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Por qué avanzar hacia la detección
MS/MS en las aplicaciones de
toxicología forense
Jaume C. Morales
MS Product Specialist
Agilent Technologies Spain
Octubre 2011
MAD/BCN
2
GC/MS QQQ ¿Qué es GC - MS/MS?
Esta técnica se está convirtiendo en la herramienta de análisis preferida en
el análisis de compuestos de interés en matrices complejas (restos de
incendio, sangre, plasma, etc…).
La técnica MS / MS es una técnica de espectrometría de masas altamente
selectiva, gracias a la cual los analitos se detectan con independencia de la
matriz de la muestra o interferencias coeluidas.
Con GC - MS/MS la matriz es virtualmente eliminada. Es ideal para el
análisis de compuestos de interés en diversas matrices como :
Complejas muestras ambientales
Plaguicidas en los alimentos
Metabolitos de drogas
Residuos de medicamentos en fluidos biológicos
y otras pruebas de trazas forenses.
3
GC/Triple Cuadrupolo Proporciona Alta
Sensibilidad y Selectividad para análisis complejos
Cuad. MS1 y
Post-Filtro
Celda de
Colisión
Pre-Filtro y Cuad.
MS2 Detector Fuente
EI/CI
7000 B MS/MS System Optimizado para cromatografía de gases
¿Cómo funciona?
4
GC/MS QQQ Cómo funciona
Cuad. MS1 y
Post-Filtro
Celda de
Colisión
Pre-Filtro y Cuad.
MS2 Detector Fuente
EI/CI
7000 B MS/MS System Optimizado para cromatografía de gases
Después de la separación por cromatografía de gases, los compuestos son
ionizados en la fuente de EI/CI.
El Cuad. MS1 opera seleccionando en primer lugar el Ion Precursor de elección
en la primera etapa de la MS/MS, que separa los iones del fondo químico de la
matriz.
GC/MS QQQ Cómo funciona
170 210 250 290
210
222
268 280 165
Espectro con todo
lo ionizado en la
Fuente EI/CI Q1 deja pasar
solamente el
ión m/z 210
190 210
210
6
GC/MS QQQ Cómo funciona
Cuad. MS1 y
Post-Filtro
Celda de
Colisión
Pre-Filtro y Cuad.
MS2 Detector Fuente
EI/CI
7000 B MS/MS System Optimizado para cromatografía de gases
Estos iones precursores seleccionados son entonces inducidos (RF) para
disociar por colisión con las moléculas de helio. La resultante es un espectro de
fragmentos único del producto que proporciona la confirmación del analito
objetivo.
GC/MS QQQ Cómo funciona
170 210 250 290
210
222
268 280 165
Espectro con todo
lo ionizado en la
Fuente EI/CI Q1 deja pasar
solamente el
ión m/z 210
190 210
210
La Celda de
Colisión rompe
el ion m/z 210
en fragmentos
150 170 190 210
210 158
191
8
GC/MS QQQ Cómo funciona
Cuad. MS1 y
Post-Filtro
Celda de
Colisión
Pre-Filtro y Cuad.
MS2 Detector Fuente
EI/CI
7000 B MS/MS System Optimizado para cromatografía de gases
De los fragmentos iónicos, el Cuad.MS2 selecciona aquellos que son
característicos para cada analito tal como se ha programado en el método
dando lugar a las llamadas transiciones. El detector cuantifica éstos iones que
ha dejado pasar el Cuad. MS2
GC/MS QQQ Cómo funciona
170 210 250 290
210
222
268 280 165
Espectro con todo
lo ionizado en la
Fuente EI/CI Q1 deja pasar
solamente el
ión m/z 210
190 210
210
La Celda de
Colisión rompe
el ion m/z 210
en fragmentos
150 170 190 210
210 158
191
Q3 sólo deja pasar
los fragmentos
característicos del
ion mz/ 210 :
158 y 191 para
cuant y cual.
160
158
190
191
no hay ruido químico
10
GC/MS QQQ
Mayor selectividad que en SIM
El aumento de la selectividad de MS/MS también se traduce en una mejora de
la relación señal / ruido, lo que permite niveles de detección más bajos.
Por otra parte GC-MS/MS proporciona una identificación inequívoca en los
casos en que los espectros GC/MS de los compuestos son difíciles de
interpretar.
Por lo tanto, incluso si la matriz contiene otro compuesto con la misma masa
que los iones de los padres para el analito de interés, es muy poco probable
que los iones de interferencia den el mismo espectro hijo que la sustancia
analizada, por lo tanto GC-MS/MS es más específica.
GC/MS QQQ Mayor selectividad que en SIM
Ion Analito
Precursor
Producto 1 Producto 3
Producto 2
EI-SIM Selectividad proporcional a
la resolución espectral
Sin selectividad para iones
con la misma m/z
EI-MS/MS Selectividad del precursor como SIM Alta probabilidad de que al menos un ión
fragmento sea único del analito y no de la
Interferencia interferencia
analito
interferencia
El ión precursor no debe utilizarse para cáculos
de ratios ni cuantificación
unit mass resolution
12
Scan Ion 315
Scan Ion 230
Scan Ion 70
SIM Ion 315
SIM Ion 316 SIM Ion 230
NPD
4.7 4.8 4.9 5.0
Respuesta MS y NPD de Oxycodone
en extracto de sangre por GC/NPD/MSD/DRS
9.55 9.6 9.65 9.7 9.75
MRM 315 -> 230.1
MRM 315 -> 258
MRM 230 -> 215.3
MRM 201 -> 186.1
La alta selectividad sobre las interferencias en la matriz de
sangre permite la confirmación con tres iones cualificadores en
~ 60 pg de Oxycodone en columna.
Respuesta GC/QQQ MS de Oxycodone
en el mismo extracto de sangre
¿Porqué GC/MS/MS?
Una imagen vale más que mil palabras …
GC/MS/MS QQQ MRM
GC/MS Single Quad SIM
EI 100fg HCB in “DIRTY”
Matrix
S/N: 116:1 RMS
100 fg HCB
MS SIM
MS/MS MRM
A chromatographer’s
dream: single peak on
flat baseline
¿Porqué GC/MS/MS?
Una imagen vale más que mil palabras …
GC/MS/MS QQQ MRM
GC/MS Single Quad SIM
EI 100fg HCB in Matriz
SUCIA
S/N: 116:1 RMS
100 fg HCB
MS SIM
MS/MS MRM
El sueño del analista:
Un pico en una linea de
base plana
SIM vs MRM para HCB
100 fg HCB in disolución acuosa
Sin
gle
MS
: S
IM 2
83.8
M
S/
MS
: 283.8
:213.9
S/N=37:1 RMS
S/N=26:1 RMS
Inyección de 100 fg de
Hexaclorobenzeno (HCB)
por SIM.
Inyección de 100 fg de
Hexaclorobenzeno (HCB)
por MRM.
Mismo orden de S/N !!!
SIM vs MRM para HCB
100 fg HCB in disolución acuosa 300 fg HCB en Diesel
Sin
gle
MS
: S
IM 2
83.8
M
S/
MS
: 283.8
:213.9
S/N=6:1 RMS
S/N=86:1 RMS S/N=37:1 RMS
S/N=26:1 RMS
La propuesta de Agilent : GCQQQ 7000B
Agilent aprovecha la mejor tecnología del líder en el mercado de GC/MS, la serie 597X :
– Cuadrupolos monolíticos de cuarzo, recubiertos de oro y calefactados
– Demostrado diseño y rendimiento de fuente EI/CI
– AUTOTUNE
Así como de la serie LC/QQQ 64XX :
– Celda de colisión con aceleración lineal
– Optica iónica de filtrado QQQ
– Mass Hunter software
7000B GCQQQ Diseño basado en el rendimiento y la robustez de la aplicación Niveles de sensibilidad de femtogramos en columna y MRM de alta velocidad accesibles para un amplio rango de usuarios
– Sensibilidad: 100 fg OFN a 500:1 RMS S/N
– Alto rendimiento SRM (MRM) con hasta 500 transiciones/s
– Celda de colisión hexapolar patentada
– Cuadrupolos de cuarzo recubiertos de oro para una segura operación en rutina
– Agilent 7890 GC con Tecnología de Flujo Capilar
– MassHunter Software
Agilent 7000B Triple Quadrupole GC/MS Gold Plated Hyperbolic Quartz Quadrupole
230°C
275°C
300°C
325°C
350°C
Sensibilidad. Fuente iónica a alta temperatura
Respuestas mejoradas para un amplio rango de compuestos
– Operación más robusta para matrices sucias
– Mejor respuesta para compuestos con “tailing”
– Picos más estrechos para compuestos de alto punto de ebullición
Diseño óptimo para el rendimiento de la fuente. El rendimiento de la lente
de entrada elimina la necesidad del pre-filtro
Problemas de la fuente de ionización en GC-MS: Contaminación en las zonas frías
Moléculas neutras a alta temperatura provenientes del GC se “pegan” a las partes frías de la fuente. La presencia de iones Helio ayudan a que estos iones se “peguen” a esas partes frías
Contaminacion de partes “frías” de la fuente (frío ≈ 200ºC)
Contaminacion de un analizador “frío”
Rods del cuadrupolo < 100ºC
- Capacidad de programación de temperatura Hot/cold S/SL (pulsed mode), temperature programmed vaporization (PTV), solvent vent.
- Flexibilidad en los volúmenes de inyección Análisis de muestras termolábiles y mínima discriminación en la inyección para compuestos con alto peso molecular
- Mayor sensibilidad en inyecciones de gran volumen
- Compatibilidad con Tecnología de flujo Capilar Venteo de disolventes y uso de Backflush
- Totalmente integrado con Chemstation, EZChrom y MassHunter
Inyector Multimodo MMI
Ambient In-vial Small-Volume Derivatization Dilution Internal Standard Heating/Mixing Headspace Extraction Sampling Addition Bar Code
GC/QQQ Analyzer
Inert, high
temp source (same as 5975)
Triple-Axis
detector (same
as 5975)
Two gold plated quartz,
hyperbolic analyzers (same as 5975)
GC/QQQ Analyzer
Shown with shields for
analyzers and collision cell
New high performance,
hexapole collision cell
with patent technology
Edwards
Split Flow Turbo
Analyzer Details
Hinges
Collision cell cradle
September, Pag
Analyzer Doors Open
Triple-Axis
Detector
Inert, 350ºC
Source
Collision Cell Details
Quadrupole post-
filter
Quadrupole pre-
filter
Support cradle
(Cell housing and 2 rods removed for clarity)
Sensibilidad. Celda de colisión con gas de quenching
Celda de Colisión
Entrada Precursor He* +
Disociación por colisión
1 ml/min N2 Gas Colisión
La transmisión de helio metastable
hacia el detector se reduce de modo
notable. Además el TAD reduce aún más el ruido de
neutros
Fuente Detector
Cuadrupolo Cuadrupolo
He Buffer Gas
He* + He → 2 He + Q
Salida Producto
+ He*
Efecto del “Helium Quench”
S/N 341:1 Helium Quench Gas OFF
tested with
hexachlorobenzene
Efecto del “Helium Quench”
S/N 1294:1 Helium Quench Gas ON
S/N 341:1 Helium Quench Gas OFF
Almost 4 X
Increase in S/N
Efecto del “Helium Quench”
Noise Comparison
S/N 1294:1 Helium Quench Gas ON
S/N 341:1 Helium Quench Gas OFF
tested with
hexachlorobenzene
The increase in
S/N was due to
reduction of noise.
High Performance Triple-Axis Detector
Ultra low neutrals noise
Long life and high linearity
“Gain Normalization” corrects tune file for detector aging to
allow repeatable long term method sensitivity
Same design as used in the 5975C GC/MSD
Triple-Axis Detector
hyperbolic quartz
transmission
quadrupole
analyzer
triple channel
electron
multiplier
high energy
dynode
steering rod
ion beam
X
Y
Offset
Z shield for
secondary
particles
0
5000
10000
15000
20000
25000
30000
35000
40000
495 500 505 510
MS2 502 Peak Shape
• Formas de pico mejoradas a alta masa
• Sensibilidad mejorada a masas
medias/altas
Mass Iris (V) Signal
Increase
69 -1 1.0X
131 -8 1.1X
264 -13 1.5X
414 -20 2.5X
502 -30 2.8X
614 -35 4.0X
Sensibilidad. Ramped Detector Iris
Backflush Tecnología de Flujo Capilar
S/SL Inlet
Capillary Flow Device
2 psi
60 psi
Detector/es
Split Vent
Durante GC Run
Después GC Run
S/SL Inlet
Capillary Flow Device
25 psi
4 psi
Detector/es
Aux EPC Split Vent
Aux EPC
Backflush al final de cada inyección
Backflush 20 sec Flujo
Backflush 30 sec Flujo
Backflush 40 sec Flujo
Backflush 60 sec Flujo
Columna Inlet
Fin del run Flujo
La finalidad es eliminar componentes pesados al final de cada inyección
Sin opción de backflush Un problema serio
Abundance
4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 0
2000000
4000000 6000000
8000000 1e+07
1.2e+07 1.4e+07
1.6e+07 1.8e+07 2e+07
2.2e+07 2.4e+07
2.6e+07 2.8e+07
3e+07 3.2e+07
3.4e+07 3.6e+07
3.8e+07 4e+07
4.2e+07 4.4e+07
4.6e+07
Time
B
A
Superposición de dos cromatogramas correspondientes a un blanco inyectado antes y después de una secuencia de tres
inyecciones sin BACKFLUSH
Tras solo 3 muestras, el fondo es claramente mayor debido al
aumento de ruido quimico a nivel espectral
Con opción de backflush Sin incrementos de fondo y RTs repetitivos
Tiempos de retención totalmente estables y línea de base casi libre de ruido químico
4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 0
2000000
4000000
6000000
8000000
1e+07
1.2e+07
1.4e+07
1.6e+07
1.8e+07
2e+07
2.2e+07
2.4e+07
2.6e+07
2.8e+07
3e+07
3.2e+07
3.4e+07
3.6e+07
3.8e+07
4e+07
4.2e+07
4.4e+07
4.6e+07
Time
Abundance
Superposición de dos cromatogramas correspondientes a un blanco inyectado antes y después de una secuencia de tres inyecciones con BACKFLUSH
Nueva Purged Ultimate Union. Modo Analítico
Venteo
Presión / Control
de Flujo
15-m HP-5ms
(0.25mm id x0.25um)
15-m HP-5ms
(0.25mm id x0.25um)
Dispositivo
de Flujo
Capilar
5975C MSD
EI mode
7890A GC
Split/Splitless Puerto
de Inyección
Y ml/min
Y+Z ml/min
Z ml/min
Pueden usarse columnas de fases y dimensiones diferentes
Purged
Ultimate
Union
Reproducibilidad* en RT para Trifluralin en 100 Inyecciones, 3 minutos backflush. Secuencia de 21 horas
Min 6.070
Max 6.075
Mean 6.073
Std Devn 0.00186
% RSD 0.0306 RT (mins)
* Agilent 2x RTL Pesticide Method
5.950
5.970
5.990
6.010
6.030
6.050
6.070
6.090
6.110
6.130
6.150
1 11 21 31 41 51 61 71 81 91 Injection Number
P1
5-20E-5 Torr
P2
8E-5 Torr
Rough Pump
He or H2 (1-8 sccm)
CH4 (0-2 sccm)
Edwards
Split Flow Turbo
Collision Cell
N2
Source Analyzer
High Performance Differentially Pumped
Manifold
Herramientas para optimización automatizada con MassHunter
Proporcionar una serie de herramientas que asisten al usuario en la CREACION y OPTIMIZACION del método de adquisición MS/MS
Dynamic MRM para GC/MS es una parte del flujo de trabajo que incluye la generacion del método (basado en RTs/transiciones conocidas y LA OPTIMIZACION DE LOS PARÁMETROS DE ADQUISICIÓN MRM
Design Experiments Assistant Analyze Experiments Assistant DynamicMRM Assistant
- MassHunter Quant - MassHunter Qual - Microsoft Excel ©
Herramientas de optimización. ¿Generación manual de segmentos?
Zonas de baja densidad de picos permiten una division manual sencilla
En zonas de gran densidad de compuestos es casi imposible. Problema
clásico del campo de residuos
¿Como funciona Dynamic MRM para GC/MS a la hora de optimizar métodos MS/MS?
Dynamic MRM optimiza scan cycle time, dwell times, y el orden de adquisición (generación automatizada de segmentos) para conseguir:
1. Maxima señal
2. Mínimo ruido
3. %RSD bajas
4. La mayor velocidad de análisis
5. La mayor robustez en el método La aproximación tiene en cuenta la integración de picos y el ruido de línea de base en el proceso de optimización del valor de dwell time.
Comparación DynamicMRM vs. Tradicional 250 ppb, 123 compuestos, 298 transiciones
Original
17 segmentos
Dynamic MRM
60 segmentos
Resultados: %RSD Comparación CompoundName
Expert-optimized
RSD
Dynamic MRM
RSD Improved?
Acetochlor 1.4 1.2 Y
Aclonifen 15.7 12.4 Y
Alachlor 2.4 0.8 Y
Allethrin 16.8 11.2 Y
Ancymidol 7.5 7.1 Y
Azaconazole 5.3 4.6 Y
Azinphos-methyl 71.1 25.3 Y
Benfuracarb 14.1 7.4 Y
Benodanil 10.1 8.8 Y
Benzoylprop ethyl 2.7 3.6
Biphenyl 11.6 9.7 Y
Bromacil 19.7 15.2 Y
Bromocyclen 8.1 6.0 Y
Bromopropylate 10.4 11.6
Bromuconazole I 6.1 5.7 Y
Bromuconazole II 5.7 5.7 Y
Buprofezin 6.2 6.1 Y
Butachlor 8.7 8.3 Y
Butralin 16.8 15.7 Y
Captafol 44.7 46.6
Carbofuran 68.3 57.1 Y
…. … …
Average %RSD 11.1 9.3
RSD Std Dev. 12.0 8.8
1. dMRM proporciona un RSD medio 15% menor que el método tradicional 2. La distribución de %RSD es notablemente menor
La ventaja más importante de todas
es el TIEMPO INVERTIDO
POR EL USUARIO.
Notablemente menos en el caso de dMRM
Detección de anómalos
1. Más de 20 criterios posibles
2. Tolerancias establecidas en el método de análisis
3. Avisos & Herramientas de filtrado
4. Report de Anómalos
Batch-at-a-Glance Comprobación de tolerancias para transiciones cualificadoras
Tolerancias definidas
Batch-at-a-Glance Navegación + Informacion
Análisis de Esteroides en Orina por GC/QQQ
Sports Doping
Investigación para la sustitución de un sistema de GC/HRMS por un sistema GC/QQQ
Sample Results: Clenbuterol (9.3 min)
Blank
25pg/ml (higher than
blank) 250pg/ml
Ions LOD
GC/MS 335(t) 337 86 500pg/ml
GC/MS/MS 335 -> 300, 262, 227(t) 30pg/ml*
GC/HRMS 335 337 30pg/ml
*Could detect down to 25 pg/ml but was present in blank.
Methandienone M1: (12.6 Min)
Blank
25 pg/ml
625 pg/ml
Ions LOD
GC/MS 358(t) 143 1000 pg/ml
GC/MS/MS 358 ->301(t) 196, 169 25 pg/ml
GC/HRMS 358 130 pg/ml
Notas de aplicación recientes
5990-7234EN
Fast and Comprehensive Doping Agent Screening in Urine by Triple
Quadrupole GC/MS
5990-7535EN
Rapid, Robust and Sensitive Detection of 11-nor-∆9-
Tetrahydrocannabinol-9-Carboxylic Acid in Hair
5990-6577EN
Separation of Oxymorphone and Oxycodone Hydroxyl-imino Tri-methy
Silyl Derivatives Using an Agilent Fast Toxicology Analyzer and an
Agilent J&W DB-35ms Ultra Inert Capillary GC Column
5990-5748EN
Longterm Detection of Anabolic Steroid Metabolites in Urine
Ejemplo
Rapid, Robust and Sensitive Detection of 11-nor-∆9-Tetrahydrocannabinol-
9-Carboxylic Acid in Hair
LOD of 0.002 pg/mg
0.01 pg/mg LOQ
Figure 3. MRM traces for the quantifying transition (left) and
both the quantifying and qualifying transitions (right) for the
0.002 pg/mg LOD of THCA (upper panel) and the deuterated
standard (lower panel) spiked into a hair sample. Figure 5. MRM traces for the quantifying transition (left) and
both the quantifying and qualifying transitions (right) for the
0.01 pg/mg LOQ of THCA (upper panel) and the deuterated
standard (lower panel) spiked into a hair sample.
Gracias por su
atención
C L E A R LY B E T T E R M S S O L U T I O N S
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Jaume C. Morales
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901.11.68.90
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