Bacteriófagos y sus aplicaciones en seguridad alimentaria

Pilar García SuárezInstituto de Productos Lácteos de Asturias (IPLA-CSIC), Villaviciosa,

Asturias, Spain

Bacteriófagos y sus aplicaciones en seguridad alimentaria

Jornadas Técnicas Sobre Biocontrol en Fermentación Láctea. 6 y 7 de Septiembre -Complejo Cultural San Francisco - Cáceres

Quesos de

España

WWW. IPLA.CSIC.ES

Tecnología y Biotecnología de P.L.Microbiología molecularFermentos lácticos y bioconservaciónFísico-química

Microbiología y Bioquímica de P.L.Probióticos, prebióticos y exopolisacáridosCultivos lácteos funcionales

INSTITUTO DE PRODUCTOS LÁCTEOS DE ASTURIAS

CSIC

DairySafe Group

Ana RodríguezBeatriz MartínezPilar García

Clara RocesLorena RodríguezDiana GutiérrezSilvia PortillaAna B. CampeloRosana CalvoPablo GonzálezDiana Lueces

ÍNDICE

1. SEGURIDAD ALIMENTARIA

2. BIOCONSERVACIÓN

3. LOS BACTERIÓFAGOS

4. PROTEÍNAS FÁGICAS

5. TERAPIA FÁGICA

6. BIOCONTROL DE PATÓGENOS EN ALIMENTOS

7. PERSPECTIVAS DE FUTURO

SEGURIDAD ALIMENTARIA

Seguridad alimentaria en el mundo: 2.2 millones de muertes al año (OMS, 2012)

Países industrializados: 5,262 brotes en 2010 EU

NUEVAS TECNOLOGÍAS: - disminuir pérdidas económicas

- bajar los costes procesamiento

- cumplir las normativas legales

- impedir la trasmisión de patógenos

- satisfacer al consumidor (aditivos, poco procesados, listos para comer, )- sostenibilidad

CAUSAS:

- patógenos emergentes

- adaptación de patógenos conservación

- resistencia a antibióticos bacterias zoonóticas

SEGURIDAD ALIMENTARIA

BIOCONSERVACIÓN

La bioconservación es la utilización de microorganismos, incluidos

bacteriofagos, sus productos metabólicos o ambos para conservar los

alimentos (Montville & Chikindas, 2007).

* CULTIVOS INICIADORES Quesos artesanales asturianos

Lactococina 972

Biocontrol de patógenos

* BACTERIOCINAS

* BACTERIOFAGOS

BIOCONSERVACIÓN

LOS BACTERIÓFAGOS

LOS BACTERIÓFAGOS: abundancia y diversidad

- 1031 partículas (104-107 pfu/ml agua mar; 108 pfu/g suelo).

- Eliminan la mitad de la población bacteriana cada 48 h.

- Papel en la evolución de las bacterias acelerando la tasa de mutación.

LOS BACTERIÓFAGOS: abundancia y diversidad

- 5100 especies diferentes

LOS BACTERIÓFAGOS: morfología y ciclo de vida

Tail

Tail fibers

Core

HeadDNA

Environmental signals

Bacteriophage

Host recognition

Adsorption

Insertion(prophage)

Penetration

Replication

Synthesis

AssemblyRelease

LYTIC CYCLE

LYSOGENIC CYCLE

7

6

5

4

3

21

LOS BACTERIÓFAGOS: morfología y ciclo de vida

PROTEÍNAS FÁGICAS: endolisinas y PG hidrolasas

EndolisinasPG hidrolasas asociadas a virión

Lisis

Bacteriófago

ReconocimientoAdsorción

Inserción(profago)

Penetración

Replicación

Síntesis

Ensamblaje

CICLO LITICO

CICLO LISOGÉNICO

7

6

5

4

3

21

MEMBRANA

PE

PT

IDO

GLI

CA

NO

ESPACIO PERIPLASMICO

CITOPLASMA

HIDROLASA

HOLINA

ENDOLISINA

CITOPLASMA

ESPACIO PERIPLASMICO

PE

PT

IDO

GLI

CA

NO Señales

ambientales

L-Ala D-Gln

D-Gln

L-Lys

D-Ala L-Lys

D-Ala

L-Ala

21

6

54

3

D-GlnD-Ala L-Lys

NAM

NAM

NAG

NAG

NAG

NAM

NAG

NAG

NAG

21

6

54

3NAM

NAM

NAG

NAG

NAG

NAM

NAG

NAG

NAG

PROTEÍNAS FÁGICAS: endolisinas y PG hidrolasas

Peptidoglycan hydrolase activities and their bond substrate in the cell wall. 1: N-acetylmuramoyl-L-alanine amidase; 2: interpeptide bridge endopeptidase; 3: N-acetyl-β-D-glucosaminidase; 4: L-alanoyl-D-glutamateendopeptidase; 5: N-acetyl- β-D-muramidase; 6: Transglycosylase.

Daniel et al., 2010

S. aureus ClyS

Capacidad antimicrobiana: enzibióticos

PROTEÍNAS FÁGICAS: endolisinas y PG hidrolasas

S. aureus LysH5

Obeso et al., 2008

TERAPIA FÁGICA

TERAPIA FÁGICA: los primeros ensayos

Phage discovery

1917 1920 1930 1940 Present

Phage therapy

Antibiotics production

Antibiotic therapy

Phage therapy in former Soviet Union

and Poland

Intestinal disorders (Phagesti)

Bacterial infections (Phagepy, PhageBioderm)

Food safety (LISTEX P100, ListShieldTM, EcoShieldTM)

Crop safety (AgriPhage)

Animal health care (SPLX-1TM

PLSV-1TM, INT-401TM , BioTector)

Bacterial detection (FASTPlaque-ResponseTM, FASTPlaqueTBTM, MicroPhage MRSA/MSSA test,

MRSA screening test, MRSA/MSSA blood culture test)

COMMERCIAL PRODUCTS

G. Eliave Bacteriophage, Virology and Microbiology Institute D’Herelle, 1917

Terapia humana

TERAPIA FÁGICA: algunos productos

TERAPIA FÁGICA: ventajas y desventajas

Ventajas

Especificidad y capacidad de autorreplicaciónEficaciaHistoria de uso seguroNo alteran las propiedades organolépticasLas endolisinas no generan resistencia

Desventajas

Los fagos pueden llevar en su genoma genes codificantes de toxinasRango de huésped estrechoBacterias resistentes a fagosInactivación por las condiciones ambientalesLas endolisinas no actúan sobre gram negativos

TERAPIA FÁGICA: empresasCompany Country Web site Target

Gangagen USA http://www.gangagen.com/ Human infections

Intralytix USA http://www.intralytix.com/ Food safety

Omnilytics USA http://www.phage.com/home5.html Crops (Agriphage)

Phage Biotech Israel http://www.phage-biotech.com/ Human infections

Hexal Genentech Germany http://www.hexal-gentech.com/index.html Human infections

Novolytics UK http://www.novolytics.co.uk/ Human infections

Biophage Inc. Canadá http://www.biophagepharma.net/index.html Environment, human and animal

Biopharm Pharmaceuticals Georgia http://www.biopharmservices.com/Pharma.aspx Human infections

EBI Food Safety Netherlands http://www.ebifoodsafety.com Food safety.(Listex P100TM)

BigDNA UK (http://www.bigdna.com/) Animal infections

JSC Biochimpharm Georgia (http://www.biochimpharm.ge/) Human infections

Biocontrol UK (http://www.biocontrol-ltd.com/) Human infections

Innophage Portugal (http://www.innophage.com/) Human infections

Phico Therapeutics UK (http://www.phicotherapeutics.co.uk/) Human infections

Phage International USA, Georgia (http://www.phageinternational.com/) Human infections

Targanta Therapeutics USA (http://www.targanta.com/) Human infections

Viridax USA (http://www.viridax.com/) Human infections

BIOCONTROL DE PATÓGENOS EN ALIMENTOS

Disinfection of equipment contact

surfaces

Biopreservation

Reduction of colonization

Phage therapy Biofilms removal

“Farm to fork”

Animals Foodstuff industry

Final product

Storage and marketing

Phage

Biocontrol

Carcass meatraw productsRTE products

Consumer

BIOCONTROL DE PATÓGENOS EN ALIMENTOS

1. Terapia fágica y profilaxis en el ganado

2. Descontaminación de superficies

3. Conservación de alimentos

4. Detección de bacterias en la cadena de producción

1. TERAPIA FÁGICA Y PROFILAXIS EN EL GANADO

E. coli O157:H7

Sheng et al. 2006

Tratados

10E6 cfu10E10 pfu/4 días10E6 pfu/ml agua

control

fagos SH1 and KH1

1. TERAPIA FÁGICA Y PROFILAXIS EN EL GANADO

Schmelcher et al., 2012

Staphylococcus aureus

12.5 µg each/gland3.36-log decrease in CFU

Endolisinas

Staphylococcus aureus

Daniel et al., 2010

5 10E9 cfu24h 1 mg endolisina ClyS

1. TERAPIA FÁGICA Y PROFILAXIS EN MANIPULADORES

Endolisina ClyS

BIOCONTROL DE PATÓGENOS EN ALIMENTOS

1. Terapia fágica y profilaxis en el ganado

2. Descontaminación de superficies

3. Conservación de alimentos

4. Detección de bacterias en la cadena de producción

biofilm

2. DESCONTAMINACIÓN DE SUPERFICIES

2. DESCONTAMINACIÓN DE SUPERFICIES

Campylobacter jejuni

Fagos CP8, CP30 y PT14

Siringan et al., 2011

Control tratados

2. DESCONTAMINACIÓN DE SUPERFICIES

Endolisinas frente a S. aureus

Sass and Bierbaum 2007 Son et al. 2010

control endolisina

C PT C PT C PT

F12 CJBP1 CJBP3

S DS R

phi-IPLA5 biofilm S. epidermidis 7 días

3h

Gutiérrez et al., 2012

2. DESCONTAMINACIÓN DE SUPERFICIES

biofilm

planctónico

Staphylococcus epidermidis

BIOCONTROL DE PATÓGENOS EN ALIMENTOS

1. Terapia fágica y profilaxis en el ganado

2. Descontaminación de superficies

3. Conservación de alimentos

4. Detección de bacterias en la cadena de producción

3. CONSERVACIÓN DE ALIMENTOS

García et al., 2009

Leche S. aureus fagos phiH5 y phiA72

Pasteurizada Cruda semidesnatada Cruda entera

S. aureus + fagos

S. aureus

* Aplicación de la microbiología predictiva

100 80 60 40 20

Figura 11. Superficie de Respuesta del Modelo 4.

Los 3 ejes representan respectivamente el % de Mortalidad, la Temperatura, y el

log10 de la Concentración de Bacteriófagos Añadida.

%M

ort

ali

dad

2 3 4 5 6 7 8 9 10

Log10fagos

10

15

20

25

30

35

40

Tem

pera

ture

, ºC

100%98%

95%90%

Figura 12. Líneas de contorno en 2D del Modelo 4 indicando las regiones de inhibición y

supervivencia de bacterias. Log10 fagos que garantiza la Mortalidad 100% a 15 ?C.

Log10 fagos

Temperatura (

? C)

7,7

X = temperatura Y = log concent fagos

Mortalidad = – 125,86 + 5,96·x + 28,76·y – 0,745·xy

Obeso et al., 2010

3. CONSERVACIÓN DE ALIMENTOS

logP

FU

mL

-1log

CF

U m

L-1

0

2

4

6

8

10

0 50 100 150 200 250

time (min)

0

2

4

6

8

10

logP

FU

mL

-1log

CF

U m

L-1

0

2

4

6

8

10

0 50 100 150 200 250

time (min)

0

2

4

6

8

10

log

CF

U m

L-1

log

PF

U m

L-1

pH

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

0 5 10 15 20 25

time (h)

4

5

6

7

log

CF

U m

L-1

log

PF

U m

L-1

pH

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

0 5 10 15 20 25

time (h)

4

5

6

7

CUAJADA ÁCIDA CUAJADA ENZIMÁTICA

Garcia et al., 2007

S. aureus fagos phiH5 y phiA72

3. CONSERVACIÓN DE ALIMENTOS

pH

fagos

S. aureus

BAL

S. aureus + fagosS. aureus + fagos

fagos

S. aureus

Φ35 y Φ88 S. aureus en queso

0

2

4

6

8

10

leche

cuaja

da24

h48

h qu

eso

5 dqu

eso

8 dqu

eso 1

5 dqu

eso 3

0 dTiempo de maduración

2

3

4

5

6

7

0

2

4

6

8

10

lech

ele

che

3 hle

che

6 hcu

ajada

24

h qu

eso

7 d

ques

o 14

d

Tiempo de maduración

2

3

4

5

6

7Mixta Ácida

pH

pH

3. CONSERVACIÓN DE ALIMENTOS

Bueno et al., 2012

pH

S. aureus

fagos

S. aureus + fagos

3. CONSERVACIÓN DE ALIMENTOS

Combinación de fagos y altas presiones

Tabla et al., 2012

L. monocytogenes phage P100 y A115

Guenther et al. 2009

1 10E3 cfu/gr ml3 10E8 pfu/ gr ml

6 días a 6°C

3. CONSERVACIÓN DE ALIMENTOS

Endolisina LysH5 S. aureus

Obeso et al., 2008

3. CONSERVACIÓN DE ALIMENTOS

LysH5 (45U/ml)LysH5 (160U/ml)

LysH5 (80U/ml)

controlcontrol

* Construcción de proteínas quimera

166 465

CHAP156

CHAP166

LYZ161

LYZ171

636 1

629

156 475

6xHis149 483

CHAP LYZ215

HydH5

Lysostaphin

SH3bEndopeptidase

249 1

132 32 167

HydH5Lyso

884 1

HydH5SH3b

739 1

CHAPSH3b

1 261

156

Rodríguez-Rubio et al., 2012a

3. CONSERVACIÓN DE ALIMENTOS

3. CONSERVACIÓN DE ALIMENTOS

37 ºC RT

Time (min)

*** *** *****

**

*** ****** ***

37 ºC RT37 ºC RT

Time (min)

*** *** *****

**

*** ****** ***

Proteína CHAPSH3 S. aureus leche cruda

Rodríguez-Rubio et al., unpublished

control con proteína

* Estudio de posibles sinergismos

Endolisina LysH5 (U/ml)

Nisin

a

6 µg/ml

0

5 ng/ml

50 0.078

García et al., 2010Rodríguez-Rubio et al., 2012a

3. CONSERVACIÓN DE ALIMENTOS

control

LysH5

nis

LysH5 + nis

SPlcn972 LysH5

1 1533 nt

506 aa1

GTA GCT CAA GCT ATG CAA GCA AAA CTA ACT AAA76 108 nt

22 32 aaVal Ala Gln Ala Met Gln Ala Lys Leu Thr Lys

lysH5SPlcn972

Rodríguez-Rubio et al., 2012b

3. CONSERVACIÓN DE ALIMENTOS

* Cultivos iniciadores con capacidad protectora

Lactococcus lactis

LysH5

LysH5

LysH5

LysH5

LysH5

lysH5

Pnis

nisR nisKnisK

nisR

LysH5

LysH5

LysH5

SPLcn972

Sec

BIOCONTROL DE PATÓGENOS EN ALIMENTOS

1. Terapia fágica y profilaxis en el ganado

2. Descontaminación de superficies

3. Conservación de alimentos

4. Detección de bacterias en la cadena de producción

L. monocytogenes

1-10 CFU/gr

Kretzer et al., 2007

4. DETECCIÓN DE BACTERIAS EN LA CADENA DE PRODUCCIÓN

Bacillus cereus

Clostridium perfringens

NC

Catalytic Binding

Linker

CBD L. monocytogenes

Schmelcher et al., 2010CFP, cyan fluorescent protein; GFP, green fluorescent protein; RS, RedStar protein

4. DETECCIÓN DE BACTERIAS EN LA CADENA DE PRODUCCIÓN

Agricultura Veterinaria

INT-401™Clostridium perfringens

PLSV-1™Salmonella

Acuicultura, tratamiento de aguas, desinfección de superficies, detección de bacterias, etc.

EcoShield™ ListShield™

SALMONELEX™

MICREOS

LISTEX™

MICREOS

PERSPECTIVAS DE FUTURO

Pilar García SuárezInstituto de Productos Lácteos de Asturias (IPLA-CSIC), Villaviciosa,

Asturias, Spain

Bacteriófagos y sus aplicaciones en seguridad alimentaria

GRACIAS POR SU ATENCIÓN