Perspectiva del uso de la secuenciación masiva en el mundo vitivinícola

Perspectiva del uso de la secuenciación masiva en el mundo vitivinícolaCarmen Portillo Dept. Bioquimica i Biotecnologia, URV

15 Abril 2016XXVIIè CONGRÉS I LA NIT DE L’ENOLOGIA 2016

Indice

Introducción de la microbiología del vino

Secuenciación masiva (HTS)

Aplicaciones de HTS en enología

Perspectivas futuras de HTS en enología

Carácter del vino

Uva

• Variedad, cepa, prácticas cultivo• Clima, microclima, enfermedades

Microorganismos

• Microbiota de la uva• Inóculo• Microbiota de la bodega

Procesado

• Recogida, macerado, aditivos, condiciones de fermentación, lias• Clarificación, filtración

Envejecimiento

• Composición, tiempo, Tª, pH, higiene, evaporación,O2

Introducción

Decisión de la bodega

Grape

Introducción

MicroorganismoEnvejecimientoProcesadoUva

MicroorganismoEnvejecimientoProcesadoUva

Microorganismo

Procesado

Procesado

Crianza

Crianza

Uva

Microorganismo

Uva

Microbiología del vinoLevaduras: Fermentación alcohólicaAzucares EtOH + CO2

LAB: Fermentación MalolácticaAc. málico Ac. Láctico

Deseables

Introducción

Sugars

Problema de contaminación

Levaduras o bacterias: • Desestabilizan la fermentación• Producen malos olores o sabores• Refermentan en el producto embotellado

Indeseables

BACTERIASAcetobacter

GluconobacterBacillus

PediococcusLactobacillus

…

LEVADURASBrettanomyces

CandidaPichia

Zygosaccha.Schizosacch.

….

Introducción

Métodos de detección alteraciones microbiológicas• Análisis sensoriales o de cromatografía gaseosa

Confirmativos

• Cultivo en placas de medios selectivosIncubación larga, VPNC, medios inadecuados

• Técnicas moleculares basadas en ADN/ARNrestricción del ADN mitocondrialPCR-RFLPPCR-RAPDPCR con cebadores específicos Pre-enriquecimiento PCR anidada LimitacionesqPCR

Introducción

Métodos de detección alteraciones microbiológicas• Análisis sensoriales o de cromatografía gaseosa

Confirmativos

• Cultivo en placas de medios selectivosIncubación larga, VPNC, medios inadecuados

• Técnicas moleculares basadas en ADN/ARNrestricción del ADN mitocondrialPCR-RFLPPCR-RAPDPCR con cebadores específicos Pre-eriquecimiento PCR anidada LimitacionesqPCR

Introducción

Secuenciación Masiva HTS

Secuenciación masiva (HTS)Secuenciación m

asiva (HTS)

ADN genómico

Fragmentación

Identificación(Tag)

Amplificación

SecuenciaciónAnálisis

Secuenciación masiva (HTS)Secuenciación m

asiva (HTS)

Aplicaciones de secuenciación masiva (HTS)

Secuenciación masiva (HTS)

• Metagenómica (mezcla de ADN dentro de un ecosistema)

• ADN de muestras prehistóricas• Secuenciación de genomas procariotas y eucariotas• Identificación de mutaciones (enfermedades)• Estudios comparativos (Metatranscriptómica)• Detección de alelos específicos del cancer• Epigenómica• Detectar ncRNA• …..

Aplicaciones de secuenciación masiva (HTS)

Secuenciación masiva (HTS)

• Metagenómica (mezcla de ADN dentro de un ecosistema)

Aplicaciones de secuenciación masiva (HTS)

Secuenciación masiva (HTS)

• Metagenómica (mezcla de ADN dentro de un ecosistema)

Investigar comunidades microbianas

16S procariotas18S/ ITS eucariotas

Alimentos

Genes/funciones

Estructura de la comunidad

-Bebidas fermentadas-Carne-Leche-Queso…

Aplicaciones HTS en enologíaAplicaciones

Bokulich et al., 2012. PLoS ONE 7(5): e36357. doi:10.1371/journal.pone.0036357

• Estudio pionero de HTS en enología realizado sobre vino Botritizado• Diversidad bacteriana mucho mayor a la descrita anteriormente• Influencia del uso de inoculo de S.cerevisiae sobre diversidad bacteriana

Aplicaciones HTS en enologíaAplicaciones

Bokulich et al., 2013. PNAS. E139–E148, doi: 10.1073/pnas.1317377110

Las comunidades microbianas (bacterias y hongos) están influenciadas por la variedad de uva, región, clima y cosecha

Aplicaciones HTS en enologíaAplicaciones

Pinto et al., 2014. PLoS ONE 9(1): e85622. doi:10.1371/journal.pone.0085622

• Procariotas y Eucariotas en las hojas de la vid a lo largo del ciclo vegetativo

• Microbiología estructurada y dinámica (Enterobacteriaceae yAureobasidium)

• Microbiota afectada por el tratamiento químico

Aplicaciones HTS en enologíaAplicaciones

Zarraonaindia et al., 2014. mBio 6(2):e02527-14.doi:10.1128/mBio.02527-14

• El suelo es una fuente importante de bacterias asociadas a la vid• Los factores edáficos y las propiedades específicas del viñedo influyen la microbiología de la planta antes de la vendimia

Mantel test r ppH 0.611 0.001C:N 0.442 0.001Carbon 0.158 0.001Soil Temp 0.155 0.001Moisture 0.125 0.005Nitrogen 0.104 0.031

Aplicaciones HTS en enologíaAplicaciones

Portillo et al., 2016. International Journal of Food Microbiology 219 (2016) 56–63

• Los más abundantes en uva: Bacillales y Lactobacillaes• Diferentes grupos taxonómicos y proporción de los mismos (viñedo y variedad)

Aplicaciones HTS en enologíaAplicaciones

Portillo et al., 2016. International Journal of Food Microbiology 219 (2016) 56–63

• La variedad de uva y el viñedo influyen en la microbiota residente en los racimos• Factores como la orientación geográfica del viñedo marcan las diferencias en la composición bacteriana de las uvas dentro de una DO (Priorat)

Aplicaciones HTS en enologíaAplicaciones

Portillo et al., 2016. International Journal of Food Microbiology 219 (2016) 56–63

• Grupos taxonómicos compartidos por los distintos viñedos

Persperctivas de HTS en enología• Hasta ahora, uso principalmente ecológico• En el área de alimentos, monitorización de grupos• Recientemente, búsqueda de contaminantes

Perspectivas

Uso de HTS para la detección de contaminantes microbiológicos durante fermentación, envejecimiento o tras el

embotellado del vino

Persperctivas de HTS en enología• Hasta ahora, uso principalmente ecológico• En el área de alimentos, monitorización de

especies• Recientemente, búsqueda de contaminantes

Perspectivas

Uso de HTS para la detección de contaminaciones microbiológicas durante

fermentación, envejecimiento o tras el embotellado del vino

Ventajas

-Descripción detallada de los microorganismos-Monitorización procesos normales/alterados-Identificación de nuevos alterantes-Posible efecto predictivo

Perperctivas de HTS en enología• Hasta ahora, uso principalmente ecológico• En el área de alimentos, monitorización de grupos• Recientemente, búsqueda de contaminantes

Perspectivas

Uso de HTS para la detección de contaminaciones microbiológicas durante

fermentación, envejecimiento o tras el embotellado del vino

Desventajas -Coste aún elevado para bodegas-Requiere conocimientos bioinformáticos

Perperctivas de HTS en enología• Hasta ahora, uso principalmente ecológico• En el área de alimentos, monitorización de grupos• Recientemente, búsqueda de contaminantes

Perspectivas

Uso de HTS para la detección de contaminaciones microbiológicas durante

fermentación, envejecimiento o tras el embotellado del vino

Desventajas -Coste aún elevado para bodegas-Requiere conocimientos bioinformáticos

Solución: Realizar análisis mediante servicios externosEjemplo: Biome Makers

Gracias!

Carmen Portillo Dept. Bioquimica i Biotecnologia, URV

15 Abril 2016XXVIIè CONGRÉS I LA NIT DE L’ENOLOGIA 2016