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Técnicas Analíticas en Estabilidad de Medicamentos:
Estabilidad Química.
Vicente Merino Bohórquez
UGC Farmacia. HU Virgen Macarena (Sevilla)
20 de Octubre de 2017
• Mijaíl Tsvet (1903):
• Botánico ruso
• El primero en usar la cromatografía en columna
• Fase estacionaria sólida INULINA en columna cilíndrica de vidrio
• Fase móvil líquida ETER DE PETRÓLEO
• Fenómenos de ADSORCIÓN Separación de clorofilas a y b
• Logró separar carotenoides y xantofilas
Ostrowski W. Michael S. Tswett--inventor of column chromatography. (On the occasion of 65th anniversary of his lecture on the column chromatography technique). Folia Biol (Krakow). 1968;16(4):429-48.
Un poco de Historia…
Método específico Fase estacionaria Tipo de Equilibrio
Líquido-sólido (adsorción) Sólido Adsorción
Líquido-líquido (Reparto) Líquido adsorbido sobre un
sólido Distribución entre líquidos
inmiscibles
Líquido-fase unida químicamente (Reparto)
Especies orgánicas enlazadas a superficie sólida
Distribución entre el líquido y la superficie enlazada
Intercambio iónico (HPLC-IEC)
Resina de intercambio iónico
Intercambio iónico
Exclusión por tamaño (HPLC-SEC)
Liquido en el intersticio de un líquido polimérico
Penetrabilidad en poros (Filtración en gel y Penetrabilidad en
gel)
Tipos de Cromatografía Líquida (I)
Tipos de Cromatografía Líquida (II)
http://www.separations.us.tosohbioscience.com/Products/HPLCColumns/ReversedPhase/
http://www.separations.us.tosohbioscience.com/Products/HPLCColumns/IonExchange/
http://www.separations.us.tosohbioscience.com/Products/HPLCColumns/SizeExclusion/
Fase directa o normal:
• FM Apolar (apolar>>polar) n-hexano,etileter,CHCl3
• F Estacionaria Polar (ciano,amino,diol,…)
• Retención de sustancias Polares
Fase inversa o reversa (ampliamente utilizada >90%)
• FM Polar (Polar>>apolar)H2O,ACN, MeOH, THF
• F Estacionaria Apolar (C18, C8, Fenilo,…)
• Retención de sustancias Apolares
Según la naturaleza de las fases líquidas implicadas:
Cromatografía de Reparto (I)
Partes de un Sistema HPLC
Mantiene la composición FM y la alta presión
Reservorio contenedor de vidrio
Mantiene la Tª en la columna (fase estacionaria)
Inyecta un volumen de muestra en el sistema sin perdidas de presión
Identificación y cuantificación Diodos en serie (DAD) Indice de Refracción
Fluorescencia
Composición de un Sistema HPLC
• Es el “corazón” del equipo HPLC
• Material químicamente INERTE (acero inox).
• Resistentes desde punto vista físico
• Compuestas de partículas muy porosas de sílice
• Existen de diferentes optimización de la EFICACIA • Diámetros (2-5 mm) • Longitudes (50-250 mm) • Tamaño poro interno (1.8-10 µm)
• Estables a pH=2-8 (algunas específicas pH extremos ZIRCONIO)
Columna HPLC-RP
Fases Estacionarias HPLC
• Distintas FE en función de lo que nos convenga:
C18-OCTADECILSILANO CIANO
AMIDA
C18-OCTADECILSILANO
Fases estacionarias de columnas HPLC-RP
• Dependerá del tipo de cromatografía (Normal vs. Reversa)
• Disolventes muy puros (grado HPLC)
• Parámetros: viscosidad, tensión de vapor, compresibilidad, absorción UV,…
• Polaridad: es el parámetro más importante DEFINE EL TIPO DE CROMATOGRAFÍA
• Los DISOLVENTES más utilizados en fase REVERSA: • Agua (tamponada o no) • Acetonitrilo • Metanol • Tetrahidrofurano (THF)
Selección Fase Móvil (I)
• Según la composición FM:
1. Condiciones ISOCRÁTICAS: composición constante de FM
durante todo análisis. Problema general de la elución.
2. Condiciones GRADIENTE: varía la composición, se va aumentando la fuerza eluotrópica del disolvente con el tiempo de análisis.
Selección Fase Móvil (II)
FM: 40%ACN:60% buffer 0.01M KH2PO4 pH=4.1
Isocrático: TMD-DKTP-DROP
FM:10% ACN60% ACN (min 06) 90% buffer40% buffer 0.01M KH2PO4 pH=4.1
Tramadol
Droperidol
Dexketoprofeno
Gradiente: TMD-DKTP-DROP
Detector Características Sensibilidad
UV/Vis Específico de compuestos cromóforos
UV ng
UV/Vis Diodos en serie Idem UV/Vis + espectros completos
3D ng
Fluorescencia Específico para compuestos
fluorescentes fg-pg
Índice de Refracción Universal: polímeros, azucares, triglicéridos, ácidos orgánicos,
excipientes 0,1-10 µg
Detector de dispersión de luz (DLS) Universal: no volátiles, semivolátiles,
compatible con gradiente ng
Electroquímica Específico: compuestos
electroactivos pg
Conductividad Específico: aniones y cationes, ácidos
orgánicos y surfactantes ng
Espectrometría de masas Universal y específico. Identificación
definitiva. fg-pg-ng
Detectores HPLC: posibilidades
• Útil para sustancias absorción UV (cromóforos)
• Permite barrido de λ 200-400 nm (espectro UV)
• Permite análisis espectral en 2D-3D
• Detección de un gran número de fármacos
Detector UV Diodos en Serie (UV- Diode Array Detector)
Cromatograma
Espectro UV 2D
Análisis espectral: Idebenona
Técnica de supresión ionización
Técnica de formación
pares iónicos
Técnicas de derivatización precolumna
Técnicas cromatográficas en HPLC-RP (I)
• Objetivo conseguir moléculas en forma lipófila (no ionizada).
• Aumento de la interacción con la F Estacionaria Mejora la separación de las moléculas.
• Control de pH de la fase móvil (pH±2 pKa)
• Dependerá de si son ácidos débiles o base débiles.
• Tener en cuenta el pH de estabilidad de la columna (2-8)
Supresión de la ionización
• AINE (Derivado arilpropiónico)
• Aplicación HPLC Determinación contenido pa
• Supresión ionización: • Columna C18 (4.6 mm x100 mm, 3.5 µm)
• Control por buffer KH2PO4/H2PO4 pH=2.5
Forma NO IÓNICA MEJOR RETENCIÓN en FASE REVERSA
Ejemplo: ibuprofeno
FM: 45% Buffer KH2PO4 (pH=2.5) 55% Acetonitrilo Columna C18 (4.6x100 mm, 3,5 µm) Tª 25ºC. UV=230 nm
Cromatograma Ibuprofeno
Técnica de supresión ionización
Técnica de formación
pares iónicos
Tecnica de derivatización precolumna
Técnicas cromatográficas en HPLC-RP (II)
• Objetivo conseguir pH todas las moléculas estén ionizadas
• A la FM se añade un contraión complejo neutro y liposoluble
• Mejora la retención en fase apolar permite separar iones
• Para ácidos (pH>pKa) Contraión + (tetrabutilamonio)
• Para bases (pH<pKa) Contraión - (octanosulfónico)
Formación de pares iónicos
• Agonista α2-adrenérgico HTA,Crisis HTA,Sdme. Abstinencia opiáceos, hiperactividad, …
• Uso pediátrico en forma de jarabe (clorhidrato de clonidina)
• Base débil (pKa=8,16) pH=10,16 desmoronamiento FE
• Análisis HPLC según USP formación pares iónicos:
+ Complejo neutro
Clonidina-Octanosulfonato (forma no ionizada)
Formas ionizadas
The United States pharmacopeia, 34nd rev., and The national formulary, 29th ed. Rockville (MD): United States Pharmacopeial Convention; 2011:2574-75.
Ejemplo: clonidina
Proyecto GT Farmacotecnia: Estabilidad fisicoquímica y microbiológica de tres formulaciones orales pediátricas
Clonidina 2,6-Dicloroanilina
Clonidina 2,6-Dicloroanilina
Sorbato potásico
Jarabe SIN conservante
Jarabe CON conservante
Cromatograma de clonidina
Técnica de supresión ionización
Técnica de formación
pres iónicos
Técnica de derivatización precolumna
Técnicas cromatográficas en HPLC-RP (III)
Fuentes en estabilidad
• Técnica útil en análisis de compuestos que no son detectables.
• Mediante una transformación química se hacen “visible” al detector y se pueden cuantificar.
• Uso de reactivos derivatizantes.
• Isoniazida tiene un producto de degradación identificado como hidrazina (carcinógeno y mutagénico)
• Derivatización con benzaldehido nos permite cuantificarlo
Derivatización precolumna
min1 2 3 4 5 6 7
mAU
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
6.510
min1 2 3 4 5 6 7
mAU
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
6.511
min1 2 3 4 5 6 7
mAU
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
6.494
40ºC
25ºC
5ºC
0
5
10
15
20
25
30
DÍA 0 DIA 6 DÍA 10 DÍA 14 DÍA 21 DÍA 28 DÍA 50 DÍA 70 DIA 90
CO
NC
ENTR
AC
IÓN
(µ
CG
/ML)
FORMACIÓN DE HIDRAZINA EN LAS DOS FORMULACIONES
F1 40ºC F1 25ºC F1 5ºC F2 40ºC F2 25ºC F2 5ºC
• Estudio caracterización infliximab biosimilar
• Comparan características FQ: • IFX BIOSIMILAR (CT-P13) vs IFX ORIGINAL (RMP)
• Ensayo de pureza: • Cromatografía de exclusión molecular (HPLC-SEC):
• TSK G3000SWXL (Tosoh®)
• FM buffer acuoso en ISOCRÁTICO
• DETECTOR UV 214 nm.
• Cumplen las especificaciones 99.4-99.9% en MONÓMEROS (Acmab)
• Ensayo de cargas de isoformas: • Cromatografía de intercambio catiónico
• Propac WCX 10 (Dionex®)
• FM: NaCl en GRADIENTE
• DETECTOR UV 214 nm.
Jung SK, Lee KH, Jeon JW, Lee JW, Kwon BO, Kim YJ et al. Physicochemical characterization of Remsima. Mabs. 2014; 6(5):1163-77.
Determinación de fármacos de origen biológico
Fuentes en estabilidad
Espectro UV-Visible e IR:
• Puede ser útil para cuantificación de sustancias farmacéuticas.
• Principios activos suelen absorber en el espectro UV-visible.
• Son técnicas poco específicas y selectivas (ojo en estudios de estabilidad)
• Especial interés de la espectroscopia IR cercano (FTIR) para identificación rápida de materia prima y determinación de aguas.
• Cada compuesto tiene un espectro IR único (excepto los isómeros ópticos)
Espectrofotometría UV-Visible-IR
Fuentes en estabilidad
• Consiste en la medición de la emisión de luz de una sustancia química cuando se expone a la radiación UV, visible u otra radiación electromagnetica.
• λexcitación<λemision (20-30 nm)
• Más sensible que la de absorción UV
• Mucho menor ruido de fondo (blanco señal baja) vs Absorción UV-Vis.
• Determinación de impurezas aminobutanol por derivatización con fluorescamina
Fluorimetría
Fuentes en estabilidad
Espectrometría de Masas
• Se generan iones que se separan m/z y registra la abundancia relativa.
• Compuesto por: • Fuente de iones: volatiliza la sustancia a estado gaseoso. • Analizador: clasifica los iones en función de su m/z. • Detector: registra los iones y registra la abundancia relativa
• Útil para cuantificación e identificación definitiva de todo tipo de moléculas ionizables:
• Fármacos y sus metabolitos. • Sustancias endógenas polares. • Macromoléculas (péptidos, proteínas, ácidos nucleicos y oligosacáridos)
CT-P13 (biosimilar)
Infliximab (comparador)
Forma Farmacéutica Control de Calidad
(contenido pa) Estudios Estabilidad FQ
Cápsulas Dexametasona Etinilestradiol
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Inyecciones intravitreas
Vancomicina Ceftazidima
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Soluciones orales -----
Clonidina Fenobarbital Hidralazina
Isoniazida (Hidrazina) Etambutol (aminobutanol)
Preparados tópicos -----
Gel Timolol
Mezclas iv TMD-DKTP-DROP N-Acetilcisteína
Experiencia HU Virgen Macarena
• Gran versatilidad a la hora de analizar distintos productos farmacéuticos (fármacos clásicos, Mabs, biológicos, etc.) tan sólo: • Cambio de columnas • Disolventes FM • Variedad de detectores
• Universalidad: técnica de referencia de las principales farmacopeas del mundoUSP,BP, EP,JP, RFE,..
• Herramienta de garantía de calidad en farmacotecnia: • Control de calidad • Estabilidad FQ
Conclusiones HPLC
• www.agilent.com
• www.thermofisher.com
• www.waters.com
• www.shimadzu.com
Para más información
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