9.- Inmunogenética - 2008

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Biología molecular

DNA RNAm proteinastranscripsión traducción

Dr. Carlos Huanqui G.



Biología molecular

Ligandos

Receptor

Vias de señalización

Factores de transcripsión (a)

Promotor de gens

Transcripsión: RNAm

Codificación: síntesis proteica

Rac Ras DAGPI3

Ap-1, NFk-B

Rib. proteina

RNAm



Ingienería genética: tecnología del DNA recombinante

----

DNA

fragmentos DNA

DNA

recombinanate

vector

(plásmido)

DNA genomico o

cromosómico

Bacteria: E. coli

plàsmido

(DNA-desnudo)

(DNA-plásmido)



Terapia Génica

”Técnica terapéutica mediante la cual se inserta

un gen funcional en las células de un pacientehumano para corregir un defecto genético o para

dotar a las células de una nueva función".

Corregir gen defectuoso

Nueva función a la célula

Plásmido DNA Célula anormal

Célula normal

Proteina corregida

Proteina nueva



TÉCNICAS DE INSERCIÓN GÉNICA Métodos físicos Microinyección

Electroporación

Microproyectiles

Métodos químicos Fosfato cálcico

Policationes

Lípidos

Liposomas

Membranas derivadas de eritrocitos

Vectores virales Retrovirus

Adenovirus o virus asociados (AAV)

É Ó É



TÉCNICAS DE INSERCIÓN GÉNICA DNA- plásmido

•Ventajas: fácil de manipular, es estable, se produce a bajo costo y

con un gran nivel de pureza, no tiene riesgo de replicación viral, no

se inserta en el genoma celular.

•Es muy pobremente inmunogénico y puede ser administrado

repetidamente a sujetos inmunocompetentes. Sin embargo, el

número y proporción de proteinas que pueden ser transducidas por

plásmido es bajo



Terapia Génica (TG): Métodos

Ex-vivo:

Se extrae las células del paciente, en medios de cultivo apropiado se lesintroduce el gen de ínterés, son reintegradas dentro del organismo .Ej.el síndrome de inmunodeficiencia combinada severa producida pordeficiencia de ADA

In vivo:

Se hace llegar en vectores adecuados los genes terapéuticos a lascélulas defectuosas a corregir a través del torrente circulatorio (ej. EV).

In-situ:

Introduciendo los genes terapéuticos directamente en el propio órganodefectuoso Ejs La distrofia muscular de Duchenne: se introduce el gende la distrofina.



Terapia genica - ex vivo protocolos de inmunoterapia genética se basan en

la transferencia, ex vivo, directamente a las células

dendríticas, con genes que codifican antígenos

tumorales (CEA y otros) o incluso ARN total de

las células tumorales; la reinfusión de las células

dendríticas modificadas causa la activación delinfocitos T citotóxicos contra los tumores. utilizar ARN

total, tiene la ventaja de permitir la expresión en las células dendríticas de numerosas

proteínas específicas de las células tumorales, con lo que se previene en buena parte el

posible efecto negativo debido a la heterogeneidad de la expresión de antígenos tumorales

en las células cancerosas.



Terapia Génica: En cáncer

Perforinas

granenzima-A

1990: 1er experimento




La idea consiste en modificar genéticamente ya sea

las células tumorales, los linfocitos T o las células

dendríticas introduciéndoles genes apropiados,

cuya expresión resulte en un incremento de larespuesta inmune.

Uno de los métodos empleados más frecuentemente consiste en la administración

a los pacientes de células tumorales a las que se han transferido genes que

codifican determinadas citoquinas (IL-2, IL-4, IL-7, IL-12, TNFa, IFN-g o GM-CSF) u otros genes como los que codifican ciertas moléculas que tienen función

co-estimuladora de la respuesta inmune, La combinación de citoquinas y moléculas co-estimuladoras ha generado

resultados esperanzadores. En particular, el uso simultáneo de IL-2 y de B7aumenta la activación de las células T




Transfección de genes

sinérgicos del CMH-II

directamente a CPA la ptac. de péptidos

tumorales a LTh,

facilitando la

activación del LTc.

IL2

IFNg

Gen CMH-II

Celula

cáncer

Perforinas, granenzima




Transfección de genesque fabrican moléculas

coestimuladoras B7-1 y

B7-2 dentro de c.

Tumorales, que activanCD28 de LTc e inhiben

su apoptosis.apoptosis

Genes de B7

Apoptosis

lisis osmótica

activación







Transfección conplásmidos copn

insertos del gen P53

dentro de células del

hepatocarcinomacelular resulta en

inducción de apoptosis

(fase I de pruebas

clínicas)

P53

apoptosis



Transferencia de genes de citoquinas a

(TILs).TILs son recuperados de los mismos tumores

después en medios de cultivo se les introduce

genes de citocinas , despues se los reinyecta.

Inconveniente : los linfocitos son resistentes a neomicina ha puesto

en duda la noción de que los TILs viajan predominantemente a lostumores.



Terapia Génica en enfermedad

autoinmune: A reumatoidea

PRUEBAS CLINICAS: (trasfección de genes ex

vivo-local). Sinoviocitos son removidos de pac con AR, se lesinyecta el gen, se reintroduce a la articulación

Transfección de genes inhibitorios del FNT-R1p55

Transfección del gen inhibitorio de IL-1



Proteina inhibitoria de IL-1

producción proteinas

inflamatorios



Proteina inhibitoria del FNT-r


inflamatorios

FNT-r



No sobreproliferación de LTh 2


IL-4, Il-10

LTh2



Terapia Génica en cardiología

Resultados preclínicos : en los individuosque recibieron el gen VEGF165 (vascular endotelial growth factor ) aparecieron nuevos

vasos sanguíneos y arteriolas funcionales, seestimuló la mitosis y la multiplicación celula,estimula la replicación de las células muscularesadultas del corazón."



Terapia Génica en cardiología

Administración de un plásmido con el genVEGF (Argentina).

Estudio multicéntrico:14 países probar laeficacia y seguridad del Ad5FGF-4,

modificación del gen VEGF, en pacientes conangina debida a la enfermedad coronaria



terapia genética combinada

: se ha demostrado un claro sinergismo

combinando la terapia basada en la transferenciadel gen supresor de tumores p53 y el cisplatino

(CDDP) en el tratamiento de tumores humanos de

pulmón implantados en ratones desnudos,



terapia genética : problemas

Se conocen muy pocos antígenos tumorales

específicos cuyo reconocimiento por el SI se haya

demostrado, el repertorio de que se pueden utilizar

en inmunoterapia es muy reducido.

A pesar de que el desarrollo futuro de técnicas

como la transferencia de RNA tumoral a células

dendríticas podrá disminuir considerablemente lamagnitud de este problema,,



Terapia Génica



Terapia Génica

3,500 pacientes participan en 600 protocolos de TG en el mundo.

Mayoría en fase I, II, pocos en fase III.

Riesgo: desarrollo de tumores (inactivación de genes supresores,

o activación de oncogenes.

Firmas biotecnólogicas

Clinical Immunology,2002;104:104-204

T i Gé i



Terapia Génica

Hipócrates: 460-377 a.c.?

“1ro. No hay que hacer daño”

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