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Oscurecimiento enzimático

EC 1.10.3.1. Polifenoloxidasa

MonofenolmonoxigenasaDifenol:O2 oxidoreductasa

OH

OH

CH3

OH

CH

+ O2+2H++2e- difenol

monofenol

CH3

OH

OH

O

O

+ 1/2 O2 -2e-

E-2Cu+ E-2Cu2+

E-2Cu+E-2Cu2+catecol

o-benzoquinona

�Fenolasas se han aislado de cutículas de camarón, de cangrejo, langosta, de la glándula de tinta de moluscos y de piel de peces “goldfish” (dorados)peces “goldfish” (dorados)

�Enzimas activas en rango de pH de 5 a 8.5,

�el PM varía según la fuente: camarón 30-40, langosta 64, mejillones 120 y cefalópodos 125-205 kDa

� Las fenolasas de crustáceos pueden existir latentes como pre-polifenoloxidasas

�En langosta esta se activa por tripsina�En langosta esta se activa por tripsina�La mancha negra ocurre en langosta

enhielada o congelada�Es suceptible a melanosis por trauma�La mancha azul-negra del cangrejo puede

estar asociada a fenolasas pero también a oscurecimiento no enzimático

�Los cangrejos estresados contienen mas sustratos de la rx fenolasa

�Tirosina (un monofenol) es el sustrato más abundante para la PPO en crustáceosabundante para la PPO en crustáceos

�La mancha negra en camarón ocurre mas en hembras

Melanosis en camarón rosa

Escala

0 Ausente2 ligera en algunos4 ligera en la mayoria6 moderado en mayoria6 moderado en mayoria8 Alta en algunos10 Alta en la mayoria

Funciones fisiológicas

�Esclerotización del exoesqueleto (mudas)�Las quinonas reaccionan con grupos �Las quinonas reaccionan con grupos

laterales de las proteínas adyacentes (endurecimiento)

�Proceso de cicatrización

Defensa contra microorganismos

� Implicaciones en inmunidad y reconocimiento

�Al reconocer microorganismos actúan las enzimas que activan los zimógenos de enzimas que activan los zimógenos de PPO

�Se producen compuestos fenólicos que actúan defendiendo contra la invasión

�Manchas ($$)

Esquema de la activación de PPO por Microorganismos

Glucanos,

Microorganismos

Melaninas

Antimicrobianos

Glucanos, Glucoproteinas,

Laminarina Proteasas

PPOinactiva

PPOactiva fenolicos

Productos polimerizados

?

Principal problema de los crustaceos como producto alimenticio

�No tiene implicaciones nutricionales

�Calidad�Calidad

Características de PPO de crustáceos

Fuente PM (kDa)

Act esp

Km (mM)

pH opt

Temp opt (oC)

c. blanco 30 59 2.83 7.5 45

c. cafe 210 0.26 6c. cafe 210 0.26 6

c. rosa 40 82.8 1.63 8 40

Langosta spiny 97 0.36 9.85 6.5 35

Langosta 21.1 2.13 6.5 30

PPO

Sitio activo

Control del oscurecimiento

�Procesamiento�Calentamiento�Refrigeración�Congelación�Congelación�Deshidratación�Irradiación�Alta presión �CO2 supercrítico�Ultrafiltración�Sonicación

Calentamiento

Congelación

� Los solutos a altas concentraciones son inhibidores (Tappel, 1966)

� Cambios en pH (Fennema, 1975)� Perturbación de grupos tiol, por:

� 1) mayor concentración de grupos disulfuro� 1) mayor concentración de grupos disulfuro� 2) cambios en la conformación� 3) oxidación de los grupos sulfidrilos debido a aumento en la concentración de

O2 en el hielo (Fennema, 1975).

� Remoción de agua durante la congelación, alteración del ambiente para la enzima (algo similar a la deshidratación)

Dosis (kGy) Efectos

0.05-0.15Inhibe germinación en tubérculos, bulbos y raíces de plantas; inhibeel crecimiento de espárrago y hongos

0.15-0.75 Desinfestación Insectos

0.25-0.50 Retarda la maduración de frutas

Irradiación

0.25-0.50 Retarda la maduración de frutastropicales, papaya, plátano, mango

>1.75 Control de enfermedades poscosecha

1.00-3.00 Acelera maduración; desarrollo de malos sabores en algunosproductos

>3.00Reblandecimiento, madurezanormal; desórdenes fisiológicos, mal sabor

Altas presiones

� Desnaturalización de la enzima � Rearreglo y/o destrucción de enlaces no

covalentes �Puentes H. interacción hidrofóbica, enlaces �Puentes H. interacción hidrofóbica, enlaces

iónicos � Reducción de espacios moleculares � Presiones de más de 5 kbar causan

desnaturalización irreversible de las enzimas

Altas presiones

Fluído supercrítico

�Un fluido supercrítico existe en el estado fluido arriba de su temperatura y presión crítica

�Tiene una densidad similar a la de un líquido, una tensión superficial cerca de cero y un rango de difusividad y viscosidad entre líquido y gas

CO2 supercrítico� El bióxido de carbono tiene una temperatura y presión

críticas baja � Su efectividad en la preservación de alimentos es

debido a que al disolver el agua, el CO2 a alta presión produce ácido carbónico, que afecta temporalmente el pH, por lo tanto inactiva enzimas y microorganismos pH, por lo tanto inactiva enzimas y microorganismos

� PPos de langosta de Florida, de camarón café y de papa han mostrado una reducción relacionada a tiempos de exposición a tratamientos de 43 oC y CO2 a alta presión a 58 atm (Chen et al. 1992). Estudios cinéticos muestran que las ppos de crustáceos fueron más vulnerables a los tratamientos que las ppos de papa

Sonicación

� El uso combinado de calor y ondas ultrasónicas puede contribuir a la inactivación de enzimas

� Cuando se aplica a líquidos, las ondas ultrasónicas promueven la formación de burbujas

� La interfase de burbuja/líquido contínuamente pasa por cambios en tamaño y forma. Las corrientes acústicas en el líquido causan tamaño y forma. Las corrientes acústicas en el líquido causan esfuerzo que promueve la desnaturalización de las enzimas

� La sonicación tambien promueve rx que involucran a los radicales libres H× y OH× que se forman de la descomposición del agua por la oscilación de las burbujas (El. piner et al. 1965)

� Estos radicales pueden ser atrapados por los residuos de aminoacidos de las enzimas que participan en la estabilidad de la estructura, la unión con el sustrato o las funciones catalíticas (Gebicki and Gebicki, 1993).

� Inhibidores�Agentes reductores/antioxidantes

�Sulfitos, ac. ascorbico, ac. eritorbico, cys,

�Acidulantes�Ac. láctico, citrico, fosfórico

�Quelantes�EDTA, fosfatos, maltol, ac. kojico

�Agentes complejos�Agentes complejos�Ciclodextrinas, quitosano

� Inhibidores de enzimas�4 hexilresorcinol, sales de haluros, miel, AA y proteinas,

�Otros�Enzimas asesinas:actinidina, papaina, bromelina, �Películas comestibles

Sulfitos

�SO2: dióxido de azufre�SO3

2-: sulfito�HSO3

-: bisulfitoS O : metabisulfito�S2O5

2-: metabisulfito

Sulfitos

�Es la práctica más común en la industria para el control de manchas

�Baño en solución al 1.25% de bisulfito�100 ppm residual máximo�100 ppm residual máximo�Quinonas a difenoles�El sulfito es competidor de la PPO, une S

al sitio activo�Ac Asc GRAS sustituto de sulfitos

Por agentes reductores

Ácido. Kójico

� Metabolito de hongos Aspergillus y Penicillium

� Presente en productos fermentados asiáticosfermentados asiáticos

� Act antifúngica y antibacteriana

� Acción quelante del Cu� Dudas de su uso por act

mutagénica

Ciclodextrinas

quitosano

� Reduce el oscurecimiento� No se conoce bien su modo de acción� Cargas positivas� Si se usa como película limita la cantidad de � Si se usa como película limita la cantidad de

oxígeno disponible

4 hexil resorcinol

� Por su semejanza compite por sustratos por la PPO

Mancha en camarón (Lambrecht, 1995)