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Actividad: Huella Genética
Enzimas de restricción
Alianza para el Aprendizaje de Ciencias y Matemáticas (AlACiMa)
Junio 4, 2007
Original: Dr. Noel Motta y Dra. Rosa V. Flores, UPR-Río Piedras
Essy Levy, M.S. y Julie Mathern, Bio-Rad
Aplicaciones al mundo real de Huella genética o “Fingerprinting”de ADN
• Escena del crimen
• Relación entre humanos
• Paternidad
• Relación entre animales
• Estudios antropológicos
• Estudios de organismos que causan enfermedades
• Identificación de alimentos
• Restos Humanos
• Monitoreo de transplantes
Ácido Deoxirribonucleico (ADN)
Figura B15.6 Silberberg 4ta Ed.
En todos los sistemas biológicos
el ADN es la molécula que lleva
la información hereditaria
mediante unidades denominadas
genes.
Ácido Deoxirribonucleico (ADN)
Un gene es la secuencia de
ADN necesaria para la síntesis
de un polipéptido o una molécula de
ARN.
Un polipéptido es una secuencia de aminoácidos unidos mediante enlace químico. Las proteínas consisten de uno o más polipéptidos.
Los Genes consisten de exones y de intrones.
Los exones son secuencias de ADN que se expresan en la célula.
Los intrones son secuencias de ADN que no se expresan en la célula.
Los Intrones son removidos del ARN durante el proceso de Transcripción
El
Genoma
es el total
del ADN
en una
célula u
organism
o.
Genoma − ADN en las Células
Los seres humanos comparten el 99.9% de su genoma.
23 pares de cromosomas
La variación genética, o diferencias en la secuencia del ADN, ocurre en el 0.1% restante.
Variación Genética
Muchas
de las
diferencia
s ocurren
en
regiones
del ADN
sin
función
conocida.
Regiones de Variabilidad en ADN
El análisis de las
regiones altament
e variables
es la clave
para la técnica de la huella digital
del ADN o Huella Genética
.
La repeticiLa repeticióón es n es una secuencia de una secuencia de
ADN corta, entre 10 ADN corta, entre 10 y 100 pares de y 100 pares de
bases (pb).bases (pb).
La secuencia La secuencia pueden estar pueden estar
repetida 14 repetida 14 veces, 9 veces, o veces, 9 veces, o
4 veces.4 veces.
El número de veces El número de veces que estque estáá repetida repetida
puede variar de un puede variar de un lugar a otro en el lugar a otro en el
mismo cromosoma.mismo cromosoma.
Regiones altamente variables Regiones altamente variables consisten de repeticiones en consisten de repeticiones en ttáándem en número variable ndem en número variable
(“VNTR”). (“VNTR”).
El número de El número de veces que estveces que estáá
repetida la repetida la secuencia de ADN secuencia de ADN
varía entre varía entre cromosoma a cromosoma a cromosoma. cromosoma.
También varía También varía entre individuo a entre individuo a
individuo. individuo.
Este tipo de Este tipo de secuencias se secuencias se
llaman también llaman también “minisatélites”.“minisatélites”.
3/10
3/11 10/11
Un hijo hereda un
cromosoma de cada par
de cromosomas que tiene el padre y la madre.
Analizando las Regiones altamente
variables del hijo, se puede
determinar quiénes son sus padres.
11/11
Huella Genética
Es una técnica que permite detectar diferencias en el ADN en diferentes individuos, analizando los
fragmentos generados por el corte de las regiones variables del ADN con enzimas de restricción.
Envuelve los siguientes pasos:
1. Aislar el ADN genómico o de las regiones variables.
2. Cortar el ADN en pedazos más pequeños.
3. Separar los pedazos de ADN por tamaño.
4. Identificar las regiones variables del ADN.
5. Analizar el perfil de pedazos de cada individuo.
Huella Genética Procedimiento Primera Parte
Huella Genética Procedimiento Segunda Parte
Huella Genética Procedimiento Tercera Parte
Enzimas de Restricción - Enzimas que cortan ADN
• Evolucionadas por bacterias para protegerse contra infecciones virales.
• Son endonucleasas, cortan en el interior de las hebras del ADN.
• Se conocen más de 3,000 enzimas de restricción.
bacteria
virus
Sitio de Reconocimiento de la Enzima de Restricción
• Cada enzima digiere (corta) ADN en una secuencia específica, o sitio de restricción.
• Las enzimas reconocen de 4 a 6 pares de bases organizadas en secuencias palindrómicas(Ej. GAATTC).
Secuencia Palindrómica
Sitio de restricción
Fragmento 1 Fragmento 2
Extremos Sobresalientes5’ o 3’
• Algunas enzimas de restricción generan extremos sobresalientes 5’ (cinco primo), como la mostrada aquí.
La enzima corta aquí
• Otras enzimas de restricción generan extremos sobresalientes 3’ (tres primo).
Enzimas de Restricción Comunes
EcoRI– Eschericha coli– Extremos
Sobresalientes 5’
Pstl– Providencia stuartii– Extremos
Sobresalientes 3’
• EcoRI – Enzima de restricción que genera extremos sobresalientes 5’.
• PstI – Enzima de restricción que genera extremos sobresalientes 3’.
Extremos Parejos
• Existen otras enzimas de restricción que generan extremos parejos;
es decir, extremos que no tienen porciones sobresalientes.
• Ejemplos:
AluI y HaeIII
AluI– Arthrobacter luteus– Extremos Parejos
HaeIII– Haemophilus
aegyptius– Extremos Parejos
Análisis de productos de una reacción enzimática
• ¿Cuántos fragmentos de ADN se obtendrían tras el corte?
• Escribe la secuencia de bases de los fragmentos.
• ¿Qué diferencias hay entre los dos fragmentos?
Otros Componentes en la Reacción de la Digestióndel ADN
• Búfer Restricción permite las condiciones óptimas para la reacción
• NaCI proporciona la concentración correcta de iónes
• Tris-HCI proporciona el pH correcto
• Mg2+ es un co-factor enzimático
Temperatura de la Digestióndel ADN ¿Por qué incubamos a 37°C?
•La temperatura del cuerpo es la temperatura óptima para éstas y otras enzimas.
¿Qué pasa si la temperatura de la reacción es demasiado fría o demasiado caliente?
•Muy caliente: la enzima puede ser desnaturalizada.
•Muy fría: la actividad de la enzima puede ser más lenta, requiriendo más tiempo para digerir el ADN.
Preguntas de la separata…
Después de 24 horas, ¿hay alguna pista visible de que las enzimas de restricción hayan modificado de alguna forma el ADN en los tubos? Razona tu respuesta.
¿Qué es lo que determina el punto dónde una endonucleasa de restricción corta una molécula de ADN?
¿Cómo podemos detectar la posición de los sitios de restricción para EcoRI y PstI en nuestras muestras de ADN?
Una manera para determinar la localización de los sitios de restricción podría ser averiguar lo siguiente: ¿Cuántos fragmentos de ADN de diferente
tamaño hay en cada muestra? ¿Cuáles son los tamaños relativos de cada
fragmento? ¿Se encuentran los sitios de restricción
para EcoRI y PstI localizados en los mismos puntos en cada muestra de ADN?
Se puede extraer ADN de casi cualquier tejido humano:
sangre
semen
tejido de una víctima muerta
células del folículo capilar
saliva
Paso 1: Aislar el ADN
Paso 2: Cortar el ADN
El ADN se corta con enzimas de restricción,
proteínas que reconocen secuencias específicas de ADN de cadena doble y
catalizan el rompimiento del enlace que une dos
nucleótidos dentro de esa secuencia.
Secuencia reconocida es palindrómica – lee igual en dirección 5’ a 3’ .
Paso 3: Separar pedazos de ADN
Paso 4: Hallar Regiones Variables
Paso 5: Analizar perfil de pedazos
Electroforesisen Agarosa: aplicando las muestras
• Corriente Eléctrica La corriente mueve el ADN, que tiene una carga negativa, hacia el electrodo positivo (+, rojo).
Fuente de Poder
Búfer
Tinta
Gel de agarosa
Electroforesisen Agarosa:corriendo las muestras
• La gel de agarosa separa los fragmentos de ADN por tamaño.
Los fragmentos más pequeños se
mueven más rápido y progresan más lejos que los fragmentos más grandes.
Fuente de Electricidad
Corriendo la Gel
Asegúrese de que los
pozos están en el lado del polo (-).
Preguntas para análisis El aparato de electroforesis origina un campo
eléctrico con un polo positivo y otro negativo situados en cada extremo del gel. ¿A qué polo (+ o -) crees que migrarán las muestras de ADN? Explica por qué.
¿Qué color representa al polo negativo? Después de cargar las muestras de ADN en
los pocillos, se les fuerza a moverse a través de la matriz del gel. ¿Qué fragmentos (grandes o pequeños) crees que migrarán al extremo opuesto del gel con mayor rapidez? Explica por qué.
¿Qué fragmentos (grandes o pequeños) esperas que se desplacen la mínima distancia desde el pocillo? Explica por qué.
Electroforesisen Agarosa:resultados típicos
• La gel de agarosa separa los fragmentos de ADN por tamaño.
Los fragmentos más pequeños se
mueven más rápido y progresan más lejos que los fragmentos más grandes.
Actividad 1: Huella Genética de un Individuo
¿Cuáles son los cromosomas que posee cada individuo?
Individuo #1: Dos cromosomas A; homocigótico (A/A).
Individuo #2: Un cromosoma A y otro B; heterocigótico (A/B).
Individuo #3: Dos cromosomas B; homocigótico (B/B).
Actividad 2: Enzimas de Restricción
# Fragmento
s
3
3
2
3
Actividad 2: Enzimas de Restricción
Huella Genética de María y JoséFragmentos
de María:
uno de 38 pb
uno de 28 pb
uno de 10 pb
dos de 7 pb
Fragmentos de José:
uno de 25 pb
uno de 20 pb
uno de 15 pb
uno de 13 pb
uno de 10 pb
uno de 7 pb
Actividad 3: Se mezclan bebés
Bebé #3
Bebé #1
Bebé #2
Actividad 4: Caso de Paternidad
¿Qué bebé podría ser hijo del Sr. Megabucks?El #2.
Actividad 5: Caso del Cuchillo
¿Mató Sminks a Millhouse?No hay pruebas suficientes.
Cierre de la Actividad
¿Como explicas el que cada individuo tenga una huella
genética única?
Huella Genética
Estudios de evolución y de taxonomía
Identificación de desaparecidos
¿Qué otros usos se le puede dar a la técnica de huella genética?
Debido a las variaciones en el ADN en ciertas regiones de los cromosomas.
