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Regulación de la Expresión Genética Mediante RNA: Interferencia por RNA
(RNA Interference), Ribozimas y Aptámeros
Oscar N. Ruiz, Ph.D.
Curso: BIOT 3250
Universidad Interamericana de Puerto Rico, Recinto de Bayamon
A. Objetivos
• Entender los mecanismos de silenciamiento y regulación de genes controlados por RNA.
• Comprender los conceptos que permiten la aplicación de la regulación mediante RNA a la biotecnología moderna.
• Aplicar los conceptos de la regulación de expresión mediante RNA para el desarrollo de agentes terapéuticos.
B. Conceptos Previos• Transcripción
– Promotor y Terminador– Estructura secundaria del RNA
• Modificaciones Post-transcripcionales– RNA Splicing : separacion del RNA
– RNA Editing: cambios de nucleotidos para favorecer codones abundantes
• Regulacion de la expression:– Eucariota: transcripcional, post-transcripcional y traduccional– Procariota: transcripcional
C. Pertinencia del Tema• Nuevas terapias son requeridas para contrarrestar:
– Enfermedades bacterianas • MRSA: “methicillin-resistant S. aureus” (www.cdc.gov)
– Enfermedades virales • VIH: Retrovirales (inhibidores de proteasa y inhibidores
de retro-transcripción)• Fiebre aviar (Avian Flu)
– Enfermedades genéticas• Cáncer: gen p53 (Brummelkamp et al., 2002)
– Desarrollo de organismos modelos
– Estudios de función de los genes mediante “gene knockdown”
D. Marco Conceptual
• Interferencia por RNA o RNA interference (RNAi): la inhibición especifica de la expresión de genes mediante dsRNA (Fire, 1999).
• RNAi es un mecanismo conservado en eucariotas:– Protege contra:
• RNAs exogenos: viruses• Transposones: elementos móviles y repetitivos
– Regulación post-transcripcional• Genes del desarrollo
• Aplicaciones biotecnológicas:
– Permite el análisis proteomico a gran escala
– Se está convirtiendo en una tecnología muy prometedora para el desarrollo de agentes terapéuticos (Santel et al., 2006) .
• Gran especificidad
• Bajos efectos secundarios
• No se conoce resistencia
– Desarrollo de organismos modelos para enfermedades humanas.
RNAi en la Célula
Shi et al., 2002
Mecanismo del RNAi
• En animales RNAi requiere múltiples pasos:
– Generación de siRNAs a partir de dsRNAs largos
• Rnase III-like endonuclease (Dicer)
– Degradación de RNA complementario mediante el complejo siRNA-RISC (RNA-induced silencing complex) (Hannon, 2002).
www.rnaiweb.com/RNAi/What_is_RNAi
• El mecanismo de RNAi es bien conservado pero con características diferentes en cada organismo:
– C. elegans: ocurre la amplificación y conversión de ssRNA a dsRNA
• RNA-dependent RNA polymerase
• Este dsRNA es substrato para mas RNAi mediante (Ahlquist, 2002).
– C. elegans: se ha observado el esparcimiento de RNAi de una célula a otra:
• Efecto sistémico
• Transportador específico de siRNA en la membrana celular (Winston et al., 2002).
• ORFs similares a los de C. elengans en humanos y en ratones pero .
park.itc.u-tokyo.ac.jp/mgrl/IINO_lab/g2_molgenet2.html
RNA polimerasa dependiente de RNA “RNA-dependent RNA polymerase”
• En C. elegans and Drosophila: – siRNA se deriva de dsRNA largos.
• En las células mamíferas:– dsRNA mayores de 29 nt producen la activación de la
“dsRNA-dependent protein kinase (PKR)” (Stark et al., 1998; Schiffelers et al., 2004)
• Produce la inhibición generalizada de la transducción e induce a la apoptosis (Gil, 2000).
• Dicer tiene baja actividad en el procesamiento de dsRNA largos in vivo
– Acumulación de dsRNA (Brummelkamp et al., 2002).
• Activa la respuesta tipo 1 mediada por inteferón• “STAT-mediated expression of PKR”.
– signal transducer and activator of transcription 1 (91kDa)
• dsRNA se une a PKR directamente y la activa– Ocurre fosforilacion del factor de iniciación eucariota (global
shutdown of translation).
• dsRNA promueve la síntesis de acido poliadenílico “polyadenylic acid”
– Activa a Rnase L
http://www.ambion.com/techlib/resources/RNAi/
fig.cox.miami.edu/~cmallery/.../how_siRNA_works.htm
www.biovalley.fr/francais/.../collec_shrna_pour_rnai.htm
• Producción de siRNA por síntesis química– Beneficios:
• Muy específicos • Síntesis a gran escala es posible
– Problemas: • Se necesita suplir el siRNA de forma continua• Su síntesis es costosa• Se necesitan con alta pureza y concentración
– estudios in vivo necesitan altas concentraciones.
• Es necesaria la utilización de lisosomas y compuestos poli-cationicos para envío.
Estatus de la Tecnología
Producción de siRNA mediante vectores plásmidos:Se Pueden utilizar el promotor de la RNA polimerasa III:
• contiene todos los elementos de transcripción contenidos de forma compact
• La RNA polimerasa III esta envuelta en la producción de micro-RNA celulares y produce una extensión de 2 nt.
• Permite expresión por periodos mas prolongados
• Alta expresión y costos mas bajos
• Problemas:
– Expresión temporera del siRNA
– Eficiencia de la transfección es muy baja especialmente in vivo.
• Para resolver algunos de los problemas encontrados se han utilizado vectores virales incluyendo: retroviruses, lentiviruses, and adeno-associated viruses:
– Herramienta muy efectiva para la producción de siRNAs en células (Brummelkamp et al., 2002; Haasnoot et al., 2004; Zhang et al., 2004)
• Expresión estable y constitutiva • Alta transferencia del transgene
• Desventajas:
– Retroviruses han causado efectos adversos en estudios clínicos.
– Limita la aplicación de este sistema y otros sistemas de integración al azar como métodos de expresión de siRNA en el futuro cercano (Recchia et al., 2006).
• Posibilidad de contaminación con virus viables.
– Capacidad limitada para utilización in vivo en humanos:
• Tropismo del virus es limitado
• Es trabajoso seleccionar las células transfectadas.
• Enfermedades humanas en estado avanzado requieren expresión del siRNA en múltiples tejidos o en el cuerpo completo.
• De manera alternativa, se podría inyectar siRNA sintetizados in vitro o químicamente cubiertos por liposomas (Santel et al., 2006).
– Mas seguro
– Requiere altas concentraciones del siRNA
– Es muy costoso
G. Resumen La tecnología del RNAi ha demostrado gran
potencial RNAi in vitro and in vivo (Fraser et al., 2000; Lewis et al., 2002)
• Grandes aplicaciones terapéuticas
• RNAi ha logrado la reducción de la expresión de proteínas en sobre un 90%.
• Múltiples genes han logrado ser silenciados:– Genes reporteros– Genes virales (HIV proteins vif, nef and LTRs)– Oncogenes (p53)
Problemas que limitan el uso de RNAi como agentes terapéuticos en humanos: (Uprichard 2005).
– Mecanismos de envío
– siRNA (small interference RNA) de tamaño específico 19-23 nt
– Efecto transitorio
– Síntesis costosa
D. Marco Conceptual: Aptámero
• Oligonucleótidos de RNA o DNA que producen estructuras secundarias tridimensionales con especificidad por otras moléculas
• SELEX: Evolución sistemática de ligándos por enriquecimiento exponencial “Systematic evolution of ligand by exponential enrichment”– Biblioteca de 1 x1014-1015
http://www.devicelink.com/ivdt/archive/07/05/010.html
E. Ventajas y Aplicaciones• Macugen (OSI Pharmaceuticals):
aptamero inhibe el “antivascular endothelial growth factor” que participa en el crecimiento de vasos sanguíneos en el ojo.– Aprobado por el FDA para tratar
degeneración macular neovascular.
• ARC183 (Gilead) : aptamero anti-trombina que inhibe la coagulación fisiológica de la sangre. – Aprobado en fase clínica I
Riboenzimas “Ribozymes”• Riboenzimas: RNA con
capacidad catalítica que cortan otras moléculas de RNA. – Cortan su propia secuencia
– Cortan secuencias en otros RNA
– Muchas contienen Mg+2 como cofactor
– Dos regiones:• Catalítica• Secuencia de reconocimiento
Pley, H.W., Flaherty, K.M. and McKay, D.B. (1994) Three-Dimensional Structure of a Hammerhead Ribozyme. Nature 372, 68-74.
E. Aplicaciones
• Ribozima anti-hepatitis B (Penn State College of Medicine): Destruye hasta el 80% del virus en el hígado del ratón.
• Es el único mecanismo in vivo que ha demostrado la reducción del virus de la hepatitis B.
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