UNIVERSIDAD DE LOS ANDES

FACULTAD DE CIENCIAS GUÍA LABORATORIO BIOLOGÍA DE ORGANISMOS

PRÁCTICA 3 REINOS EUBACTERIA y ARCHAEBACTERIA

Actualmente, los biólogos clasifican a la mayoría de los seres vivos agrupándolos en tres dominios de organismos: Bacteria, Archaea (Arquea) y Eukarya. El dominio Bacteria comprende el reino Eubacteria (bacterias verdaderas); las arqueas el reino Achaebacteria (bacterias antiguas) y el dominio Eukarya incluye todos los demás reinos. Por mencionar algunos, en el dominio Eukarya se encuentra el grupo parafilético Protista (compuesto por los protozoos y algas unicelulares fotosintéticas), los Hongos, las Plantas y animales, entre otros (Figura 1).

Antiguamente los seres vivos eran clasificados sólo en dos grupos dependiendo de la presencia/ausencia de un núcleo definido y de organelos envueltos en membranas. De tal manera, se clasificaban como Procariotas y Eucariotas. Los primeros incluyen todos los organismos unicelulares que no poseen una membrana rodeando el material genético y los organelos. Por su parte, los Eucariotas incluyen todos los seres vivos que tienen un núcleo definido y organelos rodeados por membranas celulares. Actualmente se sabe que los procariotas y eucariotas presentan otras diferencias a nivel bioquímico (ej. producción de metano como desecho metabólico), estructural (ej. la composición química de sus paredes celulares), genético (tanto en organización como en iniciadores de replicación) entre otros.

Figura 1. Árbol de la vida por Dominios. De acuerdo a la evidencia actual, el dominio Eukarya y Arquea comparten un ancestro común y por ende están más cercanamente emparentados que Arquea y Bacteria.

Dominio

Bacteria

Dominio

Arquea Dominio

Eukarya

DOMINIOS BACTERIA Y ARCHAEA

Con base en la comparación de la información genética (secuencias de ADN y ARN) entre linajes de procariotas y eucariotas, en las diferencias que muestran en las moléculas que componen sus membranas celulares y otras disimilitudes; se teoriza que los procariotas divergieron temprano en la historia evolutiva en dos linajes diferentes, el domino Bacteria y el dominio Arquea.

El reino Archaebacteria está dividido en dos fila principales: Crenarchaeota y Euryarchaeota. El primero incluye organismos termófilos (organismos que viven en ambientes con temperaturas mayores a 45°C) y psicrófilos (seres vivos que se desempeñan óptimamente en ambientes menores a 5C°), mientras que el segundo está integrado por organismos halófilos extremos (que viven en ambientes con alta concentración salina), acidófilos (viven en ambientes de pH menor a 2), metanógenos (utilizan H2 para reducir CO2 a metano) y Thermoplasma. Hay contrastes morfológicos entre dichos organismos (pueden ser redondos, espiralados, lobulados o irregulares) y pueden encontrase de forma agregada o solitaria.

Las arqueas, a pesar de ser procariotas, muestran diferencias muy marcadas con las bacterias en varios niveles biológicos. Por ejemplo, la composición estructural de las membranas celulares junto a otras características, sugiere que el dominio Arquea está más estrechamente emparentado con el dominio Eukarya que con Bacteria.

El dominio Bacteria está compuesto por 12 fila, entre los que se encuentran las bacterias Gram-positivas, Gram-negativas y las bacterias fotosintéticas, que incluyen Rickettsia, Desulfovibrionales, bacterias púrpura no sulfhídricas, bacterias púrpura sulfhídricas, espiroquetas, micoplasmas, entre otros.

Una característica peculiar de las bacterias es que son organismos ubicuos. No sólo han colonizado una gran cantidad de entornos del planeta, sino que también han podido sobrevivir al interior de otros organismos. En esta instancia, es preciso resaltar que, a pesar de la creencia popular, la mayoría de estas bacterias no son patógenas y que incluso ayudan a controlar otras poblaciones bacterianas que sí pueden ser deletéreas para el hospedero a través de competencia.

Existen otras bacterias que juegan un papel importante en el medio ambiente y la economía, al ser uno de los principales eslabones ambientales en la descomposición de la materia orgánica. Un caso práctico es la utilización de bacterias en el tratamiento de aguas residuales con la finalidad de promover la fragmentación de desechos sólidos. Cabe destacar que muchos de los alimentos que consumimos son productos derivados del metabolismo de las bacterias.

ALGUNAS CARACTERÍSTICAS GENERALES DE LAS BACTERIAS

La clasificación de las bacterias se basa en sus características bioquímicas y fisiológicas, tales como la composición de la pared bacteriana, las secuencias de ADN y ARN, la sensibilidad a antibióticos, el metabolismo y la forma de reproducción.

La pared celular y los ribosomas representan dos de los puntos más importantes de acción de los agentes antibacteriales. Un ejemplo de este tipo de antibióticos es la penicilina.

La mayoría de las bacterias pueden ser clasificadas dentro de tres grupos morfológicos principales: Rodillos (bacilos), esferas (cocos) y espirales (espirilos).

PROCEDIMIENTO EN LABORATORIO

Use un microscopio para observar los morfotipos básicos de bacterias (expuestos a continuación), y dibuje las formas observadas en la lámina bacteria types, en los espacios designados mostrados a continuación.

Demostrativa A Demostrativa B Demostrativa C

Organización: Organización: Organización: Tipo: Tipo: Tipo:

a. Nombre cuatro diferencias entre los dominios Arquea y Bacteria (recuerde diferencias a nivel de membrana celular, pared celular, metabolismo, etc.).

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b. ¿Qué evidencia apoya la cercanía filogenética entre Arquea y Eukarya? ___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

c. Explique a qué hace referencia el término extremófilo. Nombre 3 grupos de bacterias como ejemplo.

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d. ¿Qué utilidad industrial puede tener un organismo extremófilo? De un ejemplo y justifique.

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e. Consulte qué tipo de organismo es Thermoplasma y mencione las características que lo hacen único.

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TINCIÓN GRAM: COLOREAR LA PARED La tinción de Gram es una tinción específica empleada para diferenciar bacterias en función de algunas características de su pared celular. Se dice que una bacteria es GRAM (+) si al realizar la tinción de Gram, ésta mantiene el colorante azul violeta, dando como resultado una coloración morada; mientras que se denomina GRAM (-) cuando la muestra bacteriana no conserva el azul violeta en sus membranas y al final de la tinción se ve rosada.

En las bacterias GRAM (+), la afinidad hacia el colorante azul violeta está dada por la presencia de una capa gruesa de peptidoglicano en la pared celular bacteriana; en contraste, la ausencia de tinción de las bacterias GRAM (-) con el azul violeta, es causada por la presencia de una capa de peptidoglicano más delgada en la pared celular bacteriana (que no es capaz de retener el colorante después de los lavados). Para determinar con precisión si las bacterias que se están estudiando son GRAM (-) se utiliza una coloración secundaria aplicando fucsina para generar un contraste y así poder verlas de color rojo-rosado. A continuación ustedes deducirán a partir de tinción de Gram, si las cepas bacterianas 1 y 2 son Gram (+) y/o Gram (-). En seguida se muestran los pasos que deben seguir para realizar la tinción de Gram:

Procedimiento en Laboratorio – Tinción de GRAM

1. Limpie la zona de trabajo para evitar contaminar los medios con agentes biológicos externos.

2. Encienda el mechero (IMPORTANTE: primero abra la llave del gas y luego gire en contra de las manecillas del reloj la llave de paso del gas que está en la base del mechero. PRECAUCIÓN: ABRIR PARCIALENTE).

3. Abra la caja de petri cerca del mechero. 4. Exponga la punta de un asa redonda a la llama del mechero. Antes de tomar la

muestra, debe enterrar la punta del asa en el medio de cultivo cerca a las paredes de la caja para enfriarla. Luego tome una muestra de UNA COLONIA del cultivo suministrado con el asa.

5. En la superficie de una lámina ponga una gota de agua. Frote esta sección de la lámina con la punta del asa para distribuir la muestra de células bacterianas en la parte central.

6. Exponga por un breve periodo de tiempo la lámina al fuego del mechero, varias veces hasta que la muestra se seque. Utilice unas pinzas de madera para sostener la lámina.

7. Deje enfriar el preparado por 1 minuto y a continuación agregue azul violeta.

8. Un minuto después lave con agua la lámina y adicione lugol a la muestra por 2 minutos.

9. Lave con alcohol-acetona la muestra por 30 segundos.

10. Agregue fucsina y deje actuar durante 15 segundos.

11. Observe al microscopio con una magnificación de 1000X su preparado. NO OLVIDE poner una laminilla para evitar contaminar el preparado con el aceite de inmersión.

12. Realice este procedimiento para las dos cepas suministradas.

A partir de sus resultados de tinción de Gram responda:

a. ¿De qué color son las bacterias de la cepa 1 y 2? ¿Son Gram (+) o Gram (-)? (Complete la tabla que se muestra a continuación).

b. Dibuje lo observado y coméntelo. Además dibuje un esquema de la membrana y pared en cada caso:

Muestra

Muestra

Esquema Esquema

GRAM NEGATIVA GRAM POSITIVA

COLOR GRAM + GRAM - Cepa 1

Cepa 2

c. Consulte qué tipos de bacterias NO pueden ser teñidas utilizando el método de Gram. Cite dos ejemplos.

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d. ¿A qué se refiere el término Gram variable? Cite dos ejemplos de bacterias que muestren esta propiedad.

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e. ¿Bajo qué circunstancias un médico podría prescribir un antibiótico de corto espectro?

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f. ¿Y uno de amplio espectro? ___________________________________________________________________________________________________

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¿QUÉ HAY EN SUS MANOS? En esta práctica ustedes tendrán la oportunidad de observar la diferencia que hay en la microbiota bacteriana presente en la piel, antes y después de lavarse las manos. Tenga en cuenta las siguientes indicaciones:

Procedimiento en Laboratorio – Microbiota en las manos

1. Limpie la zona de trabajo con la finalidad de evitar contaminar los medios de cultivo.

2. En primer lugar, utilice una caja de Petri con medio agar Müller-Hinton y presione los cinco dedos de su mano contra el agar. Asegúrese de realizar todo el procedimiento cerca del mechero.

3. Lave su mano con abundante agua y jabón. En una nueva caja de Petri con agar

Müller-Hinton realicen la impresión de los cinco dedos con la mano limpia sobre el agar.

4. RECUERDE marcar sus cajas de cultivo con la clase, su sección de laboratorio,

su grupo y el tipo de tratamiento hecho en la caja.

5. Llevar a incubación (a 36°C).

A partir del procedimiento experimental planteado respondan: a. ¿Qué diferencias esperaría encontrar entre las cajas sembradas antes y después del lavado de manos? ___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________________________ b. ¿Qué es la microbiota simbionte? ¿Por qué es importante para la vida humana (ejemplo)? ___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ c. Cite 4 ejemplos de órganos o partes del cuerpo humano donde haya microbiota simbionte.

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ANTIBIOGRAMAS

Un antibiograma es una prueba microbiológica que se utiliza para estudiar la capacidad que tiene una sustancia para inhibir el crecimiento de bacterias sembradas en un medio conocido. Esta técnica es informativa, ya que a partir de la presencia o ausencia de anillos de inhibición y las diferencias de longitud del radio entre los controles y el compuesto evaluado, permite la cuantificación del efecto inhibitorio que posiblemente tendrá la sustancia cuando se la agreguemos a la bacteria. En esta parte, ustedes probarán la capacidad de inhibición de cuatro sustancias (agua, alcohol antiséptico, hipoclorito y solución jabón-agua) sobre dos cepas bacterianas, utilizando como medio de cultivo agar Müller-Hinton. A continuación se detallan los pasos que deben seguir para realizar esta actividad:

Procedimiento en Laboratorio - Antibiograma

1. Limpie el área de trabajo. Es recomendable utilizar guantes para evitar contaminar el medio.

2. Tome un asa redonda y exponga la punta de alambre a la llama del mechero. NO OLVIDE enfriar el asa antes de tomar la muestra, perforando el medio de cultivo con la punta. Recoja una colonia del cultivo bacteriano suministrado.

3. Realice con el asa un extendido masivo (como se muestra a continuación) en una caja de Petri con agar Müller-Hinton. El medio es bastante suave así que, para evitar dañarlo, realice el procedimiento aplicando muy poca presión.

4. Impregne discos de papel (sensidiscos) con cada una de los compuestos a evaluar y dispóngalos en el agar Müller-Hinton utilizando pinzas. Según se lo indique su instructor.

5. En el respaldo de la caja de Petri indique el tipo de sustancia a la que corresponde cada sensidisco. No olvide además marcarla con su sección de laboratorio y grupo al que pertenece.

6. Lleve a incubación a 36°C.

7. Realice el procedimiento con las 2 cepas suministradas

Tomando como referencia la metodología experimental planteada, formule una hipótesis biológica que evalué la efectividad de los antisépticos o desinfectantes frente a las cepas 1 y 2. Utilicen como dato experimental la presencia/ausencia de anillos de inhibición y/o el radio del anillo de inhibición por cada sensidisco. Es RECOMENDABLE que indaguen la diferencia entre antibiótico, antiséptico y desinfectante.

Hipótesis alterna:

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Hipótesis nula:

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Variable independiente:

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Variable dependiente:

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BACTERIAS FIJADORAS DE NITRÓGENO

Observe y dibuje las bacterias del género Rhizobium expuestas en la lámina demostrativa (Legume nodule).

Consulte cuál es la función ecológica de las bacterias fijadoras de nitrógeno en el medio terrestre. ¿En qué ambientes creería que es más frecuente encontrar una asociación entre plantas y bacterias fijadoras de nitrógeno? ___________________________________________________

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Lamina Legume nodule

Anabaena Mixed Blue-green Algae Según los preparados observados. ¿Cuáles son las formas celulares básicas de las cianobacterias? __________________________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________________________

Consulte sobre la teoría simbiótica propuesta por Lynn Margulis. Con base en dicha teoría, ¿Cuál sería el origen de las mitocondrias? ¿Cuál sería el origen de los cloroplastos? ________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________