así es posible que dichos complejos participen en la remoción de los nucleos más cerca-nos al TRE, facilitando el ensamblaje de la maquinaria transcripcional en la región promotora.8,18 Además de facilitar el ensamblaje de los factores generales de transcripción, los TR ligados a T3, inducen la fosfo-rilación en la serina-2 de la RNA Pol II, modificación asociada a una mayor tasa de síntesis de RNA.9,19

Coactivadores

Como se mencionó anteriormente, los TR se unen a los promotores blanco como heterodímeros con el receptor de retinoides X (RXR) y reclutan coactivadores transcripcionales en presencia de T3 y correpre-sores en ausencia de esta hormona. Los coactivadores que interactúan directamente con el TR ligado que facilitan la transactivación incluyen a los miembros de la familia p160: SRC1 (Steroid Receptor Coactivator), GRIP1 o SRC2 (Glutamate Receptor Interacting Protein) y ACTR o SRC3 —acetiltransferasa—. Se cree que estas proteínas funcionan en parte por su asociación a HAT potentes tales como p300 que es una proteína de unión a CREB (CBP); estas proteínas fundamentalmente dirigen la actividad HAT hacia el promotor unido al TR, lo que resulta en la ace-

tilación de los nucleosomas y en una cromatina menos compacta.10,11,20 Las histonas acetiladas pueden actuar como superficies de unión de distintos coactivadores.12,21 Adicionalmente, algunos miembros de la familia p160 contienen actividad HAT intrínseca.22 La acetilación co- rrelaciona con un incremento de 2 a 3 veces en la transcripción T3-dependiente mediada por TR:RXR.20 Tras la acetilación por medio de CBP/p300 se facilita el reclutamiento del complejo remodelador de la cromatina SWI/SNF y el mediador. La subunidad BGR1 del complejo SWI/SNF con actividad ATPasa induce cambios en la topología del DNA los cuales incluyen la formación de sitios con hipersensibilidad a DNAsas y la pérdida de la escalera nucleosomal canónica.23 Un segundo tipo de coactivadores para los TR es el complejo multimérico “TR associated protein (TRAP) mediator complex”, el cual parece unirse al TR ligado mediante una sola subunidad denominada TRAP220.22 La evidencia muestra un reclutamiento ordenado de los correguladores HAT, segui-do del mediador TRAP, en diferentes promotores blanco de células de mamífero.22 Así, el reclutamiento de actividad HAT, por medio de los TR unidos a los promotores T3-responsivos posiblemente genera una estructura de la cromatina que permite la unión de otros complejos correguladores multiméricos más grandes. En un paso temporalmente subsecuente, los TR reclutan al mediador TRAP, el cual a su vez inte-ractúa más directamente con la RNA polimerasa II, la cual aparen-temente se encuentra pre-ensamblada en el promotor24 y potencia la iniciación de la transcripción.22 Al estudiar la dinámica del ensamblaje del complejo transcripcional en respuesta a T3, se observa que tanto el TR como los coactivadores se encuentran unidos al promotor blanco 15 minutos después del estímulo con T3; sin embargo, no todos los genes blanco muestran el mismo patrón de reclutamiento de coactivadores; el reclutamiento temporal de TRAP220 y la acetilación de histonas varía entre distintos TRE, mientras que el patrón de reclutamiento de los coactivadores primarios SRC1 y GRIP1 parece ser similar en los mismos promotores. Estas diferencias podrían ayudar a determinar la especifici-dad y fuerza de la respuesta a T3 de los genes blanco.24 El reclutamiento de coactivadores también se ha estudiado en vertebrados no mamíferos, donde se observó que el complejo coactivador SRC1/CBP (p160/p300) es necesario para la metamorfosis mediada por T3 en ranas, lo cual su-

giere que este complejo se recluta en los genes T3-responsivos que mo-dulan este proceso y que el mecanismo de acción de T3 está conserva-do al menos en parte en vertebrados.25

El reclutamiento de coactivadores al TR se realiza mediante interac-ciones hidrofóbicas entre sitios conservados en la superficie de los TR y los coactivadores. Los coactivadores contienen varios motivos con-servados LxxLL denominados caja de NR (NR box), los cuales adoptan una estructura α-hélice con las tres leucinas embonando en la bolsa hidrofóbica del LBD formada tras el plegamiento del α-hélice 12 en presencia del ligando. Actualmente se han identificado aproximadamente 300 correguladores de los receptores nucleares, y se piensa que el perfil funcional de los TR en respuesta a T3 es ampliamente determinado por el uso selectivo de estos correguladores transcripcionales.26 Los TR reconocen de manera específica a los coactivadores al interactuar con los residuos variables dentro de o flanqueando el motivo LxxLL.26 El reconocimiento del motivo LxxLL por los TR se estabiliza por dos interacciones principales, las interacciones hidrofóbicas y puentes de hidrógeno entre aminoácidos cargados específicos. La abrazadera carga-da se comprende de dos aminoácidos conservados en el LBD, un resi-duo de lisina en la H3 y uno de ácido glutámico en la H12 afianzan la hélice LxxLL formando puentes de hidrógeno con la espina dorsal del péptido.27 Distintos motivos LxxLL y secuencias de contexto exhiben afinidades de unión diferenciales por distintos TR, sugiriendo que estos receptores tienen preferencia por un motivo LxxLL sobre otro en el mismo coactivador o por otro coactivador.28 Por ejemplo, trece amino ácidos abarcando el motivo LxxLL 2 de GRIP1 bloquean la interacción con el TRβ-LBD, mientras que un péptido comprendido en el motivo 3 fue mejor competidor por la unión a GR.29 La potencia y eficacia de T3 por el TR resulta tanto de la afinidad por el ligando como de la afinidad que varias proteínas correguladoras tienen por el complejo T3:TR; así, el complejo T3:TR recluta preferentemente SRC3, con una afinidad relativa en el orden nM. Los datos muestran que el SRC3 forma un complejo más estable con T3:TRβ (120 minutos) que con T4: TRβ (15 minutos), lo cual concuerda con la ausencia de actividad en presencia de T4 en ensayos de transactivación, no obstante que TRβ se ha cristalizado unido a T4.30

Correpresores

En ausencia de ligando, los TR se asocian con proteínas correpresoras tales como el NCoR y el SMRT.31 NCoR y SMRT son proteínas homó-logas de 2 500 aa con 40% de identidad. Ambas proteínas son con-sideradas como grandes plataformas que actúan como andamio sobre el cual se construye la maquinaria enzimática de represión.32 Estas proteínas contienen dominios de represión N-terminal que interactúan con desacetilasas de histonas y dominios C-terminales de interacción con receptores nucleares. Dentro de estos dominios de interacción se en-cuentran los motivos, (I/L)xx(I/V)I, denominados cajas CoRNR.31 Este motivo es análogo al LxxLL de los coactivadores, y los estudios estructurales muestran que sus sitios de unión se encuentran sobre-puestos; sin embargo, el péptido del correpresor forma tres vueltas de α-hélice, con la H12 del LBD desplazada de la posición activa.32 Los estudios muestran que los TR interactúan preferentemente con NCoR, específicamente con el primer motivo CoRNR el cual es específico para TR y no se encuentra en SMRT.31 Sin embargo, el silenciamiento de NCoR o SMRT (siRNA) por separado interfiere con la represión mediada por TR. Por lo tanto ambos correpresores participan en este proceso.33 La represión está mediada por el reclutamiento de múltiples enzimas desacetilasas de histonas tales como HDAC 1, 3, 4, 7 y Sir-tuina 1.32 Ha sido claramente demostrado que el reclutamiento de HDAC3 es esencial para la represión mediada por TR.34 Los comple-jos correpresores de NCoR y SMRT son esencialmente los mismos y se componen de NCoR/ SMRT, HDAC3, WD40-repeated protein, TBL1, y la proteína G supresora, este complejo puede ser objeto de PTM como fosforilación; de hecho, una proteína cinasa de DNA (DNA-PK) es reclutada por el complejo correpresor y la fosforilación de HDCA3 aumenta su actividad, lo cual contribuye a la represión mediada por TR.35 La región N-terminal del correpresor activa la función catalítica de la enzima HDAC3 que se conoce como el domino de activación de desa-cetilasa (DAD); la mutación de este dominio anula la represión por TR. Más aún, estudios in vivo muestran que animales transgénicos con una mutación en el dominio DAD muestran desrepresión en genes normalmente regulados positivamente por T3 y disminución de la ex-

presión basal en genes regulados negativamente por T3, lo cual indica que la interacción HDAC3-NCoR es importante para mantener la expresión basal en ambos casos.36 Más aún, la inhibición de la interac-ción NCoR-TR puede atenuar los síntomas de RTH en ratones trans-génicos que expresan un NCoR mutado que no interactúa con TR.37

1 Fondell, 2013: 3867-3875.2 Feng, Jiang, Meltzer y Yen, 2000: 947-955.3 Langlois et al., 1997: 24927-24933.4 Shibusawa, Hollenberg y Wondisford, 2003: 732-738.5 Villa, Santiago, Belandia y Pascual, 2004: 863-873.6 Kim et al. 2004: 2924-2936.7 Shen, 2004: E236-E245.8 Kim et al., 2005: 14545-14555.9 Ortiga-Carvalho et al., 2005: 2517-2523.10 Nygard, Becker, Demeneix, Pettersson y Bondesson, 2006: 517-530.11 Wang et al., 2009: 600-609.12 Santos et al., 2006: 793-800.13 Matsushita et al., 2006: 865-884.14 Wang, Xia, Weiss, Refetoff y Yen, 2010: e9853.15 Souza et al., 2011: 882-893.16 Lee, Young, Wan, Chan y Privalsky, 2011: 1111-1125.17 Matsuura, Fujimoto, Fu y Shi, 2012: 961-972.18 Shi, Matsuura, Fujimoto, Wen y Fu, 2012: 1-1.19 Mochizuki, Ishihara, Goda y Yamauchi, 2012: 1069-1073.20 Lee, 2003: 908-922.21 Dhalluin et al., 1999: 491-496.22 Sharma y Fondell, 2002: 7934-7939.23 Huang, Li, Sachs, Cole y Wong, 2003: 2146-2155.24 Liu, 2005: 483-490.25 Paul, Buchholz, Fu y Shi 2006: 7472-7481.26 Jin y Li, 2010: 1218-1226.27 Savkur y Burris, 2004: 207-212.28 Leo y Chen, 2000: 1-11.29 Darimont et al., 1998: 3343-3356.30 Jeyakumar, Webb, Baxter, Scanlan y Katzenellenbogen, 2008: 7465-7476.31 Moore y Guy, 2005: 475-482.32 Watson, Fairall y Schwabe, 2012: 440-449.33 Choi et al., 2008: 19.34 Ishizuka y Lazar, 2003: 5122-5131.

35 Jeyakumar, Liu, Erdjument-Bromage, Tempst y Bagchi, 2007: 9312-9322.36 You, Liao, Weiss y Lazar 2010: 1359-1367.37 Fozzatti et al., 2011: 17462-17467.

Antecedentes específicos 59

La 3,5-diyodotironina (T2) es una TH bioactiva

ún cuando la glándula tiroides sintetiza y secreta principalmente tiroxina o T4, es la triyodotironina o T3 la molécula a la que se le atribuyen los efectos nucleares sobre la expresión génica. De hecho, la T4 se considera una prohormona que es activada o inactivada por medio de un proceso enzimático finamente regulado y que ocurre en prácticamente todas las células del organismo. Este proceso consiste en la remoción de un átomo de yodo del anillo externo o fenilo —vía de activación—; o bien, del anillo interno o tirosilo —vía de inactivación— de la molécula de yodotironina. De esta manera, la desyodación del ani-llo externo de la T4 resulta en la formación de T3, la yodotironina que es hasta 100 veces más afín que la T4 a los TR, y por lo tanto la que se ha considerado responsable de la mayoría de los efectos biológicos de las TH. Por otro lado, la desyodación que ocurre en el anillo interno de la T4 resulta en la formación de la rT3, isómero inactivo de la T3. La desyodación secuencial del anillo externo de la T3 da lugar a la 3,5-T2 (T2), TH a la que también se le ha descrito bioactividad.1-5

Capítulo 5

Antecedentes específicos

La T2 tiene efectos extranucleares

Los efectos de las TH se pueden agrupar en dos categorías. Los involu-crados en el mantenimiento del balance energético y los morfogéni-cos relacionados a la ontogenia o historia de vida de los organismos. Los efectos sobre el balance energético se conocen desde finales del siglo XIX. Se trata de los bien conocidos efectos termogénicos o calorigéni-cos de las TH, los cuales fueron descritos por primera vez por el fisiólogo Magnus-Levi (1895). Si bien desde entonces se sabe que las TH regulan el gasto energético, hasta la fecha no son claros los mecanismos moleculares mediante los cuales ocurre esta regulación. Los primeros estudios encaminados a entender dichos mecanismos se remontan a 1963,6 casi 70 años después de los hallazgos de Magnus-Levi. Estos estudios mos-traron, de manera clara, que el aumento en el consumo de oxígeno observado después del tratamiento con TH en ratas hipotiroideas —ti-roidectomía—, requería de síntesis de proteínas de novo y que el núcleo celular era seguramente el efector final.

Aproximadamente 30 años después se publicaron resultados sor-prendentes mostrando que entre las distintas yodotironinas, la T2, al igual que T3 estimulaba el consumo de oxígeno en el hígado hipotiroideo (véase figura 12).1 La potencia entre las dos yodotironinas era similar (1 pM); sin embargo, el efecto observado con T2 ocurría más temprano que el producido por la T3. Estudios complementarios in vivo mostraron que: i) la T3 y la (3,5-)T2, pero no la 3,3’-T2 tienen un efecto sobre el metabolismo energético; ii) que el efecto observado con T2 es más temprano; y iii) que el efecto de T2 no requiere de transcripción de novo. Estos dos últimos puntos fueron interpretados como evidencia de que el mecanismo de acción de la T2 era extranuclear (véase figura 13).2,3

Además de sus acciones sobre el metabolismo energético, otros estu-dios mostraron que la T2 también tiene efectos extramitocondriales como la inhibición de la secreción hipofisaria de la hormona estimu-lante de la tiroides (TSH) y de la expresión de los receptores TRβ2;7 así como efectos estimulatorios sobre la síntesis de los mRNA que codifi-can para la GH 2 y la D1.8 Es importante destacar que estos resultados se obtuvieron en experimentos in vitro (cultivos celulares), en los cuales la magnitud de los efectos de la T2 fue hasta 100 veces menor a la obser-vada con dosis equivalentes de T3.

Antecedentes específicos 61

Efectos genómicos de la 3,5-diyodotironina

Utilizando un abordaje evolutivo y comparado, nuestro grupo de traba-jo ha venido analizando distintos factores y mecanismos que intervie-nen en la regulación del metabolismo y la acción de las TH. Nuestros modelos biológicos principales son dos especies de teleosteos, el killifish, Fundulus heteroclitus (Fh), y la tilapia, Oreochromis niloticus. Los resultados que se presentan a continuación se han obtenido en uno u otro de es-tos dos modelos. A continuación sólo se resumirán los hallazgos más relevantes relacionados con la bioactividad de la T2 y su mecanismo de acción.

a) La T2 regula la expresión de genes T3-dependientes in vivo. Inicialmen-te demostramos que al igual que la T3, la T2 regula la expre-sión de genes T3-dependientes. Así, el tratamiento con dosis suprafisiológicas de T3 o T2 aumenta o disminuye la expresión de genes regulados positiva (por ejemplo, factor de crecimiento insulinoide [IGF1]), o negativamente (desyodasa tipo 2 [D2]) por TH, respectivamente (véase figura 14).4, 9 Subsecuentemente disecamos el efecto de estas hormonas bloqueando su síntesis —metimazol: MMI— y reemplazando a los organismos con dosis fisiológicas de T3 o T2. En todos los casos, ambas TH rescatan la expresión eutiroidea de los genes T3-dependientes estudiados.4

b) La T2 y la T3 inducen la formación de complejos transcripcionales dis-tintos in vivo. Empleando extractos de las proteínas nucleares hepáticas en ensayos de retardo de la movilidad electroforética (EMSA), encontramos que las proteínas nucleares de peces euti- roideos —no tratados— forman dos complejos específicos cuando se incuban con TRE (véase figura 15). Estos complejos práctica-mente desaparecen en el grupo hipotiroideo (MMI), sugiriendo que las TH son necesarias para que el TR forme complejos con el TRE. De manera interesante, en los animales hipotiroideos reemplazados con T3 predomina el complejo de menor peso, mientras que en aquellos reemplazados con T2 el complejo de mayor peso molecular es el predominante.4 En conjunto, estos resultados muestran que la T2 y la T3: i) actúan directamente

en la regulación de genes TH-dependientes; ii) interactúan con proteínas que se unen con alta especificidad a los clásicos TRE; y iii) promueven la formación de complejos TRE-TR de distinto peso.

1 Horst, Rokos y Seitz, 1989: 945-950.2 Moreno, Lombardi, Lombardi, Goglia y Lanni, 1998: 2369-2377.3 Goglia, 2005: 164-172.4 García, López Bojorquez, Núñez, Valverde y Orozco 2007: R877-R883.5 García, Jeziorski, Valverde y Orozco, 2004: 201-209.6 Tata et al., 1963: 408-428.7 Ball, Sokolov y Chin, 1997: 137-147.8 Baur, Bauer, Jarry y Kohrle, 1997: 3242-3248.9 Navarrete Ramírez, Luna, Valverde y Orozco, 2013: 1-9.

Planteamiento del proyecto 63

Justificación

as hormonas tiroideas ejercen efectos pleyotrópícos en virtual- mente todas la células de los organismos vertebrados; sin embargo, los mecanismos de acción por medio de los cuales se realizan estos efectos son pobremente comprendidos. La T3 es la hormona a la cual se le atribuyen la mayoría de los efectos biológicos de las hormonas tiroideas, no obstante, la T2, el objeto de estudio de esta tesis, también pre-senta actividad biológica. Estudios previos en nuestro grupo de trabajo han demostrado que la T2 modula la expresión de genes T3-dependientes posiblemente mediante su interacción con un receptor de hormonas tiroideas. Esto sugiere que la T3 también es una prohormona de la cual se origina la T2, así planteamos la siguiente hipótesis:

Hipótesis

La T2 es una hormona tiroidea bioactiva cuyos efectos biológicos se rea-lizan en parte mediante su interacción con un receptor de hormonas tiroideas.

Capítulo 6

Planteamientodel proyecto

Biomédicas-5B.indd 63 26/10/15 11:03

Objetivo general

Estudiar el mecanismo de acción mediante el cual la T2 modula la expresión de genes T3-dependientes.

Objetivos particulares

•Clonarlosreceptoresdehormonastiroideasqueseexpresanenel hígado de teleósteos.

• Evaluarlacapacidaddetransactivaciónin vitro de los TR utili-zando un gen reportero acoplado a luciferasa en presencia de T3 o T2.

• Realizarestudiosestructura-funcióndelosTRdeteleósteoseva-luando la capacidad de transactivación de distintas construccio-nes de TR mutados y quimera utilizando un gen reportero.

Materiales y métodos

Clonación de los TR de tilapia

Se realizó la transcripción reversa del RNA total de hígado de tilapia usando oligo-dT. Se usaron las secuencias disponibles de cDNA del TR el de teleósteos disponibles en la base de datos Pubmed. Se clonaron dos fragmentos de 230 y 257 pares de bases los cuales tenían 94% de identidad con otros TRb1 de teleósteos reportados. Se diseñaron oligo- nucleótidos específicos para clonar ambas secuencias usando la técnica de Rapid Amplification of cDNA Ends(RACE).Seobtuvierondosdiferen-tes cDNA que codifican para dos isoformas del TRue, las cuales difie-ren sólo por 27 pares de bases en el marco abierto de lectura: L- TRb1 (1188pb)yS- TRb1(1161).Seamplificaronlassecuenciascompletasde los cDNA de las dos isoformas de TRe usando oligonucleótidos es-pecíficos para las regiones 5’ y 3’ y se ligaron en el vector de expresión pcDNA3.3-TOPO-TA—Invitrogen,Carlsbad,California—.Lasdistintasconstruccionesde receptoresmutantes yquiméricas (véase figura1)usadas,serealizaronporPCRyseconfirmaronporsecuenciaciónunavez insertadas en el vector de expresión.1

Planteamiento del proyecto 65

Ensayos de transactivación usando transfección transitoria

SeusarondosgenesT3-responsivos.ElgenreporteroSERCA(sarco[endo] plasmicreticulumCa2+ATPase)contiene5TREs(2DR4y1mediositio)insertadosenlaregión5’delpromotormínimodelSERCA1subclonado dentro del vector reportero de luciferasa de luciérnaga pGL3-basic. El Luc-DR4 contiene dos TRE DR4 ideales insertados en laregión5’delpromotormínimodetimiditacinasa(TK)subclonadoen el vector pGL2. Se utilizaron tres líneas celulares: células GH3 —hipó-fisis de rata—, células HEK293T —riñón de embrión humano— y células CV1—riñóndemonoverde—.Todaslaslíneascelularessemantuvieronen DMEM suplementado con 10% de suero bovino fetal, 100 U/mL depenicilina/estreptomicinaysemantuvierona37ºCenincubadorahúmedacon5%CO2.Las células GH3 se sembraron en platos de 12 pozos (4 × 105 células/pozo)24horasantesdelatransfecciónusandoDMEM suplementado con 10% de suero fetal de bovino dializado —con niveles no detectables de T3 RIA—. Las células se cotransfectaron usan-do lipofectamina 2000 —invitrogen— con la siguiente mezcla de plás-midos500ngdelosreporterosSERCAoLuc-DR4y300ngdeunadelas construcciones del TRb1 insertadas en pcDNA3.3. El pGL3 basic y el pcDNA 3.3 vacío se usaron como controles. El medio se remplazó 24 horas después de la transfección con medio fresco que contenía 10% desuerobovinofetal(FBS)dializadomásT3oT2(100nM),ovehículo—a concentración final de 10 nM NaOH—. Las células se lisaron 48 ho-ras después; los lisados se usaron para evaluar la actividad de luciferasa y la concentración de proteínas. Todos los experimentos se realizaron de forma independiente por triplicado.1

Resultados

Los resultados de esta tesis se publicaron en un artículo de Endocrinology y los derechos fueron cedidos a la revista, por lo tanto no se muestran en el presente libro. Sin embargo, al lector ávido, una búsqueda por título en <scholar.google.com> le facilitará una versión electrónica, que sin duda complementará el presente libro. La referencia es la siguiente:

Mendoza,A.,P.Navarrete-Ramírez,G.Hernández-Puga,P.Villalobos,G.Holzer,J.P.Renaud,V.LaudetyA.Orozco,“3,5-T2isanAlter-native Ligand for the Thyroid Hormone Receptor b1”, Endocrinolo-gy,2013Aug;154(8):2948-2958.(doi:10.1210/en.2013-1030.Epub2013Jun).

1 Mendoza et al., 2013: 2948-2958.

Discusión 67

a pleyotropia funcional de las hormonas tiroideas y sus receptores nucleares se ha estudiado desde hace varias décadas; sin embargo, aún no se comprende del todo. Esto se debe en parte a que el mecanismo de acción de las TH es sumamente complejo, ya que la inte-racción TH-TR puede activar o reprimir la expresión de una gran va-riedad de genes. Además, las TH también tienen efectos por medio de mecanismos no-genómicos al interactuar con receptores membranales de tipo integrina donde T4 es el ligando principal, lo cual amplía aún más el abanico de efectos biológicos. Hasta hace poco, se consideraba a la T3 como el único ligando endógeno de los TR y, por lo tanto, como la hormona responsable de los efectos nucleares de las TH. Sin embargo, los resultados de esta investigación doctoral muestran que la T2, TH producida por la desyodación de T3, es un ligando del TR y podría de-sempeñar un rol en el funcionamiento y desarrollo normal, al menos de teleósteos. Estudios realizados por otros grupos de trabajo muestran que la T2 aumenta la tasa del metabolismo basal en mamíferos posible-mente mediante un mecanismo de acción no-genómico. Sin embargo, aquí mostramos que la T2 tiene efectos nucleares que se realizan en su interacción con un TR en teleósteos y posiblemente en otros vertebrados incluyendo mamíferos. Más aún, mostramos que los efectos tiro-miméticos de la T2 son distintos a los efectos de T3, tanto en potencia como en las posibles modificaciones que ejercen sobre la conformación

Capítulo 7

Discusión

del TR. Por lo tanto, proponemos que la T2 tiene una vía de señaliza-ción específica que de manera paralela a la vía de T3 orquesta y modula en una tendencia tiempo y tejido específica los efectos biológicos de las TH en teleósteos, particularmente sobre la modulación de la expre-sión génica.

En esta investigación reportamos la identificación y caracterización de dos isoformas del receptor TRβ1. Una de ellas presenta un inserto de nueve aminoácidos (Ins9aa) al inicio de dominio de unión al ligando, al cual denominamos TRβ1 largo (L-TRβ1), y la otra, que carece de inserto, denominado TRβ1 corto (S-TRβ1). La caracterización molecular y funcional de estas isoformas reveló que en presencia de T2 el L-TRβ1 activa la transcripción de un gen T3-reportero en cultivos celula-res y que esta activación requiere del NTD del TR. En contraste, la T3 activa al L-TRβ1 aun en ausencia del NTD. El mRNA de la isoforma L-TRβ1 es el más abundante en el hígado de teleósteos y su perfil de expresión durante el desarrollo y metamorfosis1,2 sugiere que la activa-ción del L-TRβ1 por T2 podría jugar un papel fisiológico específico en la historia de vida de los teleósteos, contribuyendo así a explicar parte de la pleiotropía funcional de las hormonas tiroideas.

El LBD del TRβ1 del pez y del humano, y su rol en la unión de T2

La alineación de todas las secuencias del TRβ1 disponibles (n=65) en la base de datos Ensembl muestra que, excluyendo el Ins9aa, la estructura primaria del L-TRβ1 está relativamente conservada, particularmente en el saco de unión al ligando (LBP). Esto sugiere que la habilidad del L-TRβ1 para activar la transcripción por medio de T2 se encuentra directamente relacionada con la presencia del Ins9aa cuya secuencia se con-serva en los peces, en los que se ha identificado esta isoforma.3 Según las predicciones in silico, el inserto no adopta una estructura secundaria; sin embargo su ubicación en el asa formada entre las H2 y H3 del LBD puede impactar en la ubicación de ambas hélices en la estructura ter-ciaria de este dominio. Igualmente, en presencia del ligando, el Ins9aa podría adoptar una conformación distinta que incluya interacciones con otros dominios y/o regiones del L-TRβ1. Los estudios de dinámica molecular in silico sugieren tres vías que el ligando puede seguir para

Discusión 69

salir y posiblemente entrar al LBD.4 De acuerdo con estas propuestas y dada la localización del Ins9aa entre las hélices 2 y 3, es probable que una vez dentro del LBP, el ligando se estabilice principalmente median-te interacciones hidrofóbicas y dos regiones polares. Una sola histidina localizada en la H11 forma una de las interacciones polares con el hidroxilo fenólico del anillo externo de la tironina. Sin embargo, la mayo- ría de las interacciones polares con el ligando ocurren con tres residuos de arginina localizados en la hélice 3 y en las hebras β y por una serina en el TRα o una aspargina en el TRβ.5 Las interacciones polares del ligando con esta región de la proteína dependen de una intrincada red de puentes de hidrógeno que involucra moléculas de agua circundantes. Sin embargo, la alta afinidad de los ligandos del TR depende princi-palmente de su hidrofobicidad, ya que sus anillos de tironina son esta-bilizados por una serie de interacciones no polares. Así, es posible que el Ins9aa facilite la estabilización de la T2 en el LBP por medio de las interacciones polares entre la α-hélice 3 y el grupo amino de la tironina. Dado que T3 y T2 difieren sólo por la presencia de un átomo de yodo en el anillo externo, el hecho de que el L-TRβ1 una a ambas tironinas con alta afinidad (Kd 0.2 nM),6 indica que el Ins9aa modifica la estruc-tura del LBP de tal forma que las interacciones hidrofóbicas con el anillo tirosilo —anillo externo—, son suficientes para estabilizar a T2 en esta región del LBP aun en ausencia del átomo de yodo. Más aún, indi-can que los dos yodos del anillo interno son suficientes para que la T2 o T3 se unan con alta afinidad al L-TRβ1. Aún cuando se sabe que el yodo del anillo externo estabiliza la interacción entre H3 y H12 por comu-nicación alostérica, se requiere evidencia estructural del rol del Ins9aa en la activación/interacción L-TRβ1 /T2. Al respecto y como lo mues-tran los resultados de este trabajo, la T2 es significativamente más poten-te (EC50 1E-11) que T3 (EC50 1E-9 M). Este dato sugiere que el menor tamaño de la T2 con respecto a T3 facilita su entrada y estabilización dentro del LBP, además de que la unión de T2 al L-TRβ1 induce cam-bios conformacionales en el LBD que incluyen la reorientación de la H12;7 la activación del switch His-Phe8 y la rotación de las hélices asocia-das a la dimerización;9 todos ellos asociados a la formación de la superficie de interacción con coactivadores y en consecuencia a la activación de la transcripción. Dada la evidencia experimental, T2 podría inducir

estos cambios en la conformación del L-TRβ1/LBD con mayor eficien-cia que T3, posiblemente mediante una ruta distinta que incluya inte-racción con otros dominios funcionales del L-TRβ1 y/o el incremento en la afinidad por coactivadores, lo cual podría explicar la mayor po-tencia de T2 en el ensayo de transactivación a pesar de tener la misma afinidad que T3 por el L-TRβ1 (véase tabla 1, en Mendoza et al., 2013).6

El NTD y su importancia en la activación del L-TRβ1 mediada por T2

Todavía no se conoce la estructura del NTD, pero se considera que pue-de adoptar una conformación funcional en solución y que en presen-cia de ligando, podría tener un rol funcional al interactuar con otros dominios del NR.10 En este libro mostramos que el L-TRβ1 requiere del dominio N-terminal para activarse en presencia de T2 pero no de T3.6 Esta diferencia funcional ligando-específica sugiere que el L-TRβ1 adopta conformaciones distintas en función del ligando al cual se une. Más aún, la T2 podría modificar la superficie de unión a coactivadores permitiendo la unión de un conjunto distinto del que se une en pre-sencia de T3 o, posiblemente, aumentar la afinidad del L-TRβ1 por los coactivadores en una tendencia NTD-dependiente. En apoyo a estas posibilidades, existen varios estudios donde se ha determinado el rol funcional de la región NTD de los TR, tanto en la interacción con coactivadores y el DNA (TRE), así como con su activación en ausencia de ligando.10-13

La T2 también es activa en el TRβ1 en humanos

Los ensayos de transactivación y unión mostraron que la T2 interactúa con el TRβ1 de humano y que esta activación también depende de la región NTD del hTRβ1, lo cual sugiere que el mecanismo de acción de T2 se conserva en vertebrados.6 Sin embargo, la afinidad del hTRβ1 por T2 es menor, lo cual confirma reportes previos que concluyen que T2 es un agonista parcial de este receptor.14, 15 Al respecto, estudios clí- nicos recientes,16 utilizando el ácido diyodotiropropionico (DITPA), un análogo estructural de TH, con afinidad selectiva por el TRβ1,6, 17 su-

Discusión 71

gieren que dado su parecido estructural con T2, este tiromimético podría utilizarse en el tratamiento de individuos con deficiencia del transportador de T3 MCT8.

¿De dónde viene la T2?

El principal precursor de T2 es T3; sin embargo, aún no existe evidencia experimental directa que respalde esta afirmación. No obstante, la hi-pótesis de que T2 se genera a partir de la desyodación de T3 se basa en observaciones indirectas pero robustas. Se sabe que en los vertebrados, incluyendo a los teleósteos, las expresión y actividad de las desyodasas, enzimas que catalizan la activación o inactivación de las TH a nivel celu-lar, se regula tanto por sustrato como por producto.18 Así, estudios in vivo e in vitro han mostrado que la T2 modula la expresión y la actividad de la desyodasa tipo 2 (D2) en teleósteos,19, 20 y de la desyodasa tipo 1 (D1) en mamíferos.15 Ambas enzimas catalizan la remoción estéreo- específica del átomo de yodo del anillo externo de la T4 para producir T3 y por esa misma ruta D1 y D2 podrían catalizar la desyodación de T3 para producir T2. También se ha observado que la inhibición de la desyodación —ácido iopanoico: IOP— previene los efectos de la admi- nistración de T3 sobre el aumento en la tasa de consumo de oxígeno en ratas, lo cual sugiere que T2 es responsable de estos efectos.21 Recien- temente, en teleósteos22 y humanos,23 se ha mostrado que las concentraciones intramusculares o circulantes de T2 respectivamente son similares a las de T3. Así, T2 podría jugar un rol similar al de T3 en la modula-ción del eje hipotálamo-hipófisis-tiroides. Respecto a esto, recientemente se mostró que la administración crónica de T2 causa hipotiroidismo central al disminuir TSH en una tendencia similar a T3.24 Aquí mos-tramos que la T2 es tan eficiente como T3 para modular la expresión génica por medio de un TR en teleósteos lo cual indica que ambas, T3 y T2, ejercen efectos biológicos fundamentales para el funcionamiento normal del organismo.

Así, proponemos que los estudios subsecuentes deben estar encaminados a definir el rol funcional específico para cada TH, lo cual permitirá la aplicación de T2 o sus análogos estructurales como coadyu- vantes en el tratamiento de patologías asociadas al sistema tiroideo.

Conclusiones

Los hallazgos más importantes de este trabajo son los siguientes:

a) La T2 puede activar la expresión de genes por medio de un recep-tor de hormonas tiroideas en teleósteos.

b) El domino NTD del L-TRβ1 es necesario para la activación por T2, pero no por T3.

c) La T2 es un ligando para el L-TRβ1 en teleósteos.d) El mecanismo de acción de T2 está mediado por L-TRβ1 en te-

leósteos, posiblemente activando la transcripción de genes blan-co mediante la interacción con coactivadores distintos a los que se unen en presencia de T3.

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ReFeRencias de FiguRas

as figuras utilizadas para la realización de esta tesis están protegidas por Copyright, por lo cual sólo se muestran los pies de figura con referencia al artículo original con el fin de facilitar la búsqueda al lector que desee ampliar su comprensión del presente libro. De antema-no ofrezco una disculpa por cualquier inconveniente.

Figuras

1. Evolución de los receptores nucleares (NR): relación con la compleji-dad morfológica de los organismos. Se muestra el número de genes para NR y su rol propuesto en varios organismos representando las dife-rentes taxones. (F.M. Sladek, “What are Nuclear Receptor Ligands?”, Molecular and Cellular Endocrinology 334, 2011: 3-13. En <http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3010294/figure/F3/>).

2. Árbol filogenético de máxima probabilidad derivado de las secuen-cias de aminoácidos del DBD y LBD. La relación filogenética entre TR se examinó por el método de máxima probabilidad e interferencia bayesiana. (W. Wu, E.G. Niles y P.T. LoVerde, “Thyroid Hormone Re- ceptor Orthologues from Invertebrate Species with Emphasis on Schis-tosoma Mansoni”, BMC Evol Biol 7, 2007: 150. En <http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2045677/figure/F6/>).

3. Un modelo funcional dual de los TR en el desarrollo de la rana. Du-rante la embriogénesis, los genes TH-responsivos se expresan a niveles basales en ausencia de TH para facilitar el desarrollo de los órganos embrionarios. Después de la eclosión de renacuajos en la etapa 35/36, incrementa la expresión de TRα1, alcanzando sus niveles máximos por

la etapa 45 cuando los renacuajos empiezan a alimentarse. RXRα tam-bién se expresa en altas concentraciones en esta etapa, el heterodímero TR/RXR se unen a los genes TH-responsivos y reprimen su expresión debido a la falta de TH, así aseguran el crecimiento apropiado del re-nacuajo y previniendo la metamorfosis prematura. Cuando los niveles endógenos de TH se incrementan después de la etapa 55, los heterodí-meros activan los genes TH-responsivos, como el TRβ1 lo cual dirige hacia la metamorfosis. (B. Das et al., “Molecular and Genetic Studies Suggest that Thyroid Hormone Receptor is Both Necessary and Suffi-cient to Mediate the Developmental Effects of Thyroid Hormone”, Ge-neral and Comparative Endocrinology 168, 2010: 174-180. En <http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3426277/figure/F2/>).

4. Cambios en la expresión de los genes de TR durante el desarrollo de teleósteos. a) Thunnus orientalis; b) Paralichthys olivaceus TR genes; c) Con- ger japonicus. (Y. Kawakami, J. Nozaki, M. Seoka, H. Kumai y H. Ohta, “Characterization of Thyroid Hormones and Thyroid Hormone Recep-tors During the Early Development of Pacific Bluefin Tuna [Thunnus orientalis]”, General and Comparative Endocrinology 155, 2008: 597-606. En <http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0016648007 003437>).

5. Expresión de los transportadores de TH en las células del cerebro. En su camino del lumen microcapilar al núcleo celular diana, las moléculas de TH tienen que cruzar varias membranas; las membranas luminal y abluminal de las células endoteliales, la membrana del astrocito, y las membranas de las neuronas, oligodendrocitos y microglia. Los transpor-tadores pueden expresarse de forma diferencial en diferentes regiones del cerebro y núcleos individuales. (U. Schweizer y J. Kohrle, “Function of Thyroid Hormone Transporters in the Central Nervous System”, Biochim Biophys Acta 1830, 2013: 3965-3973. En < http://www.science direct.com/science/article/pii/S0304416512002206>).

6. Organización funcional y estructural de los TR. Los NTD, DBD, bisa-gra y LBD contribuyen diferencialmente a la función del receptor. Las funciones asociadas a dominios individuales se resumen en la tabla. No todas las funciones aplican a todos los TRs. Se ilustra la estructura de un NR unido al DNA. El DBD y el LBD están estructuralmente con-servados entre los NR mientras que el NTD y la bisagra carecen de conservación estructural ó secuencial. NLS; señal de localización nu-clear, NES; señal de exportación nuclear, AF; función de activación, PTM; modificación postraduccional. [PDB ID; 3dzy]. (M.M. Aagaard, R. Siersbæk y S. Mandrup, “Molecular Basis for Gene-Specific Trans-activation by Nuclear Receptors”, BBA-Molecular Basis of Disease 1812, 2011: 824-835. En < http://goo.gl/xh9fCr>).

Referencias de figuras 89

7. TRβ1 y TRβ2 tienen NTD divergentes pero son idénticos en el resto de los dominios. Panel A, esquema de los TRα1, TRβ1, TRβ2 de hu-mano. Se muestran los sitios de unión para coactivadores y correpreso-res. Panel B, alineación global de secuencias de los NTD de los TRβ1 y TRβ2. Dos puntos significan identidad de aminoácidos; un solo punto identifica substitución homologa de amino ácidos. EMBOSS Strether. (J.B. Hahm y M.L. Privalsky, “Research Resource: Identification of No-vel Coregulators Specific for Thyroid Hormone Receptor-2”, Molecular Endocrinology 27, 2013: 840-859. En <http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3634115/figure/F1/>).

8. Descripción del saco de unión al ligando en LBP en términos de resi-duos polares y no polares. A. Los residuos no polares, los cuales cons-tituyen principalmente LBP, se muestran en gris claro, mientras que los residuos polares se muestran en negro. B. Aspecto general de un agonista y sus interacciones con los residuos del LBP. La cabeza y cola polares del ligando y sus interacciones con algunos residuos polares in el LBP. El cuerpo de interacciones hidrofóbicas con un mayor numero de resi-duos no polares. (M.L. Privalsky et al., “The p160 Coactivator PAS-B Motif Stabilizes Nuclear Receptor Binding and Contributes to Isoform-Specific Regulation by Thyroid Hormone Receptors”, J Biol Chem 284, 2009: 19554-19563; y A.S. Araujo, L. Martínez, R. Paula Nicoluci, M.S. Skaf e I. Polikarpov, “Structural Modeling of High-Affinity Thyroid Re- ceptor-Ligand Complexes”, Eur Biophys J. 39, 2010: 1523-1536. En <http: //link.springer.com/article/10.1007%2Fs00249-010-0610-2>).

9. TRβ activa la transcripción a través de un TRE F2/IP6 al cual se une como homodímero. A. Resultado del análisis de transfección de célu-las U2-OS (células de osteosarcoma en humano), comparando las ac-ciones de ambas isoformas de TRs en diferentes TREs. B. El recuadro muestra un Western blot representativo de una membrana a la que se transfirieron extractos de proteínas nucleares de células transfectadas con cada TR y separadas por electroforesis en poliacrilamida usando un oligonucleótido con la secuencia de los distintos TRE. (J.D. Safer, “Defective Release of Corepressor by Hinge Mutants of the Thyroid Hormone Receptor Found in Patients with Resistance to Thyroid Hor-mone”, Journal of Biological Chemistry 273, 1998: 30175-30182; y L.F.R. Velasco et al., Thyroid Hormone Response Element Organization Dic-tates the Composition of Active Receptor”, J. Biol Chem 282, 2007: 12458-12466. En <http://www.jbc.org/cgi/pmidlookup?view=long& pmid=9804773> y <http://www.jbc.org/content/282/17/12458.long>).

10. Modelo esquemático de la regulación por TR mediante diferentes TRE. Los homodímeros de TR pueden unirse a diferentes arreglos del TRE: pa- líndroma invertido (F2 o IP6), palíndromas (PAL), y repetido directo

(DR4). Modelos de las posición de los DBD en interacción con el DNA. En F2 el DBD muestra una interface de dimerización diferente con las bisagras cruzadas. La interacción con DR4 muestra el mismo arreglo estructural en homodímeros TR/TR que en heterodímeros TR/RXR. (A.S. Araujo, L. Martínez, R. Paula Nicoluci, M.S. Skaf e I. Polikarpov, “Structural Modeling of High-Affinity Thyroid Receptor-Ligand Com-plexes”, Eur Biophys J. 39, 2010: 1523-1536; y A.C.M. Figueira et al., “Recognition by the Thyroid Hormone Receptor of Canonical DNA Res-ponse Elements”, Biochemistry 49, 2010: 893-904. En < http://www.jbc. org/content/282/17/12458.long> y <http://pubs.acs.org/doi/abs/ 10.1021/bi901282s/>).

11. Modelo de los pasos múltiples en la regulación transcripcional depen-diente de T3. En ausencia de T3, los heterodímeros TR/RXR están constitutivamente unidos a los TRE en asociación con correpresores co-mo NCoR/SMRT y desacetilasas de histonas (HDACs), lo cual genera una cromatina condensada y el silenciamiento de genes. En presencia de T3, NCoR/SMRT y HDACs se disocian y los coactivadores p160/SRC son reclutados en asociación con acetilasas de histonas (HATS, como CBP/p300) y metil transferasas (HMTs; CARM1/PRMT1) que modifican las histonas en el promotor. Este paso puede incluir el reclutamiento de los complejos remodeladores de la cromatina dependientes de ATP como SWI/SNF. En un paso temporalmente subsecuente, p160/SRC se disocia y TR/RXR recluta al mediador que forma una interface con el aparato basal de la transcripción Pol II para generar un complejo de preiniciación (PIC) funcional. El ensamblaje del PIC va seguido de la iniciación de la transcripción por Pol II. El mediador recluta al factor de elongación de la transcripción positivo b (P-TEFb) y/u otros comple-jos de súper elongación (SECs) que facilitan la liberación de la Poll II iniciada del estado pausado en un complejo de elongación produc-tivo. Seguido, Pol II escapa del PIC, RXR/TR-Med1 y otras subunida-des del mediador permanecen unidas al promotor y sirven como un complejo de reciclaje para volver al TR unido al promotor al estado de reiniciación. (L.F.R. Velasco et al., “Thyroid Hormone Response Element Organization Dictates the Composition of Active Receptor”, J. Biol Chem 282, 2007: 12458–12466; y J.D. Fondell, “The Mediator Complex in Thyroid Hormone Receptor Action”, BBA-General Subjects 1830, 2013: 3867-3875. En <http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/bi 901282s> y <http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S030 441651200044X>).

12. Efecto de las yodotironinas (T; 1 pM) sobre el consumo de O2 de híga-dos perfundidos aislados de ratas hipotiroideas en ausencia o presen-

Referencias de figuras 91

cia de propil-tiouracilo (PTU; 1 microM). Los datos son diferencia del consumo de O2 sobre los controles (n=7); el consumo a 0 min fue 1.9 microM/min por g (n=3, media + error estándar). Circulo: T2; Cua-dro: T3; Triangulo: T4. *P<0.001 vs T3, T4 y controles. *p <0.001 versus perfusión sin PTU. (Y. Liu, “Thyroid Hormone-Regulated Target Genes Have Distinct Patterns of Coactivator Recruitment and Histone Acetylation”, Molecular Endocrinology 20, 2005: 483-490; y C. Horst, H. Rokos y H.J. Seitz, “Rapid Stimulation of Hepatic Oxygen Consumption by 3,5-di-iodo-L-Thyronine”, Biochem. J. 261, 1989: 945-950. En <http: //goo.gl/eW9QtM> y <http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1138920/?page=1>).

13. Cambios en el metabolismo basal de ratas hipotiroideas [propil- tiouracilo (P) + acido iopanoico (I)] y eutiroideas (N) después de la ad-ministración de T4, T3 y T2, con o sin administración simultanea de actinomicina D. (R.S. Savkur, y T.P. Burris, “The Coactivator LXXLL Nuclear Receptor Recognition Motif”, J. Pept. Res. 63, 2004: 207-212; y M. Moreno et al., “Are the Effects of T3 on Resting Metabolic Rate in Euthyroid Rats Entirely Caused by T3 Itself?”, Endocrinology 143, 2002: 504-510. En <http://goo.gl/xPBOuC> y <http://goo.gl/9BKxyT>).

14. Niveles de mRNA de IGF1 y D2 en el hígado de tilapia después del tratamiento con distintas THs o MMI. Las tilapias fueron expuestas a 1 nM T3, T2, o rT3 por 30 días. El control negativo se expuso a 4.5 mM metimazol (MMI) . Los valores corresponden a la media + S.E.M. La signifi-cancia indica (*P<0.05 y **P<0.001). (P. Navarrete-Ramirez, M. Luna, C. Valverde y A. Orozco, “3,5-Di-Iodothyronine Stimulates Tilapia Growth Through an Alternate Isoform of Thyroid Hormone Receptor 1”, Jour-nal of Molecular Endocrinology 52, 2013: 1-9. En < http://jme.endocrino logy-journals.org/cgi/pmidlookup?view=long&pmid=24031088>).

15. EMSA representativos de los extractos nucleares de hígados de F. heteroclitus tratados con metimazol (4.5 mM) y reemplazados con dosis de 30 nM T3 o T2. Los TRE PAL o DR4 fueron radiomarcados con 32P. El análisis densitometrico muestra la banda B superior e inferior C. (n=3 ensayos distintos de experimentos distintos). (J.M.R. Moore y R.K. Guy, “Coregulator Interactions with the Thyroid Hormone Receptor”, Mol. Cell Proteomics 4, 2005: 475-482; y C. García, L. López-Bojorquez, J. Nunez, C. Valverde y A. Orozco, “3,5-Diiodothyronine In Vivo Main-tains Euthyroidal Expression of Type 2 Iodothyronine Deiodinase, Growth Hormone, and Thyroid Hormone Receptor Beta1 in the Ki-llifish”, Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 293, 2007: R877-R883. En <http://ajpregu.physiology.org/cgi/pmidlookup?view=long&pmid =17522123>).

Estudios fisiológicos y moleculares para dilucidar la función de las hormonas tiroideas.El mecanismo de acción de la 3,5-diyodotironina (T2) en teleósteos.

—editado por la Coordinación de Estudios de Posgradoy el Programa de Doctorado en Ciencias Biomédicasde la Universidad Nacional Autónoma de México—se terminó de imprimir el 28 de septiembre de 2015

en Editores e Impresores FOC, S.A. de C.V., con domicilio enLos Reyes núm. 26, Col. Jardines de Churubusco, México, D.F.

La edición consta de 200 ejemplaresen offset sobre papel cultural de 75 gr.

Forro impreso a 4 tintas sobre cartulina couché de 250 gr.

Edición compuesta en Goudy Old Style 11/13

El cuidado de la edición y coordinación editorial estuvo a cargo deLic. Lorena Vázquez Rojas

Diseño y formación: Julio Gustavo Jasso LoperenaDiseño de portada: D.G. Citlali Bazán Lechuga

Imagen de portada:Diego Rivera, Guerrero indio, 1931.

Fresco sobre cemento reforzado en estructura metálica,104.14 5 133.35 cm.

Smith College Museum of Art, Northampton, Massachusetts.Adquirido con el Winthrop Hillyer Fund, SC 1934: 8-1.

Av. 5 de Mayo núm 2, Col. Centro, Del. Cuauhtémoc, 06059México, D.F.

Reproducción autorizada porel Instituto Nacional de Bellas Artes y Literatura, 2015

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