Actividad Antioxidante - S

7/25/2019 Actividad Antioxidante - S

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TEMA: ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE

OBJETIVOS:GENERALDeterminar la capacidad antioxidante del extracto de Piper aduncum(matico) mediante el mtodo

DPPH, espectrofotomtricamente.

ESPECFICOS Realizar la lectura espectrofotomtrica a 517nm de las muestras de Piper aduncumtratadas

con el reactivo DPPH.

Preparar la solucin de Vitamina C como patrn de referencia a las concentraciones de 50,

100, 150, 200 ug/ml.

Determinar bibliogrficamente los compuestos qumicos responsables de la actividad

antioxidante de la planta Piper aduncum

MARCO TERICO: ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE, MTODOS DE DETERMINACIN (IN VITRO).

Actividad AntioxidanteLa actividad antioxidante es la capacidad de una sustancia para

inhibir la degradacin oxidativa (por ejemplo, la peroxidacin

lipdica), de tal manera que un antioxidante acta,

principalmente, gracias a su capacidad para reaccionar con

radicales libres y, por lo tanto, recibe el nombre de antioxidante

terminador de cadena. Sin embargo, es necesario distinguir

tambin entre actividad estabilizadora de radicales libres o

antiradicalaria (en ingls, scavenger) y actividad antioxidante.

(Londoo, 2006) La primera est determinada completamentepor la reactividad de un antioxidante frente a radicales libres, lo

cual puede ser caracterizado por la velocidad de esa reaccin. Por su parte, la segunda mide la

capacidad para retardar la degradacin oxidativa. Por lo tanto, una alta actividad antiradicalaria no

siempre correlaciona con una alta actividad antioxidante; en particular, algunos compuestos

fenlicos sintticos presentan alta reactividad frente a radicales libres, pero muestran moderada

actividad antioxidante.

Mtodo ABTSEn el mtodo de ABTS [ 2,2'-azinobis (cido 3-etil-benzotiazolina-6- cido sulfnico) ], el radical

ABTS se obtiene tras la reaccin de ABTS (7 mM) con persulfato potsico (2,42 mM, concentracin

final) incubados a temperatura ambiente (25C) y en la oscuridad durante 16 h. Este reactivo se

mantiene estable por 2 a 3 das si se guarda en la oscuridad. Una vez formado el radical ABTS se

diluye con etanol hasta obtener un valor de absorbancia comprendido entre 0,70 (0,02) a 734 nm

y 25C. La absorbancia se mide cada 30 s despus de la adicin de 1.0 ml de la solucin ABTS a 100

l de muestra, homogenizada durante 30 s en forma continua durante 6 minutos. La disminucin

de la coloracin es expresada como el porcentaje de inhibicin de ABTS, la cual es comparada con

una curva estndar del antioxidante sinttico de referencia. Los resultados se expresan como mol

de patrn de referencia (trolox) equivalente por gramo de muestra fresca. (Chuquinia, Alvarado,

Pearrieta, Bergenstahl, & Akesson, 2008)


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Mtodo FRAPSe basa en el poder antioxidante de reduccin frrica.

El complejo amarillo de Fe3+-TPTZ (2,4,6-tripiridil-s-triazina) fue reducido al complejo azul de Fe2+-

TPTZ por el electrn que dona una sustancia, en medio cido. Cualquier electrn donado por una

sustancia con una alta reactividad y un bajo potencial redox, puede llevar a la formacin del

complejo azul Fe3+/Fe2+TPTZ. El reactivo FRAP es una mezcla de 0.1 mol/l de buffer acetato de

sodio (pH 3.6), 10 mmol/l TPTZ y 20 mmol/l de cloruro frrico (10:1:1). Una vez mezcladas, 900 l

de la disolucin FRAP y 90l de agua y 30 l de muestra, se midi la absorbancia inmediatamente

despus de la adicin de la muestra cada 20 s durante 10 minutos a 593 nm a 25 C. El blanco

consiste en 120 l de agua y 900 l de reactivo. La absorbancia final de las muestras, fueron

comparadas con una curva estndar de trolox (100-1000 mol/l). Los resultados fueron

expresados como mol de trolox equivalente por gramo de muestra fresca. (Chuquinia, Alvarado,

Pearrieta, Bergenstahl, & Akesson, 2008)

Mtodo DPPHEste mtodo, desarrollado por BRAND-WILLAMS et al., se basa en la reduccin de la absorbancia

medida a 515 nm del radical DPPH, por antioxidantes. Con modificaciones el mtodo descrito porKIM et al., se basa en la medida de la absorbancia del radical DPPH 100 M (3,9 mL) disuelto en

metanol al 80%, a la longitud de onda de 517 nm. Se aade 0,1 mL de la muestra o patrn, la

mezcla se homogeniza cuidadosamente, y se mantiene en la oscuridad durante 30 minutos. Las

medidas de absorbancia a 517 nm se realizan antes de aadir la muestra (A0) y pasados los 30 y 60

minutos (Af). La concentracin de DPPH en el medio de reaccin se calcula a partir de una curva de

calibrado obtenida por regresin lineal. Los resultados se expresan en TEAC, o sea, actividad

equivalente a Trolox (M/g de muestra peso fresco). El antioxidante sinttico de referencia Trolox,

a una concentracin de 0,08-1,28 mM en disolucin de metanol al 80%, se ensaya en las mismas

condiciones, expresndose los resultados en TEAC (actividad antioxidante equivalente a Trolox) y

VCEAC (actividad antioxidante equivalente a Vitamina C). (Kuskoski, Asuero, & Troncoso, 2005)

Mtodo DMPDSe determina la actividad antioxidante aplicando el mtodo propuesto por FOGLIANO et al. Este se

basa en aadir 1 mL de la disolucin de DMPD 100 mM a 100 mL de disolucin tamponada con

cido actico/ acetato de sodio 0,1 M (pH 5,25). Tras la adicin de 0,2 mL de una disolucin de

cloruro frrico 0,05 M (concentracin final de 0,1 mM) se forman radicales cationes coloreados

(DMPD). Un mililitro de esta disolucin se traslada a una cubeta midindose su absorbancia,

comprendida entre 0,90 (0,1), a 506 nm. Se aade 50 L de una disolucin patrn de

antioxidante o de muestras diluidas y transcurridos diez minutos (a 25C) se hace otra medida de

absorbancia a 506 nm. La disolucin tamponada de acetato se utiliza como blanco de referencia.

Los resultados se expresan en TEAC, o sea, actividad equivalente a Trolox (en mM o M) o bien en

VCEAC, actividad equivalente a vitamina C (mg/L o mg/100 g). (Kuskoski, Asuero, & Troncoso,

2005)

ANTIOXIDANTES NATURALES. ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE DE COMPUESTOS FENLICOS(MECANISMO DE ACCIN).

Antioxidantes naturalesEl efecto de los nutrientes antioxidantes tiene la funcin en la eliminacin de carcinognicos,

inhibicin de pre-carcinognicos y la reparacin del dao al DNA. Los alimentos procesados


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contienen menor concentracin de antioxidantes que los frescos y crudos, ya que en el proceso de

preparacin exponen al alimento ante el oxgeno. (Alomar, 2002).

Dentro delos alimentos con compuestos qumicos antioxidantes se tiene algunos:

_ajo. Antioxidante: allicina

_frutilla, frambuesa, cereza, uvas, kiwis, arndanos, bayas. Antiox: Ac. Elgico

_pimiento, chiles, ajes. Antiox: capsicina

_zanahoria, tomate, naranja, papaya, lechuga, espinaca. Antiox; carotenoides(alfa y beta

carotenos, precursores de vit. A)

_t verde, cacao. Antiox: catequinas y polifenoles.

Actividad antioxidante de compuestos fenlicosLos tocoferoles tienen un anillo bencnico sustituido con un grupo hidroxilo, lo que le da gran

importancia como antioxidantes naturales. Los compuestos fenlicos propiamente dichos

presentan mayor actividad antioxidante como son: alcoholes y cidos fenlicos, cidos cinmicos,

sus derivados y glucsidos, cumarinas, flavonoides y sus glucsidos, catequinas, fenoles

condensados o taninos. (Durn & Borja Padilla, 1993)

Los antioxidantes pueden prevenir o retardar la oxidacin de un sustrato biolgico, y en algunos

casos revertir el dao oxidativo de la molculas afectadas. Segn el mecanismo de accin, se

clasifican en:

_ antioxidantes preventivos: al comienzo de una cadena de oxidacin(reductores de perxidos

orgnicos e inorgnicos) ej: enzimas, glutatin peroxidasa, catalasa y peroxidasa.

_antioxidantes secundarios: bloqueando en alguna etapa la cadena de oxidacin, una vez iniciada,

captando radicales libres. Ej: vitamina E y C, enzima superxido dismutasa. (Alomar, 2002)

Mecanismos:_Interaccin directa con especies reactivas

_Prevencin de la formacin enzimtica de especies reactivas


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_ Prevencin de la formacin de especies reactivas dependientes de metales (como agentes

quelantes).

_Activacin o induccin de la actividad de enzimas antioxidantes

REACTIVO DPPH, PROPIEDADES Y ESTRUCTURA.El radical DPPH se le denomina qumicamente como 1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl.

El DPPH es un radical libre qumicamente estable.

Es un polvo fino, soluble en alcohol etlico o metlico.

Las propiedades cromticas del DPPH estn dadas porque sta

molcula es un radical libre estable el cual no forma dmeros

como sucede con otros radicales libres. El electrn

desapareado da un mximo de absorcin a 514 nm y es colormorado. Cuando una solucin de DPPH se mezcla con una

sustancia que puede donar un tomo de hidrgeno, entonces

aparece la forma reducida DPPH-H provocando un cambio en

el color de morado a amarillo. La decoloracin resultante es

estequiomtrica con respecto al nmero de electrones

capturados. Este mtodo no es especfico a un antioxidante en particular por lo tanto aplica para

evaluar una capacidad antioxidante total. (Marty, 2010)

REACCIN DE ESTABILIZACIN DEL RADICAL LIBRE (DPPH)EL DPPH se caracteriza por poseer un electrn desapareado que es un radical libre, estabilizado

por resonancia. Por esta propiedad, el DPPH se utiliza como material de referencia para

determinar el poder antioxidante de una sustancia por captura de radicales libres . (Marty, 2010)

DPPH + A-H DPPH-H + A

La especie A es un nuevo radical libre menos reactivo generado en este primer paso. En la

reaccin anterior se aprecia la reduccin de una molcula de DPPH por una molcula del

antioxidante A-H, es decir una estequiometra 1:1. El radical A puede formar dmeros en una

reaccin regulada estequiomtricamente por el nmero de molculas de DPPH reducidas.


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A + A A-A

En otros casos la especie donadora de hidrgeno cuenta con varios sitios de abstraccin. Una

molcula de cido ascrbico puede reaccionar con dos radicales R dando una estequiometra 2:1.

El DPPH puede tambin combinarse con otros radicales Rde acuerdo a la siguiente reaccin.

DPPH + R DPPH - R

PLANTA, NOMBRE CIENTFICO, FAMILIA, SINONIMIA, COMPOSICIN QUMICA YACTIVIDAD FARMACOLGICA (RESUMIDO)

MATICO

Nombre comn: matico, hierba del soldado, palo del soldado, achotln, cordoncillo, candelillo,higuillo, pimentero de hoja angosta

Nombre cientfico:Piper aduncumFamilia:PiperaceaeSinonimia: Piper angustifolium

Piper celtidifolium

Piper elongatum

Arthante elongata

Stephensia elongata

Descripcin botnica.El Matico es un rbol pequeo delgado perenne de la familia de la pimienta. Se distribuye en toda

la cuenca amaznica, Per, Brasil, Colombia, Paraguay, Ecuador y Bolivia. El matico alcanza los 4

metros de altura. Sus tallos son verdes, con los nudos de interseccin de las hojas bastantes

hinchadas.

Sus hojas son ovaladas, con pecolo corto, de 12 centmetros de longitud. Las propiedades

medicinales del Matico se encuentran en sus hojas. El Matico posee propiedades astringentes,

hemostticas y vulnerarias. El matico se emplea para hemorragias internas y externas, en casos decadas, inflamaciones de la garganta, diarreas, disenteras, contusiones, golpes, tumores de la

matriz, lceras sencillas en el estmago, vaginitis, la bronquitis, el herpes, infecciones urinarias,

etc. (Pamplona, 2001)

Composicin qumicaAceite esencial: 7% (esteres fenlicos, un hidrocarburo, el ter matcico, cincol, terpenos); cido

artnico, maticina que es una sustancia amarga.
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Los iridoides aucubina, catalpol y O-metil catalpol, son los constituyentes qumicos ms

importantes y representativos. Un segundo grupo lo constituyen los flavonoides, cuyo tpico

representante es la escutelarena; mientras que los fenilpropanoides componen el tercer grupo,

entre ellos el verbascsido. (Muoz, Montes, & Wilkomirsky, 2001)

En general las races de esta familia producen sesquiterpenoides con anillos del sistema

cariofileno, asilndose una serie de ellos conocidos como buddledinas. El primer diterpeno

metilenquinona aislado de esta familia, y un glicosido feniletanoide denominado angarsido.

(Vanaclocha, 2003)

Actividad farmacolgicaCicatrizanteLas hojas en decoccin se usan como cicatrizantes en el tratamiento de hemorragias, siendo los

Flavonoides en un porcentaje del 5.7% responsables de dicha actividad.

Sin duda, la principal propiedad medicinal de esta planta es la de ayudar en la cicatrizacin de todotipo de heridas, ya sea externas o internas. De aqu deriva su utilidad en el tratamiento de la lcera

digestiva. Externamente, su efecto benfico sobre heridas de lenta cicatrizacin es muy

sorprendente, lo que ha contribuido en mayor medida a su gran reputacin.

La dehidroleucodina (DHL) es un buen cicatrizante, actua en los ciclos de divisin celular. El hecho

de que la DHL ayude a que las clulas epiteliales se reproduzcan ms rpido y por ende favorezcan

una ms rpida cicatrizacin, le da sus aplicaciones como cicatrizante, para sanar ms


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rpidamente la piel de las personas que han sufrido quemaduras y en las lceras de pierna, que

tardan mucho tiempo en curarse y son muy dolorosas. (Vanaclocha, 2003)

AntiinflamatoriaLos Flavonoides presentes en la planta, actan sobre los procesos inflamatorios, reduciendo el

dolor y actuando sobre la ciclooxigenasa, inhibiendo que se liberen prostaglandinas y

tromboxanos, receptores inmediatos de la inflamacin.

AntihipertensivoEl Fenilpropanoide, verbascsido, acta sobre el tono vascular sanguneo arterial, reduciendo de

esta manera la presin arterial.

AntibacterianoLos Iridoides, como el angarsido A es un producto activo contra Staphylococcus aureus.

AntioxidanteInhiben gran variedad de enzimas, como la ciclooxigenasa, lipooxigenasa, NADPH oxidasa y xantina

oxidasa, los radicales libres y reducen el estrs oxidativo). Los flavonoides, polifenoles y el alfatocoferol poseen capacidad antioxidante.

MATERIALES Y REACTIVOS:

MATERIALES REACTIVOSFrasco de vidrio Etanol

Embudo Buchner Solucin DPPH 20mg/L

Varilla de agitacin Solucin metanlica

Probeta Agua destilada

Tubos de ensayo Extracto de matico

Erlenmeyer Vitamina C

Balanza granataria Solucin Metanol-AguaRotavapor

Balones aforados

Pipetas

PROCEDIMIENTO:

Diagrama de flujo

BIBLIOGRAFA

Alomar, M. F. (2002). Antioxidantes: captadores de radicales libres o sinnimo de salud?

Manual de Geriatra, 7-9.

Chuquinia, F., Alvarado, A., Pearrieta, M., Bergenstahl, B., & Akesson, B. (2008).Determinacin de la capacidad antioxidante de especies vegetales de la region Andina de

Bolivia. Boliviana de Qumica, 75-83.

Durn, M., & Borja Padilla, R. (1993). Actividad antioxidante de los compuestos fenlicos.

Incestigaciones Cientficas-Espaa, 101-106.

Kuskoski, M., Asuero, A., & Troncoso, A. (2005). Aplicacin de diversos Mtodos qumicos para

determinar la actividad antioxidante. Ciencia y Tecnologa, 726-732.


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Londoo, J. (2006). Antioxidantes: importancia bilgica y mtodos para medir su actividad.

GRIAL, 129-162.

Marty, J. L. (2010). Determinacin del contenido fenlico en extractos naturales mediante

sensores enzimticos. Ciencia y Tecnologa de Alimentos, 22-24, 29.

Muoz, O., Montes, M., & Wilkomirsky, T. (2001). Plantas medicinales de uso en Chile: qumica

y farmacologa. Santiago de Chile: Universitaria.

Vanaclocha. (2003). Vademecum de prescripcn. En B. Caigueral, Fitoterapia. Barcelona,

Espaa: Masoon.

BIBLIOGRAFA OL-LINE Pamplona, R. (20 de Enero de 2001). Botanical-online. Obtenido de Caracteristica del Matico:

http://www.botanical-online.com/pimienta_piper_aduncun.htm

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