Poster Congreso3

Dispersin de Luz a Bajos ngulos en Redes de MicrotbulosMa. Guadalupe Gonzlez-Asevedo1, Abraham de la Cruz-Martnez1, Luis F. Rojas2 and Miguel ngel Ojeda-Lpez11Instituto de Fsica, Universidad Autnoma de San Luis Potos, Mxico, 2Departamento de Fsica, CINVESTAV Resumen Se estudi la cintica de la formacin de agregados paralelos de microfilamentos biolgicos cargados, llamados microtbulos (MTs), utilizando dispersin de luz a bajos ngulos y microscopa ptica de contraste por interferencia diferencial. En vitro, en presencia de cationes multivalentes, los MTs se agregan paralelamente formando redes de manojos, como funcin de la concentracin del catin. Los resultados de dispersin sugieren una semejanza entre la estructura de los agregados de MTs y la de los polmeros sintticos ms pequeos.Figura 1. a) Estructura tridimensional de los MTs, b) estructura de tubulina a) b) Figure 4. a) Trancisin monitoreada con SALS de MTs dispersos y manojos de MTs. b) Intensidad contra concentracin. Figura 2. a) esquema experimental b) foto de la dispersin de manojos de MTs en la CCD AGRADECIMIENTOSAgradecemos al Dr. J.L. Arauz-Lara por amablemente mostrar facilidades para realizar estos experimentos. Tambin agradecemos CONACyT-Mexico su financiamiento a travs de la beca de maestra. Este proyecto fue apoyado por CONACyT en el proyecto Microestructura y Materiales Suaves Ref. U47611-F, y de PIFI-2007. INTRODUCCIN

Los Microtbulos (MTs) son biofilamentos macromoleculares semirgidos, poseen la morfologa de un cilindro hueco, con un dimetro de tan solo 25nm y longitudes que van desde unas cuantas micras a decenas de micras. Se forma a partir de la unin de miles de dmeros de una protena conocida como tubulina (del orden de 1500 dmeros/micra), a travs de un complejo proceso bioqumico denominado polimerizacin (Figura 1). La protena tubulina es sintetizada por la mayora de las clulas eucariotas y es particularmente abundante en las clulas del sistema nervioso, de donde se extrae para experimentos in vitro. En condiciones fisiolgicas (en medio acuoso, pH~7 y T~37) la tubulina adquiere carga elctrica negativa, as los MTs pueden ser considerados como macroiones negativos; partiendo de la estructura de aminocidos de la tubulina, la carga superficial en un MT se estima del orden de -50e/nm2 . Los MTs, son componentes esenciales del citoesqueleto celular, una red intrincada de microfilamentos que da soporte mecnico a las clulas entre otras funciones. Adems los MTs participan en la divisin celular y en procesos de transporte de neuronas. En casi rodas estas funciones los MTs conforman arreglos supramoleculares asocindose con MAPs (Microtubule Associated Proteins) y con otros microfilamentos. Se conocen varios tipos de MAPs las cuales se adhieren a los MTs mediante interacciones electrostticas atractivas entre el dominio (una secuencia en la protena) y la pared proteica del MT. Experimentalmente los MTs son condensados aadiendo cationes multivalentes como espermidina +3, espermina +4. Nuestro propsito en este trabajo ha sido la transicin de MTs sueltos a su estado de agregacin usando dispersin esttica de luz a bajos ngulos. En trabajos de dispersin de rayos-X a bajo ngulo se observo esta transicin y se demostr que los MTs se empaquetan de manera hexagonal (Ref 1). Sin embargo, como la dispersin de luz envuelve longitudes de onda ms grandes, se puede obtener informacin estructural a escalas de longitud ms grandes, lo cual es importante para entender las redes de MTs y sus los agregados.MATERIALES

Los MTs fueron polimerizados de la proteina tubulina (www.cytoskeleton.com) y estabilizados con 20M de taxol, al final de este proceso cierto porcentaje de tubulina permanece sin polimerizar. La proteina sin polimerizar es separada de la soluicin de MTs centrifugando. A lo largo de los experimetos, la concentracin de MTs fue fijada a 0.5mg/ml. cation-MT. Para inducir la agregacin de MTs a manojo, un catin trivalenete (espermidina) fue aadido en pasos a partir de una solucin altamente concentrada. Para el microscopio ptico, una pequea cantidad de la muestra fue tomada y sellada dentro de un celda hecha con un porta objetos y un cubreobjeto, y analizada por microscopa ptica DIC, usando un objetivo de 60X-2X de inmersin en aceite acoplado a una video-cmara enaltecida de alta resolucin (DAGE). Para SALS, la solucin fue puesta dentro de una celda de cuarzo circular de 1cm de alto y de diametro y dispersada inmediatamente.RESULTADOSEn la figura 3 imgenes representativas del microscopio ptico DIC de MTs sueltos (3a) y manojos de catin-MT (3b) son mostrados para ilustracin. La transicin de MTs sueltos a manojos toma lugar a una concentracin critica de catin (espermidina 3+) en la solucin. El punto critico a lo largo de la transicin puede ser observada en experimentos de SALS. Por ejemplo, la figura 4a muestra la intensidad integrada I(q) para varias concentraciones (0-30 mM). La doble flecha vertical denota donde el punto critico aparece, al rededor de la concentracin de 12-14mM de espermidina. Encontramos estos valores muy consistentes con las imgenes de las muestras tomadas con microscopa. En los datos de SALS se nota el salto en la intensidad, particularmente a pequeos valores de q, y un ligero cambio en la pendiente. Para un rodillo rgido o un cilindro el desarrollo terico de I(q) en la aproximacin de Rayleigh-Gans predice una pendiente de 1/q mientras que para un polmero parecido a un gusano la aproximacin de Debye da una cada de 1/q2 (Ref. 2). En nuestro caso vemos que los MTs siguen la ltima dependencia 1/q2 cercana a la forma 1/q aun en el caso de MTs desagregados. As, nuestros datos de SALS sugieren un paralelismo con la estructura de un polmero a escalas molecular de biopolmeros macroscpicos tal como MTs. En la figura 4b se puede apreciar el cambio de intensidad para distintos qs cuando los MTs estn dispersos con respecto a los MTs agregados (entre Cz = 12mM y 14mM).DESARR0LOLLO EXPERIMENTAL

En un experimento de dispersin de luz un rayo de luz o radiacin incidente golpea una muestra y es dispersado por su estructura microscpica. En experimentos de dispersin de esttica de luz la intensidad de la luz dispersada es medida como una funcin del vector de dispersin, q, el cual esta relacionado con el ngulo de dispersin, , por la ecuacin,Donde n es el ndice de refraccin del medio y i la longitud de onda de la luz incidente. El vector q esta relacionado a escalas de longitud por d ~ 1/q. En nuestro experimento i = 0.6328m, as de la ec. (1) exploramos escalas de longitud del orden de 1-50 m, valores de