Avances Inves t iga i os en i:i Producción de Biocornbustibies

líquida caliente (LHW, de sus siglas en inglés) es solubilizar principalmente la hemicelulosa para hacer a la celulosa más accesible y evitar la formación de inhibidores. Para esto el pH debe encontrarse entre 4 y 7 durante este pretratamiento. Bajo estas condiciones se mini-miza la formación de monosacáridos y también de sus productos de degradación que pue-den posteriormente catalizar la hidrólisis del material celulósico durante el pretratamiento [52,53]. Si la degradación catalítica de los azúcares ocurre, se presenta una serie de reaccio-nes de difícil control dando como resultado subproductos no deseados.

En el pretratamiento con agua líquida caliente la cantidad solubilizada de los productos de degradación es alta, comparado con los pretratamientos con vapor, pero la concentración de estos productos es baja. Esto se debe a la gran cantidad de agua de entrada que requiere el pretratamiento comparado al realizado con vapor. El rendimiento de xilano solubilizado (monomérico) también es generalmente alto, sin embargo, su valor disminuye cuando la concentración de sólidos se incrementa, debido a que el xilano es posteriormente degradado mediante reacciones hidrolíticas a xilosa y furfural [16].

La principal ventaja del pretratamiento con agua líquida caliente es que la hemicelulosa solubilizada y los productos de la lignina están presentes en bajas concentraciones, cuando se compara con el pretratamiento con vapor, debido a la gran cantidad de agua usada en el proceso. Como resultado de las bajas concentraciones, es reducido el riesgo de obtener productos de degradación como furfural y de generar la condensación y precipitación de los compuestos de la lignina. Weil et al. [53] obtuvo incrementos en el rendimiento de la hidró-lisis enzimàtica posterior al pretratamiento con agua líquida caliente entre 2 y 5 veces.

9.2.3 Pretratamiento químico

9.2.3.1. Pretratamiento con ácido El objetivo del tratamiento de la biomasa linocelulósica con ácidos es solubilizar la hemice-lulosa y de esta forma hacer más accesible la celulosa. El pretratamiento puede realizarse con ácidos diluidos o concentrados. La principal reacción que ocurre durante un pretratamiento ácido es la hidrólisis de la hemicelulosa, especialmente el xilano, ya que el glucomanano es relativamente estable en medio ácido. La hemicelulosa solubilizada (oligómeros) puede ser sometida en medio ácido a reacciones hidrolíticas que producen monómeros, furfural, HMF y otros productos volátiles [31]. Durante un pretratamiento ácido la lignina solubili-ada rápidamente se condensará y precipitará [34, 54], La solubilización de hemicelulosa y

precipitación de lignina soluble son más pronunciadas durante un pretratamiento con ácido concentrado que con ácido diluido, lo que hace de este pretratamiento poco atractivo para a producción de etanol. Mientras que el pretratamiento con ácido diluido es considerado como uno de los métodos más prometedores, debido a las reacciones secundarias pueden ser eliminadas con este pretratamiento.

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Nuevas 1 ecnolo_nas en ia Producción de Hioetano' a partir de Biomasa i . iunocelulósica

9.2.3.2. Pretratamiento alcalino Durante el pretratamiento alcalino las primeras reacciones que dan lugar son la solvatación y la saponificación. Esto provoca un hinchamiento de la biomasa y la hace más accesible para enzimas y bacterias. Bajo condiciones fuertes de alcalinidad ocurre, además de la hi-drólisis alcalina, la degradación y descomposición de los polisacáridos disueltos. La pérdida de polisacáridos es debida principalmente a las reacciones hidrolíticas y de 'pelado' (peelim reactions), término usado en la literatura en inglés para referirse al fenómeno de degradación que presentan la celulosa y la hemicelulosa bajo condiciones alcalinas, en el cual unidades simples de monosacárido son secuencialmente removidas desde las terminaciones reducto-ras de la cadena polimèrica [55], Este 'pelado' es ventajoso para las posteriores reacciones, pero debido a la formación de compuestos de peso molecular bajo, existe un gran riesgo de degradación y pérdida de carbono, en forma de dióxido de carbono [56].

Un aspecto importante de esta etapa alcalino es que la biomasas en sí misma consume algo del álcali. Y por tanto, la concentración del álcali residual después del pretratamiento es la debida al álcali que no participó en la reacción [37]. En cuanto a la lignina, el pretratamiento alcalino puede causar su solubilización, redistribución y condensación. Estos efectos pue-den disminuir o contrarrestar los efectos positivos de la remoción de lignina e hinchamiento de la celulosa [33], Otro aspecto importante del pretratamiento alcalino es el cambio que causa en la estructura de la celulosa a una forma que es más densa y termodinàmicamente más estable que la celulosa sin tratamiento.

El pretratamiento alcalino provoca la solubilización de la hemicelulosa y parte de la ligni-na. La remoción de la hemicelulosa tiene un efecto positivo sobre la degradabilidad de la celulosa. Sin embargo, existe comúnmente una pérdida de hemicelulosa a productos de de-gradación y la lignina solubilizada puede tener un efecto inhibitorio. La pérdida de azúcares fermentables y la producción de compuestos inhibitorios hacen del pretratamiento alcalino poco atractivo para la producción de etanol.

9.2.3.3. Pretratamiento oxidativo Este pretratamiento consiste en adicionar a la biomasa una sustancia oxidante, como el pe-róxido de hidrógeno o el ácido peracético, el cual se suspende en agua. El objetivo es remo-ver la hemicelulosa y la lignina para incrementar la accesibilidad de la celulosa. Durante este pretratamiento varias reacciones tienen lugar, como sustitución electrolítica, desplazamien-to de cadenas laterales, rompimiento de enlaces alquil aril éter o el rompimiento oxidativo de núcleos aromáticos [56],

En muchos casos el oxidante usado no es selectivo y por tanto pueden ocurrir pérdidas de hemicelulosa y celulosa. Existe un gran riesgo de formación de inhibidores, ya que la lignina es oxidada también y se forman compuestos aromáticos solubles.

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Avances Investigativos en ia Producción de Biocombnstibles

Teixeira et al. [57] han investigado el uso de ácido peracético a temperatura ambiente como método de pretratamiento para álamo híbrido y bagazo de caña de azúcar. El ácido peracé-tico es muy selectivo a la lignina y no ocurren pérdidas de carbohidratos significativas. La hi-drólisis enzimàtica de la celulosa después de un pretratamiento con ácido peracético (21%) se incrementó de 6.8% (biomasa sin tratar) a un máximo de alrededor de 98%. Teixeira et al. [57] mostraron resultados similares de digestibilidad usando una mezcla de hidróxido de sodio y ácido peracético. Igualmente, determinaron que los rendimientos a temperatura ambiente fueron mayores que para temperaturas superiores.

Gould [58] demostró el uso de peróxido de hidrógeno para delignificación con su máxi-mo a pH 11.5. No encontró deslignificación substancial a valores de pH inferiores 10. De acuerdo a Gould la concentración del peróxido de hidrógeno debe ser al menos de 1% y la relación de peso entre peróxido y biomasa debe ser 0.25 para una buena deslignificación. La deslignificación es probablemente causada por el hidróxilo (OH-), el cual es un producto de degradación del peróxido de hidrógeno con cerca de la mitad de la lignina solubilizada de esta forma (temperatura cercana a 25°C y duración de 18-24 h).

Durante un pretratamiento oxidativo una gran cantidad de azúcares se pierde, debido a la oxidación no selectiva. También se forman compuestos solubles de la lignina, los cuales pueden inhibir la subsiguiente etapa de conversión.

9.2.4 Combinaciones

9.2.4.1 Pretratamiento térmico combinado con pretratamiento ácido La forma de mejorar los pretratamientos térmicos con vapor y agua líquida caliente es me-diante la adición de un ácido externo, lo cual cataliza la solubilización de la hemicelulosa, disminuye la temperatura óptima de pretratamiento y proporciona un sustrato más hidro-lizable enzimàticamente [33,41]. La biomasa es impregnada con SO, o H2S04. Durante el pretratamiento con vapor el SO, es convertido en H2S04 en los primeros segundos del proceso y después de eso la hidrólisis catalítica de la hemicelulosa tiene lugar. Un aspecto importante es que la remoción gradual de la hemicelulosa y la lignina pueden causar una re-orientación de la celulosa a una forma más cristalina [33], Este aspecto válido aplicable para todos los pretratamientos que remuevan gradualmente hemicelulosa y lignina. Sin embargo, el efecto del ácido adicionado no es del todo claro aún. Tengborg et al. [59] mostraron que existió un gran efecto inhibitorio en la producción de etanol después de implementar este método combinado de pretratamiento. Esto concuerda igualmente con los concluido por Grohmann et al. [60], quien durante un pretratamiento con vapor a 160°C y temperaturas superiores y con ácido sulfúrico al 0.5% encontró la producción de cantidades apreciables de furfural.

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iecnoiouías en a Producción de ni. 101 a partir de Biomasa Liy i .ocdulós ica

9.2.4.2. Pretratamiento térmico combinado con pretratamiento alcalino Otra forma de mejorar el pretratamiento térmico es adicionar en álcali externo al proceso en vez de un ácido. Un pretratamiento muy común es el que se realiza con cal. Este pre-tratamiento se efectúa usualmente a temperaturas entre 100 y 150 °C con la adición de aproximadamente 0.1 g de Ca(OH), por gramo de sustrato [61]. Chang and Holtzapple [29] atribuyen le eficiencia del tratamiento con cal a la remoción de los grupos acetilo y de la lignina, haciendo la celulosa más accesible a la hidrólisis. De acuerdo a Kaar y Holtzapple [62] el pretratamiento con cal y calentamiento es suficiente para incrementar la digestibili-dad de la biomasa que contiene bajas cantidades de lignina, pero no para aquellas con altas cantidades. Chang et al. [61] mencionan que el pretratamiento con cal, de pastos y residuos agrícolas del maíz (caña y hojas) no inhibe las etapas de sacarificación enzimàtica v fermen-tación. Por otro lado, para materiales con alto contenido de lignina, es necesario lavar el material antes de la sacarificación enzimàtica y fermentación para prevenir la posible inhibición pot la lignina solubilizada. El efecto positivo del uso de la cal es que ésta es relativamente barata y segura de manipular [63] y que el calcio puede ser recuperado con carbonato de calcio insoluble mediante su tratamiento con dióxido de carbono [64].

9.2.4.3. Pretratamientos térmico-oxidativo Ando et al. [65] propusieron el pretratamiento de cedro con ácido peracético y vapor a 231°C por 10 min, encontrando que la sacarificación posterior se mejoró en proporción directa con la cantidad de ácido peracético adsorbido en las fibras. Otro pretratamiento es la oxidación en húmedo, usando oxígeno como agente oxidante. Los azúcares solubles producidos durante este tipo de pretratamiento son principalmente polímeros a diferencia de los pretratamientos con vapor y ácido que producen directamente monómeros. No se presentan compuestos fenólicos como producto final durante la oxidación en húmedo pero sí ácidos carboxílicos. En cuanto al furfural y el HMF éstos se producen en pequeñas canti-dades, pero parte de la hemicelulosa se pierde como dióxido de carbono [66],

9.2.4.4. Pretratamiento térmico-alcalino-oxidativo De acuerdo a Chang et al. [61] el pretratamiento térmico con cal no es capaz de remover suficiente cantidad de lignina en biomasa con alto contenido de ésta para mejorar su diges-tibilidad, por lo que él sugiere agregar al proceso oxígeno como agente oxidante. En este pretratamiento la degradación de los azúcares es baja, probablemente como resultado de las temperaturas relativamente bajas (150°C) usadas en el proceso. La digestibilidad enzimàtica de la biomasa tratada por este método es 13 veces mayor que aquella para la biomasa sin tratar. Se recomienda, sin embargo, realizar un lavado posterior de la biomasa para remover los compuestos inhibidores de la lignina soluble que probablemente se produjeron [61]. Después del pretratamiento oxidativo con cal, alrededor del 21% de la cal adicionada puede ser recuperada mediante carbonatación con dióxido de carbono [67],

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Avances Investigativos en ta Pmducann de Biorombusnbles

9.2.4.5. Pretratamiento con amoniaco y dióxido de carbono Otros pretratamientos aplican amoniaco y dióxido de carbono. El pretratamiento con amo-niaco (también llamado pretratamiento AFEX) se efectúa con cargas de amoniaco alre-dedor de 1:1 (kg de amoníaco/kg de biomasa seca) y a temperaturas entre 25-120°C con tiempos de proceso de 10-60 días /para temperatura ambiente) o de varios minutos según la temperatura [68,69], Alizadeh et al. [68] obtuvieron un incremento de seis veces en el rendimiento de la hidrólisis enzimàtica y de 2.5 en el rendimiento a etanol después de usar este pretratamiento en biomasa lignocelulósica. El principal factor causante del aumento del rendimiento es el hinchamiento de las fibras de celulosa y la remoción de lignina proporcio-nada por el pretratamiento [69,70].

El pretratamiento dióxido de carbono se lleva a acabo a altas presiones y temperaturas (has-ta 200°C) con duración de varios minutos. El pretratamiento explosivo con vapor a altas presiones de dióxido de carbono provoca que el líquido se acidifique y éste hidrolice espe-cialmente la hemicelulosa [71]. También es posible usar el dióxido de carbono en condi-ciones supercríticas (35°C, 73 bar), incrementando el rendimiento de glucosa, por ejemplo, para el bagazo de caña, entre 50 y 70% [72], 14% para el pino amarillo y 70% para el aspen [73], Este efecto se debe probablemente al incremento en el tamaño de poro de las fibras.

9.3. Hidrólisis de celulosa

9.3.1. Hidrólisis enzimàtica La degradación microbiana de la biomasa lignocelulósica se lleva a cabo mediante la acción de varias enzimas, de las cuales las más importantes son las celulasas. Para que un microor-ganismo hidrolice y metabolice celulosa insoluble, es necesario que éste produzca celulasas extracelulares. Los tres tipos principales de actividades de las celulasas que se conocen son [74]:

• Endoglucanasas (l,4-[3-D-glucanhidrolasas) • Exoglucanasas

• Celodextrinasas (l,4-(3-D-glucan glucanohydrolasas) • Celobiohidrolasas (l-[3-D-glucan celobiohidrolasas)

• [3-glucosidasas (¡3-glucosido glucohidrolasas)

Las endolucanasas cortan aleatoriamente los sitios internos amorfos de las cadenas polisa-cáridas de celulosa generando oligosacáridos de varias longitudes y por tanto se presentan algunas cadenas cortas. Exoglucanasas actúan sobre las terminales reductoras y no reducto-ras de las cadenas de celulosa liberando tanto glucosa (glucanohydrolasas) o celobiosa (ce-lobiohidrolasas) como los principales productos. Las exoglucanasas pueden actuar también sobre la estructura microcristalina de las cadenas [75], Las ¡3-glucosadasas hidrolizan las

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1 eenolo^ias en l i I .¡I i r e de hineranol a p n i. i' de Biomasa ì j g n o c d u i ó s i c a

celodextrinas solubles y la celobiosa a glucosa. A manera de ejemplo, el sistema enzimàtico de celulasas del Trichoderma reesei consiste de al menos dos exoglucanasas, cinco endogluca-nasas y dos p -glucosidasas.

Adicionalmente a los tres tipos principales de celulasas, existen también varias enzimas se-cundarias que atacan la hemicelulosa, tales como la glucoronidasa, acetilestereasa, xilanasa, |3-xilosidasa, galactomanasa y glucomnasa [76],

La hidrólisis enzimàtica de la biomasa está limitada a varios factores tales como: la cristali-nidad, grado de polimerización, contenido de humedad, área superficial disponible y conte-nido de lignina [2,29,77,78]. Caulfield y Moore [79] mencionan que al disminuir el tamaño de partícula e incrementar el área superficial en vez de la cnstalinidad afecta la velocidad y extensión de la hidrólisis. Por otro lado, Zhang y Lynd [80] exponen que la conversión de celulosa cristalina es más lenta que la amorfa, por lo que el porcentaje de cristalinidad se verá incrementado bajo la hidrólisis de la biomasa. Sin embargo, esta tendencia no se ha confirmado.

Otros investigadores como [81-83] concluyen que el tamaño de poro en relación con el tamaño de las enzimas es el principal factor imitante en la hidrólisis enzimàtica de biomasa lignocelilósica. La remoción de la hemicelulosa incrementa el tamaño medio de poro por lo que se aumenta la probabilidad de que la celulosa sea hidrolizada [33,81,84], El secado del material pretratado puede causar un colpaso de la estructura del poro, resultando en una disminución de la digestibilidad enzimàtica [82], Otro fenómeno que puede ocurrir es que las celulasas queden atrapadas en el poro si el área interna del material es mayor que la exter-na, lo cual sucede para muchas biomasas lignocelulósica [80]. La lignina limita la hidrólisis velocidad y extensión de la hidrólisis enzimàtica actuando como un escudo y evitando que partes de la biomasa sean digeridas en la hidrólisis [29],

9.3.2. Hidrólisis àcida concentrada liste proceso se basa en el rompimiento de la estructura cristalina con ácido concentrado y una posterior hidrólisis a azúcares con ácido diluido, los rendimientos alcanzan entre 85 y 90% del teórico. Los factores limitantes de esta hidrólisis son la separación y recuperación de los ácidos [85],

9.3.3. Hidrólisis àcida diluida El proceso con ácido diluido es uno de los métodos más antiguos, simples y más eficientes que se usan en la producción de etanol a partir de biomasa. El proceso consta de dos etapas, en la primera se usa ácido sulfúrico al 0.7% a 190°C para hidrolizar la hemicelulosa presente en la biomasa. La segunda etapa consiste en la hidrólisis de la celulosa, la cual es la fracción más resistente. Se lleva a cabo con la adición de ácido sulfúrico a 0.4% y a una temperatura

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avances Jnvestigativos en ia lJ¡i>ducc]nn de Bi'>c<nr.tn

de 215°C. El hidrolizado líquido es neutralizado y es necesario remover los compuestos tóxicos generados antes de ser enviado a la fermentación [86].

9.4. Microorganismos fermentativos

Microorganismos como hongos, bacterias y levaduras pueden ser usados para la fermen-tación, especialmente las levaduras (.S'. cerevisiae, también conocida como levadura de pani-ficación) son frecuentemente usadas para fermentar glucosa en etanol. Teóricamente, 100 g de glucosa producen 51.4 g de etanol y 48.8 g de dióxido de carbono. Sin embargo, en la práctica, los microorganismos usan algo de la glucosa para el crecimiento y el rendimiento real es menor al 100%.

9.4.1 Bacterias Las bacterias que producen etanol han atraído mucha atención en los últimos años, ya que sus velocidades de crecimiento son substancialmente mayores a las de las Saccharomyces usa-das en la producción actual de alcohol, y además con los recientes avances en biotecnología, tienen un gran potencial en la reducción de costos de la producción de etanol [87]. Dentro las bacterias que producen etanol se encuentra la Z. mobilis, la cual es bien conocida y usada históricamente en áreas tropicales para producir alcohol bebido a partir de savia [88]. Las ventajas de la Z. mobilis son su gran velocidad de crecimiento y alta producción específica de etanol, sin embargo, se limita a usar como fuente de carbono la glucosa, fructosa y sacarosa. Por otro lado, las cepas Gram-neativas de Zymobacter palmae, aisladas por Okamoto et al. [89] usando un amplio rango de sustratos, es un microorganismo facultativo anaerobio que fer-menta hexosas, di y tri sacáridos con enlace a, y alcoholes de azúcares (fructosa, galactosa, lucosa, mañosa, maltosa, melibiosa, sacarosa, rafinosa, manitol y sorbitol). Esta cepa produ-ce aproximadamente 2 mol de etanol por mol de glucosa sin acumulación de subproductos y muestra productividades similares a las de Z. mobilis [90].

9.4.2. Levaduras y hongos El desarrollo de microorganismos mediante ingeniería genética se ha enfocado en la intro-ducción de genes para la asimilación de xilosa de P. stipitis (levadura que fermenta xilosa) en la levadura cerevisiae (tradicionalmente usada en la producción de etanol). Sin embargo, las cepas recombinantes de J . cerevisiae creadas en varios laboratorios han usado la xilosa en forma oxidativa en vez de manera fermentativa. Por lo tanto, la producción de etanol a par-tir de xilosa es esencialmente para el uso exitoso de la lignocelulosa [91], Muchas bacterias, levaduras y hongos asimilan xilosa, pero muy pocas la metabolizan a etanol [92].

Los levaduras que fementan xilosa, tales como P stipitis, Pachysolen tannophilusy Candida she-hatae requieren oxigenación regulada para la producción máxima de etanol [93,94] y la de-

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Nuevas Tecnologías en l i Producción de Bioetano) a part ir de Biomasa Li^noceluiósica

toxificación del hidrolizado usado como sustrato, debido a que son muy sensibles a los efectos inhibitorios propios del medio de hidrólisis de la lignocelulosa [95-98]. Estos facto-res incrementan el costo de la fermentación de xilosa. En cuanto a la S. cerevisiae, ésta tiene un eficiente metabolismo anaeróbico de azúcares, tolera sustratos inhibitorios mejor que cualquier otro microorganismo [99,100] y fermenta hexosas (glucosa, manosa y galactosa), presentes en forma abundante en los hidrolizados de biomasa lignocelulósica, con altos rendimientos y productividades.

El hongo filamentoso Fusarium oxysporum es conocido por su habilidad en la producción de etanol mediante sacarificación y fermentación simultáneas de celulosa. Sin embargo, 1 velocidad de conversión es baja y se producen cantidades significativas de ácido acético como subproducto [101]. Pocas especies microbianas tienen la habilidad de fermentar di-rectamente celulosa a etanol, algunas de las reportadas son Neurospora, Monilia, Paecilomycesy Fusarium [102]. F. oxysporum produce una amplia gama de celulasas y xilanasas, las cuales y han sido caracterizadas y tienen potencial en la producción de alcohol [103]. Otro hongo productor de etanol es el NeocaMimasfáx sp., sin embargo, su principal producto de fermen-tación es el ácido acético [104],

9.5. Configuraciones tecnológicas de la fermentación El etanol puede ser producido por medio de cuatro tipos principales de operaciones indus-triales: lotes, continuo, semi-continuo y lotes-alimentados. En la fermentación por lotes, el sustrato y la levadura son cargados en conjunto con los nutrientes. La mayoría del etanol producido hoy en día se realiza mediante operación por lotes ya que los costos de inversió son bajos, no requiere mayor control y son de fácil manejo [105].

En el proceso continuo, la alimentación (que contiene el medio de cultivo y los demás nu-trientes requeridos) es ingresada continuamente en un tanque agitado donde los microorga-nismos están activos. El producto, el cual es retirado desde la parte superior del biorreactor. contiene etanol, células y azúcares residuales [106].

La operación por lotes alimentados, la cual se puede considerar como una combinado de las operaciones por lotes y continua, es muy popular en la industria del etanol. En esta operación, la alimentación, la cual contiene el sustrato, la levadura v los minerales y vitami-nas requeridos, es ingresada al biorreactor en intervalos constantes mientras el efluente es removido discontinuamente. La principal ventaja de este sistema es que una alimentació intermitente de sustrato previene la inhibición y represión catabòlica. Si el sustrato tiene un efecto inhibitorio, la adición intermitente mejora la productividad de la fermentación a. mantener bajas concentraciones de sustrato.

En un proceso semi-continuo, una porción del caldo de cultivo es retirada en intervalos j

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-\vance^invcstifc¿uivos c n Producción de Biocombustiblcs

medio fresco es agregado al sistema. En un proceso continuo es esencial mantener el volu-men de cultivo constante, mientras que en un semi-continuo el proceso involucra variación de volumen. Este método tiene algunas ventajas respecto a las operaciones en continuo o por lotes, tales como: no hay necesidad de utilizar un recipiente aparte para el inoculo, a ex-cepción del arranque; no hay pérdidas de tiempo en operaciones de limpieza y re-esteriliza-ción y no se requiere mayor control. Sin embargo, existe un gran riesgo de contaminación y mutación debido a los largos periodos de cultivo y manipulación periódica. Adicionalmente, grandes volúmenes de reactor se requieren y por tanto se incurre en mayores costos de in-versión [105], Otros esquemas tecnológicos más avanzados como los procesos integrados y la inmovilización de enzimas permiten sobrepasar las limitantes del sistema y fermentativo, mejorando las productividades sin incurrir en mayores costos de inversión.

9.5.1. Sacarificación y fermentación simultáneas El proceso de sacarificación y fermentación simultánea (SFS) ha sido extensamente estu-diado e implementado con el fin de reducir los efectos inhibitorios de los productos finales de la hidrólisis [72,107], En este proceso, los azúcares reductores producidos en la hidrólisis de la celulosa o sacarificación son simultáneamente fermentados a etanol, lo cual reduce en gran medida los productos de inhibición de la hidrólisis. Los microorganismos habitual-mente usados en la SFS son hongos como Trichoderma reesei y cerevisiae [17]. La hidrólisis es usualmente la etapa limitante del proceso en SFS [108], ya que las temperaturas óptimas de sacarificación no son aptas para los microorganismos comúnmente usados en la fermen-tación. Para solucionar esto, se han usado levaduras y bacterias termotolerantes, las cuales permiten incrementar la temperatura cerca de la óptima de la hidrólisis. Ballesteros et al. [109] han seleccionado de 27 cepas, las levaduras Klujveromjces marxianusy K. fragilis como las que tienen los mayores rendimientos a etanol a 42°C. K. marxianus mostró un rendimiento a etanol de 0.5g/g de celulosa durante 78 h a 42°C usando Solka Floc 200® como sustrato [109],

Por otro lado, Kadam y Schmidt [110] encontraron que la levadura termotolerante Candida aci-dothermophilum produce el 80% del valor teórico de etanol a 40°C usando álamo pretratado con ácido como sustrato. Comparado con el proceso de fermentación en dos etapas de hidrólisis, la SFS tiene algunas ventajas como: el incremento en la velocidad de hidrólisis mediante la con-versión de los azúcares que inhiben la actividad de las celulasas, disminución de requerimientos de enzima, alto rendimiento, disminución de requerimientos de condiciones estériles ya que la glucosa es removida inmediatamente y el etanol es producido, menores tiempos de proceso y menor volumen de reactor ya que sólo se usa un reactor. Sin embargo, el etanol puede exhibir inhibición sobre la actividad de las celulasas en el proceso SFS [17], De acuerdo a esto el proce-so tiene algunas desventajas que deben ser consideradas para mejorar la SFS, en resumen estos aspectos son la incompatibilidad de temperaturas de hidrólisis y fermentación, la tolerancia de algunos microbios al etanol y la inhibición de las enzimas por parte del etanol.

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9.5.2. Células inmovilizadas La producción de etanol mediante fermentación puede llevarse a cabo usando células li-bres o inmovilizadas. Ambos esquemas de proceso tienen ventajas y desventajas. El uso de células inmobilizadas ha atraído la atención durante los últimos años debido a las ventajas que éste presenta sobre el proceso convencional. La inmovilización proporciona altas con-centraciones celulares y reutilización de las células. Se elimina el problema de 'lavado' a altas velocidades de dilución y el costoso proceso de recuperación y recirculación de células. Se pueden obtener también altas productividades volumétricas con la combinación de altas concentraciones celulares y altas velocidades de flujo. La inmovilización puede proveer también estabilidad genética [105],

9.6. Tecnologías de deshidratación

La recuperación de etanol producido mediante diferentes configuraciones tecnológicas y diferentes tipos de materia primas se lleva a cabo de forma similar. El contenido de etanol en el caldo de cultivo resultante de la fermentación es de alrededor 10% (en peso). Els etanol puede ser concentrado hasta casi su concentración azeotrópica (95.6% en peso) por destilación convencional, sin embargo, su implementación como alcohol carburante en mezcla con gasolina requiere que éste sea anhidro (99.6% en peso). Ya que la presencia de agua puede causar daños en el motor y formación de dos fases líquida [111].

La primera etapa de recuperación de etanol consiste en la concentración del etanol presen-te en el caldo de cultivo, ésta se efectúa en una columna de destilación convencional y se obtiene un alcohol concentrado al 50%. El siguiente paso es la rectificación de la corriente concentrada hasta una composición de etanol cercana a la azeotrópica. La deshidratación del etanol a partir de su concentración azeotrópica puede efectuarse con tecnologías como la destilación con variación de presión, destilación azeotrópica, destilación extractiva, desti-lación extractiva salina, tamices moleculares y pervaporación. Todas estas operaciones han encontrado aplicación en la industria del etanol carburante.

9.6.1. Destilación con variación de presión Para llevar a cabo la separación de una mezcla azeotrópica usando destilación con variación de presión se requiere manipular la presión de la columna, por ejemplo, utilizando una segunda columna bajo condiciones de vacío. Este tipo de destilación hace uso del cambio del equilibrio de fases líquido-vapor a bajas presiones llegando a desaparecer el azeótropo. La presión de vacío requerida para llegar a esta condición es menor a 6 kPa. Pero para ob-tener un producto de alta pureza se requiere de una gran cantidad de platos (más de 40) y alta relación de reflujo. Esta condición implica costos de inversión significativamente altos (grandes diámetros de columna) y costos energéticos grandes como resultado del vacío ne-

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Avances Investi^anvos en la Producción de <u>rrnT-.bus"'

cesario en la columna. En general, la destilación con variación de presión no siempre puede ser utilizada, su uso es limitado a mezclas con azeótropo susceptibles al desplazamiento con pequeños cambios de presión.

9.6.2. Destilación azeotrópica La mayoría de los procesos que involucran destilación para la deshidratación de etanol uti-lizado en la industria comprenden al menos tres pasos: la destilación de alcohol diluido hasta la concentración cercana a la azeotrópica, la destilación usando un tercer componente adicional que permite remover el etanol y la destilación para la recuperación y reutilización del tercer componente [112]. La destilación azeotrópica se enmarca dentro de este esquema. Esta tecnología consiste en la adición de un solvente a la mezcla etanol-agua para formar un nuevo azeótropo ternario heterogéneo, el cual permite una separación más fácil del etanol. Dentro de las sustancias comúnmente usadas en esta tecnología se encuentran: benceno, tolueno, «-pentano y ciclohexano.

En el caso del benceno, el proceso comprende una columna azeotrópica, que es alimentada con una corriente a 90-92% en peso de etanol y benceno (alimentado en la cima de la co-lumna). El etanol anhidro es obtenido por los fondos de la columna azeotrópica, mientras que por los vapores de cima se obtiene la mezcla ternaria correspondiente al azeótropo ternario etanol-agua-benceno. Esta mezcla es condensada y enviada a un separador líqui-do-líquido, en el cual se retira una fase rica en benceno que es recirculada como reflujo a la columna azeotrópica y una fase con alto contenido de agua que es enviada a la columna de recuperación de solvente. El destilado de esta tercera columna es rico en benceno y por tanto es recirculado a la columna azeotrópica o al decantador. Mientras que los fondos de esta columna contienen agua y etanol, por lo que puede ser recirculada a la columna de concentración. Como el proceso es operado en régimen continuo, el benceno es recirculado permanentemente en el sistema. Pequeñas cantidades de benceno abandonan el sistema en las corrientes de producto o de agua residual, por lo que se requiere una corriente de repo-sición de benceno.

El uso de benceno como solvente no es deseable debido a sus propiedades carcinogénicas. Adicionalmente, la destilación azeotrópica involucra la aparición de estados estables múl-tiples por lo que es muy sensible a pequeños cambios en la presión de la columna [113]. Teniendo en cuenta estos inconvenientes, se ha propuesto el uso de solventes menos con-taminantes. En particular, nuevas plantas de producción de etanol en Brasil emplean ciclo-hexano en la columna azeotrópica.

9.6.3. Destilación extractiva En este tipo de destilación, se agrega un tercer componente conocido como agente extrac-tivo o solvente a la mezcla etanol-agua. El agente extractivo modifica la volatilidad relativa

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Nuevas Tecnologías en la Producción de Bioeranol a partir de Biomasa Ugnocciuló-aca

de los componentes de la mezcla sin la formación de nuevos azeótropos, permitiendo d< esta forma la separación.

El solvente usado debe tener una volatilidad baja, por lo que éste es recuperado en una columna adicional. Adicionalmente, el solvente debe tener un alto punto de ebullición. El etilenglicol ha sido usado tradicionalmente para este propósito pero los costos energéticos son mayores que en la destilación azeotrópica usando benceno. Sin embargo, Meirelles et al. [114] exponen que la destilación extractiva puede llegar a ser competitiva bajo condiciones específicas de operación. Este hecho fue confirmado por Montoya et al. [112], quienes me-diante simulación determinaron la posibilidad de obtener menores consumos energéticos en la destilación extractiva con etilenglicol.

9.6.4. Destilación extractiva salina El empleo de agentes extractivos salinos en la destilación extractiva ha sido estudiado du-rante los últimos años. Dentro de estos agentes, el más común es el acetato de potasio [111]. Debido a que las sales son compuestos no volátiles, la mezcla etanol-agua es más fácil de separar, por lo que el costo energético es menor comparado con la destilación extractiva tradicional. El efecto de la sal consiste en la solvatación preferencial de los iones formados de la disociación de la sal con los compuestos menos volátiles, lo que da como resultado un incremento en la volatilidad relativa de los más volátiles (etanol).

Además de las sales inorgánicas, existe la posibilidad de emplear polímeros hiper-rami-ficados como las poliesteramidas y poliésteres, en la destilación extractiva de la mezcla agua-etanol. Estos polímeros exhiben buena eficiencia y selectividad y sus propiedades fi-sicoquímicas pueden ser modificadas en dependencia de la aplicación requerida. La recu-peración de estos polímeros puede llevarse a cabo mediante: lavado, evaporación, secado o cristalización [111,115].

9.6.5. Adsorción La adsorción es otra de las operaciones unitarias más ampliamente utilizada en la industria para la deshidratación de etanol. En esta operación, la mezcla etanol-agua atraviesa un lecho que contiene un material adsorbente. Debido a la diferencia en la afinidad de las molécu-las de agua y etanol respecto al adsorbente, el primero es retenido en el lecho adsorbente mientras que el alcohol lo atraviesa incrementando su concentración. Dentro de los mate-riales que se han evaluado para esta tecnología se encuentran materiales sintéticos como las zeolitas (tamices moleculares) de diferentes tamaños de poro y en otros casos biomateriales como el maíz, xilano, celulosa pura, harina de maíz y trigo, bagazo de caña de azúcar, entro otros [116-119]

La adsorción de agua empleando tamices moleculares es actualmente una de las tecnologías

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Avance* ln.'cstigativos en la Producción d^BioconAustibles

más usadas en la industria para deshidratación de etanol, de hecho, esta tecnología ha rem-plazado la destilación azeotrópica. Los tamices moleculares son materiales granulares rígi-dos con forma esférica o cilindrica fabricados a partir de aluminosilicatos de potasio. Para la deshidratación de etanol, tamices con un diámetro promedio de poro de 3 Angstroms (tipo 3A) son comúnmente usados. La molécula de agua tiene un diámetro menor (2.8Á) que el de los poros del tamiz permitiéndole ingresar a la matriz de éste, mientras que la molécula de etanol por tener un tamaño mayor no ingresa en los poros.

La operación de la adsorción requiere que una vez el lecho se haya saturado éste pueda ser regenerado y utilizado nuevamente en otro ciclo de operación. La regeneración del lecho puede hacerse con un gas caliente en contracorriente, sin embargo, para usar nuevamente el lecho es necesario esperar que éste se enfríe y las altas temperaturas deterioran rápidamente el material adsorbente. Por lo que se ha utilizado un sistema de adsorción con variación de presión (PSA, de sus siglas en inglés) en el cual la regeneración se hace con una corriente de etanol anhidro que circula por el lecho en sentido contrario a la operación de adsorción y bajo presiones de vacío [111,120]. De esta forma la vida del material puede prolongarse hasta 10 años [121,122],

9.6.6. Pervaporación En los últimos años se han desarrollado aplicaciones de las membranas tanto en la con-centración como deshidratación de etanol. La preevaporación (evaporación a través de membranas) es una operación basada en la separación de dos componentes mediante una membrana selectiva bajo un gradiente de presión, en el cual el componente que cruza la membrana es removido como una corriente gaseosa (permeado) mientras que los demás componentes permanecen en la fase líquida como una corriente más concentrada (retenta-do). Las primeras membranas industriales fueron las compuestas por alcohol polivinílico y fueron desarrolladas en la década de los años 80 del siglo pasado. Estas membranas presen-tan una alta selectividad al favorecer que el agua pase a través de ella reteniendo una gran variedad de solventes orgánicos. Las membranas de polivinil alcohol permiten el cambio del equilibrio de fases de las soluciones etanol-agua de tal manera que la transferencia de masa entre el líquido y el vapor es determinada por la membrana semipermeable y no por la interfase libre [123]. De esta manera es posible obtener una corriente de etanol concentrado con una composición sobre la del azeótropo. La fuerza motriz de la preevaporación se man-tiene con la aplicación de vacío en el lado del permeado. Así, la fuerza motriz se evidencia mediante la diferencia de presiones parciales de los componentes que cruzan la membrana. Esta diferencia de presiones parciales puede ser incrementada proporcionándole la mayor temperatura posible a la alimentación. El permeado es posteriormente condensado para generar una corriente líquida que puede ser luego recirculada a los primeros pasos de con-centración por destilación.

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Nuevas Tecnologías en [a Producción de Bine-anol a partir do Biomasa Lignoceiulósica

Diferentes modificaciones químicas de las membranas de polivinil alcohol han sido pro-puestas para mejorar la relación hidrofílica/hidrofóbica con el fin de mejorar la selectividac v el flux de la membrana [124],

A diferencia de la destilación azeotrópica y extractiva, la pervaporación no requiere el us< de solventes o agentes extractivos, por lo que las corrientes están libres de trazas de sol ventes. Adicionalmente, esta tecnología es fácilmente ajustable y muy flexible respecto ; los cambios en la concentración de alimento [111,123]. Esta tecnología consume meno energía que las demás tecnologías de deshidratación, lo que las hace de mucho interés par: su uso a nivel industrial.

Existen otras tecnología de separación basadas en membranas, como la permeación de v por, éstas han sido menos estudiadas [111|. Particularmente, la permeación de vapor ofre ciertas ventajas sobre la preevaporación [125], tales como: la construcción del módulo d permeación es más simple va que no se requiere suministrar el calor para la evaporaciór pues no es necesario calentar las fracciones de retentado que alimentan a los módulos s guientes. En la práctica, el flux de permeación de vapor es mayor que el flux de preevap ración debido a que la fuerza motriz no se ve afectada por la polarización, la concentraciói v la reducción de las presiones parciales. Por otro lado, el flux puede incrementarse signifi cativamente aumentando la presión o disminuyendo el sobrecalentamiento. La membra puede además impregnarse con diferentes sustancias (especialmente sales para mejorar < regular su selectividad y flux).

9.7. Discusión

La producción de alcohol carburante ha llevado a la comunidad científica e industrial explorar toda serie de posibilidades tecnológicas que surgen en otras aplicaciones o inclu sive desarrollar técnicas exclusivas para el campo a fin de sobrepasar todas las limitación tecnológicas que este proceso conlleva. Más aún cuando se pretende usar materias prim no relacionadas a la alimentación, es decir, la biomasa lignoceiulósica. Como se mención en este capítulo, este tipo de materia prima involucra una gran complejidad estructu que hace necesario explorar tecnologías cada vez más eficientes que permitan eliminar 1 condiciones severas de operación y aumentar los rendimientos de las etapas posteriores m diante la disposición de los sustratos sin mayor cantidad de sustancias tóxicas e inhibidor para las enzimas y microorganismos involucrados. El tipo de materia prima que se abor en este capítulo adiciona un grado más de complejidad en el proceso de obtención de ale hol carburante, y que aún hoy en día sigue siendo tema de investigación.

La principal problemática que presentan las tecnologías de pretratamiento de materiale lignocelulósico siguen siendo el costo de inversión y la obtención de subproductos no d

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Av;-incc investj anvo en la Produi/nén île PmicomlMisühic

seados, que pueden ser de carácter tóxico o que simplemente disminuyen los rendimientos por provenir de carbohidratos potencialmente aptos para la obtención de azúcares fermen-tables. Lo que se espera es que estas tecnologías puedan ser mejoradas para incluir mayor selectividad hacia el producto deseado bajo condiciones no poco severas de operación. Se están investigando nuevos agentes oxidantes a condiciones a ambiente y supercríticas que probablemente proporcionen las condiciones óptimas desde el punto de vista de costos y de rendimientos.

En cuanto a la hidrólisis de la celulasa, las enzimas (celulasas) siguen siendo el agente hi-drolizante más usado para dicha operación. Sin embargo, la producción de enzimas sigue incrementando los costos de operación globales, lo que implica que todavía es necesario hacer mayores esfuerzos en investigación para su obtención a menor costo. Las enzimas igualmente permiten integrar esta operación con la fermentación en un sólo equipo en un sistema conocido como sacarificación y fermentación simultáneas. Esta tecnología permite disminuir costos de inversión y sobrepasar los efectos inhibitorios que sufren las enzimas y los microorganismos.

La ingeniería genética ha adquirido importancia en la producción de alcohol, debido a que se requieren nuevos microorganismos recombinantes para aprovechar los diferentes tipos de azúcares (hexosas y pentosas) obtenidos de la biomasa lignocelulósica. Se han usado le-vaduras, bacterias y hongos para el aprovechamiento más eficiente de los carbohidratos, sin embargo, aún existen limitantes en cuanto a la obtención del producto deseado (etanol) ya que en la gran mayoría de microorganismos el sustrato se usa también para producir ácidos. Por lo anterior, las levaduras (S. cerevisiaé) y bacterias (Z. Mobilis) comúnmente usadas siguen siendo las preferidas para la fermentación alcohólica.

En cuanto a las tecnologías de deshidratación, en éstas se han logrado mayores desarrollos al implementar tecnologías de bajo consumo energético, y que no requieren la adición de solventes o agentes extractivos para lograr lo deshidratación, tales como la adsorción y pre-evaporación. Sin embargo, se sigue investigando en el desarrollo de nuevos materiales que provean mayor selectividad al menor consumo energético.

En este capítulo se ha hecho una breve descripción de las tecnologías tradicionales y las nuevas tecnologías en cada una de las etapas que comprenden el proceso de obtención de alcohol carburante. Se partió de la importancia que tiene el utilizar biomasa lignocelulósica para no afectar la seguridad alimentaria a nivel mundial por competencia de las materias primas actualmente usadas para su producción y que son en total utilizadas para la alimen-tación de la población, en especial en países en desarrollo.

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U H

Av ance s 1 n vcst i gilí i v< ) s en ia Prt >d u c cu j n de Biocoi n b u s tibien

CAPÍTULO 10

ESTABILIDAD DE BIORREACTORES PARA PRODUCCIÓN DE ETANOL

Isabel Cristina Paz Astudillo, Carlos Ariel Cardona Alzate*

INTRODUCCIÓN Aunque los biorreactores proveen un ambiente controlado para el crecimiento de los mi-croorganismos, el estado de un reactor bioquímico está determinado por parámetros físicos, químicos, bioquímicos y biológicos. Los parámetros físicos, tales como el volumen del cal-do, la potencia de agitación, la velocidad de transferencia de calor, la velocidad de alimenta-ción del líquido, la velocidad de flujo gas, la velocidad de dilución, entre otros, describen el funcionamiento mecánico del equipo. Los parámetros químicos, tales como las concentra-ciones de sustrato, de productos, de dióxido de carbono, de oxígeno y de nutrientes, entre otros, así como la conductividad y el pH, definen el ambiente químico dentro del reactor. Los parámetros bioquímicos, tales como el contenido de aminoácidos, de ATP/ADP, de carbohidratos, de enzimas, de NAD/NADH, de ácidos nucleicos, de proteínas, de vitami-nas, entre otras, indican el estado metabòlico de la célula durante su crecimiento. Y los pará-metros biológicos, tales como la distribución de edad y de tamaño, el grado de agregación, de contaminación y de degeneración, el tiempo de duplicación, la inestabilidad genética, la morfología, las mutaciones y la cantidad de células viables, entre otros, caracterizan el reac-tor en términos del comportamiento de la población celular. De esta manera, la actividad biológica de las células es muy sensible al medio al que se expone. En consecuencia, los sistemas bioquímicos presentan gran tendencia a la inestabilidad, y los procesos asociados a estos sistemas muestran comportamientos atípicos en las variables de salida. La producción de etanol, empleando microorganismos tales como la levadura Saccharomyces cerevisiae y la bacteria Zymomonas mobilis, es un ejemplo claro de este comportamiento. Aspectos relevan-tes sobre la estabilidad del proceso de obtención de etanol con estos microorganismos se discuten en el presente capítulo.

' Universidad Nacional, de Colombia-Sede Manuales, Plantas Piloto de Biotecnología y Agroindustria, Campas La Nubia, Maníjales, A A 127, Colombia. Tel-fax: +57-68879400 Ext. 55880.E-mail: cardonaal@unaLedu.co

^ ^ ^ ^ ^ m ^ m a m m m m m m m m m m | 1991 - « ^ ^ • i ^ m m m b m ^ ^ ^ ^ M

Estabilidad de l i ior teactorcs pa i a Producción de lüanol

10.1. CONCEPTOS BÁSICOS

Con el fin de dilucidar las complejidades de un sistema, es necesario determinar la relación entre las variables de entrada y las variables de salida del proceso. Tradicionalmente, en la fermentaciones alcohólicas, esta relación se determinaba experimentalmente, por ensayo y error, en plantas piloto. Se realizaban pequeños cambios, tipo paso, en las variables de entra-da, se observaba el comportamiento de las variables de salida, y con base en los resultados, se formulaba un modelo empírico lineal. Este era un procedimiento largo y, muchas veces, costoso [1], Además, el modelo obtenido bajo estas condiciones no era fiable para estados del proceso lejos del cual se había generado. Para superar las restricciones del modelo em-pírico, hoy en día, se prefiere formular modelos matemáticos a partir de balances de masa energía para los diferentes componentes del sistema [2],

En general, un biorreactor se puede modelar con un sistema de ecuaciones diferenciales, Si se asume uniformidad (mezcla perfecta) dentro del biorreactor, sólo ocurren variacione respecto al tiempo, y el sistema puede describirse por un grupo de ecuaciones diferencíale ordinarias de primer orden, que en forma de vector se escriben de la forma:

Donde: x = variables p = parámetros del sistema t = tiempo

Según el grado de no linealidad que exhiba el sistema dinámico descrito por la Ec. 10.1 se observan diferentes tipos de comportamientos que son propios de estos sistemas, tale como multiplicidad de estados estacionarios (o puntos de equilibrio), periodicidad, bifur-caciones y caos.

Los estados estacionarios se obtienen a partir del análisis del modelo del sistema, al igualai las derivadas a cero. Ya que generalmente el sistema está dado por n ecuaciones no-lineale puede haber más de un estado estacionario para un grupo de valores de los parámetros p El carácter de un estado estacionario x se determina linealizando el sistema de ecuaciones

s

diferenciales alrededor del estado estacionario, y calculando los valores propios X de la ma triz Jacobiana resultante descrita en la Ec. 10.2.

dt m (10.1)

(10.2)

•ük. | 200 |

Avances Invesi iaai ivos en la Product ion de Bioci .mhnsrbi.-'-

Donde:

| = Matriz jacobiana x = variables x = estado estacionario de la variable x

s

p = parámetros del sistema

En un sistema bidimensional, la estabilidad del estado estacionario se define según los crite-rios resumidos en la Tabla 10.1. Para sistemas de orden superior, donde más de dos valores propios están involucrados, se aplican criterios de estabilidad similares [3-6].

Tabla 10.1. CJasificaáón de estados estacionarios para un sistema bidimensional.

Valores propios

Signo de la parte real Clasificación Descripción Retrato de fase

Ambos son reales X,. X2 e W

Ambos negativos X, < 0 v Xj < 1)

Nodo estable

Las trayectorias se dirigen hacia el punto de equilibrio

v « i i i ¡ i

Ambos son reales X,. X2 e W

Ambos positivos X¡ >0 yX, > 0

Nodo inestable

Las trayectorias se dirigen hacia fuera del punto de equilibrio

• / A

Ambos son reales X,. X2 e W

Signos opuestos k,,X2 eSR X, < 0, X, > 0

Silla Siempre es inestable J _ \

Complejos conjugados con parte real diferente de cero X¡ ,= a ± yp

Foco Cualquier trayectoria cercana al punto de equilibrio parece un espiral !

Complejos conjugados con parte real diferente de cero X¡ ,= a ± yp

Ambos negativos a<0

Foco estable

Las trayectorias van hacia el punto de equilibrio

í i !

Complejos conjugados con parte real diferente de cero X¡ ,= a ± yp

Ambos positivos a >0

Foco inestable

Las trayectorias van hacia fuera del punto de equilibrio O n , i

Complejos conjugados con parte real diferente de cero X¡ ,= a ± yp Si p < 0 , el espiral es en

sentido de las manecillas del reloi

Complejos conjugados con parte real diferente de cero X¡ ,= a ± yp

Si p > 0, el espiral es en sentido contrario a las manecillas del reloi

a: parte real del valor propio fk parte imaginaria del valor propio

Cuando los valores propios son complejos conjugados con parte real cero, ,v7 — i ](3 , se tiene un ciclo límite. Este es una solución periódica aislada del sistema, y representa mo-

% | 201 |

Bstabindad de Biorreactores para Producción de Htanol

vimiento periódico. La definición de estabilidad para un ciclo límite es análoga a la de u punto de equilibrio [4]:

- Si todas las trayectorias que comienzan cerca del ciclo límite tienden a él cuando el tiem-po se incrementa, se tiene un ciclo límite estable.

- Si todas las trayectorias que comienzan cerca del ciclo límite divergen fuera de éste cuan-do el tiempo se incrementa, se tiene un ciclo límite inestable.

El cambio en los valores propios del sistema, cuando se varía un parámetro, caracteriza matemáticamente una bifurcación. Bifurcación se define como un cambio cualitativo en e. sistema. Por ejemplo, cuando un punto de equilibrio desaparece, o el estado estacionan cambia desde un equilibrio a una oscilación. El cambio radical ante variaciones muy peque-ñas de los parámetros se conoce como inestabilidad estructural. Esta inestabilidad puede conducir un proceso a caos. Para este fenómeno no existe una definición exacta; suele definirse como "ninguna de las anteriores", es decir, que es un comportamiento de estad estacionario limitado que no es un punto de equilibrio, ni es periodicidad [6],

10.2. ANÁLISIS DE ESTABILIDAD

Por medio del análisis de estabilidad se determina la naturaleza de cada estado, y se conoc información sobre las trayectorias de transición entre ellos. La información acerca de la es tabilidad y la dinámica local de los estados se obtiene mediante análisis de estabilidad lineal Los resultados de este análisis son apropiados sólo cerca del estado estable [7], Para estable cer el comportamiento general (no local), y obtener información acerca de transiciones d estado a estado, se generan planos de fases. El plano de fases para un biorreactor en ciclc abierto se construye integrando las ecuaciones diferenciales del modelo, seleccionando va-rios puntos de tiempo y graficando, para diferentes condiciones iniciales, los valores de las variables de salida en cada punto. También se puede construir bosquejando directament los resultados del análisis lineal.

El comportamiento de las variables de salida en el tiempo se conoce aplicando simulador dinámica. Para procesos lentos como las fermentaciones, este método puede ser ineficiente e incluso puede llegar a ser incapaz de localizar características del modelo que son responsa bles de ciertos comportamientos dinámicos, tales como bifurcaciones y caos. Incluso, algu ñas características dinámicas pueden omitirse completamente debido a que suele realizars un número limitado de corridas de simulación [8].

Para clasificar los diferentes tipos de comportamientos dinámicos que puede exhibir el sis tema, se utiliza el análisis de bifurcación |9, 10]. Este método se define, de manera simple como el estudio del cambio en las propiedades cualitativas de un sistema dinámico no linea

| 202 | >F«IIBI

Avances ínvesli¡°am'"> en !;i Proi luceion J e Biocoinbusnbles

cuando algunos parámetros clave se varían [11-14]. Las posibilidades de cambio se obtienen en forma de diagramas de bifurcación, donde se grafica la variable de interés en función de un parámetro de operación. El análisis de bifurcación permite comparaciones más profun-das, entre las predicciones del modelo y los datos experimentales, que la simulación dinámi-ca por sí sola [15],

10.3. FENÓMENOS DE ESTABILIDAD PRESENTES EN SISTEMAS CONTINUOS PARA LA PRODUCCIÓN DE ETANOL

Zymomonas mobilis y Saccharomyces cerevisiae son los microorganismos más comúnmente uti-lizados para producir etanol a escala industrial. Los cultivos de estos microorganismos en biorreactores de tanque agitado, durante los procesos a pequeña y gran escala, presentan comportamientos de inestabilidad que dificultan el control del proceso y afectan su produc-tividad. Tales comportamientos obedecen a fenómenos característicos de los sistemas no lineales [16].

En cultivos continuos de Zymomonas mobilis, los fenómenos que más se observan son la mul-tiplicidad de estados estacionarios y la oscilación de diferentes variables de proceso (con-centraciones de sustrato, de biomasa y de productos, y viabilidad de las células, entre otras) a ciertos valores de la concentración de sustrato en la alimentación y de la velocidad de dilu-ción. En algunos casos estos comportamientos causan que la concentración de biomasa y la viabilidad de las células se reduzcan en más de un 50% [17, 18], o que la productividad del proceso sea muy baja. Un ejemplo de ello es el caso de una fermentación continua [19] don-de, a altas concentraciones de sustrato en la alimentación (134 Kg/m3), se presentan grandes variaciones en las concentraciones de biomasa y producto debido al fenómeno oscilatorio. La productividad promedio del proceso es sólo 4.6 Kg/m3 h. Cuando se logra controlar el comportamiento oscilatorio, incluso para concentraciones de sustrato alimentado más ele-vadas (295 Kg/m3), la productividad promedio alcanza a ser 15.6 Kg/m3 h.

En general, para cultivos de esta bacteria, se ha determinado que para valores de la veloci-dad de dilución entre 0 y 2.5 h ', y para concentraciones de sustrato en la alimentación entre 100 y 200 Kg/m3, el sistema puede mostrar diferentes regiones de estabilidad en las cuales se presenta multiplicidad de estados estacionarios y/o oscilaciones. En los casos simples, las oscilaciones terminan en una bifurcación de período infinito, y en los casos más com-plejos, la rama periódica bifurca en fenómenos más complejos tales como caos totalmente desarrollado. Sin embargo, en algunos casos, se observa que la concentración promedio de etanol obtenida durante la oscilación es mayor que la correspondiente al estado estacionario alrededor del cual oscila [8, 20].

m 203 |

• r a b i l i . l | i ( H ^ ¡ o r i e a c t o r e ^ g g j ^ P r o d u c c i ó n de Etanol

Los cultivos continuos de Saccharomyces cerevisiae también exhiben multiplicidad de estados estacionarios y comportamiento oscilatorio. Se observa que a bajas concentraciones de sustrato en la alimentación, prevalece sólo un estado estacionario; sin embargo, a altas concentraciones de glucosa alimentada, pueden aparecer múltiples estados estacionarios sobre un rango relativamente amplio de velocidades de dilución [21], Por ejemplo, a una concentración de sustrato alimentada de 30 Kg/m3, el sistema exhibe solamente un estado estacionario estable a bajas velocidades de dilución. A medida que la velocidad de dilución se incrementa, ocurre una bifurcación donde el estado estacionario estable se vuelve inesta-ble y aparece una solución periódica estable con oscilación. Esta bifurcación está acompaña por oscilaciones de gran amplitud. La solución periódica estable existe con la solución de estado estacionario inestable para un intervalo amplio de velocidades de dilución. A media que la velocidad de dilución se incrementa más, ocurre una segunda bifurcación, la solución periódica desaparece y la solución de estado estacionario recupera su estabilidad. Esta bi-furcación se caracteriza por oscilaciones de pequeña amplitud [15].

Puesto que la mayoría de las fermentaciones realizadas a escala de laboratorio usan bajas concentraciones de glucosa en la alimentación, múltiples estados estacionarios raramente se reportan en trabajos experimentales. No obstante, debido a que la mayoría de las fermen-taciones en la industria se llevan a cabo a altas concentraciones de sustrato, este fenómeno tiene mayor relevancia a escala industrial.

10.3.1. ANÁLISIS DEL COMPORTAMIENTO OSCILATORIO Las oscilaciones en la concentración de biomasa, sustrato y producto (etanol) es un fenó-meno común que se observa en cultivos continuos de Zymomonas mobilis [17-19, 22-24] y de Saccharomyces. cerevisiae [25-29], Este comportamiento espontáneo se presenta, incluso, cuan-do las condiciones en la alimentación y los parámetros físicos como temperatura, velocidad de agitación y pH, entre otros, se mantienen constantes [30, 31],

Durante el comportamiento oscilatorio se distinguen períodos de tiempo en los cuales hay una disminución en la productividad del etanol y se presenta una alta cantidad de sustrato residual. Esto indica una pérdida de sustrato, que es inaceptable para las fermentaciones continuas a escala industrial, ya que el costo del sustrato es el mayor gasto (por lo menos 60%) en la producción global de etanol [32], Así mismo, este fenómeno afecta desfavora-blemente los esfuerzos por optimizar la operación de biorreactores continuos. Por ello, se ha considerado importante investigar los factores que causan las inestabilidades, con el fin de sugerir estrategias para eliminar el fenómeno, o determinar si las oscilaciones ofrecen algún beneficio.

Durante la década de los años 80 fue de gran interés evaluar si las oscilaciones sostenidas eran inherentes al cultivo continuo, o si se presentaban como un mecanismo de los sistemas

| 204 |

Avances ínve n an ns en !a Producción de BiocuinbusiiDles

de control que se utilizaban para regular el pH, la concentración de oxígeno disuelto u otras variables de proceso. Algunas investigaciones [30] determinaron que las oscilaciones esta-ban ligadas a la cinética de crecimiento del microorganismo, jóbses [17] relacionó el com-portamiento oscilatorio con el fenómeno de inhibición por producto. Bruce [19] estableció que las oscilaciones son consecuencia del efecto aditivo de las inhibiciones por sustrato y por producto. Finalmente, debido a que la concentración más alta de sustrato que se obser-va durante las oscilaciones, comúnmente, no alcanza el nivel considerado como perjudicial para los microorganismos, Jarzebski [33] sugirió que la concentración de glucosa a la cual Z. mobilis experimenta inhibición por sustrato puede depender de la concentración de etanol. Al revisar datos experimentales, él observó, como característica común, que las oscilaciones ocurren cuando las concentraciones de sustrato en la alimentación son suficientemente altas, mientras que a bajas concentraciones de sustrato los sistemas tienden a su estado esta-ble. Esta tendencia se observa en los resultados obtenidos por Perego [26] para Saccharomyces cerevisiae, y por Jóbses [17] y Lee [22, 23] para Zymomonas mobilis.

10.4. EFECTO DE LAS VARIABLES DE OPERACIÓN SOBRE LA ESTABILIDAD DE LOS BIORREACTORES EN LA PRODUCCIÓN DE ETANOL

La magnitud de algunas variables, tales como la velocidad de dilución y la concentración de sustrato en la alimentación, tiene gran influencia sobre el comportamiento estático y diná-mico de los fermentadores continuos de tanque agitado. De estas variables depende la apa-rición de diferentes fenómenos de estabilidad que afectan desfavorablemente la conversión de sustrato, el rendimiento de etanol y la productividad del proceso [20, 34],

En cultivos continuos de Zymomonas mobilis, el principal factor que contribuye al comporta-miento oscilatorio del microorganismo es el retraso en la respuesta de las células a un cam-bio en el ambiente, por ejemplo, a una variación en la velocidad de cambio en la concentra-ción de etanol. Por lo tanto, operar un biorreactor a bajas velocidades de dilución favorece la aparición de oscilaciones. Mientras que, cuando se trabaja a altas velocidades de dilución, las oscilaciones rápidamente se amortiguan [18]. Por otra parte, la temperatura también afecta el comportamiento dinámico del sistema. A temperaturas moderadas se evita la aparición de oscilaciones, ya que éstas aparecen a condiciones de inhibición por producto, y las altas temperaturas incrementan el efecto inhibitorio del etanol [17],

Así mismo, las condiciones ambientales, de alimentación y del cultivo influencian la estabi-lidad y afectan los indicadores de producción de las fermentaciones con Saccharomyces cerevi-siae. Por ejemplo, la temperatura afecta la velocidad específica de crecimiento de la levadura v consecuentemente, la respuesta del sistema [26],

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En cultivos aeróbicos, las oscilaciones existen en un rango definido de velocidades de di-lución y de concentraciones de oxígeno disuelto [31]. La localización y la amplitud de los intervalos de estos dos parámetros dentro de los cuales diferentes variables metabólicas exhiben comportamiento oscilatorio, dependen de la magnitud de otros parámetros, tales como la concentración de glucosa alimentada. Así, si la concentración de glucosa es muy baja durante la transición de operación discontinua a operación continua se producen os-cilaciones [30], Igualmente, el comportamiento oscilatorio en cultivos continuos en estado estacionario se induce al disminuir significativamente la concentración de glucosa mediante una reducción temporal de la velocidad de dilución. Estas oscilaciones se pueden eliminar incrementando o disminuyendo el porcentaje de oxígeno disuelto por encima o por debajo de los valores críticos, al manipular la velocidad de agitación [31].

En cultivos anaeróbicos la acción inhibitoria del etanol conduce a estados inestables. Esta acción depende de la concentración de producto, de la velocidad de dilución y de la concen-tración de sustrato alimentada [26]. A altas velocidades de dilución, para un amplio rango de concentraciones de sustrato en la alimentación (incluyendo limitación por sustrato) pre-dominan oscilaciones lentamente amortiguadas. A bajas velocidades de dilución, el efecto de la concentración de sustrato alimentada es más pronunciado y se observan oscilaciones sostenidas, oscilaciones fuertemente amortiguadas [33]. En general, las interacciones entre el sustrato limitante y los microorganismos pueden provocar comportamientos dinámicos muy complejos para rangos específicos de los parámetros [35]. La Tabla 10.2 resume los efectos de las principales variables analizadas para los dos sistemas.

Avain .... lnvt.-sr.igativoa en la Producción de Biocombusdbles

Tabla 10.2. Efecto de variables en la estabilidad» de sistemas productores de etanol.

Variable Nivel Cultivos de S. cerevisiae Cultivos de Variable Nivel Aeróbico Anaeróbico Z. mobilis

Moderada — —

Evita aparición de oscilaciones

Temperatura Alta

Afecta la velocidad específica de crecimiento de la levadura y la respuesta del sistema

—

Incrementa el efecto inhibitorio del etanol. Induce oscilaciones

Efecto pronunciado de C s f . Oscilaciones sostenidas o fuertemente amortiguadas Oscilaciones de grande amplitud.

Velocidad de dilución

Baja Inducción a oscilaciones

Efecto pronunciado de C s f . Oscilaciones sostenidas o fuertemente amortiguadas Oscilaciones de grande amplitud.

Favorece la aparición de oscilaciones

Alta

Para varios C s f , oscilaciones suavemente amortiguadas. Oscilaciones de pequeña amplitud.

Las oscilaciones se amortiguan rápidamente

Concentración Baja

Produce oscilaciones la transición de operación discontinua a continua. Inducción de oscilaciones.

Prevalece un estado estacionario

El sistema tiende a un estado estable

de sustrato alimentado

Alta Múltiples estados estacionarios sobre un rango amplio de D. Oscilaciones de mayor a menor amplitud

Se presentan oscilaciones

Concentración de oxígeno disuelto (velocidad de agitación)

Baja Existe un rango (de amplitud sujeta al valor de otras variables) dentro del cual se presentan oscilaciones

— —

Concentración de oxígeno disuelto (velocidad de agitación) Alta

Existe un rango (de amplitud sujeta al valor de otras variables) dentro del cual se presentan oscilaciones — —

10.5. CONTROL DE LOS FENÓMENOS DE ESTABILIDAD

A partir del estudio de la estabilidad de los procesos, se pueden determinar las condiciones de operación con las cuales es posible evitar los fenómenos de estabilidad que afectan des-favorablemente el rendimiento de la fermentación. Igualmente, se pueden desarrollar es-trategias de control para mantener una alta productividad [15, 36, 37], O se pueden diseñar nuevos esquemas de proceso en el cual operaciones de separación se integran al biorreactor con el fin de estabilizar el sistema. Este es el caso de fermentadores para producción de etanol a los cuales se integra la operación de extracción con solvente o con membrana con el objeto de retirar el producto, y así evitar el efecto inhibitorio del etanol sobre los micro-

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F.s¡.ubj]klad de Biorreactores para Producc ión de Etanol

organismos que causa las oscilaciones. Ambas tecnologías se han aplicado con éxito en la producción de etanol con Saccharomyces cerevisiae y Zymomonas mobilis. La continua e in situ remoción del producto inhibitorio trae consigo algunas ventajas, tales como que permite el alcance de altas velocidades de reacción, reduce costos de recuperación de producto y facilita la operación con altos volúmenes de producción [38],

En la fermentación extractiva, el uso de un solvente da un grado más de control sobre la operación, ya que la concentración del etanol se puede mantener por debajo del nivel de inhibición al manipular la velocidad de dilución del solvente, sin afectar el rendimiento de la biomasa y el etanol. En estudios realizados [39] para la producción de alcohol carburante por fermentación extractiva a partir de glucosa y xilosa, se determinó que la adición de un solvente al caldo de fermentación induce una dramática reducción en la concentración de etanol en la fase acuosa, lo que implica una menor inhibición en la velocidad de consumo de sustrato. Se observa que para un proceso de fermentación convencional, la velocidad de crecimiento se inhibe debido a las altas cantidades de etanol en el caldo de cultivo. Esto se refleja en que el consumo total de los azúcares toma 45 horas. Mientras que para una fer-mentación extractiva ambos sustratos se consumen en 25 horas.

Bruce [19] también demostró el uso de la fermentación extractiva como una técnica eficien-te para eliminar el comportamiento oscilatorio que comúnmente exhibe Zymomonas mobilis en fermentaciones convencionales. Cuando se extrae etanol con un solvente desde el caldo de cultivo, Z. mobilis es capaz de fermentar en continuo materias primas concentradas, y es posible triplicar la producción de etanol. Los estudios indican que esta tecnología no afecta adversamente los rendimientos de biomasa ni del etanol.

La Figura 10.1 y la Tabla 10.3 resumen los resultados que fueron obtenidos en un bio-rreactor continuo para producir etanol con Zymomonas mobilis cuando éste se opera en tres formas diferentes: como quemostato, y con fermentación extractiva a baja y alta velocidad de dilución del solvente [19|. Durante la operación como quemostato, el sistema muestra comportamiento oscilatorio; sin embargo, cuando la operación de extracción se acopla a la fermentación, es posible convertir sustratos más concentrados y eliminar las oscilaciones al controlar la velocidad de dilución del solvente. Los datos demuestran que la productividad del sistema es notoriamente mayor cuando el fenómeno oscilatorio se controla que cuando la operación continua se desarrolla sin extracción.

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Avances .liive--tii;;mvus en la l ' n i duc iu in ele L-iiüeoniDii-.unies

Tiempo i h ¡

Figura 10.1. Concentración venus . . extractiva Í19],

Tabla 10.3. Datos de rendimiento y productividad para fermentación convencional y extractiva [19],

Indicadores de proceso

Etapa de Fermentación

Indicadores de proceso

Quemostato convencional

C S f= 134 Kg/m 3

Fermentación extractiva a baja

velocidad de dilución del solvente (1.15 h 1 )

C5f = 280 Kg/m'

Fermentación extractiva a alta

velocidad de dilución del solvente (1.5 h ' )

C s f = 295 Kg/m 3

Rendimiento de biomasa (Kg/Kg) 0.017 0.015 0.019 Rendimiento de etanol (Kg/Kg) 0.41 0.43 0.46 Productividad del etanol (Kg/m 3 h) 4.6 12.1 15.6

Los valores de rendimiento se calcularon con base en el sustrato consumido. I^as velocidades de dilución del sustrato y el solvente se basan en el volumen acuoso del fermentado}-.

Velocidad de dilución del sustrato: D — 0.11 h- .

Similares beneficios se consiguen con extracción mediante membranas, ya que éstas actúan como estabilizadores. La remoción continua del etanol con dichos dispositivos produce un incremento en la productividad, y tiende a estabilizar el sistema debido a que las oscilacio-nes se eliminan. Cuando se minimiza la inhibición por etanol, la conversión del azúcar, el rendimiento del etanol y la velocidad de producción se favorecen [8, 11, 20, 34]. Sin embar-go, en algunos casos, cuando se incrementa demasiado el área de la membrana, decrece el rendimiento y la productividad. La Figura 10.2 muestra que, para la productividad de etanol,

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K ^ b i l i d a i ^ l ^ i i o r r e a c t o r e ^ a r a J ^ r o ^ de Eranoi

cuando el área de permeación (AM) es pequeña, coexisten múltiples estados estables. A me-dida que AM se incrementa, se alcanza un único estado estable.

Area de permeación. AM xIO-iw )

Figura 10.2. Diagrama de bifurcación para la velocidad de producción de etanol enn el área de permeación como parámetro de bifurcación [20]. estado estable, — estado inestable, ... periodicidad, estable.

CONCLUSIONES En el proceso de producción de etanol por vía biotecnológica, los fermentadores son uni-dades que generan grandes gastos. Éstos involucran el consumo de materia prima y el consumo de energía que está relacionado con la demanda de grandes volúmenes de aire comprimido, y con la alta potencia de agitación. Por ello, el diseño del biorreactor tiene un gran compromiso con la economía del proceso.

La creciente demanda del etanol como biocombustible y las estrictas exigencias en la cali-dad del producto han obligado a que se tenga un conocimiento cuantitativo de la estabilidad y dinámica de los biocultivos con el objetivo de entender, controlar y optimizar los pro-cesos. Actualmente, evaluar la estabilidad de estos bioprocesos es de gran importancia. Se ha vuelto relevante determinar la existencia de los estados estacionarios debido a que éstos corresponden directamente, en la práctica, a estados de operación.

Así mismo, debido a que los diferentes fenómenos de estabilidad que se presentan en los

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