Caracterización funcional y genómica de

bacteriófagos con potencial para el control de

la presencia de aminas biógenas en quesos

Microbiología

MolecularVictor Ladero

Compuestos nitrogenados, originados por descarboxilación, presentes en muchos alimentos capaces de provocar intoxicaciones alimentarias

Aminas biógenas

HISTIDINA HISTAMINA

CO2

Descarboxilasa (DC)H+

TIROSINA TIRAMINA

CO2

H+

Alimentos no fermentadosFamilia Scombridae (caballa, atún, …)Microbiota contaminanteBacterias Gram negativas

Alimentos y bebidas fermentadosQueso, vino, embutidos, cerveza, sidraBacterias Gram positivas (BAL)Cultivo iniciador o microbiota secundaria

Sistema circulatorioHipertensión (tiramina)Hipotensión (histamina, putrescina)Cefaleas, Bradicardia, fallo cardíacoAparato respiratorioSofocosAparato digestivoNauseas, vómitos

Aminas biógenas

Scientific Opinion (BIOHAZ)Risk Based Control of BA in Foods Reducir la presencia de AB en los alimentos

Compuestos nitrogenados, originados por descarboxilación, presentes en muchos alimentos capaces de provocar intoxicaciones alimentarias

Tiramina en alimentosValores máximos detectados

(mg/kg o mg/l) Alimento Histamina Tiramina Putrescina Cadaverina

Pescado yproductos derivados

Atún 20.000 2.000 4.470Anchoas 2.860

Productos fermentados 163 627 244 356Otros 8.910 634 337 1.690

Bebidas alcohólicasfermentadas

Cerveza 21,6 46,8 17,8 31,4Vinos fortificados 2,9 22,5 4,3 0,4

Vino tinto 34,3 18,5 21,6 5Vino blanco 55 10 10 10

Vino espumoso 9,8 47,3 46,4 0,5

SalsasSalsa de pescado 758 741 1.220 1.150

Otras salsas 16 21 27,4 82,1

Productos cárnicosEmbutidos 400 1.740 1.550 1.250

Otras carnes curadas 150 387 406 305Otros productos cárnicos 212 292 305 64

Productos lácteos

Queso fresco 119 457 348 389Queso curado 1.240 1.450 1.560 3.170

Queso de corteza lavada 392 1.900 816 2.460Queso azul 1.850 2.130 701 3.120

Quesos de cuajada ácida 102 480 648 980Total en quesos 1.850 2.130 1.560 3.170

Yogur 1 5,2 1,1 10,3Otros 0,6 0,4 0,9 3

VerdurasVerduras fermentadas 92 91 549 94

Otras verduras 75,7 25,4 310 85

Presencia de microorganismoscon actividad Aminogénica

Disponibilidad de sustratoProteolisisPeriodo de maduración

SUSTRATO

BACTERIAS

DC+

AMBIENTE

ABαα

Factores reducen ABPasteurización, HPs[Sal]

Factores aumentan ABpH ácido, TªProcesado post-maduración

Iniciadores AB -

Factores presencia Tiramina

Productores tiramina en quesos

Productores

Tiramina

E. duransE. faecium

E. faecalisL. curvatus

L. brevisS. thermophilus

E. hirae

E. faecalis

Eliminación de tiramina en quesos

Reducción

Autoreplicación

Fago-remediación

Resistencia

E. faecalisProductores

Tiramina

Especificidad Inocuidad

Aminas Biógenas

Viables

Fagos

Biocontrol en miniquesosBiocontrol

MOI: 0,1 104 cfu ml-1

Reducción tiramina84,8 %

0

1

2

3

4

t0 tf

Tyra

min

e (m

M)

*

430 mg kg-1

63 mg kg-1

Enriquecimiento

Aislamiento

Bacteriófagos frente a E. faecalisFago-remediación

Aislamiento bacteriófagos

Caracterización

Rango hospedador Morfología Ciclo vida

Fago-remediaciónAislamiento bacteriófagos

Quesos Screenings BacteriófagosCabrales 14 141, 152, 158, 159, 153, 155, 160, 161

Emmental 11 143, 146

Boffard 7 142, 144, 145, 150, 151, 153

Gamoneu 4 140

Oveja 4 156, 157

Zamorano 3 147, 149, 148

Cabra 1 162

Otras variedades 18 -

Enriquecimiento

Aislamiento

Bacteriófagos frente a productores AB

62 screenings – 23 bacteriófagos

Fago Lácteo Carne Humano Clínico Tipo Total14 2 8 2 1 27

140 11 1 5 1 1 19

141 6 0 2 0 1 9

142 0 0 1 0 0 1

143 1 0 3 2 0 6

144 2 0 4 1 0 7

145 2 0 3 1 0 6

146 1 0 1 2 0 4

147 1 0 3 2 0 6

148 12 1 2 1 1 17

149 12 1 2 1 1 17

150 6 0 2 1 1 10

151 2 0 0 1 1 4

152 4 0 0 0 1 5

153 4 0 2 0 1 7

155 0 0 0 0 1 1

156 13 1 3 2 1 20

157 13 1 3 2 1 20

158 7 0 2 0 1 10

159 6 0 2 0 1 9

160 7 0 2 0 1 10

161 6 0 0 0 1 7

162 6 0 3 0 1 10

Rango de hospedador

85,454 bp

Terminasa Lisis Estructural Replicación Desconocido

Secuenciación

Bacteriófago: 140

Origen: Queso Gamoneu

Hospedador: E. faecalis 52c

Ciclo vida: Lítico

DNA Resistente a la restricción

Identificación de genes implicados en modificación

de nucleótidos

RESULTS Bacteriophages of E. faecalis

142,215 bpTerminasa Lisis Estructural Replicación Desconocido

Secuenciación

Bacteriófago: 149

Origen: Queso Zamorano

Hospedador: E. faecalis 63c

Ciclo vida: Atemperado?

Placas pequeñas y turbias

Ciclo de vida Lítico

RESULTS Bacteriophages of E. faecalisSecuenciación

Bacteriófago: 159

Origen: Queso Cabrales

Hospedador: E. faecalis CECT481T

Ciclo vida: Lítico

Placas grandes y claras

Sin secuencia tras dos intentos

Φ159 MWΦ159HindIII

141,133 bpTerminasa Lisis Estructural Replicación Desconocido

Bacteriófago: 156

Origen: Queso Oveja

Hospedador: E. faecalis HFS59

Ciclo vida: Lítico

Placas pequeñas y con doble halo

RESULTS Bacteriophages of E. faecalisSecuenciación

Ningún gen asociado al

fenotipo “doble halo”

Bacteriófago: Q69 (162)

Origen: Queso Monterrubio (Cabra)

Hospedador: E. faecalis CECT481T

Ciclo vida: Lítico

Placas con doble haloDoble secuencia

42,241bp

42,822bp

Terminasa Lisis Estructural Replicación Desconocido

Profago de la cepa CECT481TNingún gen asociado al

fenotipo “doble halo”

Secuenciación

Comparación de secuencias

MAFFT v.6

Identificación de endolisinasIdentificación de secuencias con potencial antimicrobiano

MW E1 E2 E3 E4

p1367

815

1824

5772

42

31 34,9

pIPLA1367x6218 bps

HindIII

NcoI

pBR322 ori

Lys

lacI

Kan

f1 origen

Conclusiones

Hemos aislado 23 bacteriofagos frente a E. faecalis, productor de tiramina y putrescina.

La secuencia genómica nos permite caracterizarlos y conocer peculiaridades de los mismos

La combinación de caracterización funcional y genómica permite realizar una mejor selección de los mismos con vistas a futuras aplicaciones

La secuenciación nos permite la identificación y utilización de genes con potencial antimicrobiano.

Agradecimientos

GRUPO MICROBIOLOGIA MOLECULAR

Carolina Gómez SordoNoelia MartínezEsther Sánchez Llana

GRUPIN14-137

AGL2013-45431-R

AGL2016-78708-R