Tecnicas microbiologicas de agua

TOMA DE MUESTRADebe ser representativa del agua a analizar

Frascos estériles de vidrio o plástico con un volumen entre 250 – 500ml ( no se llenan para poder agitar contenido)

Para fijar cloro presente en agua ( agua potable) se añade tiosulfato sódico ( 1gota al 20%)

Si en el agua hay presentes concentraciones de cobre, zinc o metales pesados hay que incorporar EDTA ( forma quelatos)

Elementos: recipientes, hisopos estériles o sopletes de soldadura

Procedimiento1.-Canilla:

se limpian la parte externa y la interna de la boca del grifo

Se deja salir chorro de agua fuerte durante 2 – 5 minutos para arrastrar suciedad en la cañería

Se esteriliza la boca

Se deja correr nuevamente agua

Se toma el frasco y se abre en este momento

Se procede al llenado

2. Agua de río, arroyos, ríos :

Lejos de la costa y a una profundidad media

3.-Natatorios:

Cerca del borde y en zona de mayor profundidad

Siempre se sumerge el frasco dirigiendo la boca en sentido contrario a la corriente

Se rotulan y se envían

TRANSPORTE Y CONSERVACIÓN

Más rápido posible

Si no es así refrigerar inmediatamente

El transporte se realiza en envase aislante o en refrigerador

No pueden pasar más de 30 horas entre extracción y procesado de la muestra

TÉCNICAS

RECUENTO DE AEROBIOS MESOFILOS TOTALES

RECUENTO DE COLIFORMES TOTALES

RECUENTO DE COLIFORMES FECALES

RECUENTO DE ENTEROCOCOS

RECUENTO DE SEUDOMONAS

RECUENTO DE CLOSTRIDIOS SULFITOREDUCTORES

ELEMENTOS NECESARIOS Pipetas: 1 ml y 10 ml-

Probetas graduadas-

Tubos de ensayo con tapas y Gradillas

Tubos de fermentación según Durham: para detección de la formación microbiana de gases

Placas de Petri: tamaño estándar de 9 cm de diámetro, de vidrio o descartables.

Ansas de inoculación: de 3 mm de diámetro, de acero inoxidable o platino

Frascos para la toma de muestras: de vidrio, con tapón esmerilado

Baño de agua para templar el agar a 44-46ºC -- Contador de colonias

Estufa de cultivo graduable a diversas temperaturas de incubación

Estufa de aire caliente para esterilización (160-180°C)

Autoclave: temperatura de esterilización 121°C

Balanza analítica -- pH-metro: para control de los valores de pH de los medios de cultivo.

Solución fisiológica o agua peptonda al 1% -- Matraz y/ o Erlenmeyer: para preparar medios de cultivo, soluciones, etc.

Medios de Cultivo: Agar para recuento en placa ( Agar plate count: APC) -- Caldo Mc Conkey o Lauril Sulfato -- agar Cetridime -- Agar SPS -- Azida glucosa caldo – Caldo verde de malaquita – Pseusomona P y F -

Los materiales de vidrio, luego de la limpieza mecánica, se limpian con agentes de lavado, y posteriormente se lavan varias veces con agua de canilla, y seguidamente con agua desionizada o destilada (los residuos de agentes de lavado impiden el crecimiento microbiano). Luego se realiza el secado del material.

Los materiales de vidrio que se han utilizado para el análisis deaguas contaminadas deben someterse al autoclave antes de lalimpieza (20 min, 121°C, 1 atm).

La esterilización de los aparatos de vidrio limpios se realiza en laestufa de aire caliente, por 2 horas a 160-180°C.

LIMPIEZA Y ESTERILIZACIÓN DEL MATERIAL

EXAMEN BACTERIOLÓGICO: METODOLOGIA

Recuento de Aerobios Totales

( Método de recuento estándar en placa)

Técnica

Se realizan diluciones 1/10, 1/100 1/1000 …. Según tipo de muestra con solución fisiológica

Se agrega 1 ml de muestra + 9 ml de solución fisiológica

Muestra directa Dilución 1/10 Dilución 1/100 Dilución 1/1000

Se incorpora posteriormente el APC ( Agar Plate Count preparado con anterioridad ( según instrucciones del frasco deshidratado)

Se mezcla rotando cada placa. Dejar reposar hasta solidificación.

Llevar a estufa aeróbica a 35-37ºC durante 24, o a 20ºC durante 48 hs.

Contar en las placas donde se visualicen aisladas perfectamente entre 30- 300 colonias

Se promedia multiplicando por la inversa de la dilución

resultados

Cuando se informa el recuento se expresa con dos

dígitos significativos seguidos de tantos ceros como

la inversa de las placas cuyas diluciones promedios

se contaron las colonias ( notación científica

Ej: 84000= 8,4 x 104 )

Informar recuentos por ml de muestra

Recuento de Coliformes Totales CARACTERÍSTICAS:

Son buen indicador microbiano de la calidad del agua potable.

Entre ellos se encuentran Escherichia coli, Citrobacter, Enterobacter y Klebsiella. se asemejan morfológica y fisiológicamente. Estos M.O. con frecuencia difieren entre si en características pequeñas

Las bacterias coliformes no provienen solo de las heces de los animales de sangre caliente, sino también de la vegetación y el suelo. E. Coli, rara vez se encuentra fuera del intestino

Por lo expuesto, la presencia de algunos organismos coliformes (1-10 coliformes en 100 ml) tiene poca importancia, siempre que haya ausencia de organismos coliformes fecal. Diferenciar el tipo fecal (E.coli) y el no fecal (A: aerogenes o Citrobacter)

Son bacterias aerobias o anaerobias facultativas, Gram negativas, no esporuladas, que fermentan la lactosa con producción de ácido y gas.

. DETERMINACIÓN DEL NUMERO MAS PROBABLE (NMP) / 100 ml de bacterias de coliformes totales (Método de Wilson) o de Tubos múltiples

Ordenar 3 filas de 3 a 5 tubos de ensayo con campanas de Durham en una gradilla

F1 10ml Medio de doble concentración + 10ml

de muestra

F2 10ml Medio de concentración simple + 1ml

de muestra

F3 10ml Medio de concentración simple + 1ml

de muestra

Incubar los tubos a 32 - 35 ºC durante 48 horas.

Determinar con los tubos positivos (ácido y gas) el NMP utilizando la tabla de Hoskins.(Mc Grady) La formación de gas a las 48 horas y/o viraje del indicador se consideran evidencias suficientes de la presencia de coliformes.

TABLA DE HOSKINS / MC GRADY3 tubos de 10 ml 3 tubos de 1 ml 3 tubos 0,1 ml Índice del NMP/100 ml

0 0 1 3

0 1 0 3

1 0 0 4

1 0 1 7

1 1 0 7

1 1 1 11

1 2 0 11

2 0 0 9

2 0 1 14

2 1 0 15

2 1 1 20

2 2 0 21

2 2 1 28

3 0 0 23

3 0 1 39

3 0 2 64

3 1 0 43

3 1 1 75

3 1 2 120

3 2 0 93

3 2 1 150

RECUENTO DE COLIFORMES FECALES

Organismos coliformes fecales (termotolerantes)

Los organismos coliformes fecales son capaces de fermentar la lactosa a 44.0-44.5°C.

Entre ellos se encuentra el género Escherichia y en menor grado algunas cepas de Enterobacter, Citrobacter y Klebsiella. De todos estos microorganismos, solo E. coli tiene origen específicamente fecal.

Para que en un sistema de distribución se desarrollen organismos coliformes fecales deben existir suficientes nutrientes bacterianos, la demanda bioquímica de oxigeno (DBO) debe ser mayor de 14 mg/l, la temperatura del agua debe superar los 13°C, y no debe haber cloro libre residual.

Investigación de Escherichia coli : (coliformes termotolerantes)

1. Escoger tubos gas positivos del caldo Mc Conkey o Lactosa bilis verde brillante (Brila) procedentes del recuento de bacterias coliformes (NMP/100ml) Paralelamente también se hace un repique a caldo EC

2. Inocular una ansada de caldo de los cultivos seleccionados positivos en tubos de Caldo Mc Conkey o Brila.

3. Incubarlos tubos a 44,5 ºC ± 0,5 ºC y ver si son positivos de formación de gas a las 24 hs. y a las 48 hs.Si presenten gas o viran color son positivos : organismos coliformes fecales ya que a esta temperatura solo el bacilo coli fecal produce ácido y gas.

4. Para determinar Escherichia coli , de los tubos positivos mediante un ansa de ojal se estría la superficie de una placa de EMB, se incuba a 37º C por 24 hs (Colonias específicas)

Se confirma su presencia por las pruebas bioquímicas correspondientes al INVIC, como mínimo.( Indol, Rojo de Metilo, Voges Proskauer y Citrato: ++-- para E.coli)

RECUENTO DE ENTEROCOCOS Otros indicadores de contaminación fecal

Cuando existan dudas, sobre todo cuando se han encontradoorganismos del grupo coliforme y hay ausencia de coliformesfecales, se pueden usar otros organismos que confirmen que lacontaminación es de naturaleza fecal.

Entre estos indicadores secundarios están los estreptococosfecales o enterococos

Estreptococos fecales: se denominan así a los que seencuentran normalmente en las heces humanas y animales.Raramente se multiplican en el agua contaminada y pueden seralgo más resistentes a la desinfección que los organismoscoliformes.

TEST CUALI- CUANTITATIVO Se mezclan igual cantidad de muestra de agua que de medio: azida glucosa de

doble concentraciónmuestra caldo azida glucosa

Sin Turbidez: reacción negativa

Se incuba a 37ºC durante 24 hs.

Turbidez por crecimiento: reacción

positiva ( pruebas confirmatorias)

RECUENTO DE CLOSTRIDIOS SULFITOREDUCTORES

El recuento o conteo de bacterias anaerobias sulfito reductores de la clase clostridios se encuentran

en heces, humus y aguas residuales.

Se lo utiliza como indicador de contaminación fecal

A una temperatura particular (por ser esporulados resisten un choque térmico.) y debido a sus formas permanentes resistentes pueden permanecer con vida más tiempo en el agua que las formas vegetativas

Se realiza tratamiento térmico necesario para destruir todas las células vegetativas : 80º C por 10 min.

Luego se colocan 100 ml con 100 ml de caldo diferencial de clostridios o se hacen diluciones en placa con agar SPS .

Se incuba 48hs. A 37ºC en forma anaeróbica

Reacción positiva: coloración negra del cultivo( sulfito pasó a sulfuro)

Existencia de clostridios

Reacción negativa: sin coloración negra

RECUENTO DE SEUDOMONAS Se realiza enriquecimiento colocando 100 ml de muestra de agua en

erlenmeyer con 100ml caldo verde de malaquita de doble

concentración o caldo cristal violeta.

Reacción negativa: Sin turbidez, no se encuentra presente Pseudomonas aeruginosa. Se concluyeel ensayo. Reacción positiva: Turbidez por crecimiento microbiano.

La muestra que presente turbidez, es repicada con ansa ojal sobre una placa o pico de flauta de Agar Cetrimide.

Se incuba 24hs. A 37ºC. Si se observa desarrollo y/o pigmentación se

procede a efectuar las siguientes pruebas:

Gram Oxidasa Reducción de Nitrato Gluconato Licuefacción de

Gelatina

Pseudomona

aeruginosa- + + + +

De aquellas placas que presenten desarrollo de colonias con fluorescencia, se repicaran colonias aisladas en: ( piocianina o piorrubina)Agar P y F para Pseudomonas, en forma de estriá con el ansa para punción, durante 48 hs a 37 ºC.Agar P para Pseudomonas:a) Reacción positiva: colonias de color azul hasta verde o respectivamente rojo hasta pardo obscuro delmedio de cultivo. b) Reacción negativa: desarrollo de colonias sin formación de color o de color amarillo.Agar F para Pseudomonas:a) Reacción positiva: Fluorescencia amarilla verdosa bajo lampara UVb) Reacción negativa: Ausencia de fluorescencia.