UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE BAJA CALIFORNIA

ALERGOLOGÍA

- Curso básico de inmunología clínica y alergia –

Dr. Alberto José Escalante Domínguez

TBX21: una variante funcional predice mejora en asma con el uso de corticoesteroides inhalados

Diana Hernández Moreno

Matrícula 1211830

Grupo 362

ANÁLISIS

Para el tratamiento del asma se toman en consideración varios factores, uno de

los principales es el tipo de ataques que presenta el paciente para conocer el tipo

de tratamiento que se va a utilizar. En el asma crónico, el uso de un

broncodilatador no es suficiente, es necesario usar un antiinflamatorio; los más

usados, los corticoesteroides inhalados.

Pero hay otro factor importante en la eficacia de un tratamiento esteroideo, la

genética. La asociación de ciertas variantes en los genes con la eficacia del

tratamiento para el asma pudo ser estudiada y comprobada en la mejoría de la vía

aérea de la población seleccionada, estas variantes permiten identificar cuál es el

mejor manejo en el asma y cómo es su función en distintos genotipos. La

población seleccionada fue significativa y el tipo de estudio aleatorizado permitió

resultados que fueron de importancia clínica.

20 DE AGOSTO 2015

TBX21: una variante funcional predice mejora en asma con el uso de corticoesteroides inhalados

Kelan G. Tantisira*, Eun Sook Hwang, Benjamin A. Raby*, Eric S. Silverman, Stephen L. Lake*, Brent G. Richter*, Stanford L. Peng, Jeffrey M. Drazen, Laurie H. Glimcher§, and Scott T. Weiss*

*Channing Laboratory and Pulmonary Division, Brigham and Women’s Hospital and Harvard Medical School, Boston, MA 02115; y Washington University School of Medicine, St. Louis, MO 63110

Contribuído por Laurie H. Glimcher, Noviembre 17, 2004

TBX21 codifica el factor de transcripción T-bet (T-box “caja-T” expresada en células T), que influencia linfocitos T ingenuos y ha sido implicado en la patogenia del asma. Específicamente en ratones, la inactivación de T-bet desarrolla espontáneamente una hiperrespuesta de la vía aérea y otros cambios consistentes con asma. La sensibilidad de la vía aérea es moderada por el uso de corticoesteroides inhalados en el asma, por lo que es concebible que la variación genética en la codificación de TBX21 para reemplazar la histidina 33 con glutamina se asocia con una mejora significante en el PC20 (una medida de sensibilidad de la vía aérea) de niños asmáticos en ensayos clínicos grandes abarcando 4 años. Notamos que esta mejora ocurre solo en los niños aleatorizados para corticoesteroides inhalados y que mejora dramáticamente la PC20 en una prueba final para sujetos que, poseyendo un alelo variante estaba en el rango normal para no asmáticos tomaban corticoesteroides inhalados. En modelos celulares, se muestra que la variante de TBX21 incrementa T-helper 1 y disminuye la expresión de citosina T-helper 2 comparablemente con el tipo salvaje. TBX21 puede ser una respuesta farmacogenética determinante importante para la terapia del asma con corticoesteroides inhalables.

PC20 | farmacogenética | T-bet

Introducción

Los corticoesteroides median una variedad de acciones inmunológicas y son comúnmente usados en diversos tratamientos de enfermedades. Inhalados, los corticoesteroides son los más efectivos y más comúnmente usados en en la terapia para el control del asma pero puede ser asociado a serias reacciones adversas. Al evaluar la respuesta a la terapia del asma, se mide la función de los pulmones, como el volumen espiratorio forzado en 1 segundo (FEV1 “forced expiratory volumen at 1 second), y la sensibilidad de la vía aérea, son medidos por la concentración de metacolina causando un decremento del 20% en FEV1 (PC20) son las más comúnmente usadas. Sin embargo, hay una gran variación interindividual en las respuestas del FEV1 y PC20 a los corticoesteroides inhalados. Por lo tanto, identificar estos pacientes puede ser valioso. Porque la respuesta intraindividual a los tratamientos con corticoesteroides inhalados en pacientes con asma es altamente repetible y porque FEV1 y PC20 ambos son rasgos heredables una base genética para la heterogeneidad de esta respuesta terapéutica es plausible.

El gen TBX21 codifica para la transcripción del factor T-bet (T-box expresada en células T), que es responsable por la inducción de células T-helper (Th)1 y a represión de células Th2 por linfocitos T ingenuos. T-bet ha sido implicado en la patogénesis del asma. Las células del ratón T-bet inactivadas son espontáneamente hipersensibles en la vía aérea, un fenotipo que es modulado por corticoesteroides, nos dirigimos a los resultados sobre asma de la relación de TBX21 con PC20. Solo una (heterocigoidad estimada >5%) TBX21 SNP (polimorfismo de nucleótido simple) no sinónima ha sido descrito hasta la fecha, rs2240017, que codifica para un reemplazo de histidina 33 con glutamina (H33Q). Evaluamos los roles de este SNP en la respuesta terapéutica con corticoesteroides inhalados en niños inscritos en el Programa de Manejo de Asma de la Infancia (CAMP, Childhood Asthma Management Program). El diseño de estudio de CAMP permitió investigar esta asociación farmacogenética con los niños aleatorizados para corticoesteroides inhalados y entre el grupo de corticoesteroides, y los no aleatorizados para corticoesteroides. Aquí se demuestra una interacción significativa entre H33Q y corticoesteroides inhalados, uso que resulta en una mejora de la sensibilidad de la vía aérea a niveles no asmáticos. También otorgamos un contexto para la función celular de H33Q y una razón para el uso de los términos de interacción en análisis farmacogenéticos.

Materiales y métodos

Población de estudio: El estudio CAMP es un estudio clínico multicéntrico, aleatorizado, doble-ciego, probando la seguridad y eficacia de budesonida inhalada contra nedocromil, contra placebo sobre una media de 4.3 años. El diseño de la prueba y metodología han sido publicadas. CAMP inscribió a 1041 niños de 5-12 años de edad con asma leve a moderado. Se recolectó ADN de las familias representando >700 pro-bandas. En el criterio de inclusión se tomó en cuenta los síntomas del asma y/o el uso de medicamentos >6 meses en los años previos y una vía aérea sensible con PC20 >12.5 mg/ml.

La espirometría y prueba de metacolina fueron realizadas al menos 4 horas después del uso de un broncodilatador de acción corta y 24 horas después del último uso de un broncodilatador de acción larga. La espirometría fue realizada en un Collins Stead-Wells dry-seal Survey III. El espirómetro fue conectado a una computadora de escritorio persona Dell y conoció o excedió los estándares de la Sociedad Americana Torácica.

La sensibilidad de la vía aérea fue determinada por pruebas de metacolina con la técnica de nebulizador de Wright después del método de Cockcroft et al. modificada para la administración de metacolina y de Juniper et al. La metacolina sensitiva fue expresada en términos de PC20 con la siguiente ecuación: PC20= antilog[logeC1 + (logeC2 – logeC1)(20 – R1)/(R2 – R1)], donde C1 es de la segunda a la última concentración probada, C2es la última concentración probada, R1 es el porcentaje que decrece en FEV por diluir después C2.

Visitas de seguimiento con espirometría ocurrían cada 2 a 4 meses y cada 4 meses de ahí en adelante. Los estudios de metacolina fueron realizados durante el periodo “run-in”, a los 8 meses, después anualmente. Nuestro enfoque primario fue en el CAMP donde niños aleatorizados al grupo de corticoesteroides, fueron evaluados en su 1 y 4 años de seguimiento para el cambio en el pre-broncodilatador FEV, y en su cuarto año (44 meses) de visitas para diferencias en el PC20 de la línea base. Estos puntos de tiempo fueron elegidos porque la visita de 1 año representada en el tiempo que el máximo efecto de esteroides fue notado en el principal ensayo clínico y las visitas a 4 años representadas en la última visita con el seguimiento casi completo. El estudio auxiliar CAMP de genética fue aprobado por cada junta de revisión de cada centro de estudio, y se obtuvo consentimiento informado de todos los participantes y sus padres.

Genotipado. El genotipado fue realizado usando el SEQUENOM MassARRAY MALDI-TOF plataforma de espectrometría de masa (Sequenom, San Diego). Cebadores (primers) fueron diseñados usando un programa semiautomático (SPECTRODESIGNER, Sequenom). Hemos usado un método de extensión muy corto, donde secuenciando los productos, son extendidos solo por una base de

tres o de cuatro nucleótidos (representando uno de los alelos), permitiendo claramente una delineada masa de separación de las dos variantes alélicas en un determinado locus.

Para evaluar posibles estratificaciones de población, también se genotipó un panel aleatorio de 49 SNP a través del genoma obtenidos a través de la base de datos del consorcio SNP. SNPs fueron elegidos para excluir al gen propio (promotor, UTR genómico, exones e intrones) de genes conocidos y ser distribuido abiertamente a través del genoma. El control de calidad del genotipado consistió de al menos 90% de llamadas exitosas, regenotipado de =10% de genotipos, y documentación del equilibrio Hardy-Weinberg para cada SNP.

Análisis funcional de H33Q. Para investigar posibles consecuencias funcionales del polimorfismo H32Q T-bet, que es el homólogo del ratón para el H33Q humano, usamos un kit de mutagénesis dirigida a sitio QuickChange para generar una T-bet cDNA codificando una proteína para la que el residuo de histidina en la posición 32 es reemplazado con glutamina. Wild-type (wt) T-bet o la versión H32Q de la T-bet fueron cotransfectados dentro de células EL-4 con un gen informador promotor IFN-ɣ y un gen informador β-gal. Actividad relativa de luciferasa fue ensayada, estandarizada con actividad β-gal, y mostrada como inducción plegada. También se probó la habilidad de la H32Q versión de T-bet para controlar la producción de citosina en células T primarias tomando ventaja de los ratones T-bet deficientes. El wt y versiones polimórficas de T-bet cDNAs fueron clonadas en un vector retroviral bicistronic (RV) y el wt (RV-T-bet) y H32Q T-bet (RV-H32Q) retrovirus GFP fueron transducidos entre 24 – 36 horas dentro de células Th CD4+ aisladas del nódulo linfático T-bet -/-. Las células fueron estimuladas con anti-CD3 y anti-CD28 y cultivado por 5 días más bajo condiciones no polarizantes. En el sexto día, las células fueron organizadas para expresión de GFP y reestimuladas con anti-CD3; 24 horas después, la expresión de wt y H32Q T-bet fue medida por un análisis Western blot y la producción de citosina fue evaluada por ELISA, de acuerdo al protocolo del fabricante (Pharmingen).

Efecto celular de corticoesteroides en expresión de T-bet. Células humanas tCD4 fueron aisladas desde sangre periférica usando microperlas (Miltenyi Biotec) de CD4 humano. Estimulamos estas células CD4 con una placa unida anti-CD3 y anti-CD28 bajo no polarización, y condiciones polarizantes de Th1 en presencia o ausencia de 10-7 M dexametasona. Relativos niveles de transcripción genética para T-bet humana fueron medidos en tiempo real por RT-PCR. Como control, medimos transcripciones codificadas de IRF-4, un gen conocido regulado por esteroides. Por la rareza del alelo menor de H33Q, células CD4 no humanas con variante 33Q estuvieron disponibles para la examinación.

Metodología estadística. El porcentaje de cambio en FEV1 fue definido como (FEV1 al final de un periodo – FEV1 aleatorizado) / (FEV1 aleatorizado x 100). Valores de PC20 fueron transformados a log antes del análisis. Cambio en PC20 fue definido como PC20 a 4 años – PC20 al inicio del ensayo. Valores medios geométricos fueron calculados usando la media exponenciada de la transformación a log del PC20 en un tiempo determinado.

Modelos de regresión linear fueron usados para evaluar la asociación entre el estado genotípico de H33Q y el resultado de interés. Análisis univariantes y mutivariables ajustados por edad, sexo y base FEV1 (como porcentaje de predicción) fueron realizados. Se incorporó la altura dentro de los modelos multivariables involucrando resultados FEV1. Para probar la interacción entre tratamiento esteroideo y H33Q estados genotípicos, incluimos términos de interacción en los modelos. Pruebas t de estudiantes fueron usadas para evaluar la comparabilidad entre los grupos de el nedocromil y placebo antes de su combinación como un solo grupo “no esteroideo”. Dado el pequeño número de individuos con el genotipo de interés, nuestro análisis primario fue repetido usando la prueba no paramétrica exacta Mann-Whitney U. Adicionalmente, para considerar la naturaleza de individuos que exceden el límite máximo para dosis de metacolina, se usaron métodos de sobrevivencia no paramétricos incorporados dentro de las curvas Kaplan-Meier y pruebas log-rank para evaluar las diferencias en el PC20 durante el tiempo. Este procedimiento ha sido demostrado de ser adecuado para el análisis de sensibilidad de vía aérea en estudios basados en población.

Análisis de estratificación de SNPs procedió en dos pasos. Primero, por cada SNP individual, una prueba alélica estadística χ2 fue obtenida en moda estándar usando tablas de contingencia 2x2 que asignaron los totales de wt y variantes alélicas para las cualidades más altas y más bajas de FEV1 y log PC20 respuesta para cada cuatro células. Un resumen total de pruebas estadísticas χ2 fue obtenido sumando las pruebas estadísticas individuales χ2 y ajustando los grados de libertad al número de pruebas. Todos los análisis fueron realizados en SAS V.8 (SAS Institute, Cary, NC).

Resultados

Características de población y respuesta a corticoesteroides. De todos los niños CAMP, 701 fueron genotipados exitosamente en H33Q y tuvieron datos para resultados de interés; =30% fueron aleatorizados al grupo de corticoesteroides. Edad base, género, distribución étnica, FEV1, y PC20 fueron similares entre los

grupos de esteroides y no esteroides. Con el tiempo, la utilización de corticoesteroides fueron asociados con mejoras significativas en FEV1 y PC20. No hubo diferencias significativas entre niños aleatorizados con nedocromil o placebo (P=0.62 y 0.39 por 1 año FEV1 y 4 años PC20, respectivamente). Por lo tanto, estos niños fueron combinados en un grupo no esteroideo más grande.

Se confinaron análisis a los niños cuyos padres se identificaron como caucásicos, por preocupaciones sobre posible estratificación de población y las muestras pequeñas de otros grupos étnicos. En los niños caucásicos, no se encontró evidencia de estratificación de población abierta (P>0.05 para cada uno de los tres resultados).

Asociación de TBX221 con PC20 mejorado en el grupo de corticoesteroides la menor (G) frecuencia de alelos para el TBX21 SNP que codifica glutamina, fue 4.5% en el CAMP de caucásicos (n=24); se esperaron u observaron no homocigotos. El SNP estaba en equilibrio Hardy-Weinberg.

Para niños con corticoesteroides inhalados, el cambio en PC20 log-transformado en 4 años fue relativamente de distribución normal, sugiriendo que factores otros del tipo de tratamiento contribuyeron a esta respuesta. H33Q fue presentada en cinco de estos niños y fue significativamente asociado con este cambio en ambos, univariantes (β=2.97, P=0.0002) y multivariante (β=3.03, P=0.0001) modelos. La media estimada incrementada en PC20 log-transformado en esteroides inhalados después de 4 años fue =3.5-pliegamento, mas en los niños con variantes de glutamina comparados con los homocigotos con wt histdina 33TBX21. H33Q no fue asociado con cambios de 1 año o 4 años en FEV1.

Para explorar estos descubrimientos, nuestro análisis primario de niños con corticoesteroides inhalados fue repetido usando el Mann-whitney U test. En esta comparación no paramétrica, H33Q se mantuvo significativamente asociada con los 4 años log cambio PC.

Interacción de TBX21 con corticoesteroides. Realizamos análisis estratificados y de interacción para evaluar cuáles de las asociaciones observadas entre H33Q con mejora en PC20 fueron gracias a TBX21 influenciado en la historia natural del asma, o si un verdadero efecto famacogenético que envuelve la mejora para una respuesta terapéutica estaba presente. H33Q no fue asociado con cambios en PC20 después de tiempo en los niños aleatorizados para el grupo no esteroideo (P=0.90) pero fue, fuertemente asociado con PC20 cambio en los esteroides aleatorizados (P=0.0001).

Dados estos tratamientos con diferencias específicas, a veces incorporamos una interacción formal dentro del modelo de regresión. Después del ajuste para edad, género, y el nivel de la base del pulmón. La media estimada (SE) mejor para CAMP sujetos en corticoesteroides inhalados con la variante de H330 fue 3.85 ± 0.90, mientras para sujetos wt con corticoesteroides inhalados y 0.66 ± 0.75 para sujetos wt que no tomaban corticoesteroides inhalados (interacción P = 0.002). Sobre todo, para sujetos aleatorizados a inhalar corticoesteroides, individuos homocigotos para histidina demostraron mejora gradual en 1 año, con efecto multiplicativo al paso del tiempo. Después de 4 años, la media geométrica del valor de PC20 para acarreadores 33Q que fueron aleatorizados para el grupo de corticoesteroides fue de al menos 27.7 mg/ml. Fisiológicamente, cada valor >25 mg/ml corresponde a falta significante de sensibilidad de vía aérea, colocando a estos sujetos dentro del rango típico de individuos sin asma. Valores individuales a los 4 años para acarreadores de 33Q en esteroides tuvieron un rango entre 11.3 – 37.5

Para reportar el grupo de individuos que excedían el límite máximo de dosis de metacolina y los pequeños números de individuos con el genotipo variante, verificamos los resultados en nuestros análisis de grupos medios usando el test de rango log para evaluar las diferencias en el PC20 máximo grado durante la prueba (P=0.01). Cada uno de los acarreadores de 33Q en corticoides inhalados normalizaron sus PC20 en un punto durante el seguimiento de 4 años. Resultados similares fueron identificados en el análisis del PC20 final (P=0.05)

Características funcionales de H32Q. Las versiones wt y H32Q (el homólogo en ratón de H33Q humano) de T-bet son potentes transactivadores del gen de IFN-ᵧ medido por la expresión del gen transportador Luciferasa, sin diferencias significativas observadas entre los dos. Posteriormente, probamos la habilidad de la versión H32Q de T-bet para controlar la producción de citosinas en células T primarias. T-bet -/- en células Th transducidas con retrovirus GFP como control, produjeron cantidades muy bajas de IFN-y pero grandes cantidades de citocinas Th2: IL-4, IL-5 e IL-3. Las células Thp con RV-T-bet (wt) transducido, como se esperaba, produjeron grandes cantidades de IFN-y y exhibieron una supresión significativa de producción de citocinas TH2. La versión H32Q de T-bet fue igualmente efectiva en estas funciones.

Inhibición de T-bet por corticoesteroides. La correlación entre polimorfismos T-bet y PC20 y la respuesta a la terapia esteroidea incrementa la posibilidad de que el tratamiento con esteroides puedan controlar la expresión de T-bet. Como observado por otro, después de estimular células CD4 humanas en la presencia o ausencia de dexametasona, encontramos que los glucocorticoides inhibieron la inducción de T-bet.

Discusión

Nuestros resultados demuestran que un SNP no-sinónimo en el gen TBX21 mejora sustancialmente los efectos del uso de corticoesteroides inhalados en la respuesta de vía aérea de niños asmáticos. Los 33 transportadores de glutamina aleatorizados para corticoesteroides demostraron una mejoría sustancial en PC20 a través del tiempo, con un promedio de valor en rangos normales para no asmáticos al final del estudio. Estos hallazgos son consistentes con ambas asociaciones conocidas del uso de corticoesteroides con la mejoría en PC20 y la biología conocida de TBX21. Aún más, la asociación farmacogenética reportada representa una verdadera interacción genética-ambiental respecto a que el cambio notado en sujetos que poseen ambas variantes genéticas de interés y tratamiento de interés fue considerablemente mayor que el representado por la variación genética, efecto del tratamiento o la combinación de los efectos aislados.

TBX21 es un miembro de la familia de genes de la caja-T, una serie filogenética de series ancestrales de factores de transcripción caracterizados por una gran conservación de dominio de sitio de unión de AND. T-bet fue primeramente descrito por Szabo et al., como un factor de transcripción responsable por el compromiso de células Th vírgenes al linaje Th1. Específicamente, T-bet induce la producción de INF-y y suprime IL-4 e IL-5. Alterando el balance en una edad temprana de predominio de linfocitos Th1 sobre Th2 y puede aumentar el riesgo del niño para enfermedades atópicas, incluyendo asma: la llamada “Hipótesis de la higiene”. Dado que T-bet puede incrementar el desarrollo de células Th1 y se expresa en pulmón, se ha postulado e investigado un rol de TBX21 en la patogénesis del asma. Vías aéreas humanas de sujetos asmáticos demuestran un número disminuido de células T CD4+ expresando TBX21 comparados con controles. Deleciones del gen TBX21 en ratones ha resultado en hiperreactividad de la vía aérea. Las vías aéreas de ratones con TBX21 también ha demostrado eosinofilia aumentada y remodelamiento. Dado que PC20 es una medida de hiperreactivdad de vía aérea que está relacionada con el grado de eosinofilia pulmonar y remodelamiento a través del tiempo, nuestra asociación famarcogenética con TXB21 y PC20 a través del tiempo, es biológicamente relevante y plausible. Consistente con nuestra asociación, nuestros modelos celulares indicaron que H33Q potencialmente activa la expresión de IFN-y, incrementa la producción de citosinas Th1 y disminuye la de Th2.

En CAMP, el empeoramiento de la hiperreactividad de vía aérea se manifiesta por disminución en PC20, se asoció a disminución de función pulmonar, eosinofilia incrementada, e incremento de síntomas de asma así como su duración y

severidad. El uso de corticoesteroides inhalados mejora la inflamación de vías aéreas, hiperreactividad, obstrucción y sintomatología clínica en asma. El mejoramiento de PC20 en CAMP en el brazo ha sido documentado y se refleja en nuestros resultados. Sin embargo, reportamos una mejoría significativa de cada uno de los sujetos con corticoesteroides y la variante H33Q, comparado con el uso de esteroides inhalados con el genotipo wt solamente. Aunque el mecanismo biológico exacto por el cual tan fuerte efecto de esta modificación genética aún espera ser elucidado, después de la administración de corticoesteroides orales, especímenes de biopsia bronquial de pacientes asmáticos demostró que una reducción de la expresión de ARNm de IL-4 e IL-5 y un incremento de la expresión de ARNm de IFN-y. Como se demostró, la transducción de TBX21 H33Q se paralela con los cambios en citosinas resultando precisamente del uso de corticoesteroides. Aunque hubiéramos podido esperar que los esteroides incrementaran la expresión de T-bet concordando con su habilidad para aminorar el asma, nos indicaron que la examinación de la expresión génica en vitro no se aproxima necesariamente a la situación in vivo. Adicionalmente, las células con la variante H33Q pueden responder diferentemente a la administración de corticoesteroides exógenos.

Una limitación potencial de nuestro estudio es el tamaño de la muestra. Aunque el tamaño de nuestra muestra es razonable por las pruebas de relativamente comunes alelos, la frecuencia menor de alelo fue de solo 4.5% para H33Q, y no observamos ningún alelo homocigoto menor. Interesantemente, TBX21 heterocigoto de ratón demostró las mismas características fenotípicas que ratones homocigotos, incluyendo el desarrollo espontáneo de hiperreactividad de vía aérea, lo que sugiere que incluso cambios ligeros en la expresión génica, tal como en H33Q heterocigotos, puede contribuir a una expresión fenotípica alterada y es consistente con nuestra asociación observada. Además, sentimos que la fuera de la asociación entre el grupo que utilizó esteroides, la demonstración de que una verdadera interacción génica-ambiental y la plausibildiad biológica, apoyan fuertemente la validez de nuestros hallazgos.

En conclusión, nuestros hallazgos de una mejoría genotípica-específica de TBX21 en la respuesta de la vía aérea entre asmáticos que usan corticoesteroides inhalados provee pautas de entendimiento de la terapia del asma y puede permitir la identificación de al menos un pequeño grupo de individuos con asma que podrían beneficiarse con esta forma de tratamiento. Estudios de replicación deberían enfocarse en la interrogante de PC20 en un cohorte más grande de asmáticos usando corticoesteroides inhalados durante un periodo de tiempo relativamente más corto. Estos resultados también pueden ser pertinentes a las numerosas enfermedades tratadas con corticoesteroides y el número de enfermedades en los que se cree que T-bet juega un rol. Finalmente, nuestra

demostración de una interacción génica-ambiental provee una aproximación estadística alternativa hacia la elucidación de lo que comprometer un verdadero efecto farmacogenético. La interacción formal debería ser considerada cuando el resultado primario de interés sea medido y según como varía en el tiempo ya sea como un resultado de la intervención terapéutica o como parte de la historia natural de la enfermedad subclínica.