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TEMA 13: ESTERILIZACIN INDUSTRIALDr. Pedro F. Mateos

I. INTRODUCCION

Para poder llevar a cabo unafermentacin con xi to esimprescindible y obligatorio tener entodas las etapas cultivos libres decontaminantes, desde el cultivopreliminar hasta el fermentador deproduccin. Por lo tanto, elfermentador y su equipamiento, ascomo el medio de cultivo deben estarestriles antes de la inoculacin.Adems, el aire que se suministradurante la fermentacin debe ser estrily no deben existir roturas mecnicas enel fermentador que podran permitir laentrada de microorganismos. Tambinse deben esterilizar los aditivos(antiespumantes), sin embargo loscidos y bases concentrados no esnecesario esterilizarlos.

Un biorreactor puede ser esterilizado,destruyendo los microorganismos, conalgn agente letal como calor,radiacin o un producto qumico o bienseparando los organismos viablesmediante un procedimiento fsicocomo la filtracin.

Durante la fermentacin se debenobservar dos puntos para asegurar laesterilidad:

- Esterilidad en el medio de cultivo

- Esterilidad del aire que entra y sale

Para lo cual es necesario unaconstruccin apropiada del biorreactorque facilite la esterilizacin as comola prevencin de la contaminacindurante la fermentacin.

II. ESTERILIZACION DEL MEDIODE CULTIVO

El medio nutritivo que se preparainicialmente contiene una variedad declulas vegetativas diferentes y deesporas que proceden de losconstituyentes del medio, del agua ydel recipiente. Estos microorganismosdeben ser eliminados por unprocedimiento adecuado antes de lainoculacin. Existen un conjunto deprocedimientos para la esterilizacin,pero en la prctica, para instalaciones agran escala, el calor es el principalmecanismo utilizado.

Un conjunto de factores influyen en elxito de la esterilizacin por calor: elnmero y tipo de microorganismospresentes, la composicin del medio decultivo, el valor del pH y el tamao delas partculas en suspensin. Lasclulas vegetativas son eliminadasrpidamente a tempera turasrelativamente bajas, pero para ladestruccin de las esporas se necesitantemperaturas de 121C.

Tiempo y temperatura de esterilizacin devarios grupos de microorganismos

La esterilizacin por filtracin seutiliza frecuentemente para todos loscomponentes de la solucin denutrientes que son sensibles al calor y

Clulas Tiempo (min) Temp. ( C)

Cl. vegetativas 5-10 60

Esporas de hongos 15 80

Esporas bacterianas 5 121

Esporas de Bacillusstearothermophilus 15 121

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que seran por tanto desnaturalizadosdurante el proceso de esterilizacin porvapor utilizado normalmente enfermentacin industrial. Las vitaminas,los antibiticos o los componentes dela sangre son ejemplos de compuestoslbiles al calor que deben seresterilizados por filtracin.

A.- Esterilizacin discontinua

La mayor parte de los medios decultivo se esterilizan en la actualidaden volmenes discontinuos en elbiorreactor a 121C. Los tiempos deesterilizacin aproximados pueden sercalculados a partir de la naturaleza delmedio y del tamao del fermentador.No solamente debe ser esterilizado elmedio nutritivo, sino tambin lasuniones, vlvulas y electrodos delpropio fermentador. Por consiguiente,los tiempos de esterilizacin reales sonsignificativamente ms largos que loscalculados y deben ser determinadosempricamente para las solucionesespecficas de nutrientes presentes enel fermentador. Un mtodo deesterilizacin es inyectar vapor en lacamisa del fermentador o en losserpentines interiores (esterilizacinindirecta). Otro mtodo es inyectarvapor en la propia solucin denutrientes (procedimiento directo), encuyo caso un pre-requisito es tenervapor puro (libre de aditivosqumicos). Muchos suministros devapor industrial contienen productosqumicos txicos derivados de aditivosanticorrosivos utilizados en el procesode produccin del vapor. Adems, conla inyeccin directa de vapor elcondensado se acumula dentro delfermentador y de esta forma elvolumen del lquido aumenta duranteel proceso de esterilizacin.

Los inconvenientes del proceso deesterilizacin discontinua por calor deun fermentador discontinuo de 3.000 l

se muestran en la figura. Se necesitande 2 a 3 horas para alcanzar latemperatura de esterilizacin (121C)lo que depende de la conduccin delvapor y del tamao del fermentador.Una vez se ha alcanzado la temperaturacorrecta se requieren otros 20 - 60minutos para el proceso real de muerte,seguidos de enfriamiento durante unahora. Para enfriar el fermentador, laenerga que se requiere para elc a l e n t a m i e n t o d e b e s e rsubsecuentemente retirada y, si el aguacaliente que se obtiene durante elenfriamiento no se puede aplicar aalgn uso, la esterilizacin por calor sehace muy costosa.

Perfil de temperatura y cambios en elmedio de cultivo en una esterilizacindiscontinua para un fermentador de 3.000 l

Otra desventaja de la esterilizacin porcalor (y desde el punto de vista de laMicrobiologa el defecto que resultams significativo) es que las fases decalentamiento, esterilizacin yenfriamiento no solamente matan a losmicroorganismos, sino que tambinalteran severamente la solucin denutrientes. La decoloracin y loscambios en el valor del pH se originancomo consecuenc ia de lacaramelizacin y la reaccin deMaillard. Las vitaminas se destruyen yla calidad del medio de cultivo sedeteriora. La extensin en la que esafectada la fermentacin subsecuentedepende del organismo y del proceso.

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B.- Esterilizacin continua

Las dos desventajas principales de laesterilizacin discontinua, dao almedio de cultivo y alto consumo deenerga, pueden ser evitadas en granparte mediante el uso de unprocedimiento de esterilizacincontinua. Aunque la esterilizacincontinua es la etapa preliminar lgicaen una fermentacin continua a escalaindustrial, tambin se puede utilizar enla fermentacin discontinua obteniendoposibles mayores rendimientos en eltiempo y el espacio asignados. Larazn para esto se debe a la relacinexponencial entre velocidad de muertey temperatura, que hace ms corto eltiempo necesario para la eliminacincompleta de los organismos vivoscuando se utiliza una temperatura msalta. Mientras la esterilizacindiscontinua se lleva a cabo en 30-60minutos a 121 C, la esterilizacincontinua se lleva a cabo normalmenteen 30-120 segundos a 140 C. Elcalentamiento del medio de cultivopara la esterilizacin continua puedeser llevado a cabo mediante inyeccinde vapor o mediante intercambiadoresde calor. La esterilizacin coninyeccin de vapor se hace inyectandovapor en la solucin de nutrientes. Latemperatura se eleva rpidamente a140 C y se mantiene durante 30-120segundos. Debido a la formacin decondensados la solucin nutritiva sediluye; para corregir esto la solucincaliente se bombea a travs de unavlvula de expansin a un vaporizadory el condensado se retira mediantebombas de vaco de forma que lasolucin esterilizada de nutrientes tienela misma concentracin despus delproceso de enfriamiento que antes. Ladesventaja de este proceso es lasensibilidad que presenta a cambios enla viscosidad del medio y a variacionesen la presin.

En el proceso continuo que utilizaintercambiadores de calor, la solucinde nutrientes, en el primerintercambiador de calor, se precalientaa 90-120 C durante 20-30 segundospor la solucin nutritiva previamenteesterilizada que sale. Luego, en elsegundo intercambiador de calor, secalienta indirectamente con vapor a140 C. Esta temperatura se mantienedurante 30-120 segundos en unatubera de mantenimiento antes de quesea colocada en el primerintercambiador mediante enfriamientopreliminar y posteriormente en untercer cambiador para refrigeracin a latemperatura del fermentador. La fasede enfriamiento es slo de 20-30segundos.

Esquema de una esterilizacin continuamediante intercambiadores de calor

En el proceso que uti l izaintercambiadores de calor el 90% delaporte de energa se recupera. Ladesventaja de este mtodo es que conalgunas soluciones de nutrientes seforman sales insolubles (p. ej. fosfatoclcico u oxalato clcico) y aparecenincrustaciones en el primer

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intercambiador de calor debido a lasdiferencias de temperatura entre lasolucin de nutrientes esterilizada y lasolucin fra que entra. Si se produceuna precipitacin, el coeficiente detransferencia de calor disminuye por loque el sistema se debe detener y tratarcon agentes que limpian (cido o base)y re-esterilizarlo. Esterilizandoseparadamente los componentescrticos de la solucin de nutrientes semantiene constante el coeficiente detransferencia de calor por lo que elperodo til puede extenderse durantesemanas.

Las soluciones que contienen almidn,que se hacen viscosas cuando secalientan, son difciles de utilizar enprocesos de esterilizacin continua.Antes de la esterilizacin real debellevarse a cabo una licuefacin ehidrlisis parcial mediante cidos oamilasas. Adems, si hay partculas ensuspensin en la solucin denutrientes, los cortos tiempos deesterilizacin en el proceso continuopueden ser insuficientes para que elcalor permanezca completamente atravs de ellas. El tiempo decalentamiento para partculas de 1 mmes de 1 segundo; para partculas de 1cm es de 100 segundos. Porconsiguiente el tamao de laspartculas debera estar restringido a 1-2 mm en procesos continuos deesterilizacin.

III. ESTERILIZACION DEL AIREDE FERMENTACION

La mayor parte de las fermentacionesindustriales operan en condiciones deagitacin vigorosa y el aire que sesuministra al fermentador debe seresterilizado. El nmero de partculas ymicroorganismos en el aire vara engran medida dependiendo de lalocalizacin de la planta, el

movimiento del aire y el tratamientoprevio del aire. Como media, el aireexterior tiene 10 - 100.000 partculaspor m3 y 5 - 2.000 microorganismospor m3. De estos, el 50% son esporasde hongos y el 40% son bacterias G (-).Los fermentadores funcionangeneralmente con velocidades deaireacin de 0,5 - 1,0 vvm (volumen deaire/volumen de lquido por minuto).Un fermentador que tenga un volumende trabajo de 50 m3 con una velocidadde aireacin de 1 vvm necesita 3.000m3 de aire estril por hora. Laimportancia crtica de la esterilizacindel aire en la microbiologa industrialpuede ser deducida a partir de estosvalores.

Los mtodos existentes para laesterilizacin de los gases incluyen lafiltracin, inyeccin de gas (ozono),depuracin de gas, radiacin (UV) ycalor. De todos estos, slamente lafiltracin y el calor son prcticos aescala industrial. Durante muchos aosel aire se esteriliz pasndolo sobreelementos calentados elctricamente,pero debido al alto coste de laelectricidad a partir de la crisis delpetrleo de los aos 70, este procesoha sido reemplazado por la filtracin.

Actualmente, en los sistemasindustriales el aire se esteriliza porfiltracin. En los sistemas msantiguos se instalaban filtros enprofundidad como los de lana de vidrioen los que las partculas son atrapadaspor una combinacin de efectos fsicos(inercia, bloqueo, difusin, gravedad yatraccin electrosttica). Los dosltimos mecanismos tienen un efectomnimo sobre la eliminacin de laspartculas. Las desventajas de losfiltros de lana de vidrio incluyen elarrugamiento y la solidificacindurante la esterilizacin por vapor.

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A c t u a l m e n t e e s t n s i e n d oreemplazados por filtros de cartuchosque utilizan membranas plegadas. Lasventajas de estos filtros es que sonsustancialmente ms pequeos, debidoa la construccin de los cartuchos esfcil reemplazar los elementosfiltrantes utilizados, al poseer unaestructura membranosa (steres decelulosa, polisulfona o nylon) tienenun efecto de filtros absolutos. Ladesventaja de la mayor parte de lossistemas instalados actualmente es queno existen todava, para uso industrial,filtros absolutos para bacterifagos.Los bacterifagos pueden ocasionar elfallo total de un sistema como porejemplo la produccin de cidoglutmico por Corynebac ter iumg l u t a m i c u m o al trabajar conEscherichia coli.

El aire que sale del fermentadortambin debe ser esterilizado, sobretodo si se trabaja con organismosrecombinantes. No slo como medidade seguridad, sino tambin paraprevenir que las cepas industriales seliberen al medio ambiente y por lotanto estn disponibles de una formagratuita para los competidores. Denuevo, se utiliza la filtracin.

Esquema de un sistema de esterilizacindel aire de fermentacin por filtracin