Evaluación de un nuevo sistema de detección

Evaluación de un nuevo sistema de

detección inmunohistoquímica aplicado

al diagnóstico de la patología linfoide

Sergio Serrano Hospital del Mar-IMIM UAB

• Información clínica

• Información histológica

• Información inmunohistoquímica

• Información molecular y citogenética

• Recapitulación y diagnóstico

Diagnóstico en patología linfoide

CCND1 CD38

++ ++

Técnicas moleculares

Histología: H/E

Inmunohistoquímica

Citogenética

Información clínica

Diagnóstico Pronóstico Predicción

+++

+++

++

++

+++

+

+++

+++

++

+++

+

Inmunohistoquímica

• Técnica

• Interpretación

Inmunohistoquímica: Técnica

• Fijación

• Recuperación antigénica

• Reacción antígeno-anticuerpo primario

• Detección de la reacción

Inmunohistoquímica: Técnica

• Fijación

• Recuperación antigénica

• Reacción antígeno-anticuerpo primario

• Detección de la reacción

1966 Anticuerpos conjugados a peroxidasa

1979 Métodos avidina-biotina-peroxidasa

1993 Polímeros conjugados con Ac. y peroxidasa

Ac. primario

H2O2

DAB 1966

O2

PR Peroxidasa

Ac. primario

B

1979

Biotina

Ac. primario

B A

1979

Avidina

Ac. primario

PR

PR

PR

B

B

B

B

A

1979

H2O2

DAB

O2

Dextrano

H2O2

DAB

Ac. primarios

1993

O2

Ac. secundarios

Ac. primario

PR

PR

PR PR

PR

PR

H2O2

DAB

Dextrano

O2

Ac. primario

PR

PR

PR

PR

PR

PR

PR

PR

PR

PR

PR

Ac. secundario

Ac. Terciarios

H2O2

DAB Dextrano

O2

CD10

HQ

HQ

HQ

HQ

HQ

HQ

PR

PR

PR

PR

PR

PR

PR

PR

PR

PR

PR

PR

H2O2

DAB

Ac. primario

Ac. sec. conjugado con HQ

Ac. ter. conjugado con PR

2011

O2

HQ

HQ

HQ

HQ

HQ

HQ

HQ

HQ

HQ

HQ

HQ

HQ

HQ

HQ

HQ

HQ

HQ

HQ

IgG Cabra anti Conejo

IgG Cabra anti Ratón

IgM Cabra anti Ratón

HQ

HQ

HQ

HQ

HQ

HQ

PR

PR

PR

PR

PR

PR

PR

PR

PR

PR

PR

PR

H2O2

DAB

Ac. primario

Ac. sec. conjugado con HQ

Ac. ter. conjugado con PR

2011

O2

Hapteno es una molécula de pequeño peso molecular que solo es inmunógena cuando se une a una molécula transportadora de gran tamaño como una proteina

3-hidroxi-2-quinoxalincarbamida

(Hidroxiquinoxalina)

PM: 175 O

NH2 N

N OH .

.

.

.

. .

.

.

.

Haptenos

•Los de origen sintético como la hidroxiquinoxalina no se detectan en mamíferos

•Los Ac. dirigidos contra ellos no han de proceder de una especie diferente de la del Ac. marcado

•La conjugación a un Ac. apenas reduce la actividad de este último.

•Una molécula de Ig. puede conjugarse a múltiples haptenos

•Conjugados a la tiramida permiten amplificar la señal con poca tinción de fondo

Ac. primario

PR

PR

PR

PR

PR

PR

PR

PR

PR

PR

Ac. secundario

Ac. terciarios

H2O2

DAB

HQ

HQ

HQ

HQ

HQ

HQ

PR

PR

PR

PR

PR

PR

PR

PR

PR

PR

PR

PR

Ac. primario

Ac. sec. conjugado con HQ

Ac. ter. conjugado con PR PR

Dextrano

O2

H2O2

DAB

O2

1 amígdala y 12 linfomas

21 antígenos

2 sistemas de detección:

273 secciones

273 secciones

1 amígdala y 12 linfomas

21 anticuerpos

2 sistemas de detección:

273 secciones

273 secciones

PAX5, CD79a, CD19, CD20, CD23, CD10, BCL6,

OCT2, MUM1, CD138

CD7, CD5, CD3, CD4, CD8, CD56

CD45RB, CD15, CD30, BCL2, Ciclina D1

Antígenos estudiados

La expresión de cada antígeno se estudió el mismo día con ambos métodos y en secciones histológicas que se habían realizado de manera simultánea

La valoración fue efectuada por dos observadores

Se valoraron parámetros cuantitativos y cualitativos

Evaluación cuantitativa

• Intensidad de la señal Intensa: +3

Moderada: .+2

Débil: +1

Muy débil: +0.5

Negativa: +0

Evaluación cualitativa

• Calidad de la señal

Bien definida: .+1

Granular o grumosa: ..-1

• Tinción de fondo

Debil: …-0.5

Intensa: .-1

• Reacción cruzada: .-1

Detección basada en polímeros

Gana: .3/13 casos

Empata: ..2/13 casos

Pierde: 8/13 casos

Detección basada en haptenos (OptiView®)

Gana: 8/13 casos

Empata: 2/13 casos

Pierde: 3/13 casos

Resultados de la evaluación cuantitativa

Detección basada en polímeros

Gana: .0/13 casos

Empata: ..0/13 casos

Pierde: 13/13 casos

Detección basada en haptenos (OptiView®)

Gana: 13/13 casos

Empata: 0/13 casos

Pierde: 0/13 casos

Resultados de la evaluación cualitativa

CD30: Polímero CD30: Optiview®

MUM1: Polímero MUM1: Optiview®

BCL6 : Polímero BCL6 : Optiview®

CD5 Polímero CD5: Optiview®

CD5 Polímero CD5: Optiview®

Haptenos

•Los de origen sintético como la hidroxiquinoxalina no se detectan en mamíferos

•Los Ac. dirigidos contra ellos no han de proceder de una especie diferente de la del Ac. marcado

•La conjugación a un Ac. apenas reduce la actividad de este último.

•Una molecula de Ig. puede conjugarse a múltiples haptenos

•Conjugados a la tiramida permiten amplificar la señal con poca tinción de fondo

R

Tiramida

PM:164

HO

N

O

.

.

.

.

.

.

.

.

Mod Pathol 2003;16(2):161-165

Tiramida-Hidroxiquinoxalina (OptiView®)

HO

N

O

.

.

.

O

NH2 N

N OH .

.

.

.

.

.

.

.

.

. . .

OH

N

O

HO

+

Peroxidasa

OH Proteina Cadenas laterales de tirosina

Proteina

H2O2

O2

N

O

HO Tiramida Hidroxiquinoxalina

Hidroxiquinoxalina

HQ

HQ

HQ

HQ

HQ

HQ

HQ

HQ

HQ

HQ

HQ

HQ

HQ

HQ

HQ

HQ

HQ

HQ

HQ

TM

HQ

TM HQ

TM

HQ

TM

H2O2

H2O2

H2O2

H2O2

HQ

HQ

HQ

HQ

HQ

HQ

H2O2

H2O2 H2O2

HQ

HQ

HQ

HQ

HQ

HQ

DAB

H2O2 O2

MALD1 MCL

0

20

40

60

80

100

CD38

MALD1 MCL

0

20

40

60

80

100

CD38

% C

D3

8

po

sit

ive

ce

lls

MALD1 MCL

0,00

0,50

1,00

1,50

2,00

2,50

MALD1 MCL

0,00

0,50

1,00

1,50

2,00

2,50

CD

38

mR

NA

ex

pre

ss

ion

CD38 expression in MCL

CD38 CD38