Manual laboratorio clinico

PRÁCTICA No. 1

BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO CLINICO

Definición: Conjuntos de normas y procedimientos para obtener una situación carente de riesgos o con riesgos limitados.

PRECAUCIONES UNIVERSALES:1. Acceso restringido, permitido solo a personas autorizadas2. Prohibido usar el celular, comer, fumar, beber o almacenar comidas o cualquier

objeto de uso personal dentro del laboratorio. 3. Usar ropa protectora de trabajo como mandil, mascarillas, guantes (de látex) la

misma que debe ser retirada antes de abandonar el laboratorio. Botas y gorra en casos de exposición a microorganismos de alta peligrosidad.

4. Antes de iniciar cualquier actividad en el laboratorio asegurarse de que en la mano no existan escoriaciones. En caso contrario cubrir las mismas de manera adecuada.

5. Cambio inmediato de los guantes en caso de rotura y lavado de manos.6. No tocarse la boca ni los ojos con las manos enguantadas7. Evitar la formación de aerosoles y gotas.8. Manejo adecuados de los objetos corto punzantes. Una vez utilizados se deben

almacenar en recipientes rígidos y eliminarse luego de ser decontaminados.9. Terminantemente prohibido pipetear con la boca. Debe utilizarse los

pipeteadores automáticos.10. Decontaminar las superficies de trabajo una vez terminado el trabajo diario.Se

recomienda el uso de hipoclorito de sodio al 10%11. Evitar conductas inseguras y de riesgo.12. Manejo adecuado de los desechos desde el lugar de origen y realizar tratamiento

adecuado especialmente de los infecciosos.13. Los desechos de los fluidos corporales pueden eliminarse por las cañerias

habituales una vez que hayan sido decontaminados.14. Lavarse las manos con abundante agua y jabón luego de haber terminado el

trabajo diario.15. Plan de inmunizaciones para el personal de laboratorio

TRABAJO EN CLASE:Poner en práctica las normas anteriores durante cada sesión de laboratorio

PRACTICA No. 2

Tema: Toma de muestras de sangre (venosa y capilar)

Objetivos:1. Conocer la técnica para la obtención de muestras de sangre como medio para

mantener la integridad del profesional de salud y la del paciente 2. Adiestramiento adecuado para el manejo de instrumentos necesarios en la toma

de muestras sanguíneas3. Aplicar las precauciones universales de bioseguridad en el laboratorio con

respecto al manejo de líquidos biológicos y material infeccioso4. Conocer los usos de los diferentes anticoagulantes empleados en el laboratorio

Autora: Dra. Celia Bowen

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Fundamento teórico:La relativa facilidad con que se obtiene la sangre venosa hace de esta técnica el principal método de obtención de sangre en los laboratorios de análisis clínicos. A partir de la sangre sin anticoagulante se obtiene suero, si la sangre contiene anticoagulante, se obtiene plasma. Del plasma forma parte el fibrinógeno, sustancia de la que carece el suero.

Materiales:-Torniquete-Algodón-Alcohol antiséptico (isopropílico al 70%)-Jeringuillas-Sistema vacutainer: capsula, tubos alvacío, agujas de toma múltiple- Lancetas-Tubos capilares heparinizados-Plastilina

Técnica de la punción venosa:1. Se identifica al paciente comprobando que la solicitud de exámenes corresponda

al mismo2. Si se solicita una muestra en ayunas, debe comprobarse que efectivamente el

paciente no ha ingerido alimentos3. Hay que dirigirse al paciente e informarle sobre el procedimiento a que va a ser

sometido. Se debe tranquilizarle, eliminando en lo posible su tensión.4. Se ha de colocar adecuadamente al paciente, según éste se encuentre sentado, o

en decúbito prono, para tener acceso fácil y cómodo a la fosa antecubital.5. Hay que preparar todo el material, incluidos los tubos para recogida de la

muestra, el torniquete, los objetos que se emplean para limpiar la piel, las jeringas, cuando sea necesario, la aguja estéril para extracción de sangre y dispositivo utilizado para fijar la aguja al tubo de extracción al vacío.

6. Se solicita al paciente que cierre el puño para que las venas resulten más palpables.

7. Se seleciona una vena adecuada para la punción. Se prefieren las venas de la fosa antecubital, en particular la cubital interna y la cefálica. También pueden utilizarse las venas de la muñeca, el tobillo y la mano. Si existiera ya un catéter intravenoso en un brazo, se utilizará el otro para la extracción de la muestra.

8. Preparar la cápsula insertando la aguja pero dejando un poco flojo la capucha de la parte externa de la misma para retirarlo al momento de la punción.

9. Se aplica un torniquete varios centímetros por encima de la zona de punción (aproximadamente a cuatro dedos sobre el doblez del brazo). No hay que dejar nunca el torniquete más de 1 minuto. En casos excepcionales no debe usarse el torniquete, por ejemplo cuando en el pedido está el Calcio.

10. Se limpia la zona de la venopunción con una torunda embebida en solución en alcohol antiséptico. Se comienza en el punto de la punción y se prosigue la limpieza hacia fuera siguiendo un movimiento en espiral. Se deje que la zona se seque y no se toca con ningún objeto que no haya sido esterelizado previamente.

11. Se fija firmemente la vena tanto por encima como por debajo del lugar de punción, con la ayuda de los dedos pulgar y medio, o índice y pulgar.

12. Se realiza la venopunción. a) Se penetra a través de la piel con la aguja formando un ángulo de aproximadamente 15º con el brazo y con el bisel hacia

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arriba. Se sigue la dirección de la vena con la aguja. B) Se introduce la aguja con suavidad pero con la suficiente rapidez para reducir las molestias del paciente. No hay que enterrar la aguja. C) Si se utiliza una jeringa, se tira hacia atrás del émbolo, con tensión lenta y uniforme a medida que la sangre va fluyendo en su interior. No debe realizarse este movimiento con excesiva rapidez, ya que podría hemolizarse la sangre o colapsarse la vena. d) Si se utiliza un tubo al vacío, en cuanto la aguja haya penetrado en la vena, se dirigirá el tubo todo lo posible hacia delante en el dispositivo de sujeción. Al mismo tiempo se sujeta tenuemente la aguja en su lugar. Una vez que haya llenado el tubo, se retira, cogiéndolo por su extremo y tirando suavemente de él.

13. Cuando la sangre comience a fluir, se suelta el torniquete.14. Una vez que se haya extraído toda la muestra, hay que indicar al paciente que

relaje el puño y que no bombee con la mano.15. Se coloca suavemente sobre el punto de la punción una bola de algodón estéril.

Se extrae la aguja y a continuación se ejerce presión sobre la zona.16. Se venda el brazo. En general es suficiente una tira de esparadrapo sobre la bola

de algodón, para detener la hemorragia.17. Se mezclan los tubos con el anticoagulante. Si la muestra ha sido extraída con

jeringa, se transferirá la sangre a los tubos correspondientes tomando las debidas precauciones para evitar la hemólisis de las muestras.

18. Se comprobará el estado del paciente; por ejemplo, si se ha mareado y si la hemorragia está controlada.

19. Se elimina el material contaminado: agujas, jeringas, algodones, etc.20. Se marcan las etiquetas y se registra la hora en que se extrajeron las muestras.21. Se envían los tubos de sangre para su análisis a los correspondientes

departamentos del laboratorio. Si es preciso, se hace constar la hora en la solicitud.

Punción capilar:1. Tener todo el material en perfecto orden: algodón, alcohol, lancetas, tubos

capilares y plastilina.2. Pedir al paciente que se frote el dedo pulgar hasta que obtenga una buena

irrigación de la zona de punción.3. Desinfectar la zona y secarla con otro algodón libre de alcohol4. Sacar la lanceta y realizar la punción de forma rápida y firme.5. Deshechar la primera gota para evitar contaminación con restos de alcohol.6. Colocar el capilar en la zona e ir llenándolo hasta las tres cuartas partes del tubo.7. Retirarlo de la zona y colocar un algodón con poco alcohol y solicitar al paciente

que se sostenga por unos minutos para que deje de fluir la sangre.8. El capilar sellarlo con plastilina y colocarlo en el lugar designado para ese

paciente.

Anticoagulantes utilizados con mas frecuencia

EDTA (tapón lila): Tubo estéril con anticoagulante EDTA: sal de ácido etileno diamina tetracético di o tripotasica o di sódica, concentración: 1,2 a 2,0mg/ml de sangre (4,1 a 6,8mmol/l de sangre) basado en EDTA anhidro. Para uso en hematología

Citrato de sodio (tapón azul 1/9 y tapón negro 1/4): citrato trisódico con 0,100 a 0,136 mol/l de ácido cítrico. Se recomienda 0,105 mol/l para lograr la estandarización

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recomendada por la WHO para que quede a 3,2%. Se usa para pruebas de coagulación (TP, TTP, fibrinógeno), utilizar l parte de citrato y 9 de sangre entera. 

Tapón rojo: Tubo estéril sin anticoagulantes ni aditivos ni geles separadores. Para obtener suero.

Los tapones de colores con una banda Gris agregada indican que el tubo corresponde a  uno los anteriores y que además contiene gel separador de suero o plasma

TRABAJO EN CLASE:

Estudiar bien las instrucciones anteriores para ponerlo en práctica con algún compañero de clase

PRACTICA No. 3

Tema: Soluciones y diluciones

Objetivos:- Conocer lo que es un soluto y un solvente para preparar soluciones a diferentes

concentraciones- Conocer dos formas de expresar matemáticamente la proporción de soluto a

solvente dentro de una solución (p/v y v/v)- Realizar diluciones simples a partir de una solución

Fundamento teórico:Las soluciones son mezclas homogéneas de dos o más substancias, que pueden separarse por métodos físicos en sus diversas substancias componentes. En una solución, aquella substancia que se encuentra en mayor proporción se conoce como Solvente y las demás como Solutos.

Existen varias formas de expresar la concentración de una solución, esto es, la proporción de soluto a solvente. Para efectos cualitativos, frecuentemente se habla de soluciones diluidas, concentradas, saturadas o sobresaturadas. Aunque existen diversas formas de expresar matemáticamente la proporción de soluto a solvente dentro de una solución, las de uso mas extendido suelen ser Molaridad, el Porcentaje Peso a Volumen, el Porcentaje Peso a Peso y las Partes por Millón.

El porcentaje Peso a Volumen es una relación que expresa los gramos de soluto que se hallan contenidos en cada 100 mililitros de solución.

Materiales y reactivos:Materiales:

- Probeta graduada de 50 ml- Vaso de precipitación de 50 ml- Matraz aforado de 50 ml- Pipetas graduadas de : 1, 2, 5 y 10 ml.- Peras de seguridad- Tubos de ensayo - Gradillas

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- Balanza- Varilla de vidrio

Reactivos:- Safranina en polvo- Cloruro de sodio en polvo- Agua destilada

Procedimiento:1. Método para preparar soluciones:Unidades de medidas:p/v = peso de soluto sobre volumen de solvente expresado en gr/ 100mlv/v = volumen de soluto sobre volumen de solvente expresado en ml/100 ml.

Ejemplo de soluciones p/v:Preparar 50 ml. de solución de NaCl (cloruro de sodio) al 0.85% en agua destilada Datos

V1= 50 ml.V2= 100 mlConcentrac. Solución= 0.85% (pesar 0.85 gramos de NaCl y aforar con agua destilada hasta obtener 100 ml de solución)

0.85 gr. NaCl 100 ml agua destilada X 50 ml agua destilada

X= 0.425 gr. de NaCl disolver en agua destilada hasta obtener 50 ml de solución

Ejemplo de soluciones v/v:Preparar 40 ml. de solución de Etanol al 70% en agua destilada

DatosV1= 40 ml.V2= 100 mlConcentrac. Solución= 70% (70 ml de etanol puro diluidos en 100 ml de agua destilada)70 ml de etanol 100 ml agua destilada X 40 ml agua destilada

X= 28 ml. de etanol puro diluir en 12 ml de agua destilada para obtener una solución de 40 ml de etanol al 70%

2. Método para realizar diluciones Partiendo de una solución cualquiera que sea su concentración las diluciones se realizan del siguiente modo: Si se tiene una solución HCl (ácido clorhidrico) y se quiere diluir en agua destilada 1:20 para obtener un volumen final de 50 ml se realiza los siguientes cálculos: 1ml de soluc. HCl 20 ml. de agua destilada X 50 ml de agua destilada X =2.5 ml de HCl se necesita para obtener una solución de 50 ml en agua destilada (medir 47.5 ml de agua)

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3. Para obtener el factor de dilución:Utilizando el ejemplo anterior el factor de dilución se obtiene del siguiente modo:

Fd = Volumen mayor = 50 = 20 Volumen menor (alícuota) 2,5

La solución en efecto está diluida 20 veces

PRACTICA No. 6

CARBOHIDRATOS: Determinación de glucosa en sangre

1. Objetivos:

1. Conocer la técnica mediante la cual se determina la glucosa en sangre2. Diferenciar pacientes con hipo e hiperglicemia

2. Fundamento teórico:

La glucosa es la principal fuente de energía de las células en el organismo. La glucosa es un monosacárido con una concentración postpandrial de 90 mg/dl en la sangre y sirve como una fuente de energía indispensable para la función celular.

El diagnóstico de los trastornos del metabolismo de los hidratos de carbono se apoya en parte en la medición de la glucosa plasmática, ya sea en ayuna o tras estimulación o pruebas de supresión.

Los resultados de la glucosa plasmática pueden clasificarse como hiperglucémicos (como la diabetes mellitus) o hipoglucémicos.

Principio de la reacción:

La prueba utilizada se determina mediante el método enzimático colorimétrico, basado en la reacción de Trinder.

Glucosa + O2 + H2O GOD (glucosa oxidasa) ácido glucónico + H2O2

2H2O2 + 4-aminoantipirina + fenol POD (peroxidasa) quinoneimina (rojo) + 4H2O

La glucosa se determina después de la oxidación enzimática en presencia de glucosa oxidasa. El peróxido de hidrógeno formado reacciona bajo la catálisis de peroxidasa con fenol y 4-aminoantipirina formando un complejo rojo violeta llamado quinoneimina.

Punto final de una reacción: Las reacciones catalizadas por enzimas son únicas en el sentido de que presentan aumentos muy grandes de la velocidad en relación a las reacciones no catalizadas y muestran una cinética de saturación, es decir la velocidad de la reacción alcanza un valor máximo a una concentración determinada de sustrato, no dan por resultado aumento de la velocidad de la reacción. La medida se realiza siempre en las condiciones óptimas de pH, temperatura, presencia de cofactores, etc. En estas

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condiciones, la velocidad de reacción observada es la velocidad máxima (Vmax). La velocidad puede determinarse bien midiendo la aparición de los productos o la desaparición de los reactivos.

En el caso de la reacción de la glucosa catalizada por la enzima glucosa oxidasa y la peroxidasa llega a su punto final cuando todo el sustrato (glucosa) se ha oxidado, y después se mide el cambio de color.

Espectofotómetro:

La absorbancia y la transmitancia de una sustancia en disolución se miden con un aparato denominado espectrofotómetro, el cual consta básicamente de los siguientes componentes:

Fuente de luz: Lámpara que emite una mezcla de longitudes de onda.

Colimador: Conjunto de lentes que enfocan la luz convirtiéndola en un haz de rayos paralelos.

Monocromador: Dispositivo que selecciona luz de una única longitud de onda.

Detector fotoeléctrico: Transductor de luz en electricidad. La luz provoca el desplazamiento de electrones en el metal del detector, produciendo una corriente eléctrica que es proporcional a la intensidad de la luz recibida.

Registrador: Mide la señal del detector, la compara y genera una medida en una escala determinada. 

A) Esquema de un espectrofotómetro de un solo hazB) Esquema de un espectrofotómetro de doble haz, en el cual se corrigen las variaciones espectrales de los diferentes elementos ópticos que lo componen

El funcionamiento del espectrofotómetro es el que sigue: la luz de una fuente continua pasa a través de un monocromador, que selecciona una banda estrecha de longitudes de onda del haz incidente.

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Esta luz “monocromática” atraviesa una muestra de espesor b, y se mide la potencia radiante de la luz que sale. Es necesario calibrar el espectrofotómetro con un blanco antes de medir las absorbancias de la disolución problema. Esta celda o cubeta de referencia sirve para compensar los efectos de reflexión, dispersión o absorción de luz de la celda con el disolvente.

Cuando emerge poca luz de la muestra (absorbancia alta), la intensidad es difícil de medir. Cuando emerge mucha luz de la muestra (absorbancia baja), es difícil detectar la diferencia de absorbancia entre las celdas de muestra y de referencia.

3. Parte experimental:3.1. Procedimiento:Ensayo:Longitud de onda: Hg 546 nm.Paso de luz: 1 cmTemperatura: 20-25ºCMedición: frente a un blanco de reactivo. Se requiere un blanco de reactivo por serieEsquema de pipeteo:

Microdeterminación

Pipetear en las cubetas Blanco de reactivo STD ó muestra

STD ó muestra 5 ul

Reactivo para glucosa 500 ul 500 ulMezclar, incubar por 10 minutos de 20-25ºC ó 5 minutos a 37ºC. Medir la absorbancia del STD y las muestras frente a un blanco de reactivo antes de 60 minutos.

Materiales y reactivos:

Materiales Reactivos

Espectrofotómetro Reactivo para glucosa

Tubos de ensayo Estándar de glucosa (100 mg/dl)

Gradilla Muestras de suero sanguíneo (ó plasma)

Pipetas automática

Puntas de plástico para pipetas automát..

Reloj

Cubetas de plástico para espectrofot.Nota: El espectrofotómetro debe estar encendido 20 minutos antes de leer las absorbancias.Autora: Dra. Celia Bowen

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2. Cálculo de la concentración de la glucosaC (mg/dl)= 100 x ∆A muestra ∆A Estándar

Valores de referencia: 70 – 100 mg/dl TRABAJO EN CLASE:

Realizar el análisis de glucosa en un suero sanguíneo y luego reportar los cálculos en la carpeta con la respectiva interpretación del resultado.

PRÁCTICA No 7

LÍPIDOS: Determinación de colesterol en sangre1. Objetivos:

3. Conocer la técnica mediante la cual se determina el colesterol en sangre4. Diferenciar pacientes con hipo e hipercolesteremia

2. Fundamento teórico:

Los principales lípidos del plasma humano son el colesterol, los ésteres del colesterol, los triglicéridos, los fosfolípidos y los ácidos grasos no esterificados. El colesterol es un importante componente estructural de las membranas celulares y un precursor para la biosíntesis de los ácidos biliares y las hormonas esteroideas.

El riesgo cardiovascular es una función continua de la concentración de colesterol y que los individuos situados en el límite superior del margen normal tienen un riesgo mayor que los que están situados en el límite inferior.

La prueba utilizada para determinar colesterol es mediante el método enzimático colorimétrico del siguiente modo:

Principio de la reacción:

Esteres de colesterol + H2O CHE(colesterol esterasa) colesterol + ácidos grasos

Colesterol + O2 CHO (colesterol oxidasa) colesterol- 3-ona + H2O2

2H2O2 + 4-aminoantipirina + fenol POD (peroxidasa) Quinoneimina (rojo) + 4 H2O

El colesterol se determina después de hidrólisis enzimática y oxidación. El indicador es la quinoneimina (complejo rojo) formada por el peróxido de hidrógeno y 4-aminoantipirina en presencia de fenol y peroxidasa.

2. Parte experimental:2.1. Procedimiento:Ensayo:

Autora: Dra. Celia Bowen

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Longitud de onda: Hg 546 nm.Paso de luz: 1 cmTemperatura: 20-25ºCMedición: frente a un blanco de reactivo. Se requiere un blanco de reactivo por serieEsquema de pipeteo:

Microdeterminación

Pipetear en las cubetas Blanco de reactivo STD ó muestra

STD ó muestra 5 ul

Reactivo para colesterol 500 ul 500 ul

Mezclar, incubar por 10 minutos de 20-25ºC ó 5 minutos a 37ºC. Medir la absorbancia del STD y las muestras frente a un blanco de reactivo antes de 60 minutos.

Materiales y reactivos:

Materiales Reactivos

Espectrofotómetro Reactivo para colesterol

Tubos de ensayo Estándar de colesterol (200 mg/dl)

Gradilla Muestras de suero sanguíneo (o plasma)

Pipetas automática

Puntas de plástico para pipetas automát..

Reloj

Cubetas de plástico para espectrofot.

Nota: El espectrofotómetro debe estar encendido 20 minutos antes de leer las absorbancias.

3. Cálculo de la concentración de colesterol

C (mg/dl)= 200 x ∆A muestra ∆A Estándar

Valores de referencia: hasta 200 mg/dl

TRABAJO EN CLASE:

Autora: Dra. Celia Bowen

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Realizar el análisis de colesterol en un suero sanguíneo y luego reportar los cálculos en la carpeta con la respectiva interpretación del resultado

CONSULTA:Criterios de la OMS para:

- Síndromes metabólicos - Factores de riesgo cardiovascular

Nota: Archivar en la carpeta y estudiar para la evaluación parcial

PRÁCTICA No. 8

TEMA: Método para electroforesis de proteínas en suero

Objetivo: Aplicar la técnica de electroforesis para separar las diversas fracciones proteícas del suero humano

Fundamento teórico:La electroforesis es una técnica basada en los movimientos de moléculas cargadas en un campo eléctrico, cada molécula se mueve hacia el electrodo de carga opuesta (cátodo y ánodo), este movimiento denominado “electroforesis” da nombre a la técnica. En el transporte electroforético, a la fuerza del campo eléctrico se opone la resistencia viscosa del medio, produciéndose, cuando se igualan una velocidad constante de desplazamiento de las partículas.

En resumen, puede decirse que cuando una molécula cargada se coloca en un campo eléctrico se moverá hacia uno u otro electrodo dependiendo de: 1) su carga eléctrica, 2) su tamaño, 3) la intensidad del campo eléctrico y 4) la temperatura del medio.

La electroforesis se aplica en el campo de la Bioquímica a la separación de compuestos que poseen grupos ionizables (aminoácidos, péptidos, proteínas, ácidos nucleicos) teniendo en cuenta que la carga neta de estas sustancias depende del pH del medio en que se encuentren. Si la molécula tiene carga positiva migrará hacia el cátodo, si tiene carga negativa hacia el ánodo. La fuerza iónica de la solución tampón tiene una importancia fundamental en la electroforesis, puesto que cuando es baja, permite velocidades de migración de los solutos más rápidas y con menor desprendimiento de calor.

Las proteínas están compuestas de aminoácidos que poseen grupos ionizables (principalmente -COO- y –NH+

3), pueden encontrarse cargadas positiva o negativamente, o bien de permanecer eléctricamente neutras según la proporción de los diversos grupos ionizados a un determinado pH. En su punto isoeléctrico (pI o pH I), la proteína tiene carga neta cero. Por debajo de pI las proteínas estarán cargadas positivamente y por encima del pI negativamente.

El porcentaje normal de estas proteínas en el suero humano es:-Albúmina………54-62%-α-globulinas……9-15%-β-globulinas……14-19%-γ-globulinas……14-19%

Autora: Dra. Celia Bowen

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En el siguiente cuadro se observa la concentración normal en mg/dl , peso molecular (PM) y funciones de las proteínas (el cuadro no presenta una clasificación completa de las proteínas, se observan unos cuantos ejemplos que se encuentran en mayor concentración)PROTEÍNAS PM CONCENTRACIÓN FUNCIÓN1)Albúmina 69000 3500 a 4500 mg/dl Presión oncótica y

transporte2)Globulinas alfa1Alfa1 glucoproteína ácida

40000 55 a 140 mg/dl Proteína de fase aguda

Alfa 1 antitripsina 54000 200 – 400 mg/dl Proteasa inhibidora3)Globulinas alfa2Alfa2 macroglobulina

725000 140 – 420 mg/dl Proteasa inhibidora

Haptoglobina 90000 380 a 780 mg/dl Liga HB circulante3.Globulinas betaTransferrina 76000 200 a 300 mg/dl Transporte del FeHemopexina 5700 50 a 100 mg/dl Liga el hem4.Gama globulinasIgG 150000 700 a 1500 mg/dl AnticuerposIgA 150000 a 300000 - AnticuerposIgM 750000 a 900000 - AnticuerposCrioglobulinas 220 - Desconocido

TRABAJO EN CLASE:Realizar el análisis de las proteínas en un suero sanguíneo y luego reportar en la carpeta con una foto los resultados con una posible patología de la respectiva consulta (realizar un ejemplo de cada una en la misma foto)CONSULTA:Patologías que se presentan cuando hay aumento ó disminución de cada una de las proteinas (albúmina, alfa1 y alfa2 globulina, beta1 y beta globulina, gamma globulina)Nota: Archivar en la carpeta y estudiar para la evaluación parcial

PRÁCTICA No. 9

TEMA: Determinación de urea (Método enzimático-colorimétrico)

Fundamento teórico:La urea es el principal compuesto nitrogenado no proteico más imporatnte en la mayoría de los líquidos biológicos. En el hombre es el principal producto final del metabolismo proteíco. Se produce en el hígado y es excretada en la orina a través de los riñones.

Una elevación de la concentración sérica de urea, se interpreta generalmente como una posible disfunción renal. Sin embargo, no debe dejarse de lado el hecho de que los valores séricos de urea se encuentran íntimamente relacionados con la dieta y el metabolismo proteico, por lo que cualquier alteración en estas variables se traducirá en un cambio de la concentración de urea en suero.

Fundamento del método:Autora: Dra. Celia Bowen

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La urea se hidroliza por acción de la ureasa en presencia de agua para producir amoníaco y dióxido de carbono. En una reacción de berthelot modificada los iones amonio reaccionan con hipoclorito y salicilato produciendo un complejo verde llamado indofenol que se determina colorimétricamente. ureasa NH2 – CO – NH2 + H2O (NH4

+)2 + CO2

Nitroprusiato (no es enzima)(NH4

+)+salicilato+ClONa+ 2-oxoglutarato Indofenol (verde)

Parte experimental:1.Procedimiento (en suero o plasma):1.1. En cuatro tubos de ensayo marcados como B (blanco), S (Standard), M1 (muestra 1) y M2 (muestra 2) agregar:

B S M1 M2Standard - 10 ulSuero o plasma - - 10 ul 10 ulReactivo 1 1000 ul 1000 ul 1000 ul 1000 ulEnzima ureasa 5 ul 5 ul 5 ul 5 ulMezclar por agitación suave e incubar 10 minutos a 20-25º C o por 3 minutos a 37ºCReactivo 2 1000 ul 1000 ul 1000 ul 1000 ulMezclar por agitación suave e incubar 10 minutos a 20-25º C o por 5 minutos a 37ºC. Leer la absorbancia de la muestra (∆A muestra) y del estándar (∆A Estándar) en espectrofotómetro a Hg 578 nm frente a un blanco reactivo antes de 60 minutos

Cálculos de concentración de urea:C (mg/dl)= ∆A_muestra x 80 ∆A estandar

Valores de referencia en suero: 10 – 50 mg/dl Parámetros a considerar:- El espectrofotómetro debe estar encendido 20 minutos antes de realizar las lecturas de las muestras

2.Materiales y reactivos:2.1. Materiales:-Gradilla-Cuatro tubos de ensayo-Espectrofotómetro-Pipetas automáticas-Puntas de plástico para pipeta automática-Cubetas de plástico para espectrofotómetro-Reloj

2.2.Reactivos:-Reactivo 1: Buffer fosfatos (pH 7.0), Salicilato de sodio, Nitroprusiato de sodio, EDTA-Reactivo 2: Buffer fosfato (pH≤ 13), hipoclorito-Standard: solución de urea 80 mg/dl-Ureasa (enzima): Solución estabilizada y tamponada de alta potencia-Suero sanguíneoAutora: Dra. Celia Bowen

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TRABAJO EN CLASE:Realizar el análisis de urea en un suero sanguíneo y luego reportar los cálculos en la carpeta con la respectiva interpretación del resultado

Autora: Dra. Celia Bowen

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