MÉTODOS-HISTOLÓGICOS

MÉTODOS HISTOLÓGICOS

GISELA GARCÍA CRESPO.Profª Titular

Facultad de Ciencias Veterinarias

Histo

Creado por Ysrael VillamarínDibujo: Jan Acevedo

• Los métodos o técnicas histológicas se puede definir como: la serie de procedimientos especiales a los que se somete el material que se va a estudiar bajo el microscopio (Histológicamente)

MÉTODOS HISTOLÓGICOS

METODOS HISTOLÓGICOS• DIRECTOS( En

vivo)• INDIRECTOS

(Postmorten)• COLORACIÓN

MÉTODOS DIRECTOS

• ESTUDIO DONDE SE EMPLEAN PROCEDIMINETOS QUE NO AFECTAN LA BIOLOGÍA CELULAR, O PERMITEN OBSERVAR LOS CAMBIOS QUE SUFRE ANTE DETERMINADOS PROCEDIMIENTOS.

METODOS INDIRECTOS

• PROCEDIMIENTOS QUE REQUIEREN MAYOR TIEMPO PARA PODERLOS EJECUTAR, A VECES REQUIEREN DE UNA FIJACIÓN PREVIA.

• SON PROCEDIMIENTOS MEDIATOS O POSTMORTEN.

Entre estos procedimientos contamos...

METODOS HISTOLÓGICOS

• CULTIVOS CELULARESSe cultivan células fuera del

organismo que les dio origen.Requiere un medio apropiado:

aséptico (sin agentes nocivos), temperatura, pH, humedad, nutrientes, etc.

Ej: HeLa, linfocitos, etc.

CULTIVOS CELULARES

CULTIVOS CELULARES

CULTIVOS CELULARES

METODOS HISTOLÓGICOS

• AUTORRADIOGRAFIA:Técnica por la cual un objeto radiactivo produce una imagen de sí mismo sobre una película fotográfica. La imagen se denomina autorradiografía

Autorradiografía

METODOS HISTOLÓGICOS• CENTRIFUGACIÓN -

ULTRACENTRIFUGACIÓNSe obtienen células o componentes

subcelulares específicos de acuerdo a su gradiente de sedimentación Ej.: glóbulos rojos, glóbulos blancos; mitocondrias, retículo endoplasmático, etc.

METODOS HISTOLÓGICOS

• INJERTOS O TRANSPLANTES

– Homo-injertos: se realizan en la

misma especie• Auto-transplantes ( el mismo individuo)• Alo-injertos (diferentes individuos)

– Isotransplante

Homotransplante

Alotransplante

METODOS HISTOLÓGICOS

– Hetero-injertos o xeno-injertos: se

efectúan entre especies diferentes

Xenotransplante o heterotransplante

Xenotransplante o heterotransplante

METODOS HISTOLÓGICOS

• Disociación

• Escisiones

• Iluminación especial

METODOS HISTOLÓGICOS• Disociación

• Escisiones

METODOS HISTOLÓGICOS

• Maceracion

es

• Inyecciones

METODOS HISTOLÓGICOS

• Reconstrucciones

METODOS HISTOLÓGICOS

• Fotografías• Videos• Dibujos

METODOS HISTOLÓGICOS

• DIRECTOS• INDIRECTOS• COLORACIÓN

METODO DE COLORACIÓN

• SE BUSCA CONTRASTAR COMPONENTES CELULARES O EXTRACELULARES A TRAVÉS DE SUSTANCIAS CROMÓGENAS.

TEORÍAS DE LA COLORACIÓN

FÍSICAQUÍMICAFÍSICO-QUÍMICA

CLASIFICACIÓN DE LOS COLORANTES

CLASIFICACIÓN POR SU ORIGEN

• NATURALES• ARTIFICIALES

CLASIFICACIÓN DE LOS COLORANTES

CLASIFICACIÓN POR SU ORIGEN

• NATURALES

COLORANTES

NATURALESVEGETALES

• hematoxilina, azafrán, orceína.

COLORANTES

ANIMALES• carmín

(cochinilla)

COLORANTES

ARTIFICIALESPIGMENTOS

• rojo rutenio, verde brillante, azul de Prusia.

• Derivados de la anilina

• (destilación de la hulla)

Colorantes. Clasificación química

• Colorantes Básicos

• Colorantes Ácidos

• Colorantes Neutros

...

Procesamiento Histológico

• Toma de la muestra• Fijación• Repicado• Inclusión de la muestra• Corte al micrótomo• Coloración• Montaje

Fases o procesos:

Procesamiento Histológico

• Toma de la muestra– Identificación

• Especie• Raza• Número• Etc.

Procesamiento Histológico

• Toma de la muestra– Tamaño

Procesamiento Histológico

• Toma de la muestra– Tamaño: 0,5 a 1

cm

FIJACIÓN

PRINCIPIO DE LA FIJACIÓNCARACTERÍSTICAS DE UN BUEN FIJADOR

FIJACIÓNFormol al 10 %

Inmersión o perfusión

Procesamiento Histológico

• Toma de la muestra– Identificación

Repicar la muestra

Procesamiento Histológico

• TOMA DE LA MUESTRA (0,5-1 CM)• FIJACIÓN: 40-60 VECES EL VOLUMEN• LAVADO EN AGUA CORRIENTE

¿cómo cortar tan delgado?

¿ 5 micrómetros?

¡¡¡ parafina !!! ... Pero y el agua?

¡¡¡ No son miscibles!!!

Procesamiento Histológico

• DESHIDRATACIÓN EN ALCOHOLES CRECIENTES (50º- 100º)

• ACLARAMIENTO EN XILOL• INCLUSIÓN EN PARAFINA

• CONFECCIÓN DE LOS BLOQUES

Inclusión en parafina

• Procesamiento de la muestra– Lavado– Deshidratación– Aclaramiento

(xilol)– Inclusión en

parafina

Inclusión

• Confección del bloque– Identificación

Inclusión

• Confección del bloque

Corte al microtomo

• 5 micrómetros– Deslizamiento– Rotación

• 5 micrómetros– Deslizamiento– Rotación

MICROTOMO DE DESLIZAMIENTO

Procesamiento Histológico

Microtomos de deslizamiento

Corte al microtomo

• 5 micrómetros– Microtomos de rotación

Procesamiento Histológico

• Recolección de los cortes– Pescado (baño

María)

Procesamiento Histológico

• Recolección de los cortes• Desparafinación

– Estufa– Xilol

¿ y el agua ? ...

• Hidratación(alcoholes decrecientes)

• Coloración

COLORACIÓN HEMATOXILINA Y EOSINA

COLORACIÓN HEMATOXILINA Y EOSINA

• Coloración– Desparafinación (xilol)– Hidratación– Coloración Hematoxilina– Coloración Eosina

HEMATOXILINA & EOSINARESUMEN:• CORTE AL MICROTOMO• RECOLECCIÓN (BAÑO DE MARÍA)• DESPARAFINACIÓN (XILOL)• HIDRATACIÓN ALCOHOLES DECRECIENTES

(100º A-AGUA)• COLORACION HEMATOXILINA( núcleo-

ácidos)

HEMATOXILINA & EOSINA

• LAVADO AGUA CORRIENTE• COLORACIÓN EOSINA• LAVADO CON AGUA• DESHIDRATACIÓN• ACLARAMIENTO• MONTAJE

Tipos de coloración ( acorde color producido )

Tipos de coloración ( acorde color producido )

• Ortocromática

• METACROMÁTICA

• Impregnación

Tipos de coloración ( acorde color producido )

• Retrógrada

• Progresiva

• VITAL (in vivo, in vitro)

• Histoquímica

MÉTODOS HISTOQUÍMICOS

Para carbohidratos: PAS, PAS-D

Lípidos.: SUDÁN, ACEITE ROJO

Ácidos nucléicos: FEULGEN

Pigmentos y minerales: VON KOSSA (Ca.)

EnzimaS : FOSFATASA (alcalina , ácida), ESTERASAS

MÉTODOS HISTOQUÍMICOS

COMPOSICIÓN QUÍMICA DE LOS TEJIDOS

MÉTODOS INMUNOHISTOQUÍMICOSENZIMAS (P-AP), FLUORESCENCIA

OTRAS COLORACIONES

• PARA TEJIDO CONJUNTIVO• FIBRAS RETICULARES• IMPREGNACIONES ARGÉNTICAS Y

ÁUREAS• CELULAS CROMAFINES• HONGOS• BACTERIAS

Coloración H & E

COLORACIÓN H & E

HISTOQUÍMICA: Azul Alciano

HISTOQUÍMICA: PAS

COLORACIONES ESPECIALES: TRICRÓMICAS

COLORACIÓN FIBRAS ELÁSTICAS

FIBRAS ELÁSTICAS

IMPREGNACIÓN ARGÉNTICA

METACROMASIA: AZUL DE TOLUIDINA

TRICRÓMICA

CME “DR. HUMBERTO FERNÁNDEZ MORÁN”

PANTALLA FLUORESCENTE

RESULTADO

Transmisión Barrido

GRACIAS POR SU ATENCIÓN