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Evaluación del proceso de reparación en heridas de
mucosa oral de conejos injertadas con tejido
conjuntivo artificial autólogo elaborado con soportes
de colágeno unidireccionales y multidireccionales
Andrea del Pilar Escalante Herrera
Universidad Nacional de Colombia
Facultad de Ciencias, Microbiología
Bogotá, Colombia
2013
Evaluación del proceso de reparación en heridas de
mucosa oral de conejos injertadas con tejido
conjuntivo artificial autólogo elaborado con soportes
de colágeno unidireccionales y multidireccionales
Andrea del Pilar Escalante Herrera
Tesis presentada como requisito parcial para optar al título de:
Magister en Ciencias - Microbiología
Directora:
Q. F. Ph.D. Marta Raquel Fontanilla Duque
Línea de Investigación:
Biología Celular
Grupo de Investigación:
Grupo de Trabajo en Ingeniería de Tejidos
Universidad Nacional de Colombia
Facultad de Ciencias, Maestría en Microbiología
Bogotá D.C., Colombia
2013
Agradecimientos
A Dios, mis padres, mis tíos, mi nonita, mi hermana, Jorge, Alejandra y Fabio por su
apoyo incondicional y paciencia desde antes de empezar esta aventura.
A la profe Marta por su guía, apoyo, energía, comprensión y por proveer los medios para
llevar a cabo el trabajo.
A todos los integrantes del Grupo de trabajo en Ingeniería de Tejidos por su colaboración
en cada paso: Lady, Edward, Diana M., Diana N., Rosa, Ronald, José Manuel, Sergio,
Ana Milena, María Elisa, Adriana, Leonardo, Ronald, Bryan, Hector, Don Rafa.
A todos aquellos que se involucraron de una u otra forma brindándome su mano: Itali,
Irene, Jimena, Daniel, Elizabeth, Alejandro, Jenny, Maira, Juan Manuel, Profe María
Teresa, Claudia Parra, Keile, Natalia, Lorena, Anjeli.
A Socorrito porque sin ella uno se perdería en el camino.
A Manuel por su asesoría y largas horas dedicadas a la lectura de biopsias.
Al Bioterio Central de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia a cargo del
profesor Jesús Cortes y muy especialmente a Arturo y sus muchahos, por la inmensa
colaboración.
Al instituto de Biotecnología y a Mauricio por su colaboración con el liofilizador.
Al programa de becas Asistente Docente de la Universidad Nacional de Colombia y a la
Facultad de Odontología.
Al laboratorio equipos comunes de la Facultad de Medicina, por el préstamo de equipos
utilizados para la elaboración de este trabajo.
A la Profesora Constanza Quintero por la asesoría en estadística.
Resumen
Los defectos de mucosa oral son tratados con autoinjertos que generan alta morbilidad
en el sitio donante. Una alternativa de tratamiento es la elaboración de tejidos artificiales,
que podría ayudar a superar algunas restricciones de los tratamientos convencionales. El
objetivo de este trabajo fue evaluar clínica e histomorfométricamente el proceso de
reparación en heridas de mucosa oral injertadas con tejido conjuntivo artificial autólogo
(TCAA) elaborado con soportes de colágeno unidireccionales y multidireccionales, en un
modelo lagomorfo de heridas de espesor parcial en mucosa oral. Con los animales fuente
de los fibroblastos se hicieron tres grupos de estudio, cada uno con 12 conejos. En cada
animal se hicieron dos heridas contralaterales de espesor parcial sobre la zona vestibular
de la mucosa oral. En dos grupos aleatoriamente cada una de las heridas fue injertada
con TCAA elaborado con soportes unidireccionales (TCAA-unidireccional) o
multidireccionales (TCAA-multidireccional) o dejada cerrar por segunda intención. En el
tercer grupo una de las heridas fue injertada con TCAA-unidireccional y la opuesta con
TCAA-multidireccional. Durante el tiempo postquirúrgico se realizaron evaluaciones
clínicas, luego se tomaron biopsias de las heridas donde se analizó
histomorfométricamente teniendo en cuenta el grosor del epitelio y del tejido conjuntivo,
la intensidad de la inflamación y la vascularización. Los datos obtenidos indican que las
heridas tratadas con TCAA elaborado con soportes con fibras orientadas unidireccional o
multidireccionalmente, muestran características histomorfométricas diferentes a las de
las heridas cerradas por segunda intención (Control). Igualmente, que hay diferencias
histológicas y clínicas en las heridas injertadas con tejido unidireccional o
multidireccional, que muestran mayor contracción en las primeras que en estas últimas.
Palabras clave: Tejido conjuntivo artificial autólogo, colágeno unidireccional,
colágeno multidireccional, tejidos artificiales.
Evaluation of the repair process in wounds grafted oral mucosa of rabbits with autologous artificial connective tissue made from collagen scaffolds
unidirectional and multidirectional
Abstract
Oral mucosa defects treated with autograft that generate high morbidity at the donor site.
An alternative treatment is the development of artificial tissues, which could help to
overcome some restrictions of conventional treatments. The aim of this study was to
evaluate clinical and histomorphometrically the repair process in oral mucosal wounds
grafted with autologous artificial connective tissue (AACT) prepared with supports
unidirectional and multidirectional collagen in a lagomorph model partial thickness
wounds in oral mucosa. With the source of fibroblasts animals three study groups, each
with 12 rabbits were made. Were made In each animal two contralateral partial thickness
wounds on the vestibular area of the oral mucosa. Randomly into two groups each wound
was grafted with AACT made with unidirectional media (AACT-way) or multi (multi- AACT)
or left to close by secondary intention. In the third group of the wound was grafted with
AACT- way and the opposite with AACT -multidirectional . During postoperative period the
clinical evaluations were performed, then wound biopsies where histomorphometrically
analyzed considering the thickness of the epithelium and connective tissue, the intensity
of inflammation and vascularization were taken. The data indicate that wounds treated
with AACT prepared with supports unidirectional or multidirectionally oriented fibers show
different histomorphometric characteristics than wounds closed by secondary intention
(Control). Similarly, there is histological and clinical differences in wounds grafted with
unidirectional or multidirectional tissue, showing greater contraction in the former than in
the latter.
Keywords: Autologous Artificial Connective Tissue, Collagen unidirectional,
Collagen multidirectional, Artificial tissues.
Contenido
Resumen…………………………………………………………………………………………
Lista de Figuras…………………………………………………………………………………
Lista de Tablas…………………………………………………………………………………..
Lista de símbolos y abreviaturas…………………………………………………………….
Introducción…………………………………..…………………………………………………..1
1. Marco teórico …………………...………………………………………….…….3
1.1 Mucosa Oral ............................................................................................................ 3
1.1.1 Características clínicas de la mucosa oral.......................................................... 3
1.1.2 Características histológicas de la mucosa oral ................................................... 3
1.2 Reparación de heridas ............................................................................................ 5
1.2.1 Proceso de reparación de heridas ...................................................................... 5
1.2.2 Tipos de cicatrización .......................................................................................... 6
1.2.3 Migración celular en la reparación de heridas .................................................... 7
1.3 Tratamientos de defectos en mucosa oral e ingeniería de tejidos......................... 8
1.4 Soportes y microestructura en ingeniería de tejidos .............................................. 8
1.4.1 Células ............................................................................................................... 11
1.4.2 Reguladores ...................................................................................................... 11
2. Formulación del problema ........................................................................................ 12
3. Hipótesis ...................................................................................................................... 14
4. Objetivos ..................................................................................................................... 15
4.1. Objetivo general ........................................................................................................ 15
4.2. Objetivos específicos ............................................................................................ 15
5. Metodología ................................................................................................................. 16
5.1 Diseño experimental ............................................................................................. 16
5.2 Consideraciones éticas ......................................................................................... 17
5.3 Análisis estadístico ................................................................................................ 17
5.3.1 Definición de variables ...................................................................................... 17
5.4 Elaboración de soportes de colágeno tipo I (SC) y tejido conjuntivo artificial
autólogo (TCAA)............................................................................................................... 18
5.4.1 Elaboración de soportes de colágeno. .............................................................. 18
5.4.2 Aislamiento y cultivo de fibroblastos..................................................................18
5.4.3 Elaboración de tejido conjuntivo artificial autólogo ...........................................19
5.4.4 Evaluación de la reparación de heridas mucosas de espesor parcial..............20
5.4.5 Manejo y cuidado postoperatorio de los conejos ..............................................21
5.4.6 Evaluación clínica de las heridas tratadas ........................................................21
5.4.7 Evaluación histomorfométrica de las heridas tratadas .....................................21
6. Resultados ...................................................................................................................24
6.1 Objetivo específico No. 1: Construir y caracterizar histológicamente TCAA a
partir de fibroblastos y soportes de colágeno unidireccionales y multidireccionales. .... 24
6.1.1 Características morfológicas e histológicas del TCAA .....................................24
6.1.2 Viabilidad celular del TCAA con MTT ................................................................25
6.1.3 Evaluación del TCAA con microscopía confocal...............................................26
6.2 Objetivo específico No. 2: Comparar el cierre de heridas mucosas de espesor
parcial injertadas con tejido conjuntivo artificial autólogo elaborado con soportes de
colágeno unidireccional y multidireccional. ..................................................................... 27
6.2.1 Seguimiento clínico de los tratamientos ............................................................27
6.2.2 Evaluación histológica .......................................................................................48
6.2.3 Análisis histomorfológico del grosor del epitelio, conjuntivo, inflamación y
formación de nuevos vasos sanguíneos ......................................................................52
6.2.3.1 Número de capas del epitelio: ....................................................................52
6.2.3.2 Grosor del tejido conjuntivo: .......................................................................54
6.2.3.3 Inflamación..................................................................................................55
6.2.3.4 Número de vasos sanguíneos....................................................................56
7. Discusión .....................................................................................................................57
8. Conclusiones...............................................................................................................63
9. Recomendaciones ......................................................................................................64
Bibliografía
Lista de Figuras
Figura 1. Histología de la mucosa oral. Principales tejidos de la mucosa oral.
Fotografía original, Grupo de Trabajo en Ingeniería de Tejidos, Universidad Nacional de
Colombia.
Figura 2. Método de análisis de biopsias. A: Disposición de las biopsias en la lámina.
B: Magnificación del corte a evaluar, el cual es dividido en 5 porciones donde II, III y IV es
la zona tratada, I y V son las zonas adyacentes a la zona tratada.
Figura 3. Análisis histológico de TCAA elaborado con soportes de colágeno
unidireccionales y multidireccionales. TCAA-unidireccional (Panel A); imagen con
mayor resolución de la región del TCAA-unidireccional, enmarcada dentro del recuadro
(Panel B). TCAA-multidireccional (Panel C); imagen con mayor resolución de la región
del TCAA-multidireccional, enmarcada dentro del recuadro (Panel D). Convenciones
usadas: Fibras de colágeno del soporte (FCS); fibras de colágeno sintetizadas por los
fibroblastos (FCF); matriz extracelular (MEC) secretada por las células.
Figura 4. Tinción con MTT de TCAA elaborado con soportes unidireccionales o
multidireccionales. Imagen de corte de TCAA-unidireccional; las flechas señalan células
viables aparentemente orientadas en la misma dirección de las fibras unidireccionales
(Panel A). Imagen de corte de tejido multidireccional; las flechas señalan células viables
orientadas en múltiples direcciones (Panel B).
Figura 5. Microscopía confocal de TCAA. La figura presenta imágenes de microscopia
confocal de TCAA elaborado con soportes unidireccionales (Panel A) y TCAA elaborado
con soportes multidireccionales (Panel B).
Figura 6. Progresión temporal del proceso de reparación de heridas injertadas con
TCAA-unidireccional y de control. Apariencia de la herida control y de la herida
injertada al día 0 (Paneles A y B, respectivamente), día 7 (Paneles C y D) y día 14
(Paneles E y F). Las flechas señalan los bordes de la herida control (b) y la zona
injertada (zi) en el día 14.
Figura 7. Progresión temporal del proceso de reparación de heridas injertadas con
TCAA-unidireccional y de control. Apariencia de la herida control y de la herida
injertada al día 0 (Paneles A y B, respectivamente), día 7 (Paneles C y D) y día 14
(Paneles E y F). Las flechas muestran los bordes de la herida control (b) y la zona
injertada (zi) en el día 14.
Figura 8. Progresión temporal del proceso de reparación de heridas injertadas con
TCAA-multidireccional y TCAA-unidireccional. Apariencia de las heridas injertadas
con soporte multidireccional y unidireccional en el día 0 (Paneles A y B,
respectivamente), día 7 (Paneles C y D) y día 14 (Paneles E y F). La flecha en el Panel
E, muestra la continuidad de la zona injertada con la adyacente. La flecha en el Panel F,
señala los bordes elevados en la zona injertada con el soporte unidireccional.
Figura 9. Apariencia histológica de heridas cerradas por segunda intención
(Control) y de heridas injertadas con TCAA-unidireccional, tinción con H&E. El
Panel A, muestra la histología de la herida control. En el Panel B, se observa la imagen
histológica de la herida injertada con TCAA-unidireccional. Convenciones usadas:
músculo (M), borde de la herida (BH), células inflamatorias (CI), crestas interpapilares
(CIN), epitelio (EP), glándulas salivales (GM), hiperplasia pseudoepiteliomatosa (HP),
vasos sanguíneos (VS). Escala: 126μm.
Figura 10. Apariencia histológica de heridas cerradas por segunda intención
(Control) y de heridas injertadas con TCAA-multidireccional, tinción con H&E. El
Panel A, muestra la histología de la herida control. En el Panel B, se observa la imagen
histológica de la herida injertada con TCAA-unidireccional. Convenciones usadas:
músculo (M), borde de la herida (BH), células inflamatorias (CI), crestas interpapilares
(CIN), epitelio (EP), glándulas salivales (GM), hiperplasia pseudoepiteliomatosa (HP),
vasos sanguíneos (VS). Escala: 126μm.
Figura 11. Apariencia histológica de heridas injertadas con TCAA-unidireccional o
con TCAA-multidireccional, tinción con H&E. Herida injertada con TCAA-
unidireccional (Panel A); herida injertada con TCAA-multidireccional (Panel B).
Convenciones usadas: músculo (M), borde de la herida (BH), células inflamatorias (CI),
crestas interpapilares (CIN), epitelio (EP), glándulas salivales (GM), hiperplasia
pseudoepiteliomatosa (HP), vasos sanguíneos (VS). Escala: 126μm.
Figura 12. Promedios de porcentaje de recuperación del número de capas del
epitelio formado a las dos semanas. En el Panel A, se observan los resultados del
porcentaje de recuperación del grupo de animales en los que una herida se injertó con
TCAA-unidireccional y la contralateral se dejó cerrar por segunda intención. El Panel B,
presenta los datos obtenidos en el grupo en el que una herida se injertó con TCAA-
multidireccional y la contralateral se dejó cerrar por segunda intención. El Panel C,
muestra el análisis de los datos provenientes del grupo en el que las heridas de un lado
fueron tratadas con TCAA-multidireccional y las contralaterales con TCAA-unidireccional.
Figura 13. Promedios porcentaje de recuperación de del grosor del tejido
conjuntivo formado a las dos semanas. En el Panel A, se observan los resultados del
grupo de animales en los que una herida se injertó con TCAA-unidireccional y la
contralateral se dejó cerrar por segunda intención. El Panel B, presenta los datos
obtenidos en el grupo en el que una herida se injertó con TCAA-multidireccional y la
contralateral se dejó cerrar por segunda intención. El Panel C, muestra el análisis de los
datos provenientes del grupo en el que las heridas de un lado fueron tratadas con TCAA-
multidireccional y las contralaterales con TCAA-unidireccional.
Figura 14. Grado de inflamación en la zona de herida. En el Panel A, se observan los
resultados del grupo de animales en los que una herida se injertó con TCAA-
unidireccional y la contralateral se dejó cerrar por segunda intención. El Panel B,
presenta los datos obtenidos en el grupo en el que una herida se injertó con TCAA-
multidireccional y la contralateral se dejó cerrar por segunda intención. El Panel C,
muestra el análisis de los datos provenientes del grupo en el que las heridas de un lado
fueron tratadas con TCAA-multidireccional y las contralaterales con TCAA-unidireccional.
Figura 15. Análisis de la formación de vasos sanguíneos. En el Panel A, se observan
los resultados del grupo de animales en los que una herida se injertó con TCAA-
unidireccional y la contralateral se dejó cerrar por segunda intención. El Panel B,
presenta los datos obtenidos en el grupo en el que una herida se injertó con TCAA-
multidireccional y la contralateral se dejó cerrar por segunda intención. El Panel C,
muestra el análisis de los datos provenientes del grupo en el que las heridas de un lado
fueron tratadas con TCAA-multidireccional y las contralaterales con TCAA-unidireccional.
Lista de tablas
Tabla 1. Materiales empleados para la elaboración de soportes para uso en
ingeniería de tejidos.
Tabla 2.Variables de respuesta analizadas en el ensayo preclínico.
Tabla 3. Procedimientos llevados a cabo en cada tratamiento.
Tabla 4. Escala de evaluación del grado de inflamación.
Lista de símbolos y abreviaturas
% Porcentaje
± Más o menos
® Marca registrada
°C Grados centígrados
AVMA American Veterinary Medical Association
BH Borde de la herida
BSA Albúmina sérica bovina
CIN Crestas interpapilares
cm Centímetro
cm2 Centímetro cuadrado
CO2 Dióxido de carbono
DAPI Dilactato 4´, 6-diamidino-2-fenilindol
DMEM (Dulbecco's modified Eagle's médium) Medio de Eagle’s modificado por
Dulbecco’s
DS Desviación estándar
EDTA Ácido etilendiaminotetra-acético
EGF (Epidermal Growth factor) Factor de crecimiento epidermal
ENSAB Estudio Nacional de Salud Bucal
EP Epitelio plano
etc Etcétera
F Fibroblasto
FC Fibra de colágeno
FCN Fibras de colágeno nuevas
FGF Factor de crecimiento de fibroblastos
FITC (Fluorescein isothiocyanate) Isotiocianato de fluoresceína
FSC Fibras del soporte de colágeno
g Gramos
HR Herida reparada
IGF (Insuline Growth Factor) Factor de crecimiento parecido a la Insulina
IL Interleuquina
IFN- Interferón gama
KFG (Keratinocyte Growth Factor) Factor de crecimiento de queratinocitos
kg Kilogramo
M Molar
MEC Matriz extracelular
MEM Medio esencial mínimo
min Minutos
mg Miligramo
mL Mililitro
mm Milímetro
MMP (Matrix metalloproteinase) Metaloproteinasa de matriz
MTT 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il) 2,5 difenil bromuro de tetrazolium
n Número de individuos de un subconjunto de la población.
N Número total de individuos de la población.
NADH Nicotinamida adenina dinucleótido deshidrogenasa
NaOH Hidróxido de sodio
nm Nanómetro
P Paraqueratosis
PBS (Phosphate buffered saline) Buffer salino de fosfatos
PDGF (Platelet-derived growth factor) Factor de crecimiento derivado de
plaquetas
pH Potencial de hidrógeno
SC Soporte de colágeno tipo I
SDS-PAGE Electroforesis en gel de poliacrilamida dodecilsulfato de sodio
SFB Suero fetal bovino
TCAA Tejido conjuntivo artificial autólogo
TGF (Transforming Growth Factor-beta) Factor de crecimiento transformante -
beta
TM (Trademark) Marca registrada
TNF- α (Tumor necrosis factor alpha) Factor de necrosis tumoral - alfa
U Unidades
VEGF (Vascular Endotelial Growth Factor) Factor de crecimiento endotelial
vascular
VS Vaso sanguíneo
vs Versus
α Alfa
β Beta
γ Gama
μg Microgramo
μL Microlitro
μm Micrómetro
Introducción
Los defectos de mucosa oral tienen gran prevalencia a nivel mundial; múltiples eventos
llegan a causar este tipo de defectos como alteraciones genéticas entre ellas labio y
paladar hendido, posiciones aberrantes de músculos como frenillos o adquiridos como
pérdida de dientes o ausencia de encía. En todos estos casos el tratamiento
convencional es el de autoinjertos, que son tomados de mucosa oral propia; esto
presenta limitaciones, como son: la extensión que pueden llegar a tener las heridas y la
morbilidad que se genera en el sitio donante. Una alternativa es la elaboración de tejidos
artificiales, que podría ayudar a superar algunas restricciones de los tratamientos
convencionales.
En trabajos previos, el Grupo de Trabajo en Ingeniería de Tejidos estandarizó un método
para elaborar soportes de colágeno (SC) tipo I. A partir de estos soportes con fibroblastos
aislados de mucosa oral de conejos, se desarrolló tejido conjuntivo oral artificial autólogo
(TCAA). Los sustitutos de tejido desarrollados fueron evaluados como injertos en heridas
de espesor parcial de mucosa oral de los conejos fuente de los fibroblastos, donde el
tejido artificial se integró y no produjo rechazo ayudando así al proceso de reparación de
heridas (Espinosa, et al., 2010; Fontanilla, et al., 2012).
La influencia de la microestructura de soportes tridimensionales en la formación in vitro
de tejidos y en la calidad del tejido formado, ha sido explorada (Madaghiele, et al., 2007).
La microestructura está definida por la porosidad, el tamaño de poro, la interconectividad
y la orientación de las fibras del soporte Este último parámetro tiene consecuencias
directas en el tipo de tejido artificial que se forma al sembrar fibroblastos. Con el ánimo
de determinar el efecto que tiene la orientación de las fibras del SC en la cicatrización, el
grupo desarrolló soportes de colágeno laminares con las fibras orientadas
unidireccionalmente (Suesca, 2013). En el mismo trabajo, se sembraron células sobre
soportes unidireccionales y multidireccionales y se comparó la orientación adquirida por
estas al crecer y formar nuevo tejido.
Para completar los estudios hechos in vitro, en esta tesis se comparó la cicatrización de
heridas tratadas con TCAA elaborado con soportes multidireccionales con la observada
en heridas contralaterales tratadas con TCAA elaborado con soportes unidireccionales,
en un modelo animal de herida mucosa de espesor parcial. En los animales fuente de las
células que se usaron para fabricar el tejido conjuntivo, se hicieron dos heridas
contralaterales de espesor parcial sobre la zona vestibular de la mucosa oral.
Aleatoriamente, cada una de las heridas fue injertada con TCAA elaborado con soportes
unidireccionales o multidireccionales. Durante el tiempo postquirúrgico se realizaron
evaluaciones clínicas. Posteriormente a se hicieron sacrificios para obtener biopsias de
las heridas incluyendo tejido sano circundante. Las muestras de tejido se analizaron
histomorfométricamente teniendo en cuenta el grosor del epitelio y el tejido conjuntivo, la
intensidad de la inflamación y la vascularización.
Los datos obtenidos indican que en las heridas injertadas con los dos tipos de TCAA, se
observó tejido conjuntivo más denso que en las zonas que cerraron por segunda
intención. Sin embargo, en las zonas tratadas con el TCAA-unidireccional fue evidente la
presencia de fibras colágenas paralelas a la superficie de la herida, así como de células
elongadas con su eje longitudinal en la misma dirección de las fibras colágenas,
mientras que en las zonas injertadas con TCAA-multidireccional las fibras del tejido
formado se orientaron azarosamente en distintas direcciones. Estos hallazgos sugieren
que en las heridas injertadas con el tejido unidireccional la contractura es mayor que en
las zonas que recibieron TCAA-multidireccional.
1. Marco teórico
1.1 Mucosa Oral
1.1.1 Características clínicas de la mucosa oral
El tejido blando que tapiza la cavidad bucal se denomina mucosa, la cual está compuesta
por epitelio y tejido conjuntivo subyacente que conforma la lámina propia. Estos dos
tejidos están conectados por la lámina basal (Figura 1). La mucosa de la cavidad bucal
puede clasificarse de acuerdo a su localización y función en mucosa de revestimiento,
masticatoria y especializada (Gómez de Ferraris & Campos, 2003; Winning & Townsend,
2000; Squier & Kremer, 2001).
Mucosa de revestimiento: Tapiza las mejillas, el paladar blando, las porciones lateral y
ventral de la lengua e interna de los labios, rara vez recibe el impacto directo del acto
masticatorio, por esta razón el epitelio es plano estratificado, no queratinizado, posee otra
capa conjuntiva denominada submucosa, que brinda gran movilidad (Gómez de Ferraris
& Campos, 2003; Winning and Townsend, 2000; Squier and Kremer, 2001).
Mucosa masticatoria: Recubre la zona de paladar duro y encía. Recibe todas las
fuerzas que se realizan durante la masticación, el epitelio presente en ésta es plano
estratificado que puede encontrarse queratinizado o paraqueratinizado, la lámina propia
puede ser más o menos fibrosa; la submucosa está ausente lo cual lo hace carecer de
movilidad (Gómez de Ferraris & Campos, 2003; Winning and Townsend, 2000; Squier
and Kremer, 2001).
Mucosa especializada: Corresponde a la superficie dorsal de la lengua ya que las
papilas linguales poseen corpúsculos gustativos que se encargan de estímulos de
sensaciones gustativas (Gómez de Ferraris & Campos, 2003; Winning and Townsend,
2000; Squier and Kremer, 2001).
1.1.2 Características histológicas de la mucosa oral
Al estar el epitelio y el conjuntivo conectados por la membrana basal, el tejido conjuntivo
emite prolongaciones hacia el epitelio denominadas papilas coriales, a su vez el epitelio
se proyecta hacia la lámina propia en forma de evaginaciones que se interdigitan con las
papilas coriales y reciben el nombre de crestas epiteliales; esta disposición estructural
facilita la nutrición del epitelio oral al permitir una mayor proximidad con el tejido
conjuntivo (Gómez de Ferraris & Campos, 2003; Winning and Townsend, 2000; Squier
and Kremer, 2001).
Epitelio. Constituye uno de los tejidos básicos de los animales; se encuentra cubriendo
cavidades, glándulas y superficies del cuerpo. En la cavidad oral, se identifican los
siguientes tipos de epitelios.
Epitelio plano estratificado queratinizado: Está constituido por dos tipos de poblaciones
celulares: los queratinocitos (90%), células dendríticas o células claras (9%)
(melanocitos, células de Merkel y células de Langerhans) y población transitoria (1%:
granulocitos, linfocitos y monocitos). Los queratinocitos se disponen formando cuatro
estratos: basal, espinoso, corneo y basal (Figura 1). (Gómez de Ferraris & Campos,
2003; Winning and Townsend, 2000; Squier and Kremer, 2001).
Epitelio plano estratificado paraqueratinizado: Presenta iguales características que el
queratinizado, las diferencias se observan en las células del estrato córneo puesto que
conservan sus núcleos y también algunos organelos (Gómez de Ferraris & Campos,
2003; Winning and Townsend, 2000; Squier and Kremer, 2001).
Epitelio plano estratificado no queratinizado: Se diferencia del epitelio queratinizado
porque no produce la capa superficial córnea y carece además del estrato granuloso
(aunque pueden formarse gránulos incompletos), las capas de un epitelio no
queratinizado son: capa basal, capa intermedia y capa superficial (Gómez de Ferraris &
Campos, 2003; Winning and Townsend, 2000; Squier and Kremer, 2001).
Conjuntivo. Las principales células son los fibroblastos, separadas por una abundante
matriz extracelular, la cual es sintetizada por ellas mismas, la matriz está compuesta por
fibras (que tienen proteínas como colágeno, elastina y fibronectina) y sustancia
fundamental amorfa que está formada por ácido hialurónico, proteínas derivadas del
suero, proteoglicanos y factores solubles (Gómez de Ferraris & Campos, 2003; Winning
and Townsend, 2000; Squier and Kremer, 2001). Se encuentran otras células como los
histiocitos que son los precursores de los macrófagos; las células endoteliales que
recubren el sistema vascular y linfático, los mastocitos que secretan mediadores
inflamatorios, células dendríticas y macrófagos (Gómez de Ferraris & Campos, 2003;
Winning and Townsend, 2000; Squier and Kremer, 2001).
Figura 1. Histología de la mucosa oral. Principales tejidos de la mucosa oral. Fotografía original,
Grupo de Trabajo en Ingeniería de Tejidos, Universidad Nacional de Colombia.
Colágeno. Son proteínas que forman parte de matrices extracelulares a las que
confieren sus propiedades funcionales, que constituyen la familia de proteínas más
abundante en el cuerpo humano. Hasta el momento, se han identificado 28 tipos de
colágeno, los cuales se han dividido de acuerdo con las características que exhiben en
los tejidos (Ricard-Blum, 2010). Los colágenos fibrilares, están constituidos por los
colágenos I II, III, V, XI, XXIV. El colágeno I es la proteína de matriz extracelular más
abundante de la mucosa oral, el hueso y la piel. Tiene la habilidad de formar redes de
fibras que exhiben alta resistencia a la tensión; es importante en el proceso de
cicatrización, porque reemplaza gradualmente los otros tipos de colágeno cuando el
tejido es remodelado (Abou Neel et. al., 2012).
1.2 Reparación de heridas
Comienza inmediatamente después de una lesión, con el propósito de restaurar la
integridad del tejido afectado. La reparación de la lesión está sujeta a la profundidad y el
tamaño de la herida; por este motivo, la cicatrización puede clasificarse en una
cicatrización primaria (por primera intención) o secundaria (por segunda intención). La
reparación ocurre en cuatro fases sobrepuestas en el tiempo: Hemostasis, fase
inflamatoria, fase proliferativa y remodelamiento y formación de la cicatriz (Beldon, 2010;
Enoch & Leaper, 2008; Reichert, 2008; Mak et al., 2009; Young & McNaugth, 2011;
Strecker-McGraw et al., 2007; Clark & Singer, 2000; Abou Neel, et al. 2012).
1.2.1 Proceso de reparación de heridas
Hemostasis: Como primer paso se produce vasoconstricción para reducir la pérdida de
sangre, entrando inmediatamente las plaquetas que se adhieren al tejido lesionado y se
activan para liberar citoquinas, quimoquinas y factores de crecimiento (factor de
crecimiento derivado de plaquetas - PDGF, factor de crecimiento fibroblástico β - TGF-β)
que estimulan la migración de células del lecho de la herida. Después de su activación y
adhesión, las plaquetas se agregan para formar con las fibras de fibrina el coágulo
sanguíneo. Este constituye una matriz temporal con funciones hemostáticas y de soporte
para la adhesión de las células que migran del lecho de la herida, las cuales se encargan
de recambiar el coágulo por nuevo tejido (Beldon, 2010; Enoch & Leaper, 2008; Reichert,
2008; Mak, et al. 2009; Young & McNaught, 2011; Strecker-McGraw et al., 2007; Clark &
Singer, 2000).
Inflamación: La inflamación puede ser dividida en una fase temprana y otra tardía según
el tiempo y la duración de la respuesta y el tipo de células involucradas. La lesión tisular y
la activación de la cascada de la coagulación estimula la liberación de citoquinas
vasoactivas (como las prostaglandinas, histamina y otras aminas), lo que se traduce en
un aumento de vasodilatación local y la permeabilidad capilar. También, se produce la
migración de leucocitos polimorfonucleares encargados de la fagocitosis de los tejidos
dañados y bacterias, los cuales resultan ser las células más abundantes en la zona.
Luego de estos son los monocitos que, diferenciándose en macrófagos, incrementan el
proceso de fagocitosis e inician el recambio del coágulo formado inicialmente (Reichert,
2008; Mak, et al. 2009; Young & McNaught, 2011; Strecker-McGraw et al., 2007; Clark &
Singer, 2000).
Proliferación: Se inicia alrededor del día 3 y tiene una duración de 2-4 semanas, se
caracteriza por la migración de los fibroblastos atraídos por factores de crecimiento
(PDGF y TGF-α), la deposición de la matriz extracelular y la formación de tejido
conjuntivo altamente vascularizado o tejido de granulación. Se presenta angiogénesis
activada por Factor de Crecimiento Vascular Endotelial (VEGF) y TGF-β, como un
proceso independiente a partir de vasos preexistentes. La epitelización de la herida
representa la etapa final de la fase proliferativa (Reichert, 2008; Mak, et al. 2009; Young
& McNaught, 2011; Strecker-McGraw et al., 2007; Clark & Singer, 2000).
Remodelación: Este proceso se da en el trascurso de varias semanas, la síntesis y la
remodelación de la matriz extracelular se inicia conjuntamente con el desarrollo de tejido
de granulación y continúa durante periodos prolongados, alcanzando un estado
estacionario 21 días después de la lesión. La contracción de la herida se produce a
través de las interacciones entre los fibroblastos y la matriz extracelular circundante y
está influenciada por citoquinas como el factor de crecimiento transformante-β, factor
derivado de las plaquetas y el factor de crecimiento básico de los fibroblastos. En esta
etapa, el colágeno es degradado por metaloproteinasas específicas producidas por los
fibroblastos, neutrófilos y macrófagos presentes en el sitio de la herida; sus fibrillas son
reordenadas y disminuye la proporción de colágeno tipo III, incrementándose la de
colágeno tipo I. Al comienzo las fibras de colágeno se organizan al azar y exhiben baja
resistencia; con el tiempo, el grosor de las fibrillas y las uniones interfibrillas aumentan lo
que incrementa su grosor (Diegleman & Evans, 2004; Hosgood, 2006; Reichert 2008;
Mak et al. 2009; Young & McNaught, 2011, Strecker-McGraw et al., 2007, Clark &
McNaught 2000, Enoch & Leaper, 2008, Beldon, 2010; Schultz & Wysocki, 2009).
1.2.2 Tipos de cicatrización
Cicatrización primaria: Ocurre cuando se causa una disrupción focal de la continuidad
de la membrana basal epitelial y del conjuntivo en el tejido subyacente; presentándose,
un equilibrio adecuado en el proceso de proliferación celular, metabolismo del colágeno y
actividad de las metaloproteinasas de la matriz. En consecuencia, la herida cierra
después de su creación, ayudada por la aproximación de los bordes con sutura o con
algún otro mecanismo mecánico (Beldon, 2010; Enoch & Leaper, 2008; Reichert, 2008).
Cicatrización secundaria: Se presenta cuando hay pérdida extensa de tejido blando. La
regeneración de las células epiteliales por sí sola no puede restaurar la arquitectura
original, por lo que se produce un crecimiento interno de tejido de granulación en el borde
de la herida, seguido por la acumulación de matriz extracelular con la fijación de
colágeno. Este proceso genera contracción de la herida y posterior epitelialización
(Beldon, 2010; Enoch & Leaper, 2008).
1.2.3 Migración celular en la reparación de heridas
La migración de plaquetas, polimorfonucleares, macrófagos, células endoteliales, entre
otras, del lecho de la herida, juega un papel central en su reparación. Propiedades físicas
y químicas de las células, así como la señalización de los componentes de la matriz
extracelular, modulan ese desplazamiento. Durante su locomoción, las células adquieren
una asimetría espacial que conduce a la polarización morfológica inicial, que impulsada
por rearreglos del citoesqueleto de actina forma un seudópodo, que se une a los
componentes del coágulo. Una vez unida la primera parte de la célula, ésta desplaza su
parte distal para terminar el anclaje y comenzar a secretar sustancias que degradan y
reemplazan el coágulo de fibrina que actúa como matriz provisional (Lauffenburger &
Horwitz, 1996; Lauffenburger & Wells, 2003; Friedl & Wolf, 2009). Estos movimientos son
colectivos y producen una migración ordenada, en la que fibroblastos que se encuentran
en el borde de la herida se polarizan simultáneamente y migran en forma laminar. Al
anclarse, las células reemplazan la matriz provisional del coágulo con fibras de colágeno
que inducen la contracción de la herida (Goldman, 2004; Enoch & Leaper, 2005; Sorokin,
2010).
1.3 Tratamientos de defectos en mucosa oral e ingeniería de tejidos
El tratamiento convencional de lesiones de tejidos blandos es el autoinjerto. A pesar de
que no produce rechazo, presenta limitaciones como la morbilidad y cicatrización por
segunda intención del sitio donante, en caso de necesitarse gran cantidad de tejido hace
que la escasez de tejido disponible para injerto sea restrictivo por este motivo deben
tomarse incluso tejidos de otras zonas del cuerpo mostrando en el proceso de reparación
la retención de las características originales del tejido (Janssen, et al., 2013; Lauer, et al.,
1991; Ueda, et al., 1991; Cooper, et al.,1993; Wang, et al., 2005).
La ingeniería de tejidos es un “Campo interdisciplinario que aplica los principios de la
ingeniería y de las ciencias de la vida para el desarrollo de sustitutos biológicos que
restauren, mantengan y mejoren la función de un tejido” (Langer & Vacanti, 1993;
McGuire, 2003), usando herramientas como soportes, células y reguladores (Lamme, et
al., 1998; Lamme, et al., 2000). Varios productos de ingeniería de tejidos han sido
desarrollados para uso en mucosa oral, entre los que se encuentran láminas de
queratinocitos (Lauer, 1994; Tsai, et al., 1997), soportes acelulares, dermis humana y
submucosa gástrica porcina descelularizada (Badylak & Gilbert, 2008), conjuntivo
artificial (Wong, et al., 2007; Rodríguez, et al., 2010; Espinosa, et al., 2010) y mucosa
artificial completa (Izumi, et al., 2003a; Izumi, et al., 2003b). En una revisión reciente
llevada a cabo por nuestro grupo de investigación (Fontanilla, et al., 2013), se
encontraron dos sustitutos celulares de mucosa oral con aprobación terapéutica oficial
para ser distribuidos comercialmente: Bioseed-M® que consiste en un soporte de fibrina
cultivado con células autólogas de mucosa oral (Vanscheidt, et al., 2007) y GINTUITTM
compuesto por fibroblastos y queratinocitos heterólogos de prepucio de neonato en un
soporte de colágeno (McGuire, et al., 2011; Schmidt, 2012).
1.4 Soportes y microestructura en ingeniería de tejidos
Para elaborar sustitutos de mucosa oral y piel, se emplean soportes tridimensionales
elaborados con biomateriales sintéticos o naturales, biodegradables y biocompatibles.
También, se utilizan tejidos naturales descelularizados como válvulas cardíacas. La
Tabla 1, muestra los materiales más empleados para la elaboración de soportes
tridimensionales. Unos y otros exhiben una microestructura característica, que determina
su interacción con las células y su bioactvidad (Zeltinger, 2001).
Tabla 1. Materiales empleados para la elaboración de soportes para uso en
ingeniería de tejidos.
Biomaterial
Referencia
Proteínas: Colágeno, fibrina y elastina
Caves, et al., 2011; Gomes, et al., 2012
Polisacáridos: Glicosaminoglicanos, quitosan
Bhardwaj, et al., 2011
Polihidroxialcanoatos: Polihidroxibutirato
Burkoth, et al., 2000
Poliesteres Petersen, et al., 2011; Griffin, et al., 2010, Buxton, et al., 2007;
Polipéptidos sintéticos Kumada & Zhang, 2010
La microestructura de los soportes está definida por las siguientes características:
Porosidad: Es la medida de la fracción de espacio vacío del soporte y delimita la
cantidad de material que lo compone. Para una adecuada eficiencia de siembra y
crecimiento de células en el soporte, se necesita alta porosidad (Gibson, 2005).
La porosidad afecta la difusión de los nutrientes, factores de crecimiento,
citoquinas, metabolitos y productos de desecho a través del soporte (Karande, et
al., 2004).
Tamaño de poro: Es el tamaño del espacio dejado por la sustancia empleada
como agente porógeno. Debe ser lo suficientemente grande para que las células
migren dentro del soporte y lo pueblen. Esta variable afecta la morfología,
expresión fenotípica y viabilidad celular (Yannas, 2005; O'Brien, et al., 2005;
O'Brien, et al., 2007).
Interconectividad: La interconectividad hace referencia a la existencia de
comunicación entre los poros. La porosidad no interconectada presenta
membranas entre poros adyacentes, aislando el ambiente de cada poro. En
ingeniería de tejidos es deseable que los poros estén interconectados para
permitir la invasión celular, vascularización, interacción y difusión de nutrientes y
productos de desecho (Freyman, et al., 2001).
Orientación: la orientación de las fibras de los soportes debe estar acorde con la
orientación natural de las fibras en los tejidos que se quieren reemplazar. Algunos
tejidos como tendón y nervios son alineados; por eso se han desarrollado
soportes unidireccionales con fibras orientadas longitudinalmente. La fabricación
de soportes unidireccionales ha sido investigada en la regeneración de nervios
periféricos (Stokols & Tuszynski, 2004; Chamberlain, et al., 1998), médula espinal
(Spilker, et al., 2001), tendón (Louie, et al., 1997; Liu, et al. 2007), y córnea (Wray
& Orwin, 2009) y hueso (Silva, et al., 2006; Yunoki, et al. 2007). Estudios en
modelos animales han demostrado que la microestructura afecta el fenotipo de
fibroblastos de córnea, que se logra con la disminución de la expresión de alfa-
actina en fibroblastos corneales de conejo (Wray & Orwin, 2009). Es así como las
matrices de colágeno definen sus propiedades por su estructura, siendo más
popular en el mercado la multidireccionalidad de las fibras, no hay evidencia
directa que la unión de células a matrices orientadas al azar desoriente el eje
longitudinal de estas. (Soller, et al., 2012).
La orientación de las fibras, tiene consecuencias directas en el tipo de tejido que se
forma en una herida. El patrón de deposición de las fibras de colágeno en heridas del
feto es reticular (multidireccional) e indistinguible del tejido normal adyacente, mientras
que en las heridas del adulto, que cierran por segunda intención, es unidireccional y
caracterizado porque los haces de colágeno depositados son largos y paralelos a la
superficie de la herida. Esta organización del tejido cicatrizal del adulto, dificulta la
migración de los fibroblastos a través de la matriz extracelular neo-formada, por lo que
estos se desplazan a lo largo del margen de la herida provocando la contracción (Adzick
& Lorenz, 1994). En contraposición, el tratamiento de las heridas de tejido conjuntivo con
sustitutos de tejido artificiales proporciona un soporte con organización reticular que
estimula una orientación de las células y procesos de deposición de colágeno similares a
los observados en el tejido cuando el individuo se está formando haciendo que se
favorezca su regeneración (Yannas, 1998; Abou Neel, et al., 2012; Yannas, 2013).
Los resultados de estudios pre-clínicos y clínicos de soportes sembrados o no con
células, sugieren la hipótesis de que estos inhiben la contracción debido a que
establecen una conexión temprana con las células contráctiles (miofibroblastos) del lecho
de la herida, que limita su alineación unidireccional y la generación de fuerzas que
aumentan la contractura (Yannas, 1998). De ahí, la importancia de evaluar el efecto que
tiene la organización microestructural de los poros del soporte de colágeno, en el
crecimiento de fibroblastos y la morfología del tejido resultante (Yannas, 2013).
1.4.1 Células
Cuando los daños de los tejidos y órganos son extensos, el uso del soporte solo no
garantiza que se inhiba la cicatrización con contractura y la reparación (Reing, et al.,
2009; Yannas, 2013). Por eso, se ha recurrido a la elaboración de tejido y órganos
artificiales sembrando células en soportes tridimensionales que semejen la estructura
que se quiere reemplazar. En la elaboración de piel o mucosa oral artificial, se usan
células indiferenciadas y células diferenciadas (Berry, et al., 1998; Yannas, 2013). Los
sustitutos que cuentan con aprobación oficial emplean fibroblastos y queratinocitos
aislados de biopsias de piel o de mucosa oral homólogas (Vanscheidt, et al., 2007;
McGuire, et al., 2011; Schmidt, 2012). Las células se usan en pasajes tempranos puesto
que la producción de matriz extracelular disminuye al incrementar el número de pasajes
(Takeda, et al., 1992; Khorramizadeh, et al., 1999, Yannas, 2013). La mayoría de
sustitutos comerciales aprobados son acelulares, debido a que la inclusión de células en
el soporte le confiere las características de un tejido vivo.
1.4.2 Reguladores
La inclusión de células en los soportes obliga a que se utilicen reguladores que señalicen
a las células para que proliferen y diferencien. Estos pueden ser físicos (ej.: Fuerzas
mecánicas, luz ultravioleta, electricidad, campos magnéticos, etc.) y químicos (ej.:
factores de crecimiento, hormonas, citoquinas, nutrientes, etc.). Dentro de los
compuestos químicos más importantes, se encuentran los medios de cultivo encargados
de suplir los nutrientes, factores de crecimiento y citoquinas que las células necesitan
para vivir. Los medios de uso corriente para el cultivo de mucosa oral, son: Medio Eagle
modificado por Dulbecco (DMEM) y Ham F-12 (Izumi, et al., 2000; Espinosa, et al., 2010;
Yannas, 2013).
2. Formulación del problema
El Estudio Nacional de Salud Bucal más reciente (ENSAB III, 1998), refiere que en
Colombia el 50.2% de la población presenta pérdida de inserción gingival (42.0% de las
personas presentan una pérdida localizada y el 8.2% generalizada) y el 45% de las
personas adultas jóvenes han perdido algún diente debido a un accidente o enfermedad
dental o de la encía. La enfermedad congénita labio y paladar hendido, en el país tiene
una prevalencia de 1:1000 (Chavarriaga & González, 2010) y el Instituto Nacional de
Cancerología reportó 146 nuevos casos de cáncer con localización primaria en cavidad
oral y faringe (Instituto Nacional de Cancerología, 2009). Todas estas lesiones llevan a
cirugías periodontales, cirugías preprotésicas, cirugía de implantes dentales y cirugías
reconstructivas que requieren injertos.
Cuando se encuentran lesiones con grandes extensiones, las zonas donantes comienzan
a ser limitadas por la extensión del defecto a cubrir; adicionalmente, el sitio donante
cicatriza por segunda intención provocando alteraciones estéticas y en algunos casos
funcionales. Los productos de ingeniería de tejidos son una fuente alternativa de tejido
para injerto (Clark, 2000; Izumi, et al. 1999; Herson, et al., 2001; Hildebrand, et al., 2002;
Moriyama, et al., 2001; Ma, et al., 2003)
En el Grupo de Trabajo de Ingeniería de Tejidos se ha estandarizado la elaboración de
sustitutos de mucosa oral (soportes de colágeno-SC y tejido conjuntivo artificial autólogo-
TCAA) en evaluación preclínica (Bello, et al., 2004; Fontanilla, et al., 2006; Espinosa, et
al., 2010). Los datos obtenidos muestran que cuando se injertan en heridas que al
dejarse cerrar por segunda intención cicatrizan con contractura, promueven la formación
de tejido conjuntivo con características histológicas similares a las del tejido sano
circundante (Espinosa, et al., 2010).
La influencia de la microestructura de soportes tridimensionales en la formación in vitro
de tejidos y en la calidad del tejido formado, ha sido explorada (Madaghiele, et al., 2007).
Con el ánimo de determinar el efecto que tiene la orientación de las fibras del SC en la
cicatrización, el grupo desarrolló soportes de colágeno laminares con las fibras
orientadas unidireccionalmente (Suesca, 2013). En el mismo trabajo, se sembraron
células sobre soportes unidireccionales y multidireccionales y se comparó la orientación
adquirida por estas al crecer y formar nuevo tejido, mostrando una orientación elongada
en el caso de los soportes unidireccionales paralelas a las fibras colágenas. El desarrollo
de los soportes in vitro hace que deba probarse su respuesta in vivo, por esto surge este
trabajo donde de forma preclínica se comparó la cicatrización de heridas tratadas con
TCAA elaborado con soportes multidireccionales con la observada en heridas
contralaterales tratadas con TCAA elaborado con soportes unidireccionales, en un
modelo animal de herida mucosa de espesor parcial.
3. Hipótesis
La reparación de heridas de espesor parcial de mucosa oral en conejo injertadas
con TCAA elaborado con soportes de colágeno multidireccionales o con soportes
unidireccionales es igual.
4. Objetivos
4.1. Objetivo general
Evaluar clínica e histomorfométricamente el proceso de reparación en heridas de mucosa
oral injertadas con TCAA elaborado con soportes de colágeno unidireccionales y
multidireccionales.
4.2. Objetivos específicos
Construir y caracterizar histológicamente TCAA a partir de fibroblastos y soportes de
colágeno unidireccionales y multidireccionales.
Comparar el cierre de heridas mucosas de espesor parcial injertadas con tejido
conjuntivo artificial autólogo elaborado con soportes de colágeno unidireccionales y
multidireccionales.
5. Metodología
5.1 Diseño experimental
Se llevó a cabo un ensayo preclínico en el que la asignación de las unidades
experimentales a los diferentes tratamientos efectuados fue realizada de una manera
aleatoria. La verificación de supuestos se realizó mediante pruebas no paramétricas
(prueba Kruskal-Wallis) para características de una población que no obedecen a una
distribución normal. El control de error se hizo con un diseño completamente
aleatorizado; además, cada zona de tratamiento fue comparada con una zona adyacente
a este tratamiento, estableciéndose así el control pareado para cada muestra. Las
variables de respuesta evaluadas se incluyen en la Tabla 2. Los datos correspondientes
a estas variables se analizaron usando un nivel de significancia de α=0.05.
Tabla 2.Variables de respuesta analizadas en el ensayo preclínico.
ENSAYO VARIABLES DE RESPUESTA
Análisis histológico Porcentaje de recuperación en el número de capas del epitelio
Porcentaje de recuperación en el grosor del epitelio
Porcentaje de recuperación en el grosor del tejido conjuntivo
Nivel de infiltrado inflamatorio
Nivel de vascularización
Las comparaciones de los tratamientos, llevaron a la definición de 3 procedimientos
diferentes mostrados en la Tabla 3.
Tabla 3. Procedimientos llevados a cabo en cada tratamiento.
TIPOS DE PROCEDIMIENTO
TRATAMIENTO TRATAMIENTO
Procedimiento 1 TCAA-unidireccional Control
Procedimiento 2 TCAA-multidireccional Control
Procedimiento 3 TCAA-unidireccional TCAA-multidireccional
Esta tesis se desarrolló en dos fases. En la primera, se obtuvo y caracterizó
histológicamente el TCAA construido con soportes unidireccionales y multidireccionales.
En la segunda fase, en los conejos fuente de las células se comparó el proceso de
cicatrización de heridas de mucosa oral de espesor parcial injertadas con TCAA,
elaborado con soportes multidireccionales o con soportes unidireccionales.
5.2 Consideraciones éticas
Este trabajo se enmarcó en el proyecto “Estudio del efecto de la microestructura de
soportes de colágeno en el proceso de reparación de heridas inducidas en mucosa oral
de conejo” el cual fue aprobado por el Comité de Ética de la Facultad de Ciencias el 06
de mayo de 2008 (acta 01).
La manipulación de los animales fue llevada a cabo siguiendo los lineamientos
internacionales [Instituto Nacional de Salud de los Estados Unidos de América (National
Association for Biomedical Research, 2007; National Institute of Health, 1996), ARVO] y
nacionales [Artículo 11 de la Resolución nº 008430 de 1993 del Ministerio de Salud y Ley
84 del 27 de diciembre de 1989] con el fin de minimizar el sufrimiento animal. Todos los
procedimientos fueron llevados a cabo por personal calificado. Los desechos biológicos
se guardaron refrigerados en bolsas rojas, mientras eran recogidos para su incineración.
5.3 Análisis estadístico
5.3.1 Definición de variables
Primera fase: Se observó si hubo o no presencia de células en los soportes.
Segunda fase: La variable independiente fue el tratamiento utilizado en las heridas de
espesor parcial de mucosa oral de los conejos: injerto de TCAA unidireccionado,
multidireccionado y cierre por segunda intención (control). Las variables dependientes o
de respuesta fueron numéricas: porcentaje de recuperación en el número de capas del
epitelio, porcentaje de recuperación en el grosor del tejido conjuntivo, nivel de infiltrado
inflamatorio referido a intensidad (conteo de linfocitos por área) y cambio en la
vascularización (conteo de capilares por área).
5.4 Elaboración de soportes de colágeno tipo I (SC) y tejido conjuntivo artificial autólogo (TCAA)
5.4.1 Elaboración de soportes de colágeno.
Los soportes de colágeno tipo I fueron elaborados con fascia bovina de acuerdo con el
procedimiento estandarizado en el Grupo de Trabajo en Ingeniería de Tejidos (Pérez, et
al., 2001, Suesca, 2013). La fascia se limpió y cortó en pedazos pequeños, que se
sumergieron en ácido acético 0.01M y se mantuvieron a 4°C hasta disolución. La
suspensión se llevó a una concentración de 5mg/mL, se sirvió en moldes, se congeló y
se liofilizó por 48 horas. Los soportes obtenidos se entrecruzaron con glutaraldehído, se
lavaron con agua hasta no detectar agente entrecruzante y se volvieron a liofilizar. En el
congelamiento se usaron dos procedimientos diferentes, con el fin de obtener soportes
multidireccionales (Espinosa, et al., 2010) y soportes unidireccionales (Suesca, 2013).
5.4.2 Aislamiento y cultivo de fibroblastos
Los fibroblastos se aislaron de cada uno de los conejos que se utilizaron en el ensayo
preclínico. Se usaron 36 machos de raza Nueva Zelanda, de 3 meses de edad y un peso
aproximado de 2-4 kg. Bajo anestesia general por inyección intramuscular con clorhidrato
de ketamina (Imalgene® 1000) 35mg/kg y xylazina (Seton®2%) 5mg/kg y anestesia local
infiltrativa con 0.5 mL lidocaína al 1% epinefrina 1:200.000, se tomaron biopsias de
mucosa oral de la zona vestibular de incisivos inferiores, de cada uno de los conejos. El
tejido de aproximadamente 3 x 5 mm se transportó en medio DMEM suplementado con
4x antibióticos y antimicótico (penicilina-estreptomicina, fungizona y gentamicina). En él
laboratorio, las muestras se lavaron 5 veces con solución amortiguadora de fosfatos
salina PBS 1X (pH 7.4), suplementada con 4X [penicilina 200 U/mL, estreptomicina 200
ug/mL y anfotericina a 0,5 g/mL] (Gibco, Invitrogen, Grand Island, NY, USA)]. Después
del lavado, las muestras se cortaron en pequeños fragmentos o explantes (1 x 1 x 1 mm).
Los explantes se sembraron en cajas de 6 pozos y se cubrieron con DMEM (Gibco,
Invitrogen) suplementado con 10% de Suero Fetal Bovino (SFB) (Sigma Chemical Co.,
St. Louis, MO, USA), aminoácidos no esenciales 1% (Gibco, Invitrogen), piruvato de
sodio 1% (Gibco, Invitrogen), vitaminas 1% (Sigma Chemical Co.), penicilina 100 UI /mL,
estreptomicina 100 μg /mL (Gibco, Invitrogen) y anfotericina B (0,25 μg/mL) (Gibco,
Invitrogen). Los cultivos se incubaron en atmósfera húmeda (5% de CO2) a 37oC durante
dos semanas y se realizaron dos cambios de medio semanalmente. Después de alcanzar
la confluencia, las células fueron disgregadas con solución de tripsina/ ácido
etilendiaminotetraacético (EDTA) (0,25%/0,025%) (GibcoBRL, Life Technologies, USA)
por 5min a 37°C. La tripsina fue neutralizada empleando 5 mL de medio de cultivo con
10% de suero fetal bovino. La suspensión celular resultante fue centrifugada, lavada con
PBS y las células contadas empleando una tinción vital (Espinosa et al., 2010; Suesca
2013).
5.4.3 Elaboración de tejido conjuntivo artificial autólogo
Fibroblastos de segundo pasaje, fueron sembrados (500.000 células/cm2) en los soportes
de colágeno e incubados por una semana en atmósfera húmeda (5% de CO2) a 37oC. Al
séptimo día el TCAA obtenido fue injertado, dejando muestras para el análisis histológico
(Espinosa et al., 2010; Suesca 2013).
Análisis histológico. Las muestras de TCAA fueron fijadas en una solución de formol al
10% en PBS, pH 7,4 a 4 °C durante 24 horas. Después de deshidratar usando series
ascendentes de etanol (70%-80%-90%-100%), se transfirieron a una solución de xilol al
100% por 30 minutos, se embebieron en parafina y con ayuda de un micrótomo se
obtuvieron cortes histológicos de cinco micrómetros de espesor que se colocaron en
láminas portaobjetos y fueron teñidos con hematoxilina – eosina. Los cortes fueron
observados con un microscopio de luz.
Viabilidad de las células sembradas en los soportes. La viabilidad fue evaluada
usando el kit Vybrant® MTT bromuro de [3-(4,5-dimetiltiazol-2-il) 2,5-difenil tetrazolium]
Cell Proliferation Assay Kit (Invitrogen, Grand Island, NY, USA), de forma cualitativa
siguiendo las instrucciones del fabricante. Después del tratamiento, las muestras fueron
observadas con un microscopio de luz invertido (Nikon Eclipse TS100, Japan).
Paralelamente, el formazán precipitado dentro de las células del tejido artificial fue
solubilizado con 500 µL de isopropanol e incubando por 10 minutos en atmósfera
húmeda (5% de CO2) a 37°C.
Evaluación del tejido artificial con microscopía confocal: El tejido artificial fue fijado
con paraformaldehído 10% por 24 horas y lavado con buffer de fosfatos (PBS) (pH 7,4).
Después de permeabilizar con Tritón X-100 al 0,2% en PBS con Albúmina Sérica Bovina
(BSA) al 1% por 20 minutos, se lavó dos veces con PBS por 10 minutos y se agregó
dilactato 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) 30nM (Invitrogen, USA) y faloidina conjugada
con rodamina 41,2nM (Invitrogen, USA), por 20 minutos. La tinción se retiró, se hicieron 6
lavados consecutivos con PBS y las muestras fueron observadas con un microscopio
confocal (Nikon C1Plus ECLIPSE Ti). La excitación de las muestras se hizo con laser
diodo 17 MW de 408nm, laser argón 50 MW de 488nm y laser HeNe 1 MW de 543nm. En
las tinciones fueron incluidos como controles, soportes de colágeno sin células y
fibroblastos de mucosa oral de conejo sembrados en láminas Lab-Tek II (Nalge Nunc,
USA).
5.4.4 Evaluación de la reparación de heridas mucosas de espesor parcial
Para establecer el número de conejos a incluir en este análisis, se llevaron a cabo
simulaciones empleando datos preliminares del grupo, con el software R Project for
Statistical Computing versión 2.6.0, utilizando una diferencia esperada del 5 % (Espinosa,
et al. 2010). Se establecieron tres grupos, cada uno con 12 conejos, los cuales fueron
sacrificados a las dos semanas de haberse realizado el tratamiento. En el primer grupo,
se hicieron dos heridas contralaterales que al azar fueron injertadas con soportes
unidireccionales o dejadas cerrar por segunda intención (Control). En el segundo grupo,
las heridas fueron injertadas con TCAA elaborado con soportes multidireccionales o
dejadas cerrar por segunda intención (Control). En el tercer grupo, las heridas fueron
injertadas al azar con TCAA elaborado con soportes unidireccionales o con TCAA
elaborado con soportes multidireccionales.
Bajo anestesia general por inyección intramuscular de clorhidrato de ketamina
(Imalgene® 1000, 35mg/kg de peso) y xylazina (Seton®2%, 5mg/kg) y anestesia local
infiltrativa con 5 mL de una solución de lidocaína al 1% - epinefrina 1:200.000, se
crearon heridas en la zona vestibular del maxilar superior, en la región ubicada entre la
línea mucogingival y el borde gingival libre de las zonas edéntulas que existen entre
incisivos y premolares. Con un molde se delimitó el área de tejido (1.0 x 0.8 cm), se
hicieron incisiones y se retiró el tejido de espesor parcial preservando el periostio. Todas
las heridas se manejaron con la misma técnica quirúrgica y fueron realizadas por la
misma cirujana. En las heridas se colocó el material para injerto, previamente cortado de
acuerdo al tamaño del defecto, y se inmovilizó mediante puntos simples con suturas
absorbibles de ácido poliglicólico 5-0 (LOOKTM - POLYSYNTM).
5.4.5 Manejo y cuidado postoperatorio de los conejos
Durante el período postoperatorio se realizaron evaluaciones diarias del estado de salud
de los animales (Exámen clínico general y oral, revisión de condiciones de alojamiento,
etc.). Después de la cirugía, se aplicó una dosis única para analgesia con meloxicam de
0,2 mg/kg vía intramuscular (Melocam®, La Francol S.A., Cali, Valle del Cauca,
Colombia).
5.4.6 Evaluación clínica de las heridas tratadas
La evaluación clínica de las heridas fue realizada en compañía de un médico veterinario
los días 3, 7, 11 y 14 post-cirugía. Los parámetros a considerar para la evaluación, fueron
presencia de inflamación y ocurrencia de infección; en las heridas injertadas, también se
determinó la permanencia del injerto y de las suturas.
5.4.7 Evaluación histomorfométrica de las heridas tratadas
Los grupos de animales tratados fueron sacrificados mediante administración, en la vena
marginal de la oreja, de una solución concentrada de anestésicos no inhalantes tipo
barbitúricos [(pentobarbital sódico (200 mg/mL) y fenilhidantoína (Eutanex®, Aprofarm
Ltda., Bogotá D.C., Colombia)], a dosis de 1 mL/ 5 kg de peso. La eutanasia de estos
animales fue realizada por el auxiliar del Bioterio Central de la Facultad de Veterinaria y
Zootécnia de la Universidad Nacional de Colombia, siguiendo los protocolos descritos en
“Report of the AVMA Panel on Eutanasia” (Ministerio de Salud, 1993; American
Veterinary Medical Association, 2007).
Para los análisis histológicos, se tomaron biopsias de espesor total que incluían tejido
mucoso oral del área injertada y el tejido sano circundante, utilizado como control. Las
biopsias se fijaron en una solución de formol al 10% en PBS, pH 7,4 a 4° C, se
deshidrataron en series ascendentes de etanol (70%-80%-90%- 100%) y se transfirieron
a una solución de xilol al 100% por 30 minutos. Posteriormente, las muestras fueron
embebidas en parafina y con ayuda de un micrótomo se obtuvieron cortes histológicos,
de cinco micrómetros de espesor que se colocaron en láminas portaobjetos y fueron
teñidos con hematoxilina – eosina. Para realizar las evaluaciones histológicas, se utilizó
un microscopio de luz (DSF 1-U2; Nikon, Tokyo, Japan) y se tomaron fotografías con una
cámara digital adaptada a este (cámara Digital sight DS-2Mv, Nikon, Japón). En la
imagen obtenida se delimitó el área sana y el área tratada o cerrada por segunda
intención, según el caso y en cada una se realizaron mediciones de las variables
numéricas establecidas con ayuda del software Image J [versión libre obtenida por medio
electrónico del National Institutes of Health (NIH), USA]. Las imágenes histológicas
fueron analizadas llevando a cabo un estudio ciego en el cual participaron dos
observadores (un patólogo oral y una periodoncista).
El espesor del epitelio y del tejido conjuntivo fue medido en las áreas injertadas y las
áreas adyacentes a las injertadas. Para esto se realizó una división imaginaria de la
lámina en 5 secciones, las de cada extremo fueron consideradas como adyacentes o
control interno de la lámina y las tres centrales como el área intervenida (Ver Figura 2). A
cada sección se le tomó una fotografía con el software NIS ELEMENTS AR2.30 Build
309 (Nikon) en el microscopio (DSF 1-U2; Nikon, Tokyo, Japan). De cada imagen digital
se realizaron diez mediciones aleatorias del espesor del epitelio y el tejido conjuntivo, se
compararon los valores promedios de las áreas injertadas con los valores promedios de
las áreas adyacentes (control) para evaluar las diferencias significativas (p valor <0,05).
Figura 2. Método de análisis de biopsias. A: Disposición de las biopsias en la lámina. B:
Magnificación del corte a evaluar, el cual es dividido en 5 porciones donde II, III y IV es la zona
tratada, I y V son las zonas adyacentes a la zona tratada.
Para evaluar el grado de inflamación, en diez campos consecutivos se realizó el conteo
de células inflamatorias y se calculó el valor promedio de estos. Adaptando
procedimientos descritos (Espinosa, et al., 2010; Morton & Dongari-Bagtzoglou, 2001), el
valor promedio obtenido se intercaló en un rango de valores para clasificar la inflamación
como nula, leve, moderada y severa, en función del número de células inflamatorias
observadas. En la Tabla 4 se muestra la relación establecida entre el promedio de
células inflamatorias y el grado de inflamación. La angiogénesis fue determinada
contando los vasos presentes en las zonas tratadas y en las heridas control; este
procedimiento fue llevado a cabo de la misma forma en que se contaron las células
inflamatorias.
Tabla 4. Escala de evaluación del grado de inflamación.
Número de células inflamatorias por campo
microscópico observado
Grado de
Inflamación
Menos de 10 Nula
10 a 30 Leve
30 y 50 Moderada
Más de 50 Marcada
6. Resultados
6.1 Objetivo específico No. 1: Construir y caracterizar
histológicamente TCAA a partir de fibroblastos y soportes de colágeno unidireccionales y multidireccionales.
6.1.1 Características morfológicas e histológicas del TCAA
Para estos análisis se tomaron muestras de los tejidos obtenidos sembrando fibroblastos
de mucosa oral gingival en soportes de colágeno uni y multidireccionales, e incubando
por siete días. Se encontró TCAA con características similares a las encontradas en la
literatura (Espinosa et al., 2010); la Figura 3, muestra imágenes representativas de los
cortes del tejido elaborado con soportes unidireccionales (Paneles A y B) y
multidireccionales (Paneles C y D. En las imágenes del tejido producido con soportes
unidireccionales se observa la direccionalidad de las fibras y fibroblastos adheridas a
estas, que exhiben una morfología elongada (Panel A). La magnificación de una región
del tejido unidireccional, claramente evidencia que el eje mayor de los fibroblastos
elongados se orienta paralelamente a las fibras del soporte (Panel B).
C D
Figura 3. Análisis histológico de TCAA elaborado con soportes de colágeno
unidireccionales y multidireccionales. TCAA-unidireccional (Panel A); imagen con mayor
resolución de la región del TCAA-unidireccional, enmarcada dentro del recuadro (Panel B).
TCAA-multidireccional (Panel C); imagen con mayor resolución de la región del TCAA-
multidireccional, enmarcada dentro del recuadro (Panel D). Convenciones usadas: Fibras de
colágeno del soporte (FCS); fibras de colágeno sintetizadas por los fibroblastos (FCF); matriz
extracelular (MEC) secretada por las células.
6.1.2 Viabilidad celular del TCAA con MTT
Se encuentra viabilidad celular del TCAA, las imágenes de tejidos teñidos con MTT
obtenidas con microscopia de luz, evidencian la viabilidad de los fibroblastos sembrados
(Figura 4). En el tejido obtenido con soportes unidireccionales se observan células
teñidas orientadas unidireccionalmente y en paralelo con las fibras (Panel A); mientras
que, en el tejido elaborado con soportes multidireccionales se observan células teñidas
orientadas en diferentes direcciones (Panel B). TCAA-unidireccional
Figura 4. Tinción con MTT de TCAA elaborado con soportes unidireccionales o
multidireccionales. Imagen de corte de TCAA-unidireccional; las flechas señalan células viables
aparentemente orientadas en la misma dirección de las fibras unidireccionales (Panel A). Imagen
de corte de tejido multidireccional; las flechas señalan células viables orientadas en múltiples
direcciones (Panel B).
A B
6.1.3 Evaluación del TCAA con microscopía confocal
Se usó microscopía confocal para evaluar TCAA elaborado con células inmunoteñidas
con DAPI, tinción fluorescente que se une al DNA. La Figura 5, Panel A, muestra
imágenes representativas de TCAA elaborado con soportes unidireccionales en las que
se observan fibroblastos adheridos a lo largo de las fibras unidireccionales. No se puede
apreciar la morfología elongada de estas, debido a que la tinción es núcleo-específica y
no permite evidenciar el citoplasma celular. El Panel B de la misma figura, muestra
células adheridas a las fibras orientadas multidireccionalmente del soporte. A pesar de no
ser evidente la morfología celular, claramente se aprecia la ubicación aleatoria de las
células adheridas a las fibras orientadas multidireccionalmente; estas imágenes
evidencian la distribución tridimensional de las células compatible con las características
de TCAA.
Figura 5. Microscopía confocal de TCAA. La figura presenta imágenes de microscopia confocal
de TCAA elaborado con soportes unidireccionales (Panel A) y TCAA elaborado con soportes
multidireccionales (Panel B).
A B
6.2 Objetivo específico No. 2: Comparar el cierre de heridas
mucosas de espesor parcial injertadas con tejido conjuntivo artificial autólogo elaborado con soportes de colágeno unidireccional y multidireccional.
6.2.1 Seguimiento clínico de los tratamientos
En todos los conejos se usaron heridas contralaterales de características similares, para
aplicar al azar los tratamientos evaluados. La Figura 6, muestra el seguimiento de una
herida injertada con TCAA-unidireccional y su control (Cierre por segunda intención). En
la herida control y en el injerto posicionado con suturas en la herida tratada, al día 0
(Paneles A y B), son evidentes las características de la herida, el tipo de sutura realizada
en la zona injertada y el efecto hemostático del soporte después de ser fijado en el lecho
de la herida. Al séptimo día en la herida injertada se aprecia tejido de granulación en los
bordes, remodelación parcial del TCAA y remanentes de sutura; también, se puede
apreciar que los bordes de la herida control son más elevados y blancos que los de la
herida que fue injertada (Paneles C y D, respectivamente). En el día 14 se encontró que
la herida control carecía de continuidad entre la zona de cicatrización y la mucosa sana
adyacente (Panel E); mientras que la herida injertada epitelializó con consistencia firme y
resilente y adquirió coloración similar a la de la mucosa sana circundante.
Control TCAA - Unidireccional
Figura 6. Progresión temporal del proceso de reparación de heridas injertadas con TCAA-
unidireccional y de control. Apariencia de la herida control y de la herida injertada al día 0
(Paneles A y B, respectivamente), día 7 (Paneles C y D) y día 14 (Paneles E y F). Las flechas
señalan los bordes de la herida control (b) y la zona injertada (zi) en el día 14.
La Figura 7, muestra las imágenes del seguimiento de la herida injertada con TCAA-
multidireccional y su control. Al igual que en las heridas injertadas con TCAA-
unidireccional, en el día 0 son evidentes las características de la herida, el tipo de sutura
realizada en la zona injertada y el efecto hemostático del soporte (Paneles A y B). En el
séptimo día en los bordes de la herida injertada se aprecia tejido de granulación; así
como, TCAA remodelado y remanentes de sutura. Claramente se ve que los bordes de la
herida control son más elevados y blancos que los de la herida que fue injertada
(Paneles C y D, respectivamente). En el día 14, la herida control no mostró continuidad
con la mucosa sana adyacente (Panel E). Contrariamente, la herida injertada epitelializó
con consistencia firme y resilente y adquirió coloración similar a la de la mucosa sana
circundante.
Día 0
Día 7
Día 14
A B
C D
E F
b zi
Figura 7. Progresión temporal del proceso de reparación de heridas injertadas con TCAA-
unidireccional y de control. Apariencia de la herida control y de la herida injertada al día 0
(Paneles A y B, respectivamente), día 7 (Paneles C y D) y día 14 (Paneles E y F). Las flechas
muestran los bordes de la herida control (b) y la zona injertada (zi) en el día 14.
La Figura 8, muestra imágenes de la comparación de heridas tratadas con TCAA-
multidireccional versus heridas tratadas con TCAA-unidireccional. En los dos
tratamientos se observa epitelización de la zona lesionada; sin embargo, las heridas
injertadas con soportes multidireccionales presentaron bordes continuos y adquirieron
apariencia muy similar a la mucosa sana circundante. Contrariamente, en las heridas
tratadas con los soportes unidireccionales se observó inflamación leve y presencia de
bordes ligeramente elevados.
Día 7
Día 14
Día 0
E F
TCAA - Multidireccional TCAA - Unidireccional
b zi
Control TCAA - Multidireccional
Figura 8. Progresión temporal del proceso de reparación de heridas injertadas con TCAA-
multidireccional y TCAA-unidireccional. Apariencia de las heridas injertadas con soporte
multidireccional y unidireccional en el día 0 (Paneles A y B, respectivamente), día 7 (Paneles C y
D) y día 14 (Paneles E y F). La flecha en el Panel E, muestra la continuidad de la zona injertada
con la adyacente. La flecha en el Panel F, señala los bordes elevados en la zona injertada con el
soporte unidireccional.
6.2.2 Evaluación histológica
En la Figura 9, se ven cortes histológicos de las biopsias tomadas en heridas cerradas
por segunda intención (Control) versus heridas injertadas con TCAA-unidireccional, 14
días después de las cirugías. La herida control presenta una delgada capa de epitelio sin
formación de crestas interpapilares, ni paraqueratosis, orientación paralela de fibras
colágenas, con escaso infiltrado inflamatorio agudo en el tejido conjuntivo (Panel A). En
la región injertada con el TCAA-unidireccional, se observa un epitelio de más de 8 capas
que ha cubierto el tejido conjuntivo expuesto en la herida, tejido conjuntivo fibroso
Día 0
Día 7
Día 14
ligeramente denso con aumento en fibras colágenas y fibroblastos, hiperplasia
pseudoepiteliomatosa, hiperemia, congestión vascular y múltiples vasos sanguíneos
(Panel B).
Figura 9. Apariencia histológica de heridas cerradas por segunda intención (Control) y de
heridas injertadas con TCAA-unidireccional, tinción con H&E. El Panel A, muestra la
histología de la herida control. En el Panel B, se observa la imagen histológica de la herida
injertada con TCAA-unidireccional. Convenciones usadas: músculo (M), borde de la herida (BH),
células inflamatorias (CI), crestas interpapilares (CIN), epitelio (EP), glándulas salivales (GM),
hiperplasia pseudoepiteliomatosa (HP), vasos sanguíneos (VS). Escala: 126μm.
La Figura 10, presenta cortes histológicos de las biopsias tomadas en heridas cerradas
por segunda intención (Control) versus heridas injertadas con TCAA-multidireccional, 14
días después de las cirugías. La herida control presenta una delgada capa de epitelio sin
formación de crestas interpapilares, ni paraqueratosis, orientación paralela de fibras
colágenas, con escaso infiltrado inflamatorio agudo en el tejido conjuntivo (Panel A). En
la región injertada con el TCAA-multidireccional, se observa un epitelio de más de 8
capas, tejido conjuntivo fibroso ligeramente denso con aumento en fibras colágenas y
A B
Control TCAA- Unidireccional
fibroblastos, hiperplasia pseudoepiteliomatosa, hiperemia, congestión vascular y
múltiples vasos sanguíneos (Panel B).
Figura 10. Apariencia histológica de heridas cerradas por segunda intención (Control) y de
heridas injertadas con TCAA-multidireccional, tinción con H&E. El Panel A, muestra la
histología de la herida control. En el Panel B, se observa la imagen histológica de la herida
injertada con TCAA-unidireccional. Convenciones usadas: músculo (M), borde de la herida (BH),
células inflamatorias (CI), crestas interpapilares (CIN), epitelio (EP), glándulas salivales (GM),
hiperplasia pseudoepiteliomatosa (HP), vasos sanguíneos (VS). Escala: 126μm.
La Figura 11, muestra cortes histológicos de las biopsias tomadas en heridas injertadas
con TCAA-unidireccional o con TCAA-multidireccional, 14 días después de las cirugías.
En la lesión tratada con TCAA-unidireccional, se observa un epitelio de más de 8 capas
que ha cubierto el tejido conjuntivo expuesto en la herida, tejido conjuntivo fibroso
ligeramente denso con aumento en fibras colágenas y fibroblastos orientados de forma
paralela a la zona de la herida, hiperplasia pseudoepiteliomatosa, hiperemia, congestión
A B
Control TCAA - Multidireccional
vascular y múltiples vasos sanguíneos (Panel A). En la herida injertada con TCAA-
multidireccional, se observa un epitelio con mayor número de capas que ha cubierto el
tejido conjuntivo expuesto en la herida, tejido conjuntivo fibroso ligeramente denso con
aumento en fibras colágenas, organizadas en diferentes direcciones y fibroblastos,
hiperplasia pseudoepiteliomatosa, hiperemia, congestión vascular y múltiples vasos
sanguíneos.
Figura 11. Apariencia histológica de heridas injertadas con TCAA-unidireccional o con
TCAA-multidireccional, tinción con H&E. Herida injertada con TCAA-unidireccional (Panel A);
herida injertada con TCAA-multidireccional (Panel B). Convenciones usadas: músculo (M), borde
de la herida (BH), células inflamatorias (CI), crestas interpapilares (CIN), epitelio (EP), glándulas
salivales (GM), hiperplasia pseudoepiteliomatosa (HP), vasos sanguíneos (VS). Escala: 126μm.
El Anexo 1 incluye cortes de las biopsias provenientes del grupo de 12 conejos en los
que se llevó a cabo la comparación de heridas injertadas con TCAA-unidireccional y
TCAA-multidireccional. En general se observa que en las imágenes de las zonas tratadas
con TCAA-unidireccional hay más zonas en las que las fibras de colágeno se encuentran
paralelas a la superficie de la herida que en las zonas injertadas con TCAA-
multidireccional. Aunque en algunas de las zonas injertadas con este último tejido se
A B
TCAA - Unidireccional TCAA - Multidireccional
observa disposición paralela de algunas fibras de colágeno, la mayoría de las imágenes
de este tratamiento muestran a las fibras de colágeno dispuestas en varias direcciones.
6.2.3 Análisis histomorfométrico del grosor del epitelio, conjuntivo, inflamación y formación de nuevos vasos sanguíneos
El espesor del epitelio y el tejido conjuntivo fue medido en las áreas injertadas y sus
controles. En cada imagen digital se realizaron diez mediciones aleatorias del espesor
del epitelio y del tejido conjuntivo los valores promedios de las áreas injertadas fueron
comparados con los valores promedios de las áreas control para evaluar las diferencias
significativas (p valor <0,05). Al aplicar las pruebas de normalidad se encuentra que los
datos de este estudio no corresponden a una distribución normal; por lo cual, en el
análisis se usaron pruebas no paramétricas.
6.2.3.1 Número de capas del epitelio:
El número de capas de epitelio se evaluó calculando el porcentaje que estas representan
del número de capas original del tejido adyacente a la herida (100%).
# capas de la herida * 100% = Porcentaje de recuperación del epitelio
# capas tejido sano adyacente
La Figura 12, muestra la distribución de los promedios en porcentaje de recuperación
del número de capas del epitelio formado a las dos semanas en los tres grupos de
animales evaluados (heridas injertadas con TCAA-unidireccional vs control, TCAA-
multidireccional vs control y TCAA-multidireccional vs TCAA-unidireccional). El análisis
estadístico realizado con la prueba no paramétrica Kruskal-Wallis para muestras
independientes, reveló que el número de capas del epitelio formado sobre el tejido
cicatrizal de las heridas injertadas con TCAA-unidireccional (Panel A) y TCAA-
multidireccional (Panel B) fue significativamente mayor que el observado en sus
controles (p= 0.001 y p=0.0001, respectivamente). El análisis de los datos de los
animales que fueron injertados en un lado con TCAA-unidireccional y en la herida
contralateral con TCAA-multidireccional, indica que no hay diferencias significativas
entre ellos (p=0.11) (Panel C).
Figura 12. Promedios de porcentaje de recuperación del número de capas del epitelio
formado a las dos semanas. En el Panel A, se observan los resultados del porcentaje de
recuperación del grupo de animales en los que una herida se injertó con TCAA-unidireccional y la
contralateral se dejó cerrar por segunda intención. El Panel B, presenta los datos obtenidos en el
grupo en el que una herida se injertó con TCAA-multidireccional y la contralateral se dejó cerrar
por segunda intención. El Panel C, muestra el análisis de los datos provenientes del grupo en el
que las heridas de un lado fueron tratadas con TCAA-multidireccional y las contralaterales con
TCAA-unidireccional.
A B
C
p=0.001 p=0.001
p=0.119
6.2.3.2 Grosor del tejido conjuntivo:
El grosor del tejido conjuntivo formado en las heridas, se evaluó calculando el porcentaje
que este representa del grosor de tejido conjuntivo sano adyacente (Grosor tejido
conjuntivo herida/ Grosor tejido conjuntivo sano * 100%). En la Figura 13, se ve
que el grosor del tejido conjuntivo fue significativamente mayor en las heridas injertadas
con TCAA-unidireccional (Panel A) y TCAA-multidireccional (Panel B), que en sus
controles (p= 0.0001 y p=0.005, respectivamente). Contrariamente, en los animales
injertados con TCAA-unidireccional en un lado y con TCAA-multidireccional en él otro, la
diferencia en el grosor no fue significativa (p=1.000) (Panel C).
Figura 13. Promedios porcentaje de recuperación de del grosor del tejido conjuntivo
formado a las dos semanas. En el Panel A, se observan los resultados del grupo de animales en
los que una herida se injertó con TCAA-unidireccional y la contralateral se dejó cerrar por
segunda intención. El Panel B, presenta los datos obtenidos en el grupo en el que una herida se
injertó con TCAA-multidireccional y la contralateral se dejó cerrar por segunda intención. El Panel
A B
C
p=0.0001 p=0.005
p=1.000
C, muestra el análisis de los datos provenientes del grupo en el que las heridas de un lado fueron
tratadas con TCAA-multidireccional y las contralaterales con TCAA-unidireccional.
6.2.3.3 Inflamación
El análisis de los resultados de los conteos de las células inflamatorias presentes en las
zonas injertadas o cerradas por segunda intención, se presenta en la Figura 14. La
comparación de los datos de las heridas injertadas con TCAA-unidireccional con los de
las heridas que cerraron por segunda intención (Panel A), indica que hubo un aumento
significativo del número promedio de células inflamatorias presentes en la zona injertada
con respecto al control (p=0.011). El mismo fenómeno fue observado cuando se
compararon los datos de las zonas injertadas con TCAA-multidireccional con sus
controles (p=0.008) (Panel B). Sin embargo, el análisis de los datos provenientes de los
animales que recibieron en una herida TCCA-multidireccional y en la otra TCAA-
unidireccional indica que el número de células inflamatorias presentes en unas y otras,
no fue significativamente diferente (p=0.885), (Panel C).
Figura 14. Grado de inflamación en la zona de herida. En el Panel A, se observan los
resultados del grupo de animales en los que una herida se injertó con TCAA-unidireccional y la
C
B A p=0.011 p=0.008
p=0.885
contralateral se dejó cerrar por segunda intención. El Panel B, presenta los datos obtenidos en el
grupo en el que una herida se injertó con TCAA-multidireccional y la contralateral se dejó cerrar
por segunda intención. El Panel C, muestra el análisis de los datos provenientes del grupo en el
que las heridas de un lado fueron tratadas con TCAA-multidireccional y las contralaterales con
TCAA-unidireccional.
6.2.3.4 Número de vasos sanguíneos
La medición de vasos sanguíneos presentes en las heridas mostró, que en este parámetro no se
evidencian diferencias significativas entre ninguno de los 3 grupos de animales evaluados (Ver
Figura 15). El Panel A, muestra los resultados obtenidos al comparar las zonas injertadas con
TCAA-unidireccional y sus controles; en el Panel B, se incluyen los resultados obtenidos al injertar
TCAA-multidireccional y compararlo con las heridas control (Panel B). En el Panel C, se incluyen
los datos obtenidos al comparar las heridas injertadas con TCAA-multidireccional con las
contralaterales injertadas con TCAA-unidireccional.
Figura 15. Análisis de la formación de vasos sanguíneos. En el Panel A, se observan los
resultados del grupo de animales en los que una herida se injertó con TCAA-unidireccional y la
contralateral se dejó cerrar por segunda intención. El Panel B, presenta los datos obtenidos en el
p=0.553
p=0.657 p=0.492
C
B A
grupo en el que una herida se injertó con TCAA-multidireccional y la contralateral se dejó cerrar
por segunda intención. El Panel C, muestra el análisis de los datos provenientes del grupo en el
que las heridas de un lado fueron tratadas con TCAA-multidireccional y las contralaterales con
TCAA-unidireccional.
7. Discusión
Las patologías bucodentales son responsables de morbilidad sin distinción de edad,
género ni estrato socioeconómico dentro de la población colombiana. El sistema de
vigilancia epidemiológico de salud bucal ha establecido que en todas las etapas de la
vida de los colombianos un 65.3% de la población sufre de caries y que la enfermedad
gingival está presente en el 73.4% (Secretaría Distrital de Salud, 2009; ENSAB III, 1998).
Cualquier patología bucodental puede resultar en pérdida de la continuidad de la mucosa
oral. Tratamientos convencionales toman autoinjertos que generan morbilidad en otra
zona del paciente afectándolo funcional e incluso estéticamente, con defectos que
cicatrizan por segunda intención (Clark & Singer, 2000; Izumi, et al., 1999; Herson, et al.,
2001; Hildebrand, et al., 2002; Moriyama, et al., 2001; Ma, et al., 2003). Los
procedimientos más comunes que llegan a requerir de estos injertos son cirugías
periodontales (Al-Juboori, et al., 2012), cirugías de implantes dentales (Holmes & Aponte-
Wesson, 2010) y cirugías reconstructivas (Schultes, et al., 2013; Abdel Fattah & Zaghloul,
2010; Thoma, et al., 2012; Ysunza, et al., 2010; Hashemi, et al., 2012).
El uso de sustitutos artificiales de tejido es un tratamiento alternativo, que evita la
creación de un sitio donante y que en muchos casos mejora la cicatrización de la zona
injertada. Están elaborados a partir de soportes tridimensionales sembrados con células
autólogas u homólogas y poseen características similares a las de la mucosa o la piel
(Sándor, 2013; Payne, et al., 2013; Izumi, et al., 2003b; Liu, et al., 2007; Kriegebaum, et
al., 2012; Moharamzadeh, et al., 2012). Estudios preclínicos y clínicos de sustitutos de
mucosa oral, han mostrado la conveniencia de su uso como nuevos tratamientos de
heridas de espesor total y parcial (Izumi, et al., 2003b; Izumi, et al., 2003a; Liu, et al.,
2007; Kriegebaum, et al., 2012; Moharamzadeh, et al., 2012). De acuerdo con su
composición y estructura pueden ser utilizados en defectos en encía queratinizada,
recesiones gingivales y deficiencia de tejido conjuntivo (Harris, 2001; Harris, 2004; Prato,
et al., 2003; Thoma, et al., 2012; Fowler, et al., 2000), reemplazo del epitelio (Tsai, et al.,
1997; Lauer, 1994; Fowler, et al., 2000), estímulo de epitelialización in vivo (Ueda et al.,
1991; Prato, et al., 1992) y reemplazo de mucosa oral de espesor total (Izumi, et al.,
2003a; Izumi, et al., 2003b; Raghoebar, et al., 1995).
Nuestro grupo de investigación desarrolló un modelo de herida de mucosa oral de
espesor parcial y demostró su utilidad para evaluar el desempeño de tejido conjuntivo
artificial autólogo (TCAA). Usando este modelo se probó que heridas tratadas con
soportes de colágeno (SC) o con TCAA, cicatrizaron mejor que heridas contralaterales
que cerraron por segunda intención (Espinosa, et al., 2010). Paralelamente, el grupo
diseñó y produjo soportes laminares unidireccionales empleados para hacer tejido
conjuntivo artificial en el que los fibroblastos sembrados exhiben orientación
unidireccional y morfología elongada (Bustos, et al., 2013). Con el fin de evaluar si esta
disposición observada in vitro se mantiene al injertar tejidos unidireccionales e incide en
las características clínicas e histológicas de la zona tratada, el objetivo de este trabajo
fue evaluar el desempeño del tejido conjuntivo artificial autólogo (TCAA) de mucosa oral
elaborado con soportes de colágeno tipo I unidireccionales y compararlo con el obtenido
al injertar tejidos elaborados con soportes multidireccionales.
Los resultados histológicos indican que en las heridas injertadas con los tejidos
elaborados con soportes unidireccionales y multidireccionales hay presencia de matriz
extracelular, eosinofilia y nuevas fibras de colágeno; confirmando lo encontrado
previamente al evaluar el desempeño de TCAA multidireccional (Espinosa, et al., 2010;
Fontanilla, et al., 2012), y aportando evidencia de que el TCAA elaborado con soportes
unidireccionales también mejora la cicatrización con respecto a heridas que cierran por
segunda intención. La existencia de tejido conjuntivo ligeramente denso y la recuperación
del grosor del tejido conjuntivo en los sitios tratados, evidencia la integración de los dos
tipos de TCAA al sitio injertado y su recambio por nuevo tejido.
Los datos obtenidos indican que en las heridas injertadas con los dos tipos de TCAA, se
observó tejido conjuntivo más denso que en las zonas que cerraron por segunda
intención; sin embargo, en las zonas tratadas con el TCAA-unidireccional se observó la
presencia de fibras colágenas paralelas a la superficie de la herida, mientras que en las
zonas injertadas con TCAA-multidireccional el tejido formado se orientó en distintas
direcciones. A pesar de esta diferencia entre las heridas injertadas con TCAA-
multidireccional y con TCAA-unidireccional, la calidad del conjuntivo sintetizado fue mejor
que la del formado en las heridas que cicatrizaron por segunda intención.
Probablemente por eso, en las heridas injertadas se observó la formación de crestas
epiteliales interpapilares integradas al tejido conjuntivo subyacente, lo cual se ha
relacionado con la presencia de conjuntivo de buena calidad (Roberts & Mansbridge,
2002; Raguse & Gath, 2005; Moharamzadeh et al., 2007; Novaes, et al., 2007; Arroyo &
Iruela-Arispe, 2010; Sorokin, 2010; Soller, et al., 2012; Abou Neel, et al., 2012). Algunas
de las características halladas en el epitelio estratificado formado sobre el conjuntivo de
las áreas injertadas, fueron la hiperplasia pseudoepiteliomatosa y la espongiosis sin
progresión a la malignidad; las cuales se presentan durante un proceso de reparación
tisular (Nguyen & Yoon, 2006; Soares, et al., 2005; Abu Eid & Landini, 2005).
En la ingeniería de tejidos existen tendencias encontradas acerca de la conveniencia o
no, de usar soportes sembrados con células e incubados para promover la formación de
tejido artificial in vitro que después se injerta. Este y otros trabajos previos del grupo,
proporcionan evidencia que soporta lo encontrado por otros investigadores, acerca de
que las células presentes en sustitutos de tejido conjuntivo propician una eficiente
reparación de heridas (Stephens, et al., 1996; Pageon, et al., 2012; Arroyo & Iruela-
Arispe, 2010; Sorokin, 2010; Kubo & Kuroyanagi, 2003a; Kubo & Kuroyanagi, 2003b;
Wong, et al., 2007; Yamada, et al., 2008). Por este motivo, el uso de soportes sembrados
con fibroblastos se reafirma como una alternativa de los autoinjertos en cirugía oral y
maxilofacial, en especial para defectos de grandes extensiones donde la morbilidad del
sitio donante es mayor.
A pesar de que el TCAA-unidireccional al injertarse mostró buena adaptación al área y al
contorno de la herida, clínicamente se observó una ligera elevación en sus bordes a
diferencia de las heridas injertadas con TCAA-multidireccional; lo cual, puede
relacionarse con el aumento de fibras de colágeno dispuestas paralelamente a la
superficie de la herida en las zonas injertada con el tejido unidirecional. Esta observación
es reforzada por trabajos previos del grupo y de otros autores que reportan que el
aumento de contractura, evidenciada por la presencia de fibras colágenas paralelas a la
superficie del corte, conduce a defectos en la cicatrización (Oliveira et al., 2012; Yannas,
2013; Espinosa et al., 2010; Chamberlain, et al., 2000).
En contraste a lo descrito en el párrafo anterior, el análisis histomorfométrico de los
cortes provenientes de los tejidos formados en las heridas injertadas con TCAA-
unidireccional o multidireccional, mostró que el grosor del epitelio, el grosor del
conjuntivo, el número de células inflamatorias y el número de vasos sanguíneos no
fueron significativamente diferentes. En consecuencia, podemos afirmar que a pesar de
que en las heridas injertadas con TCAA-unidireccional el cierre ocurre con mayor
contractura que en las heridas injertadas con TCAA-multidireccional, los dos tipos de
tejidos artificiales permiten la ocurrencia de angiogénesis y epitelización de manera
similar.
En el proceso de reparación de heridas una fase fundamental es la inflamación, según el
tipo, la duración y la resolución puede modularse el proceso reparativo; es por eso que
una respuesta inflamatoria rápida y transitoria favorece el cierre de la herida sin infección
a diferencia de cuando se prolonga y se presenta excesivamente beneficiando la difícil
cicatrización (Martin & Leibovich, 2005; Davidson & Breyer, 2003; Eming, et al., 2007;
Ophof, et al., 2002; Jansen, et al., 2008; Novaes, et al., 2007). En este trabajo se observó
que con respecto a los controles, el número de células inflamatorias aumenta
significativamente en las heridas injertadas con los dos tipos de tejido artificial evaluados.
Sin embargo, al relacionar el número de células inflamatorias con el tipo de inflamación
(nulo, leve, moderado y severo), esta se mantuvo como inflamación leve debido a que el
aumento en el número de células no fue suficiente para sugerir un grado mayor de
inflamación, de acuerdo con la tabla usada en este trabajo y adaptada de trabajos
previos del grupo y de otros autores (Morton & Dongari-Bagtzoglou, 2001, Espinosa, et
al., 2010).
La orientación de las fibras es uno de los componentes de la microestructura de los
soportes, que ayuda a definir las características topográficas vistas por las células
cuando son sembradas en estos. En el desarrollo de tejidos artificiales con morfología
fibrosa (Nervios y músculos), se ha estudiado el efecto de la orientación de los poros en
el comportamiento celular y en la regeneración (Madaghiele, et al, 2007). Soportes
tubulares de colágeno I y III con fibras unidireccionales, se usaron con buenos resultados
para promover el crecimiento celular y promover la regeneración guiada de nervios
periféricos (Bozkurt, et al., 2012). Este parámetro también ha sido estudiado en sustitutos
de miocardio, hechos con geles de fibrina constituidos por fibras unidireccionales o
multidireccionales y células cardiacas, encontrándose que la morfología de las células y
las propiedades mecánicas son diferentes (Black, et al., 2009)
La influencia de la orientación de la fibra no ha sido evaluada en soportes laminares de
colágeno I sembrados con fibroblastos orales; por esta razón, nuestro grupo de
investigación desarrolló soportes laminares de colágeno I con poros unidireccionales y
estableció el efecto de esta orientación en la morfología, alineamiento y secreción de
fibroblastos orales sembrados en ellos. La comparación de los datos obtenidos en tejido
conjuntivo artificial (TCA) hecho con soportes unidireccionales con los de TCA hecho con
soportes multidireccionales, mostró que estos parámetros varían (Suesca, 2013; Bustos,
et al., 2013).
En esta tesis de maestría se uso un modelo in vivo, para establecer si la reparación de
heridas de espesor parcial de mucosa oral en conejo injertadas con TCAA elaborado con
soportes de colágeno multidireccionales o con soportes unidireccionales es diferente. Los
resultados muestran que el tejido formado en las heridas injertadas con TCAA-
multidireccional exhibe fibras de colágeno distribuidas aleatoriamente con células
distribuidas de la misma manera. Contrariamente, en las zonas injertadas con TCAA-
unidireccional las fibras se encuentran en su gran mayoría organizadas paralelamente a
la superficie de la herida y se observan células elongadas con su eje longitudinal en la
misma dirección de las fibras colágenas que probablemente están contribuyendo a que
en estas heridas la contractura sea mayor que en las zonas que recibieron TCAA-
multidireccional (Soller, et al., 2012; Yannas, 2013).
8. Conclusiones
Este trabajo muestra que controlando la orientación de las fibras de soportes de colágeno
I, se obtiene tejido conjuntivo artificial que después de ser injertado puede modular la
cicatrización. Los tejidos conjuntivos elaborados con soportes multidireccionales
estimularon más la regeneración que la reparación de las zonas injertadas; mientras que
en los tejidos obtenidos con soportes unidireccionales, fue más evidente la ocurrencia de
reparación. El hecho de que otros parámetros, diferentes a la orientación de las fibras, no
hubieran sido significativamente diferentes en las heridas injertadas con uno u otro tipo
de tejido, soporta esta afirmación. El contar con la tecnología requerida para elaborar
tejido conjuntivo con fibras orientadas en forma diferente, ayuda a que en nuevos
estudios se pueda profundizar en formas de orientar la cicatrización en función de las
direcciones de las fibras que constituyen los soportes con que estos son elaborados.
9. Recomendaciones
Evaluar otro modelo adicional al modelo lagomorfo.
Evaluar el desempeño del TCAA como injerto en heridas de espesor total.
Evaluar los factores de crecimiento y citoquinas del medio producido por el TCAA,
acompañado de evaluación in vivo de estos mismos factores para buscar diferencias
entre los tejidos elaborados con soportes unidireccionales y multidireccionales.
A. Anexo: Comparación histológica de heridas injertadas con TCAA-unidireccional y con TCAA-multidireccional
UNIDIRECCIONAL MULTIDIRECCIONAL
UNIDIRECCIONAL MULTIDIRECCIONAL
UNIDIRECCIONAL MULTIDIRECCIONAL
Comparación histológica de heridas injertadas con TCAA-unidireccional (paneles
izquierdos: A, C, E, G, I, K, M, O, Q, S, U, W, Y, AA, AC) y con TCAA-
UNIDIRECCIONAL MULTIDIRECCIONAL
multidireccional (paneles derechos: B, D, F, H, J, L, N, P, R, T, V, X, Z, AB, AD),
tinción con H&E. Escala: 126μm
Bibliografía
Abdel Fattah, H., Zaghloul, A. 2010. Pre-prosthetic surgical alterations in maxillectomy to
enhance the prosthetic prognoses as part of rehabilitation of oral cancer patient. J Egypt
Natl Canc Inst. 22(4):251-63.
Abou Neel, E.A., Bozec, L., Knowles, J.C., Syed, O., Mudera, V., Day, R., Hyun, J.K.
2012. Collagen--emerging collagen based therapies hit the patient. Adv Drug Deliv
Rev. 65(4): 429-56.
Abu Eid, R.,Landini, G. 2005. Morphometry of pseudoepitheliomatous hyperplasia:
objective comparison to normal and dysplastic oralmucosae. Anal Quant Cytol Histol.
27(4):232-40.
Adzick, NS. & Lorenz, HP. 1994. Cells, matrix, growth factors, and the surgeon. The
biology of scarless fetal wound repair. Ann Surg. 220: 10-8.
Al-Juboori, M., Bin Abdulrahaman, S., Jassan, A. 2012. Comparison of flapless and
conventional flap and the effect on crestal bone resorption during a 12-week healing
period. Dent Implantol Update. 23(2):9-16.
American Veterinary Medical Association (AVMA). 2007. Guidelines on Euthanasia
Formerly Report of the AVMA Panel on Euthanasia. Schaumburg, IL: American
Veterinary Medical Association. Consultado en:
http://grants.nih.gov/grants/olaw/Euthanasia2007.pdf. Revisado Junio 2 de 2011.
Arroyo, A., Iruela-Arispe, M. 2010. Extracellular matrix, inflammation, and the angiogenic
response. Cardiovascular Research. 86: 226–235.
Badylak, S.F. and T.W. Gilbert. 2008. Immune response to biologic scaffold materials.
Semin Immunol. 20(2): 109-16.
Beldon, P. 2010. Basic science of wound healing Review Article Surgery. 28 (9): 409-412
Bello, S.A., Pereira, R., and Fontanilla, M.R. 2004. Elaboración de tejido conjuntivo
artificial autólogo de mucosa oral y evaluación de su desempeño como cobertura
biológica, en lesiones mucosas inducidas en conejos. Rev. Fed. Odontol. Colomb. 20: 12-
28.
Berry, D.P., Harding, K.G., Stanton, M.R., Jasani, B., Ehrlich, H.P. 1998. Human wound
contraction: collagen organization, fibroblasts, and myofibroblasts. Plast Reconstr Surg.
102:124-31.
Bhardwaj, N., Chakraborty, S., Kundu, S.C. 2011. Freeze-gelled silk fibroin protein
scaffolds for potential applications in soft tissue engineering. Int J Biol Macromol. 49(3):
260-7.
Black, L.D., Meyers, J.D., Weinbaum, J.S., Shvelidze, Y., Tranquillo, R.T. 2009. Cell-
induced alignment augments twitch force in fibrin gel-based engineered myocardium via
gap junction modification. Tissue Eng Part A. 15: 3099-108.
Bozkurt, A., Lassner, F., O’Deya, D., Deumens, R., Böcker, A., Schwendt, T., Janzene,
C., Suscheka, C., Tolbaf, R., Kobayashi, E., Sellhaus B., Tholl S., Eummelenh, L.,
Schügnerh, F., Daminkh, L., Weis, J., Brook, G., Palluaa, N. 2012. The role of
microstructured and interconnected pore channels in a collagen-based nerve guide on
axonal regeneration in peripheral nerves. Biomaterials 33: 1363-1375.
Burkoth, A.K., Burdick, J., Anseth, K.S. 2000. Surface and bulk modifications to
photocrosslinked polyanhydrides to control degradation behavior. J Biomed Mater Res.
51(3):352-9.
Bustos, R., Suesca, E., Millán, D., González J., Fontanilla, M.R. 2013. Real-time
quantification of proteins secreted by artificial connective tissue made from uni- or multi-
directional collagen I scaffolds and oral mucosa fibroblasts. Biomaterials. (Artículo en
revision).
Buxton, A.N., Zhu, J., Marchant, R., West, J.L., Yoo, J.U., Johnstone, B. 2007. Design
and characterization of poly(ethylene glycol) photopolymerizable semi-interpenetrating
networks for chondrogenesis of human mesenchymal stem cells. Tissue Eng. 13(10):
2549-60.
Caves, J.M., Cui, W., Wen, J., Kumar, V.A., Haller, C.A., Chaikof, E.L. 2011. Elastin-like
protein matrix reinforced with collagen microfibers for soft tissue repair. Biomaterials.
32(23): 5371-9.
Chamberlain, L.J., Yannas, I.V., Hsu, H.P., Strichartz, G., Spector, M. 1998. Collagen-
GAG substrate enhances the quality of nerve regeneration through collagen tubes up to
level of autograft. Exp Neurol. 154(2): 315-29.
Chamberlain, L.J., Yannas, I.V., Hsu, H.P., Spector, M. 2000. Connective Tissue
Response to Tubular Implants for Peripheral NerveRegeneration: The Role of
Myofibroblasts. Journal of Comparative Neurology. 417:415–430.
Chavarriaga Rosero, J., González Caicedo, M.X. 2010. Prevalencia de labio y paladar
hendido: aspectos generales que se deben conocer. Revista Nacional de Odontología.
6(11): 70-81.
Clark, R., Singer, A. 2000. Wound Repair: Basic Biology to Tissue Engineering Principles
of Tissue Engineering (Second Edition), Chapter 61: 857-878.
Cooper, ML., Andree, C., Hansbrough, JF., Zapata-Sirvent, RL., Spielvogel, RL. 1993.
Direct comparison of a cultured composite skin substitute containing human keratinocytes
and fibroblasts to an epidermal sheet graft containing human keratinocytes on athymic
mice. J Invest Dermatol. 101: 811-819.
Davidson, J. M., Breyer, M. D. 2003. Inflammatory modulation and wound repair. J Invest
Dermatol.120: xi-xii.
Diegleman, RF., Evans, MC. 2004. Wound healing: an overview of acute, fibrotic and
delayed healing. Front Biosci. 9: 283-289.
Eming, S. A., Krieg, T. & Davidson, J. M. 2007. Inflammation in wound repair: molecular
and celular mechanisms. J Invest Dermatol, 127: 514-25.
Enoch S., Leaper D. J. 2008. Basic science of wound healing Review Article. Surgery. 26
(2): 31 – 37.
Enoch, S. & Leaper, D. J. 2005. Basic science of wound healing. Surgery. 23: 37-42.
Espinosa, L., Sosnik, A. & Fontanilla, M. R. 2010. Development and preclinical evaluation
of acelular collagen scaffolding and autologous artificial connective tissue in the
regeneration of oral mucosa wounds. Tissue Eng Part A. 16: 1667-79.
Fontanilla, M.R., Espinosa, L.G. 2012. In vitro and in vivo assessment of oral autologous
artificial connective tissue characteristics that influence its performance as a graft. Tissue
Eng Part A. 18(17-18):1857-66.
Fontanilla, M. R., Espinosa, L. G. & Pérez, L. A. 2006. Performance of autologous
artificial connective tissue and acellular collagen scaffolds on rabbit oral mucosal lesions.
Abstract 5th Annual Meeting of European Tissue Engineering Society International
(ETES). Rotterdam, The Nederlands. Oct 8 – 11.
Fontanilla, M.R, Suesca, E., Casadiegos, S. 2013. Biomateriales aplicados al diseño de
sistemas terapéuticos avanzados. Editado por Universidad de Coimbra, Portugal, en
colaboración con la red Rimadel. Capítulo 6: “Ingeniería de tejidos y medicina
regenerativa” (En proceso de publicación).
Fowler, E.B., Breault, L.G. 2000. Root coverage with an acellular dermal allograft: a three-
month case report. J Contemp Dent Pract.1:47–59.
Freyman, T.M., Yannas, I.V., Pek, Y.S., Yokoo, R., Gibson, L.J. 2001. Micromechanics of
fibroblast contraction of a collagen-GAG matrix. Exp Cell Res. 269(1): 140-53.
Friedl, P., & Wolf, K. 2009. Proteolytic interstitial cell migration: a five-step process.
Cancer Metastasis Rev. 28: 129-35.
Gibson, L. 2005. Biomechanics of cellular solids. Journal of Biomechanics. 38: 377-399.
Goldman, R. 2004. Growth factors and chronic wound healing: past, present, and future.
Adv Skin Wound Care. 17: 24-35.
Gomes, S., Leonor, I.B., Mano, J.F., Reis, R.L., Kaplan, D.L. 2012. Natural and
Genetically Engineered Proteins for Tissue Engineering. Prog Polym Sci. 37(1):1-17.
Gómez de Ferraris, M., Campos Muñoz, A. 2003. Histología y embriología bucodental.
Ed. Médica Panamericana. 2da Edición. Madrid. pag. 110-136.
Griffin, J., Carbone, A., Delgado-Rivera, R., Meiners, S., Uhrich, K.E. 2010. Design and
evaluation of novel polyanhydride blends as nerve guidance conduits. Acta Biomater.
6(6):1917-24.
Harris, R.J. 2001. Clinical evaluation of 3 techniques to augment keratinized tissue
without root coverage. J Periodontol. 72: 932–938.
Harris, R.J. 2004. A short-term and long-term comparison of root coverage with an
acellular dermal matrix and a subepithelial graft. J Periodontol. 75:734–743.
Hashemi, H. M., Parhiz, A. A., & Ghafari, S. S. 2012. Vestibuloplasty: allograft versus
mucosal graft. International Journal Of Oral & Maxillofacial Surgery, 41(4), 527-530.
Herson, MR., Mathor MB., Altran S., Capelozzi VL., Ferreira MC. 2001. In vitro
construction of a potential skin substitute through direct human keratinocyte plating onto
decellularized glycerol-preserved allodermis. Artif Organs. 25: 901-906.
Hildebrand, HC., Hakkinen, L., Wiebe, CB., Larjava, HS. 2002. Characterization of
organotypic keratinocyte cultures on deepithelialized bovine tongue mucosa. Histol
Histopathol. 17: 151-163.
Holmes, J.D., Aponte-Wesson, R. 2010. Dental implants after reconstruction with free
tissue transfer. Oral Maxillofac Surg Clin North Am. 22(3):407-18.
Hosgood, G. 2006. Stages of Wound Healing and Their Clinical Relevance. Vet Clin
Small Anim. 36: 667–685.
Instituto Nacional de Cancerología. 2009. Instituto Nacional de Cancerología Anuario
Estadístico 2009. Bogotá, D.C.: República de Colombia, Ministerio de la Protección
Social, Instituto Nacional de Cancerología, Empresa Social del Estado.
http://www.cancer.gov.co/documentos/Anuario%20Estaditico/2009/Anuario%20Impreso_
009.pdf. Consultado en agosto 25 de 2011.
Izumi, K., Feinberg, S. E., Iida, A. & Yoshizawa, M. 2003a. Intraoral grafting of an ex vivo
produced oral mucosa equivalent: a preliminary report. Int J Oral Maxillofac Surg. 32:
188-97.
Izumi, K., Feinberg, S. E., Terashi, H. & Marcelo, C. L. 2003b. Evaluation of transplanted
tissue engineered oral mucosa equivalents in severe combined immunodeficient mice.
Tissue Eng. 9: 163-74.
Izumi, K., Takacs, G., Terashi, H., Feinberg, SE. 1999. Ex vivo development of a
composite human oral mucosal equivalent. J Oral Maxillofac Surg. 57: 571-577.
Izumi, K., Terashi, H., Marcelo, CL., Feinberg, SE. 2000. Development and
characterization of a tissue-engineered human oral mucosa equivalent produced in a
serum-free culture system. J Dent Res. 79: 798-805.
Janssen, N.G., Weijs, W.L., Koole, R., Rosenberg, A.J., Meijer, G.j. 2013. Tissue
engineering strategies for alveolar cleft reconstruction: a systematic review of the
literature. Clin Oral Investig. Feb 22. DOI 10.1007/s00784-013-0947-x.
Jansen, R.G., Kuijpers-Jagtman, A.M., van Kuppevelt, T.H., Von den Hoff, J.W. 2008.
Collagen scaffolds implanted in the palatal mucosa. J Craniofac Surg. 19(3):599-608.
Karande, T.S., J.L. Ong, and C.M. Agrawal. 2004. Diffusion in musculoskeletal tissue
engineering scaffolds: design issues related to porosity, permeability, architecture, and
nutrient mixing. Ann Biomed Eng. 32(12): 1728-4.
Khorramizadeh, MR., Tredget, EE., Telasky, C., Shen, Q., Ghahary, A. 1999. Aging
differentially modulates the expression of collagen and collagenase in dermal fibroblasts.
Mol Cell Biochem. 194: 99-108.
Kriegebaum, U., Mildenberger, M., Mueller-Richter, U.D., Klammert, U., Kuebler, A.C.,
Reuther, T. 2012. Tissue engineering of human oral mucosa on different scaffolds: in vitro
experiments as a basis for clinical applications. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral
Radiol. 114(5):190-8.
Kubo, K., Kuroyanagi, Y. 2003a. Development of a cultured dermal substitute composed
of a spongy matrix of hyaluronic acid and atelo-collagen combined with fibroblasts:
fundamental evaluation. J. Biomater Sci Polym. 14: 625-41.
Kubo, K., Kuroyanagi, Y. 2003b. Effects of vascular endothelial growth factor released
from cultured dermal substitute on proliferation of vascular endothelial cells in vitro. J. Artif
Organs. 6: 267-72.
Kumada, Y., Zhang, S. 2010. Significant Type I and Type III Collagen Production from
Human Periodontal Ligament Fibroblasts in 3D Peptide Scaffolds without Extra Growth
Factors. PLoS One. 5(4): 10305. Published online 2010 April
22. doi: 10.1371/journal.pone.0010305.
Lamme, E. N., Van Leeuwen, R. T., Brandsma, K., Van Marle, J. & Middelkoop, E. 2000.
Higher numbers of autologous fibroblasts in an artificial dermal substitute improve tissue
regeneration and modulate scar tissue formation. J Pathol. 190: 595-603.
Lamme, E. N., Van Leeuwen, R. T., Jonker, A., Van Marle, J. & Middelkoop, E. 1998.
Living skin substitutes: survival and function of fibroblasts seeded in a dermal substitute in
experimental wounds. J Invest Dermatol, 111: 989-95.
Langer, R. & Vacanti, J.P. 1993. Tissue engineering. Science. 260(5110): 920-6.
Lauer, G., Otten, JE., von Specht, BU., Schilli, W. 1991. Cultured gingival epithelium. A
possible suitable material for pre-prosthetic surgery. J Craniomaxillofac Surg. 19: 21-26.
Lauer, G. 1994. Autografting of feeder-cell free cultured gingival epithelium. Method and
clinical application. J Craniomaxillofac Surg. 22(1): 18-22.
Lauffenburger, D. A. & Horwitz, A. F. 1996. Cell migration: a physically integrated
molecular process. Cell. 84: 359-69.
Lauffenburger, D. A. & Wells, A. 2003. Quantitative parsing of cell multi-tasking in wound
repair and tissue morphogenesis. Biophys J. 84: 3499-500.
Liu, H., Wang, Y., Toh, S.L., Sutthikhum, V., Goh, J.C. 2007. Modification of sericin-free
silk fibers for ligament tissue engineering application. J Biomed Mater Res B Appl
Biomater. 82(1): 129-38.
Louie, L.K., Yannas, I.V., Hsu, H.P., Spector, M. 1997. Healing of Tendon Defects
Implanted with a Porous Collagen-GAG Matrix: Histological Evaluation. Tissue
Engineering. 3(2): 187-195.
Ma, L., Gao, C., Mao, Z., Zhou, J., Shen, J., Hu, X., et al. 2003. Collagen/chitosan porous
scaffolds with improved biostability for skin tissue engineering. Biomaterials. 24: 4833-
4841.
Madaghiele, M., Sannino, A., Yannas, IV and Myron Spector. 2007. Collagen-based
matrices with axially oriented pores. J Biomed Mater Res A. 85 (3): 757-767.
Mak, K., Manji, A., Gallant-Behm, C., Wiebe, C., Hart, D., Larjava, H., Häkkinen, L. S.
2009. Healing of oral mucosa is characterized by faster resolution of inflammation and
control of myofibroblast action compared to skin wounds in the red Duroc pig model
Original Research Article. Journal of Dermatological Science. 56(3): 168-180.
Martin, P., Leibovich J. 2005. Inflammatory cells during wound repair: the good, the bad
and the ugly Review Article. Trends in Cell Biology. 15(11): 599-607.
McGuire, M.K. 2003. Tissue engineering--rewriting the rules of regeneration. Int J Oral
Maxillofac Implants. 18: 327-8.
McGuire, M.K., Scheyer, E.T., Nevins, M.L., Neiva, R., Cochran, D.L., Mellonig, J.T.,
Giannobile, W.V., Bates, D. 2011. Living cellular construct for increasing the width of
keratinized gingiva: results from a randomized, within-patient, controlled trial. J
Periodontol. 82(10):1414-23.
Ministerio de Salud, Colombia. 1998. III Estudio Nacional de Salud Bucal ENSAB III.
Disponible en URL http://onsb.udea.edu.co/site/images/pdf/ensab3.pdf, consultado el 18
de agosto de 2011.
Ministerio de Salud. 1993. RESOLUCIÓN Nº 008430: Por la cual se establecen las
normas científicas, técnicas y administrativas para la investigación en salud. Republica
de Colombia, Bogotá D. C.
Moharamzadeh, K., Brook, I. M., Van Noort, R., Scutt, A. M. & Thornhill, M. H. 2007.
Tissue engineered oral mucosa: a review of the scientific literature. J Dent Res. 86: 115-
24.
Moharamzadeh, K., Colley, H., Murdoch, C., Hearnden, V., Chai, W.L., Brook, I.M.,
Thornhill, M.H., Macneil, S. 2012. Tissue-engineered oral mucosa. J Dent Res. 91(7):
642-50.
Moriyama, T., Asahina, I., Ishii, M., Oda, M., Ishii, Y., Enomoto, S. 2001. Development of
composite cultured oral mucosa utilizing collagen sponge matrix and contracted collagen
gel: a preliminary study for clinical applications. Tissue Eng. 7: 415-427.
Morton, R. S. & Dongari-Bagtzoglou, A. I. 2001. Cyclooxygenase-2 is upregulated in
inflamed gingival tissues. J Periodontol. 72: 461-9.
National Institute of Health. 1996. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals.
Washington D.C.: Institute of Laboratory Animal Resources, Commission on Life
Sciences, National Research Council. Consultado en:
http://grants.nih.gov/grants/olaw/Guide-for-the-Care-and-Use-of-Laboratory-Animals.pdf.
Revisado: Mayo 22 de 2011.
Nguyen, T. H. & Yoon, J. 2006. Carcinoma epidermoide. In: Rigel, D. S., Friedman, R.,
Dzubow, L. M., Reintgen, D. S. (eds.) Cancer de Piel. 1a ed. España: ELSEVIER.
Novaes, A. B., JR., Marchesan, J. T., Macedo, G. O. & Palioto, D. B. 2007. Effect of in
vitro gingival fibroblast seeding on the in vivo incorporation of acellular dermal matrix
allografts in dogs. J. Periodontol. 78: 296-303.
O'Brien, F.J., Harley, B., Waller, M., Yannas, I.V., Gibson, L. and Prendergast, P.J. 2007.
The effect of pore size on permeability and cell attachment in collagen scaffolds for tissue
engineering. Technology and Health Care. 15: 3-17.
O'Brien, F.J., Harley, B.A., Yannas, I.V., Gibson, L.J. 2005. The effect of pore size on cell
adhesion in collagen-GAG scaffolds. Biomaterials. 26(4): 433-41.
Oliveira A., Sunc L., Kimc H., Huc X., Ricec W., Klugec J., Reis R., Kaplanc D. 2012.
Aligned silk-based 3-D architectures for contact guidance in tissue engineering. Acta
Biomaterialia. 8: 1530–1542.
Ophof, R., Maltha, J. C., Kuijpers-Jagtman, A., & Von den Hoff, J. W. 2008. Implantation
of tissue-engineered mucosal substitutes in the dog palate. European Journal Of
Orthodontics, 30(1): 1-9.
Ophof, R., van Rheden, RE., Von den Hoffa, JW., Schalkwijk, J., Kuijpers-Jagtman, AM.
2002. Oral keratinocytes cultured on dermal matrices form a mucosa-like tissue.
Biomaterials. 23: 3741-3748.
Pageon, H., Zucchi, H., Asselineau, D. Distinct and complementary roles of papillary and
reticular fibroblasts in skin morphogenesis and homeostasis. 2012. Eur J
Dermatol. 22(3):324-32.
Payne, K.F., Balasundaram, I., Deb, S., Di Silvio, L., Fan, K.F. 2013. Tissue
engineering technology and its possible applications in oral and maxillofacial surgery. Br
J Oral Maxillofac Surg. S0266-4356(13)00094-6.
Pérez, S., Doncel, A., Roa, C.A., Fontanilla M.R. 2001. Estandarización de un Método
Para la Elaboración de un Análogo de Dermis Humana. Revista Colombiana de Ciencias
Químico-Farmacéuticas. 30 (1): 9-15.
Petersen, L.K., Oh, J., Sakaguchi, D.S., Mallapragada, S.K., Narasimhan, B. 2011.
Amphiphilic polyanhydride films promote neural stem cell adhesion and differentiation.
Tissue Eng Part A. 17(19-20): 2533-41.
Prato, G.P., Rotundo, R., Magnani, C., Soranzo, C., Muzzi, L., Cairo, F. 2003. An
autologous cell hyaluronic acid graft technique for gingival augmentation: A case series. J
Periodontol. 74:262–267.
Prato, P.G., Tinti, C., Vincenzi, G., Magnani, C., Cortellini, P., Clauser, C. 1992. Guided
tissue regeneration versus mucogingival surgery in the treatment of human buccal
gingival recession. J Periodontol. 63:919–928.
Raghoebar, G.M., Tomson, A.M., Scholma, J., Blaauw, E.H., Witjes, M.J. & Vissink, A.
1995. Use of cultured mucosal grafts to cover defects caused by vestibuloplasty: an in
vivo study: in vivo study. International Journal of Oral and Maxillofacial and Surgery. 53:
872–879.
Raguse, J. D., Gath, H. J. 2005. A metabolically active dermal replacement (Dermagraft)
for vestibuloplasty. J Oral Rehabil, 32, 337-40.
Reichert, W.M., editor. 2008. Indwelling Neural Implants: Strategies for Contending with
the In Vivo Environment. Boca Raton. Chapter 1 Overview of Wound Healing in Different
Tissue Types. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK3938/ Consultado en: Junio 10 de
2011.
Reing, J.E., Zhang, L., Myers-Irvin, J., Cordero, K.E., Freytes, D.O., Heber-Katz, E, et al.
2009. Degradation products of extracellular matrix affect cell migration and proliferation.
Tissue Eng Part A. 15:605e14.
Ricard-Blum, S. 2010. The Collagen Family. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2011 Jan 1;
3(1): a004978. doi: 10.1101/cshperspect.a004978.
http://cshperspectives.cshlp.org/cgi/doi/10.1101/cshperspect.a004978 Consultado en:
Junio 3 de 2011.
Roberts, C., Mansbridge, J. 2002. The scientific basis and differentiating features of
dermagraft. The Canadian Journal of Plastic Surgery. 10: 6A-13A.
Rodríguez, A. Z., Tambasco De Oliviera, P., Novaes JR., A. B., Maia, L. P., Scombatti De
Souza, S. L. & Palioto, D. B. 2010. Evaluation of In vitro human gingival fibroblast seeding
on acellular dermal matrix. Brazilian Dental Journal. 21(3): 179-185.
Sándor, G. 2013.Tissue engineering: Propagating the wave of change. Ann Maxillofac
Surg. 2013 Jan-Jun; 3(1): 1–2.
Schultes, G., Kärcher, H., Gerzanic, L. 2013. Prefabricated iliac crest transplant. J Oral
Maxillofac Surg. 71(2):428-32.
Schultz, G. S. & Wysocki, A. 2009. Interactions between extracellular matrix and growth
factors in wound healing. Wound Repair Regen, 17, 153-62.
Secretaría Distrital de Salud. Subsistema de vigilancia en Salud Pública de la Salud Oral.
SISVESO 2009. versión Febrero 2010.
Schmidt, C. 2012. Gintuit cell therapy approval signals shift at US regulator. Nat
Biotechnol. 30(6):479.
Silva, M.M., Cyster, L.A., Barry, J.J., Yang, X.B., Oreffo, R.O., Grant, D.M., Scotchford,
C.A., Howdle, S.M., Shakesheff, K.M., Rose, F.R. 2006. The effect of anisotropic
architecture on cell and tissue infiltration into tissue engineering scaffolds. Biomaterials.
27(35): 5909-17.
Soares, F.M., Tarver, E.J., Bimstein, E., Shaddox, L.M., Bhattacharyya, I. 2005. Gingival
overgrowth in a child with arthrogryposis treated with a Er,Cr: YSGG laser: a case report.
Pediatr Dent. 31(1):8-13.
Soller, E., Tzeranis, D., Miua, K., Soa, P., Yannas, I.V. 2012. Common features of optimal
collagen scaffolds that disrupt wound contraction and enhance regeneration both in
peripheral nerves and in skin. Biomaterials 33: 4783-4791.
Sorokin, L. 2010. The impact of the extracellular matrix on inflammation. Nat Rev
Immunol. 10: 712-23.
Spilker, M.H., Yannas, I.V., Kostyk, S.K., Norregaard, T.V., Hsu, H.P., Spector, M. 2001.
The effects of tubulation on healing and scar formation after transection of the adult rat
spinal cord. Restor Neurol Neurosci. 18(1): 23-38.
Squier, C. A. & Kremer, M. J. 2001. Biology of oral mucosa and esophagus. J Natl Cancer
Inst Monogr. 29: 7- 15.
Stephens, P., Davies, K. J., Al-Khateeb, T., Shepherd, J. P., Thomas, D. W. 1996. A
comparison of the ability of intra-oral and extra-oral fibroblasts to stimulate extracellular
matrix reorganization in a model of wound contraction. J Dent Res, 75, 1358-64.
Strecker-McGraw, M., Russel, T., Baer, D. 2007. Soft Tissue Wounds and Principles of
Healing Emerg Med Clin N Am. 25: 1–22.
Stokols, S. and M.H. Tuszynski. 2004. The fabrication and characterization of linearly
oriented nerve guidance scaffolds for spinal cord injury. Biomaterials. 25(27): 5839-46.
Suesca, E. 2013. Estudio del efecto de la microestructura de soportes de colágeno en el
proceso de reparación de heridas. Tesis doctoral en proceso, Doctorado en Ciencias
Farmacéuticas, Facultad de Ciencias, Departamento de Farmacia, Universidad Nacional
de Colombia.
Takeda, K., Gosiewska, A., Peterkofsky, B. 1992. Similar, but not identical, modulation of
expression of extracellular matrix components during in vitro and in vivo aging of human
skin fibroblasts. J Cell Physiol. 153: 450-459.
Thoma, D., Sancho-Puchades, M., Ettlin, D., Hämmerle, C., Jung, R. 2012. Impact of a
collagen matrix on early healing, aesthetics and patient morbidity in oral mucosal wounds
- a randomized study in humans. J Clin Periodontol. 39(2):157-65.
Tsai, C.Y., Ueda, M., Hata, K., Horie, K., Hibino, Y., Sugimura, Y., Toriyama, K., Torii, S.
1997. Clinical results of cultured epithelial cell grafting in the oral and maxillofacial region.
J Craniomaxillofac Surg. 25(1): 4-8.
Ueda, M., Ebata, K., Kaneda, T. 1991. In vitro fabrication of bioartificial mucosa for
reconstruction of oral mucosa: basic research and clinical application. Ann Plast Surg 27:
540-549.
Vanscheidt, W., Ukat, A., Horak, V., Brüning, H., Hunyadi, J., Pavlicek, R., Emter, M.,
Hartmann, A., Bende, J., Zwingers, T., Ermuth, T., Eberhardt, R. 2007. Treatment of
recalcitrant venous leg ulcers with autologous keratinocytes in fibrin sealant: a
multinational randomized controlled clinical trial. Wound Repair Regen. 15(3):308-15.
Wang, H., Pieper, J., Peters, F., van Blitterswijk, CA., Lamme, EN. 2005. Synthetic
scaffold morphology controls human dermal connective tissue formation. J Biomed Mater
Res A. 74: 523-532.
Winning, T. A. & Townsend, G. C. 2000. Oral mucosal embryology and histology. Clin
Dermatol. 18: 499- 511.
Wong, T., J.A. McGrath, and H. Navsaria. 2007. The role of fibroblasts in tissue
engineering and regeneration. Br J Dermatol. 156(6): 1149-55.
Wray, L.S. and Orwin E.J. 2009. Recreating the microenvironment of the native cornea for
tissue engineering applications. Tissue Eng Part A. 15(7): 1463-72.
Yamada, N., Uchinuma, E., Matsumoto, Y. & Kuroyanagi, Y. 2008. Comparative
evaluation of reepithelialization promoted by fresh or cryopreserved cultured dermal
substitute. J Artif Organs. 11: 221-4.
Yannas, I.V. 2005. Facts and theories of induced organ regeneration. Adv Biochem Eng
Biotechnol. 93: 1-38.
Yannas, I.V. 2013. Emerging rules for inducing organ regeneration. Biomaterials. 34(2):
321-30.
Yannas, I.V. 1998. Studies on the biological activity of the dermal regeneration template.
Wound Rep Reg. 6: 518-524.
Ysunza, A., Pamplona, M., Quiroz, J., Yudovich, M., Molina, F., González, S., Chavelas,
K. 2010. Maxillary growth in patients with complete cleft lip and palate, operated on
around 4-6 months of age. Int J Pediatr Otorhinolaryngol. 74(5):482-5.
Young, A., McNaught, C. 2011. The physiology of wound healing Review Article. Surgery.
29(10): 475-479.
Yunoki, S., Ikoma, T., Tsuchiya, A., Monkawa, A., Ohta, K., Sotome, S., Shinomiya, K.,
Tanaka, J. 2007. Fabrication and mechanical and tissue ingrowth properties of
unidirectionally porous hydroxyapatite/collagen composite. J Biomed Mater Res B Appl
Biomater. 80(1): 166-73.
Zeltinger, J., Landeen, L.K., Alexander, H.G., Kidd, I.D., Sibanda, B. 2001. Development
and characterization of tissue-engineered aortic valves. Tissue Eng. 7(1): 9-22.
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