Cuantificacin de las clulas formadoras de anticuerpo, mediante la tcnica de Jerne

Universidad Nacional Autnoma de Mxico.

Facultad de Estudios Superiores Zaragoza Laboratorio de Inmunologa L-121

Prez Prez Jos Manuel ____________ Prez Sevilla Alma Beatriz ____________

Equipo 3, Grupo 2802

rganos linfoides Los rganos linfoides se clasifican como primarios o secundarios, en funcin de su participacin en los procesos de diferenciacin, maduracin y especializacin de las clulas linfoides. Primarios: en ellos las clulas linfoides (linfocitos), adquieren el grado de diferenciacin y

maduracin que requieren para el adecuado desempeo de sus funciones inmunolgicas. Los

rganos son:

medula sea en mamferos

bolsa de Fabricio en aves

timo en ambos Secundario: es el sitio de concentracin de clulas linfoides, ocurren las interacciones entre las

clulas y los antgenos que dan origen a las repuestas inmunitarias. Estos rganos son:

bazo

ganglios linfticos

placa de Peye

ganglios linfticos mesentricos

tejido linfoide asociado a los bronquios El bazo Localizado en la regin supramesoclica del abdomen, detrs del estomago, envuelto por una capsula fibrosa de la que se desprenden tuberculas que dividen parcialmente y sostiene al parnquima esplnico. La masa esplnica consta de una porcin conocida como pulpa blanca, donde se concentran las clulas linfoides, y una porcin llamada pulpa roja, donde se encuentran las otras clulas de la sangre.

Pulpa Roja: destruye a los eritrocitos viejos y que han perdido funciones

Pulpa Blanca: se encuentran los linfocitos T y los linfocitos B, que se activan en presencia de antgenos.

La funcin del bazo es participacin en repuesta inmunitaria, rgano de filtracin sangunea y es donde se retienen y destruyen la mayora de las clulas circulante envejecidas

Inmunidad

Inmunidad es un trmino que describe el estado de tener suficientes defensas biolgicas para

evitar la infeccin, enfermedad, u otra invasin biolgica no deseada. La inmunidad involucra

tanto a componentes especficos y no especficos. Los componentes no especficos actan como

barreras o como eliminadores de patgenos para detener la infeccin por microorganismos antes

de que puedan causar la enfermedad. Otros componentes del sistema inmunolgico se adaptan

ellos mismos a cada nueva enfermedad encontrada y son capaces de generar inmunidad especfica

contra el germen patgeno.

La inmunidad adaptativa o especfica a menudo se subdivide en dos grandes tipos dependiendo de

cmo se introdujo la inmunidad. Pueden subdividirse an ms, dependiendo de la cantidad de

tiempo que dura la proteccin. La inmunidad pasiva es a corto plazo, y normalmente dura slo

unos pocos meses, mientras la proteccin va inmunidad activa dura ms tiempo, y es a veces de

por vida.

Una subdivisin ms de la inmunidad adaptativa se caracteriza por las clulas involucradas; la

inmunidad humoral es el aspecto de la inmunidad que es mediado por anticuerpos secretados,

mientras que la proteccin proporcionada por inmunidad celular involucra slo linfocitos T. La

inmunidad humoral es activa cuando el organismo genera sus propios anticuerpos, y pasiva

cuando los anticuerpos son transferidos entre individuos. Asimismo, la inmunidad celular es activa

cuando las clulas T propias del organismo son estimuladas y pasiva cuando las clulas T vienen de

otro organismo

La inmunidad humoral se caracteriza por la produccin de Ig o Ac (anticuerpos) que se dividen en diversas clases: IgG, IgM,IgA, IgE e IgD. La inmunidad celular se caracteriza por la produccin de linfocitos T sensibilizados especficamente hacia un Ag (antgeno). Se entiende por inmunidad activa el proceso mediante el cual los organismos producen sus propios anticuerpos o linfocitos T sensibilizados, generndose, por lo tanto memoria inmunolgica. Inmunidad activa

Respuesta inducida una vez producido el contacto con Ag

Respuesta inmune formada por anticuerpos y linfocitos T

Confiere resistencia a largo plazo (produccin Ab)

Lenta progresin de la resistencia y la necesidad de contacto prolongado con el antgeno La inmunidad pasiva es aquella en la que reciben un anticuerpo o linfocitos preformados en otro organismo. Inmunidad Respuesta basada en anticuerpos ya existentes en otro hospedero transmitidos de forma natural a travs de la placenta o a travs del calostro forma de proteccin rpida, pero de corta duracin Inmunidad Innata

Respuesta no especifica

Respuesta rpida, inmediata

Mediada por clulas :macrfagos, neutrofilos, basofilos

Mediada componentes humorales: complemento citocinas, IL

Sin memoria inmunolgica

Inmunidad adaptativa

Respuesta especifica contra patgenos y antgenos

Tiempo de demora para una respuesta maxima

Mediada por celulas :Linfocitos T y B

Mediada por componentes:Complemento Conduce a Memoria Respuesta inmune celular La primera fase de la inmunidad celular es el reconocimiento de antgenos extraos dentro del organismo por clulas B a travs de su receptor de membrana. Sin embargo, a pesar de la interaccin con antgeno, la clula B no se activa hasta ser estimulada por una lnea de linfocitos T llamados linfocitos T cooperadores. Esa unin, clula B: linfocito cooperador, estimula la expansin clonal y diferenciacin de los linfocitos B, los cuales:

Secretan anticuerpos primeramente de tipo IgM

Cambian de isotipo, bien sea IgG, IgA o IgE, dependiendo del estmulo adecuado

Maduran a anticuerpos de alta afinidad por el antgeno inicial

Remanentes de la lnea producida permanecern como linfocito B de memoria.

La respuesta de anticuerpos en contra de los antgenos no proteicos (lpidos, polisacridos) no requieren la participacin de linfocitos T cooperadores, por lo que son llamados Antgenos T-Independientes. Las clulas que producen los anticuerpos son clulas plasmticas, un tipo especial de linfocito B que se especializa en la produccin de un anticuerpo particular y especfico. Respuesta humoral primaria La cantidad de anticuerpo secretado por clulas plasmticas y la clonacin de estas mismas clulas la primera vez que entra en contacto el receptor con el antgeno encuentran su mximo aproximadamente a los 7 das de la primera infeccin (5-10 das). Habitualmente, la respuesta mxima de anticuerpos son del isotipo IgM, por encima de IgG, inducida por todo tipo de inmungeno. La dosis necesaria para la inmunizacin generalmente debe ser relativamente alta, ptimamente con la presencia de adyuvantes para los antgenos proteicos. Respuesta humoral secundaria Una infeccin repetida por un mismo antgeno activa los linfocitos de memoria creados como consecuencia de la respuesta humoral primaria. La respuesta, entonces, se inicia ms rpidamente, al cabo de unos 3 das. Por su parte, la respuesta mxima de anticuerpos es mayor, con una intensidad de 100 a 1000 veces la respuesta primaria, y es principalmente del isotipo IgG (en ciertas situaciones de los isotipos IgA e IgE). Tambin dura ms tiempo, haciendo que su declive sea ms lento. Es una respuesta inducida por antgenos proteicos y slo son requeridas bajas dosis de antgenos infectantes, sin necesidad de adyuvantes.

Respuesta humoral primaria vs. Secundaria

Respuesta primaria Respuesta secundaria

Dura 5-10 das para instalarse Habitualmente 3 das para instalarse

Respuesta mxima de anticuerpos menor

Respuesta mxima de anticuerpos mayor

Generalmente IgM > IgG Aumento relativo de IgG y de IgA e IgE en ciertos casos

Menor afinidad media por anticuerpos Afinidad madurada y mayor por anticuerpos

Inducida por cualquier inmungeno Inducida slo por antgenos proteicos

Dosis de inmunizacin relativamente alta

Inducida por baja dosis de antgenos

Adyuvantes requeridos ptimamente Adyuvantes no necesarios usualmente

Reacciones de hemolisis. El complemento (C) fija los complejos Antgeno (Ag)-Anticuerpo (Ac) (Ag-Ac) y forma un complejo Ag-Ac-C y si Ag es una clula, se produce lisis. Si la clula es un eritrocito, se libera la hemoglobina despus de la lisis. Este fenmeno se conoce como hemolisis. Midiendo la cantidad de hemoglobina liberada, se consigue una expresin de la amplitud de la hemolisis, y, por lo tanto, de una cantidad de complejo Ag-Ac. Las placas hemolticas fueron desarrolladas por Niels Jerne, en 1963. Esta prueba es para el estudio de las bases celulares de la reaccin inmune, lo que la reaccin de precipitacin cuantitativa es la inmunoquimica. El mtodo de placas hemolticas da la idea del nmero de clulas formadoras de anticuerpo en una poblacin. Estas clulas se denominan clulas formadoras de palca (CFP). El principio de la prueba consiste en que si las clulas productoras de anticuerpos contra un antgeno de eritrocito se suspenden en una capa de agar que contengan los antgenos de eritrocito, el anticuerpo secretado por una clula se difundir a travs del agar, reaccionara con los eritrocitos, y formara un complejo localizado, antgeno-anticuerpo. Cuando se aade complemento a la capa de eritrocito-linfocito, solo aquellos eritrocitos que han reaccionado con el anticuerpo se fijarn el complemento y se consumara su lisis, estos producen zonas localizadas de hemolisis. Estas zonas locales reciben el nombre de placas por que se parecen a las que produce un bacterifago. Los linfocitos obtenidos del animal sensibilizado y una suspensin de clulas indicadoras (GRC), se mezclan y se distribuye en un medio semislido (agarosa). Los GR pueden ser el antgeno o pueden estar sensibilizados con el antgeno que se est investigando. Con la adicin de complemento, los GR se lisan y en las placas se hacen visible un halo de hemolisis alrededor de cada linfocito B capaz de producir anticuerpos. Los CFP se cuantifican como placas por bazo, placas por cultivo o placas por 106 clulas probadas. El mtodo da una medida cuantitativa de las clulas productoras de anticuerpo contra un antgeno. Las placas que se obtienen directamente, representan principalmente clulas que producen IgM, pues este anticuerpo tiene una alta eficiencia hemoltica. Para demostrar clulas que sintetizan IgG, es necesario favorecer la unin del complemento al complejo eritrocito- anticuerpo IgG, aadiendo antes suero anti-IgG de conejo; esta tcnica constituye la llamada de (placas indirectas) y se utiliza para identificar distintas clulas, que fabriquen anticuerpos pertenecientes a diferentes subclases, suponiendo que se posea los antisueros de conejo apropiados. Este mtodo es de amplia aplicacin, al ser posible recubrir la superficie del eritrocito con multiplicidad de antgenos como el polisacrido de neumococo, o uniendo grupos haptnicos a la superficie del eritrocito. La tcnica tiene diferentes usos, uno de ellos es demostrar, en forma experimental, la sensibilizacin previa de una animal frente a un antgeno, estudiando in-vitro la capacidad de los linfocitos B para producir anticuerpos, y analizando el fenomeno de la interaccion celular requerida tanto durante la presentacaion del antigeno como en el proceso de activacion de la clula B por la clula T. Modificaciones de la tcnica de Jerne Se han realizado diversas modificaciones a la tcnica original de Jerne, entre las que se encuentran las siguientes:

Golub, Mishell y Dutton: Esta modificacin emplea toxoide de difteria, con la finalidad de obtener una mayor cantidad de anticuerpos. Schwartz Braun: Es una prueba con bacterina, emplea E.coli muertas por calor. Se lleva a cabo con clulas del bazo + E. col viva + agar+MEM. Se le adiciona complemento y permite Nossal, Warner y Lewis: Inmuniza a conejo con Salmonella typhi; emplea Clulas de ganglios linfticos, Sangra al conejo a los 5 das y un segundo conejo a los 21 das Observa una primera respuesta que es IgM (respuesta primaria) y IgG (respuesta secundaria). Cunningham y Szemberg: Emplea portaobjetos en lugar de placas, no utiliza azarosa. Emplea clulas+GRG+MEM.

Referencias:

Bellanti A.J. Inmunologa. 3 Ed. Mxico: Panamericana, 1986: 188-192.

Goldsby R. A. et al. Inmunologa. 5 Ed. Mxico: Mac Graw Hill, 1992: 154-155.

Rojas E. O. Inmunologa de memoria.2 Ed. Mxico: Panamericana, 2001:162-163.

Stites P.D. inmunologa humana y bsica. Mxico: Panamericana, 1994: 351-352.

Es evidente que la penetracin de sustancias extraas en el organismo, en forma natural o inducida, ya sean bacterias o sustancias qumicas de naturaleza proteica, estimulan el desarrollo de otras sustancias, los anticuerpos, que reacciona con la sustancia estimulante o antgena.

Los hematies de oveja y otros se han

utilizado no solo en ensayos directos si no

tambin como portadores de numerosos

antgenos capaces de fijarse qumicamente a

su superficie

La tcnica de placa de Jerner ha tenido

buena aceptacin para determinar el

desarrollo de clulas productoras de

anticuerpo en el bazo de un ratn durante la

induccin de una respuesta inmune, la

tcnica presenta ventajas de detectar

pequeos nmeros de clulas productoras

de anticuerpo, entre poblaciones de gran

tamao. Mishell y Dutton han aplicado una

tcnica que se basa en los linfocitos de la

sangre perifrica para medir la produccin in

vitro de anticuerpos para eritrocitos de oveja

Los rganos linfoides se clasifican de

la siguiente forma:

La funcin de los rganos primarios

es nica e imprescindible; mientras que

de los secundarios redundante y

prescindible.

Los rganos secundarios son sitios

donde ocurre el contacto entre las

clulas linfoides y los antgenos. El

contacto entre estos elementos induce a

la proliferacin celular y la sntesis de los

mediadores solubles de la respuesta

inmune (anticuerpos y citocinas). El Bazo

se divide en pulpa blanca rica en

folculos linfoides y centros germinales y

pulpa roja abundante en macrfagos,

eritrocitos, escasos linfocitos y clulas

plasmticas.

Los anticuerpos de la clase IgM son

terceros en cuanto su concentracin en

sangre. Su estructura polimrica les

confiere gran capacidad neutralizante de

las toxinas y aglutinante de los

microorganismos. Slo esta clase de

anticuerpos de las IgG son capaces de

activar el sistema del complemento por la

llamada va clsica; ste tipo de

anticuerpo es el predominante en las

etapas tempranas de las respuestas

inmunes primarias.

La tcnica de Jerne est basada es

una hemlisis localizada, como se puede

apreciar en la siguiente figura:

evaluar bacterinas por tiempo.

Modificaciones de la tcnica de Jerne

Se han realizado diversas

modificaciones a la tcnica original de

Jerne, entre las que se encuentran las

siguientes:

Golub, Mishell y Dutton: Esta modificacin emplea toxoide de difteria, con la finalidad de obtener una mayor cantidad de anticuerpos. Schwartz Braun: Es una prueba con

bacterina, emplea E.coli muertas por

calor. Se lleva a cabo con clulas del

bazo + E. col viva + agar+MEM. Se le

adiciona complemento y permite

Nossal, Warner y Lewis: Inmuniza a

conejo con Salmonella typhi; emplea

Clulas de Ganglios linfticos, Sangra al

conejo a los 5 das y un segundo conejo

a los 21 das Observa una primera

respuesta que es IgM (respuesta

primaria) y IgG (respuesta secundaria.

Cunningham y Szemberg: Emplea portaobjetos en lugar de placas, no utiliza azarosa. Emplea Clulas+GRG+MEM +C, es una tcnica sensible, observa anticuerpos aglutinantes. Poduval: Emplea Toxoide de difteria, linfocitos +GR sensibilizados +MEM+ C, Se obtiene hemoglobina liberada que se cuantifica con medidor de ELISA; la evaluacin de anticuerpos se hace en base a la hemoglobina liberada

Las aplicaciones que tiene la

tcnica de Jerne son mltiples, entre

las cuales se encuentra la deteccin

de enfermedades infecciosas,

alergias, enfermedades autoinmunes,

compatibilidad en trasplantes,

estudios de endocrinologa, y el

estudio de vacunas tanto para

bacterias como para virus.