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Actualización de los conceptos asociados con la regeneración celular en plantas
Natali Rueda Chacón
Universidad de Santander
Facultad de Ciencias Exactas, Naturales y Agropecuarias
Programa de Microbiología Industrial
Bucaramanga
2019
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Actualización de los conceptos asociados con la regeneración celular en plantas
Natali Rueda Chacón
Monografía presentada para optar al título profesional como Microbióloga
Industrial
Directora:
Martha Rocío Chacón Velasco
Magister Microbióloga Industrial
Universidad de Santander
Facultad de Ciencias Exactas, Naturales y Agropecuarias
Programa de Microbiología Industrial
Bucaramanga
2019
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iv
Agradecimientos
A mis padres por su eterno amor y paciencia durante cada paso de este proceso
v
Contenido
Introducción ................................................................................................................................................................ 2
Capítulo 1 ..................................................................................................................................................................... 5
1. Técnicas biotecnológicas utilizadas en el estudio de la regeneración
vegetal ...................................................................................................................................5
Capítulo 2 ..........................................................................................................................15
2. Multiplicación vegetal .............................................................................15
2.1 Multiplicación sexual de plantas superiores .........................................................16
2.1.1 Embriogénesis cigótica ...................................................................................16
2.1.1.1 Meristemos primarios y secundarios .........................................................18
2.1.2 Reguladores de crecimiento vegetal ..............................................................20
2.1.2.1 Auxinas ....................................................................................................21
2.1.2.2 Citoquininas .............................................................................................22
2.1.2.3 Mecanismos de acción de las hormonas vegetales ..................................22
2.1.3 Diferenciación celular ...................................................................................25
2.2 Multiplicación asexual en plantas superiores ......................................................25
2.2.1 Cultivo in vitro de tejidos vegetales ..............................................................26
2.2.1.1 Micropropagación ....................................................................................27
2.2.1.2 Técnicas básicas de micropropagación ....................................................28
vi
2.2.1.3 Fases de la micropropagación ..................................................................28
2.2.1.4 Factores que garantizan el éxito del cultivo .............................................29
2.2.1.5 Problemas asociados con el cultivo in vitro de tejidos vegetales .............30
Capítulo 3 ................................................................................................................................................................ 32
3. Conceptos asociados a la regeneración vegetal ....................................32
3.1 Totipotencia celular: el dogma de la biología vegetal ..........................................32
3.2 Células madre vegetales .......................................................................................34
3.3 Células pericíclicas y similares a las pericíclicas ................................................37
3.4 Las diversas estrategias de regeneración vegetal..................................................38
3.4.1 Organogénesis directa .....................................................................................41
3.4.1.1 De raíz a brote ...........................................................................................43
3.4.1.2 De brote a raíz ..........................................................................................44
3.4.2 Organogénesis indirecta ..................................................................................45
3.4.2.1 El origen del callo .....................................................................................46
3.4.2.2 Características y organización celular del callo ........................................47
3.5 Diferenciación celular ............................................................................................48
3.5.1 Desdiferenciación ............................................................................................50
3.5.2 Transdiferenciación .........................................................................................50
3.6 Fases intermedias de la regeneración vegetal ........................................................51
vii
3.6.1 Adquisición de competencias para la regeneración ........................................53
3.6.2 Formación de células progenitoras .................................................................55
3.6.3 Destino celular y patrones de desarrollo ................................................................... 56
4. Resumen y Análisis .................................................................................59
5. Conclusiones ...........................................................................................62
6. Bibliografía ..............................................................................................63
viii
Lista de tablas y figuras
Tabla 1. Panorama de los aportes de métodos bioquímicos y marcadores moleculares
para la comprensión de embriogénesis somática ...........................................................................14
Figura 1. Organización basal en los tejidos y órganos durante la embriogénesis de
Arabidopsis thaliana ............................................................................................................................................................ 18
Figura 2. Estructura morfológica d la raíz de Arabidopsis .................................................................. 20
Figura 3. Modelo simplificado de la ruta de señalización .................................................................. 23
Figura 4. Modelo de percepción y transducción de señales en células vegetales ..................... 24
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Resumen
Título: Actualización de los conceptos asociados con la regeneración celular en plantas
Autor: Natali Rueda Chacón
Palabras clave: totipotencia, diferenciación, regeneración, in vitro
Descripción:
En una edición especial de la revista Science "¿Que no sabemos?", dedicada a las 25
preguntas más importantes que enfrentan los científicos de todas las disciplinas, una de las cuales
fue: ¿cómo se forma una planta completa a partir de una célula somática? La respuesta se puede
encontrar en la teoría de la capacidad totipotente de las células vegetales. La cual establece que
todas las células somáticas de la planta poseen la capacidad de regenerar una planta completa. En
contraste con esta teoría aceptada, recientes artículos científicos sobre la regeneración vegetal
indican que: (i) las células vegetales regeneradas a partir de tejido dañado parecen no
desdiferenciarse, (ii) los callos son un tejido organizado y diferenciado, (iii) los callos no se forman
a partir de cualquier tipo de célula somática sino predominantemente a partir de una población
especializada de células madre adultas.
Estos resultados indican que nuestra visión actual de la regeneración vegetal necesita un
reanálisis crítico. Por esta razón, se hace necesario contar con una revisión actualizada que permita
sintetizar los últimos conceptos relacionados con la regeneración celular que ayude a responder a
las preguntas fundamentales que se hace la biología del desarrollo vegetal.
x
Tras una revisión exhaustiva de las últimas publicaciones realizadas en esta área, en los
últimos 18 años, se puede concluir que no todas las células somáticas de la planta son totipotentes.
y que la mayoría de los procesos de regeneración celular observados se dan a partir de células
madre meristemáticas y células no meristemáticas con cualidades similares a las de las células
madre. Es por esto que las investigaciones realizadas en el campo del cultivo in vitro de tejidos
vegetales a nivel nacional y regional, deben, no solo tener en cuenta estos nuevos concepto, sino
también aportar a los avances en el área de la biotecnología.
xi
Abstract
Title: Updating concepts associated with cell regeneration in plants
Author: Natali Rueda Chacón
Keywords: totipotency, differentiation, regeneration, in vitro
Description:
In a special edition of Science “what we don’t know?” dedicated to the 25 most important
questions that scientists of all disciplines faced at the time, one of them was: “How does a single
somatic cell from an adult plant?” the answer can be found in the theory of plant totipotency. This
theory established that any somatic cell has the ability to regenerate into an adult plant. in contrast
to this wildly accepted concept, recent research on plant regeneration has reported that: (i) cells
that regenerate from an injured tissue don’t seem to have gone through dedifferentiation (ii) Callus
are an organized and differentiated tissue, (iii) Callus don’t form from any type of somatic cell but
predominantly, from a specific group of specialized adult stem cells. These results indicate that
our view of plant regeneration needs a critical reanalysis.
That is why there’s a need for a thorough review that allows the synthesis of the latest
concepts related to plant regeneration, which could help give answers to fundamental questions of
developmental plant biology.
After an exhaustive review of the publications made in the last 18 years, it is possible to
conclude that not all somatic cells are totipotent and that most of the process of regeneration on
xii
plants are carried away by meristematic stem cells and by a group of non-meristematic cells that
have similar qualities to stem cells. The understanding of the molecular mechanisms through
which plants regenerate is crucial for the advances of plant biotechnology. It is why the research
that is done at a national and regional level, should not only take into account these new concepts
but also contribute to the advances in this area of biotechnology.
2
Introducción
En una edición especial de la revista Science "¿Que no sabemos?", dedicada a las 25
preguntas más importantes que enfrentan los científicos de todas las disciplinas, una de las cuales
fue: ¿cómo se forma una planta completa a partir de una célula somática? (Vogel, 2005). La
respuesta se puede encontrar en la capacidad totipotente de las células vegetales, concepto
pionero propuesto por Schwann y Schleiden en 1938. Dicha teoría establece que las células son
autosuficientes y que en principio son capaces de regenerar una planta completa (Pierik, 1990).
No fue hasta 1902 que el botánico alemán, Gottlieb Haberlandt, realizó los primeros intentos
para probar dicha teoría. A pesar de que sus experimentos iniciales no dieron frutos, logró
plantear varios postulados y principios que impulsaron el estudio del cultivo in vitro de tejidos
vegetales. Con el paso del tiempo los postulados de Haberlandt han sido confirmados
experimentalmente, y por lo tanto se le considera como el padre del cultivo de los tejidos
vegetales. (Bhojwani & Dantu, 2013)
A pesar de los grandes avances que se realizaron en el cultivo in vitro de tejidos vegetales
durante todo el siglo XX, el enfoque de la investigación se centró en la formulación de medios de
cultivo, generación de técnicas de cultivo exitosos para una gran número de especies, técnicas de
conservación de germoplasma, entre otros. Mientras que las evidencias presentadas para apoyar
los conceptos de totipotencia, dediferenciación celular y otros aspectos fundamentales del
desarrollo y regeneración vegetal, permanecieron limitados en su mayoría a observaciones
morfológicas descriptivas. En 2001, Abraham D. Krikorian hablaba de un cambio en el énfasis
de las investigaciones modernas acerca de los problemas relacionados con el desarrollo vegetal.
3
Krikorian plantea que “se deben estudiar los mecanismos de control molecular y bioquímico, en
vez de los aspectos fenomenológicos o descriptivos, que ya están pasados de moda” debido a que
las aproximaciones fenomenológicas son limitadas y dejan pocas enseñanzas. (Perea, 2001)
Actualmente la mayoría de los libros de botánica nos enseñan que las células vegetales
son totipotentes, y que después de una herida o al cultivarse, estas generan una masa celular
indiferenciada llamada callo, de la cual se forma un nuevo brote o raíces; requiriendo que las
células se desdiferencien para lograr la regeneración de una nueva planta. En contraste con esta
teoría aceptada, recientes artículos científicos sobre la regeneración vegetal indican que: (i) las
células vegetales regeneradas a partir de tejido dañado parecen no desdiferenciarse, (ii) los callos
son un tejido organizado y diferenciado, (iii) los callos no se forman a partir de cualquier tipo de
célula somática sino predominantemente a partir de una población especializada de células
madre adultas. (Atta et al., 2009). Aunque estos nuevos resultados no necesariamente indican
que la regeneración vegetal nunca ocurre a partir de células diferenciadas, que nunca ocurra
dediferenciación en el camino hacia la regeneración, o que los callos siempre son diferenciados.
Si indican que nuestra visión actual de la regeneración vegetal necesita un re análisis crítico
(Sugimoto, Gordon, & Meyerowitz, 2011).
Por esta razón, se hace necesario contar con una revisión actualizada que permita
establecer y clarificar las definiciones de los conceptos más importantes en el área de la
regeneración celular en plantas, que permitan entender los nuevos mecanismos que forman parte
de estos procesos revisando los avances investigativos más importantes publicados en los últimos
años para así establecer un panorama sobre el estado actual de nuestra comprensión actual y lo
que aún nos falta por vislumbrar; ya que, el entender los mecanismos de regeneración celular
puede responder preguntas fundamentales en relación con los mecanismos moleculares y
4
celulares de la reprogramación de las células vegetales. El descubrimiento de nuevos reguladores
que permitan potencializar el cultivo de especies de plantas recalcitrantes o aumentar la
eficiencia de la regeneración, también puede motivar al cultivo de cultivos verdes
(Radhakrishnan et al., 2018)
Con el objetivo de generar el estado del arte de los conceptos de regeneración celular en
plantas se realizó la revisión bibliográfica de documentos publicados entre el año 2000 y el año
2018 para así llegar a detallar los procesos de regeneración en tejidos meristemático y no
meristemático, teniendo en cuenta los factores exógenos y endógenos que ejercen control sobre
estos procesos celulares.
Esto permitirá tener una compilación de los conceptos de regeneración celular vegetal
que han sido estudiados en los últimos 18 años que facilitara a los estudiantes e investigadores de
Biotecnología vegetal que lleguen a leerla actualizar estos conceptos y posiblemente lleve a la
apertura de nuevas ramas de investigación con la posibilidad de aportar a los avances científicos
en esta área de la biología vegetal.
5
Capítulo 1.
Técnicas biotecnológicas utilizadas en el estudio de la regeneración vegetal
Los organismos multicelulares sean plantas superiores o animales se originan de una
célula cigótica, la cual sufre divisiones mitóticas y presenta diferenciación celular. Las células
vegetales retienen el potencial de revertirse a un estado meristemático y formar nuevas plantas al
ser expuestas a condiciones favorables, independientemente de su tipo de especialización celular
o su nivel de ploidía (haploide, diploide, triploide). La potencialidad de células diferenciadas y
especializadas de formar plantas completas como un zigoto se define como totipotencia celular
(Bhojwani & Dantu, 2013). Este término fué acuñado probablemente por T.H Morgan(1901)
pero fué Haberlandt (1902) quien introdujo el término totipotencia celular y consideró que las
células de la plantas diferenciadas deberían ser capaces de regenerar una planta completa si
poseía todos los cromosomas completos. Concepto que ha sido retomado actualmente por los
investigadores del desarrollo vegetal como la habilidad de una célula de pasar por todas las
etapas de desarrollo y generar un organismo adulto completo (Sugimoto, et al., 2011)
El cultivo in vitro de tejidos es un sistema ventajoso para estudiar diferentes procesos de
la fisiología celular y desarrollo de las plantas debido a las condiciones controladas del cultivo se
facilita el monitoreo de los efectos que ejercen varios factores tales como medios de cultivo,
temperatura luz, humedad y tipo de planta (Buenavista, 2010). Para comprender a la luz de las
nuevas investigaciones relacionadas con la biología del desarrollo vegetal, cuales son los
mecanismos que causan regeneración de las plantas es necesario contextualizar a nivel teórico e
histórico el constructo conceptual y metodológico que ha conducido a explicar la enorme
interacción entre los factores endógenos y exógenos que causan crecimiento y desarrollo
celular.
6
En el presente capítulo se pretende mostrar un breve recuento histórico de cómo la
técnica de cultivos de tejidos junto con el avance de las herramientas empleadas en biología
molecular han sido catalizadores en la comprensión de los procesos de regeneración vegetal.
El Cultivo in vitro de tejidos vegetales hace referencia al proceso de colocar un
“explante” o parte de una planta en contenedores específicos de vidrio o plástico con la adición
de nutrientes, reguladores de crecimiento y un grupo de vitaminas tales como tiamina,
piridoxina; los cuales crecen en condiciones controladas como temperatura, luz, humedad, pH
y en condiciones de estricta asepsia.
Con el planteamiento de la teoría celular en 1838 por Schleiden y Schwann se afirmó que
las células son autosuficientes y capaces de generar una planta completa, fenómeno conocido
como totipotencia celular, dicho concepto creó las bases para el establecimiento del cultivo de
tejidos y células in vitro (Pierik, 1990). Los primeros intentos para probar la teoría de la
totipotencia, fueron realizados por G. Haberlandt cuando cultivó en una solución nutritiva de
Knop, células diferenciadas de Lamium purpureum, Eichhornia crassipes, Pulmonaria
mollissima y Tradescantia spp; las células lograron sobrevivir durante un mes y aunque
aumentaron de volumen no lograron dividirse. Sus ensayos le permitieron plantear en 1902
varios postulados y principios del cultivo de tejidos vegetales a saber: (a) las células en el cuerpo
de la planta dejan de crecer una vez han adquirido sus características requeridas por el organismo
completo sin perder su totipotencia inherente para un crecimiento adicional y (b) eran capaces de
reanudar su crecimiento al ser expuestas a los estímulos correctos. Propuso además la posibilidad
de obtener embriones a partir de células somáticas; por lo anterior se le considera el padre del
cultivo de los tejidos vegetales al haber sido confirmados sus postulados de manera experimental
(Cañas, 1993).
7
Se inician los primeros ensayos para probar el comportamiento de diferentes explantes
para la regeneración in vitro, en 1922 Kotte y Robbins sugirieron que las células meristemáticas
en los brotes apicales y radiculares posiblemente podría ser usadas para iniciar cultivos in vitro,
su cultivo de raíces poco exitoso abrió puertas a nuevos estudios en el cultivo de tejidos
vegetales. White, en 1932 cultivó raíces de tomate en un medio de cultivo que contenía sales
inorgánicas, extracto de levadura y azúcar; la levadura se reemplazó por las vitaminas del
complejo B (piridoxina, tiamina y ácido nicotínico) obtuvo su crecimiento por varios años
mediante subcultivos periódicos, por ello se le considera el creador del primer medio sintético.
Se continúa la búsqueda de mejorar lo medios de cultivo, así el descubrimiento de las auxinas
(Kogl et al. 1934 citado por Bhojwani & Dantu, 2013) y el reconocimiento de la importancia de
las vitaminas B en el crecimiento vegetal (White, 1939), impulsa la formulación de diferentes
tipos de medios y la respuesta de diversos explantes en ellos. Gautheret en 1939 obtuvo plantas
con crecimiento continuo a partir de cambium de raíces de zanahoria usando ácido indolacético y
vitamina B. White y Nobécourt en éste mismo año obtuvieron callos a partir de tejido tumoral
del híbrido Nicotiana glauca x Nicotiana langsdorffii y zanahoria respectivamente. Ball 1946
obtuvo plantas completas a partir de meristemos apicales de Lupinus y Tropaeolum. Jabloski y
Skoog en 1954 demostraron el papel del extracto de levadura en la inducción de la división
celular en células maduras de tabaco. Miller et al 1955, descubrieron las citoquininas naturales y
sintéticas, la disponibilidad de éstas hormonas fue fundamental para garantizar el desarrollo del
cultivo de tejidos. Skoog y Miller en 1957 manipularon diferentes concentraciones de auxinas y
citoquininas en el medio de cultivo, con sus ensayos demostraron la regulación química de la
organogénesis en cultivos de tabaco, así, altas concentraciones de auxinas estimulaban el
enraizamiento y elevados niveles de citoquininas favorecieron la diferenciación de los
8
meristemos. (Kirakosyan & Kaufman, 2009). Murashige y Skoog en 1962 formularon el medio
de cultivo MS ampliamente usado en el cultivo in vitro de tejidos vegetales. Se encontró otra
forma de regeneración vegetal diferente a la embriogénesis cigótica, a partir del hallazgo de
embriones somáticos en cultivo de raíces de zanahoria realizadas por Reinert y Steward et al en
1958 (Pierik, 1990). Morel en 1960 descubre el potencial de los meristemos como método para
la propagación clonal rápida y producción de plantas genéticamente idénticas libres de virus con
el cultivo de meristemos de orquídea. Por ésta época los métodos para el cultivo in vitro estaban
razonablemente bien desarrollados y se dió comienzo al aislamiento de un amplio número de
protoplastos, mediante el uso de filtrados del hongo Myrothecium verrucaria para romper la
pared celular. Para 1968 Takebe et al. utilizaron enzimas comerciales (celulosa y macero
enzima) para aislar protoplastos a partir de células del mesófilo de tabaco. En 1970 Takebe et al
y Nagata y Takebe 1971 demostraron la totipotencia de los protoplastos. Backs-Hüsemann y
Reinert en 1971 obtuvieron embriones a partir de células somáticas individuales de zanahoria lo
que apuntó a considerar la embriogénesis somática como el método de clonación rápida para ser
explotado comercialmente, porque estos embriones podrían ser convertidos en semillas sintéticas
a través de la encapsulación en sustancias biodegradables para el sembrado directo en campo. La
micropropagación tuvo entonces un gran auge pero inherente al proceso aparecieron
variaciones en la ploidía, morfología, pigmentación e índices de crecimiento de los cultivos
vegetales, pero fueron Heinz y Mee en 1971 quienes publicaron el primer reporte sobre la
variación morfológica en híbridos de caña de azúcar. Larkin y Scowcroft 1981 introdujeron el
concepto de variación somaclonal que sirvió de punto de partida para estudiar y aislar
variaciones útiles en cuanto a rendimiento, resistencia a enfermedades y contenido de azúcar en
Saccharum spp y otros cultivos de interés. Evans et al en 1984 introdujeron el término
9
gametoclones para las plantas regeneradas a partir de células gaméticas, varios somatoclones y
gametoclones han sido lanzados al mercado como cultivares mejorados (Buenavista, 2010).
Paralelamente a los avances mencionados en el área de tejidos vegetales, entre 1940 a
1953 fue fundamental el nacimiento de la biología molecular como disciplina (Senior-Martinez,
2016). El descubrimiento de la estructura del DNA por Watson y Crick en 1953 se constituyó en
el punto de partida para el desarrollo de la ingeniería genética en los años setenta, lo que hoy se
conoce como nueva o moderna biotecnología (Azcón-Bieto & Talón, 2013) .Así en 1950 Braun
demostró el gen Ti en Agrobacterium tumefaciens era transferido al genoma de las plantas de
manera natural, que después fue considerado como el agente causante de la formación de
“agalla de corona” en algunas plantas. La ingeniería genética por medio de la biotecnología
agrícola empezó a ofrecer nuevos elementos de análisis a nivel de moléculas, células y tejidos
para comprender mejor las características agronómicas y por consiguiente su manipulación. El
desarrollo de procesos de restricción (Aber y Linn, 1969 citado por Azcón-Bieto & Talón, 2013);
el aislamiento de plásmidos y su caracterización fueron conjugados para establecer dos sistemas
para introducir genes: (a) de transferencia directa por técnicas de micro inyección o bombardeo
de partículas y (b) la transferencia mediada por bacterias.) La ingeniería genética se aplica desde
entonces para obtener plantas tolerantes a virus, patógenos e insectos, resistentes a herbicidas y
mejor calidad nutricional. La tecnología del ADN recombinante, uso de endonucleasas de
restricción, clonación de vectores, técnicas de secuenciación y expresión de proteínas se amplió
no solo en las plantas sino también para propósitos medicinales. En plantas se intensificó la
obtención de metabolitos secundarios como en el caso de la vainilla (Roca, 1991; Schwab et al.,
2018).
10
En las últimas décadas se ha realizado un acelerado progreso en la comprensión del
proceso de desarrollo de las plantas gracias a la identificación de genes que juegan un papel
crítico en los procesos de regulación del crecimiento, la diferenciación celular y patrones de
desarrollo. Esto ha sido posible en gran medida a los estudios realizados en Arabidopsis thaliana,
pero además varios descubrimientos importantes también han sido producto del estudio de otras
especies como Antirrhinum, maíz, petunia, tomate y tabaco. En la mayoría de los casos, los
genes de importancia para el desarrollo fueron revelados por medio de estudios elaborados en
plantas mutagénicas que permitieron encontrar individuos con procesos de desarrollo alterados,
involucraron esfuerzos heroicos para mapear, clonar y secuenciar el gen mutante.
Por consenso internacional Arabidopsis thaliana desde 1980 se seleccionó como planta
modelo para estudios de biología molecular, bioquímica y estudios de transformación genética
pero especialmente para entender los mecanismos moleculares que gobiernan la embriogénesis
somática. Ha sido la primera planta que ha tenido la secuenciación completa. (Taiz & Zeiger,
2002). Arabidopsis thaliana de la familia Brassicaceae se caracteriza por producir millones de
semillas, de tiempo generacional corto, expresar rasgos homocigotos recesivos en la primera
generación que facilitó los estudios de mutagénesis química. El genoma de Arabidopsis thaliana
está organizado en cinco cromosomas, contiene un estimativo de 20,000 genes (Rounsley et al,
1996, citado por Taiz & Zeiger, 2002). Las secuencias codificadoras constan de 5 Kb en
promedio y la secuencia completa tiene alrededor de 100,000 Kb, el 6 % del genoma codifica
RNA ribosomal y el otro 2 % tienen altas secuencias repetitivas, un factor efectivo para
identificar genes representativos relacionados con el desarrollo de estructuras vegetales.
Arabidopsis thaliana desde entonces ha sido utilizada en estudios enfocados en: (a)
creación de mutantes bien por mutagénesis química e insercional que afectaban funciones
11
fundamentales de los meristemos hasta obtener extensas colecciones de mutantes,(b) cruces e
introducción de DNA en plantas transformadas,(c) mapeo de cromosomas,(d) marcadores
moleculares los cuales quedaron disponibles en fuentes de información de Arabidopsis (TAIR)
(Bahadur, Rajam, Leela, & Krishnamurthy, 2015). Estos ensayos pioneros de los niveles de
expresión de Arabidopsis thaliana(Schmid et al., 2005) han permitido que recientemente se
utilicen para estudiar señales de adaptación entre especies intergenéricas (Yant & Bomblies,
2017), para identificar secuencias de genes conservadas en el desarrollo vegetal en plantas de
interés agrícola, (Trevaskis, 2018) e identificar los genes implicados en el ciclo de la vida
(Hays, 2002), así como, la comprensión de los fenómenos epigenéticos en la naturaleza
(Schmitz & Ecker, 2012).
Los estudios de transformación mediados con Agrobacterium tumefaciens facilitaron la
obtención de miles de líneas transgénicas con inserciones T-DNA aleatorio depositados en
centros stock público. Los mutantes obtenidos se enfocaron en estudiar los fenómenos de
gametogénesis, formación de semillas, desarrollo de raíces y hojas, florecimiento, senescencia,
metabolismo y vías traductoras de señales. El análisis genético y molecular de Arabidopsis
thaliana ha permitido aclarar también diversas rutas metabólicas tales como: vía señal del
etileno, hormona receptora en plantas, síntesis de brasinoesteroides, comprensión de la
bioquímica de esteroides importantes para la salud humana , identificación de receptores y
señales que componen el fototropismo y ritmos circadianos, acción de los fitocromos, genes
reguladores del florecimiento en plantas, avances en la bioquímica y biología celular del
transporte de iones y ácidos grasos para la biosíntesis de la pared celular y mantenimiento de
los cloroplastos, así como en la comprensión de la embriogénesis somática (Meinke et al.,
1998; Teyssier & Guérin, 2016).
12
Sin embargo los estudios se han ampliado también en otras plantas para conocer el papel
de la expresión de los genes asociados con el desarrollo vegetal como maíz, algodón, avena, loto
y agave (Borji,et al., 2017; Cervantes-Pérez et al., 2018; Guo et al., 2017; Long et al., 2018; Ma
et al., 2018; Nanda & Melnyk, 2017).
Diversas herramientas bioquímicas, citogenéticas y moleculares han sido ampliamente
desarrolladas para contribuir en el avance de la comprensión de las técnicas de regeneración in
vitro, entre ellas la embriogénesis somática como una de las vías de regeneración de plantas a
partir de células selectas aplicables al mejoramiento de las plantas.
Un breve resumen de los aportes dados por el uso de éstas herramientas se muestran la
tabla 1.
Por todo lo anteriormente expuesto el cultivo de tejidos vegetales tiene actualmente una
enorme contribución en la micropropagación de ornamentales y especies forestales, producción
de componentes de interés farmacéutico, en el entrecruzamiento de plantas, incremento del valor
nutricional de los cultivos. Con apoyo de la biotecnología se aprovecha la producción de
haploides, variación somaclonal para seleccionar rasgos deseables, creación de variantes
genéticas, control de la polinización, establecimiento de bancos de germoplasma para la
conservación genética de especies de interés alimenticio, ornamental y plantas libres de virus
(Anis & Ahmad, 2016; García-Águila, Feria, & Autor, 2007; Huylenbroeck, 2018).
Las herramientas empleadas en cultivo in vitro y la biología molecular han servido para
impulsar la producción de cultivos de interés alimenticio, industrial y agrícola. Las
investigaciones deben procurar encaminarse a comprender los mecanismos de regeneración
vegetal para de esta manera se puedan tener plantas adaptadas a las condiciones ambientales y
necesidades alimenticias de la humanidad.
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Tabla 1. Panorama histórico de algunas de las técnicas moleculares y bioquímicas
empleadas, con énfasis en el papel de Arabidopsis thaliana en la comprensión de la
regeneración de plantas (Bhojwani & Dantu, 2013).
A pesar de los enormes avances moleculares y genéticos y a pesar de que se conoce con
claridad que codifican factores de transcripción y varias de las características específicas de
estos genes , su papel sigue siendo investigado para enlazarlo con secuencias específicas de
ADN y el control que ejerce sobre otros genes o vías de señalización si se complementan con
análisis clonales, estudios celulares, fisiológicos y/o bioquímicos. Con todo lo anterior estos
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avances han permitido identificar principios importantes en el desarrollo de las plantas y a pesar
de que estamos lejos de comprenderlos totalmente, hasta el momento se ha podido llegar a
afirmar que: (a) La expresión de genes que codifican factores de transcripción determina la
identidad de la célula, del tejido o del órgano, (b)el destino celular es determinado por su
posición y no por su historial clonal, (c)las vías del desarrollo están controladas por redes de
genes interactivos, (d)el desarrollo es regulado por la señalización intercelular.
15
Capítulo 2
Multiplicación vegetal
En principio las plantas se pueden multiplicar de dos maneras: de forma generativa
(sexualmente, por semilla) y de forma vegetativa (asexual) (Pierik, 1990).
La reproducción sexual se inicia con la unión de células espermáticas y la célula huevo
que forman un cigoto inicia un proceso de embriogénesis hasta formar un embrión que
formará la planta completa. A diferencia de los animales, el desarrollo embrionario en plantas
no se detiene una vez el embrión se ha convertido en el cuerpo adulto de la planta. Las plantas
poseen la habilidad de desarrollarse pos embrionariamente, gracias a la capacidad regenerativa
de los meristemos. Esto les permite reparar o regenerar tejidos dañados y mantener la elongación
y engrosamiento de su cuerpo.
La multiplicación vegetativa, puede ocurrir tanto in vivo como in vitro. (Azcón-Bieto &
Talón, 2000). La multiplicación vegetativa in vivo, puede darse a partir de esquejes, división,
acodos, distintos tipos de injertos. Por otro lado la multiplicación vegetativa in vitro, se realiza en
un ambiente controlado con la siembra de explantes en medios de cultivo nutritivos
suplementados con hormonas de crecimiento vegetal, que permiten regenerar plantas completas.
En el presente capítulo se presenta una visión general de los procesos de multiplicación de las
plantas, con un enfoque especial en el cultivo in vitro de tejidos vegetales.
16
2.1 Multiplicación sexual de plantas superiores
La multiplicación sexual de las plantas superiores se realiza por vía embriogénesis
cigótica. La embriogénesis comienza con la unión de un espermatozoide y un óvulo, lo cual
forma una única células denominada cigoto. Tras la fertilización se inician tres procesos de
desarrollo adicionales: desarrollo del endospermo, raíz y fruto.
2.1.1 Embriogénesis cigótica
La embriogénesis transforma al cigoto en una planta embrionaria, microscópica,
multicelular. Un embrión completado tiene el plan básico del cuerpo de la planta madura y varios
de los tejidos del cuerpo adulto, aunque se encuentran en forma rudimentaria. La embriogénesis
ocurre en el saco embrionario del óvulo mientras que el óvulo y estructuras asociadas se
convierten en raíz.
El desarrollo de la embriogénesis y el endospermo usualmente ocurre de forma paralela
con el desarrollo de la semilla y el embrión es parte de la semilla. El endospermo también puede
considerarse como parte de la semilla madura, pero en algunas especies el endospermo
desaparece antes de que el desarrollo de la semilla sea completado.
Cuando este proceso de desarrollo culmina, tanto la semilla, como el embrión alojado en
su interior se inactivan y son capaces de sobrevivir por largos periodos de tiempo si las
condiciones no son favorables para su crecimiento, así, la habilidad de formar semillas es clave
para el éxito evolutivo de las plantas. El hecho de que el cigoto genere un embrión organizado
con una estructura predecible y específica para especies nos dice que el cigoto está
genéticamente programado para desarrollarse de una manera particular y que la división celular,
17
la expansión celular y la diferenciación celular son controladas durante la embriogénesis. Si estos
procesos llegaran a ocurrir de forma aleatoria en el embrión, el resultado sería una masa de
células desordenadas sin una forma o función definida.
La embriogénesis establece las características esenciales de la planta adulta. La
embriogénesis vegetal difiere con el proceso de desarrollo en animales , pues estos en la
mayoría de los casos, no generan tejidos y órganos posterior a su desarrollo embrionario , pero
en las plantas adultas si es posible regenerar órganos de forma directa. Se conoce que durante la
embriogénesis en las angiospermas se forma un cuerpo rudimentario, que típicamente consiste de
un axis embrionario y dos cotiledones (si es una planta dicotiledónea)(figura 1.) no obstante, la
embriogénesis establece los dos patrones básicos de desarrollo, los cuales persisten y pueden
verse fácilmente en la planta adulta. (i) El patrón de desarrollo axial apical y basal y (ii) El
patrón radial de los tejidos encontrado en tallos y raíces. La embriogénesis también establece a
los meristemos primarios.
La mayoría de las estructuras que conforman a la planta adulta son generadas tras la
culminación de la embriogénesis mediante la actividad de los meristemos. Aunque estos
meristemos primarios son establecidos durante la embriogénesis, solo se activan tras la
germinación de las semillas para iniciar la generación de órganos y tejidos de la planta adulta.
18
Fig. 1 La organización apical basal en los tejidos y órganos en el embrión de
Arabidopsis. Se establecen de manera temprano. El diagrama ilustra cómo los órganos de la
planta son originados a partir regiones específicas del embrión. (Tomado de Taiz y Zeiger,
2003)
2.1.1.1 Meristemos primarios y secundarios
Los meristemos son una pequeña población de células isodiamétricas, es decir que poseen
dimensiones iguales en todos sus lados, que poseen características embrionarias. No solo
producen los tejidos que formarán el cuerpo de la raíz y el brote, sino que también se regeneran a
sí mismos continuamente. Un meristemo puede retener sus características embrionarias
indefinidamente, hasta por miles de años en el caso de los árboles.
La razón de esta habilidad es que algunas células meristemáticas no están comprometidas
a un destino celular específico y son consideradas indiferenciadas. Estas células retienen la
19
capacidad de dividirse mitóticamente siempre y cuando el meristemo mantenga su estado
vegetativo.
Los meristemos basales y apicales formados durante la embriogénesis son llamados
meristemos primarios. Después de la germinación, la actividad de estos meristemos primarios
genera los tejidos y órganos primarios que constituyen el cuerpo primario de la planta.
La mayoría de las plantas desarrollan una variedad de meristemos secundarios durante el
desarrollo pos embrionario. Los meristemos secundarios pueden tener una estructura similar a la
de los meristemos primarios. Se considera como meristemos secundarios a los meristemos
axilares, de inflorescencia, meristemos intercalares y los laterales (cambium vascular y
procambium).
En las secciones transversales del cuerpo primario la planta se destaca un patrón de
distribución semejante al de la planta adulta. En las raíces el sistema fundamental adyacente al
sistema vascular parece separada del córtex por un cilindro de celdas especializadas (Periciclo),
que mantiene la actividad meristemática (Figura 2) (Taiz y Zeiger, 2003).
20
Figura 2. Estructura morfológica de la raíz de Arabidopsis thaliana, se aprecia el patrón
de organización del tejido y la presencia del periciclo (Epidermis, Córtex, Endodermis, periciclo)
(Tomado de Taiz y Zeiger, 2003).
2.1.2. Reguladores de crecimiento vegetal
Las hormonas se pueden forman en diversas células y tejidos de la planta, aunque no
todas presentan la misma capacidad para sintetizarlas. Los principales lugares de biosíntesis son
los ápices meristemáticos de tallos y raíces, primordios de órganos vegetativos o reproductivos y
semillas en desarrollo.
Las hormonas son compuestos orgánicos sintetizados por las plantas superiores influyen
en el crecimiento y desarrollo; actúan en lugares diferentes de donde se producen, son activas en
pequeñas cantidades. Según Azcón, define las hormonas como: “un grupo de sustancias
orgánicas, sintetizadas en las plantas, que tienen la capacidad de afectar a los procesos
fisiológicos en concentraciones mucho más bajas que los nutrientes o las vitaminas. El control de
la respuesta hormonal se lleva a cabo en la concentración y la sensibilidad de los tejidos a las
hormonas” (Azcón-Bieto, 2013)
Existen en forma natural y forma sintética. Se les atribuye la función de distribuir los
compuestos que la planta biosintetiza. Pierik, 1990. Existen cinco categorías de Fito
reguladores: Auxinas, citoquininas, Giberelinas, ácido abscísico y etileno (Cañas, M 1993);
recientemente se han identificado otras sustancias que juegan papel en el desarrollo o el fenotipo
de mutantes, incluyen Brasinoesteorides, oxipilinas, poliaminas, salicilatos, oligopéptidos y
óxido nítrico.
21
2.1.2.1. Auxinas
Fueron las primeras hormonas vegetales descritas y estudiadas, descubiertas por Darwin
en 1837. Fueron aisladas en 1928 por Went. Han sido de gran interés en diversas investigaciones
por estar implicadas en el control que ejercen sobre el crecimiento. Producen alargamiento y
agrandamiento celular y promueven la división celular. Implicadas en el alargamiento de la
membrana celular, juegan papel importante en la dominancia apical, los tropismos, procesos de
diferenciación y otros eventos fisiológicos. La auxina natural más conocida y usada en cultivo in
vitro es el ácido indol acético (AIA) y las sintéticas como el ácido 2,4 -diclorofenoxiacético(2,4
D), el ácido naftalenacético ( ANA) y el ácido indolbutírico (AIB). Producen elongación celular
y expansión de los tejidos, división celular (formación de callo) y formación de raíces
adventicias, inhibición de la formación de vástagos axilares y adventicio y frecuentemente
embriogénesis en los cultivos en suspensión. Bajas concentraciones de auxina en el medio
predominan la formación de raíces adventicias. (Pierik, 1990). Se ha encontrado que en algunos
casos la adición de auxinas al medio basal puede ser suficiente para iniciar y sustentar el
crecimiento. (Krikorian, 1991; Pierik, 1990; Cañas, 1993). Actualmente se ha demostrado por
amplios estudios que el 2-4 D es la auxina más utilizada por su fuerte actividad, contribuye no
sólo a la eficiencia de la embriogénesis somática sino que también induce estrés. Se ha
corroborado de que la mitad de los factores de transcripción están relacionados con el estrés que
ocasiona el 2-4 D durante la iniciación de la embriogénesis somática en Arabidopsis thaliana
(Fher, 2017). La concentración endógena de auxinas en el explante es de gran importancia, el 2-
4D es la auxina más significativa en la morfogénesis de la planta; así explantes con altos niveles
endógenos de auxinas muestran una mayor inducción generalmente a la respuesta in vitro.
22
2.1.2.2 Citoquininas
La primera citoquinina aislada fue la Zeatina por Miller en 1961. Poseen una alta
actividad sobre la división celular y retrasan la senescencia en los órganos vegetales. Existen
citoquininas sintéticas que se derivan de la adenina, la más empleada es la Kinetina, la
benciladenina y la furfuriladenina. También se encuentran en extractos naturales como la leche
de coco, extracto de malta y la levadura e incluso en el ADN degradado por la temperatura del
cual se aisló la 6-(Furfuril)-purina o Kinetina. Han recibido mucha atención como sustancias
estimuladoras de la división celular. En la planta induce la iniciación del crecimiento en tallos y
yemas, participa en el rompimiento del letargo de yemas y semillas. A nivel de cultivo de tejidos
son usadas para estimular el crecimiento, proliferación de tejidos a bajas concentraciones, para la
neo formación de yemas sobre callos y proliferación de meristemos axilares (Krikorian, 1991)
2.1.2.3 Mecanismos de acción de las hormonas vegetales.
El control hormonal es de tipo interactivo positivo o negativo entre los diferentes grupos
de hormonas. Las células responden a las señales hormonales mediante un sistema de
acoplamiento estímulo-respuesta que requiere el reconocimiento de la hormona por un receptor y
la utilización subsiguiente de una serie de moléculas capaces de transmitir la señal que activará
la respuesta. El conjunto constituye la denominada cadena de transducción de la señal hormonal
o ruta de señalización( Azcón – Bieto, 2013 ).La respuesta de las señales ocurre así: (a)
Percepción de la señal (primer mensajero) por parte de la célula, (b) generación y transmisión de
la señal (transducción), (c) activación de un cambio bioquímico (respuesta). Se puede apreciar
en la figura 4 el modelo simplificado de respuesta a las señales. El aislamiento y la clonación
23
genes mutados ampliamente utilizados actualmente constituyen un enfoque que conducen a la
identificación de la proteína receptora que causa la mutación cuya modificación originó el nuevo
fenotipo; la modificación provoca ausencia de respuesta en presencia de la hormona o respuesta
sin hormona. Los receptores identificados son proteínas quinasas ligadas a membranas como
proteínas solubles localizadas en el citoplasma, núcleo, o en ambas (Auxinas, giberelinas y
ABA)( Azcón-Bieto y Talón 2013) .
Fig 3. Modelo simplificado de la ruta de señalización por receptores proteína quinasa
RPK. La unión de la señal promueve la autofosforilación del dominio catalítico (DC) del
receptor. Seguidamente, este fosfato es transferido otra proteína, que queda fosforilada
Iniciándose una cadena de fosforilación de proteínas (cascada de proteínas quinasas) que
finalmente induce una respuesta (un factor de transcripción), que activa la transcripción de un
gen (Tomado de Azcón-Bieto ,2013)
24
De igual manera se ha encontrado que la cadena de transducción depende del tipo de
receptor. En el caso de que dicho receptor sea una quinasa (RPK) como se mencionó
anteriormente en la figura 3., la unión induce la actividad quinasa del receptor y la cadena de
transducción tiene lugar a través de una cascada de proteínas quinasas que se fosforilan
secuencialmente. Si los receptores se acoplan a proteínas G (GPCR) se debe activar la familia
de las GTPasas, la proteína G activa algunas proteínas efectoras , ciclasas y canales iónicos que
regulan producción de segundos mensajeros ; algunos de los segundos mensajeros pueden
activar proteínas quinasas específicas. Ver figura 4.
Fig. 4. Modelo de percepción y transducción de señales en células vegetales. Las
señales, incluidas las hormonas, pueden alterar las potencias de membrana, activar los
receptores o modificar las proteínas quinasas. En el modelo no se muestran los receptores
solubles ni la síntesis de segundos mensajeros (Tomado de Azcón-Bieto, 2013).
25
La integración de las metodologías in vitro, la biología molecular y la fisiología son
disciplinas fundamentales para dejar paso a conocimientos básicos para avanzar en el
conocimiento del desarrollo vegetal.
2.1.3 Diferenciación celular
La diferenciación es el proceso mediante el cual la célula adquiere sus propiedades
metabólicas, estructurales y funcionales que son distintas a las que presentan su célula
progenitora. (Azcón-Bieto. 2013)
En las plantas, en contraste con los animales, la diferenciación celular usualmente es un
proceso reversible, particularmente cuando las células diferenciadas son removidas de la planta y
colocadas en condiciones de cultivo in vitro. Bajo estas condiciones, las células pasan por un
proceso de desdiferenciación en el cual pierden su destino celular y reinician la división celular;
así en algunos casos, bajo las concentraciones apropiadas de nutrientes y hormonas de
crecimiento vegetal, es posible regenerar una planta completa (Taiz & Zeiger, 2002)
Esta habilidad de desdiferenciación demuestra que las células vegetales diferenciadas
poseen totipotencia. La única excepción a esta regla son las células que pierden su núcleo, como
por ejemplo, las células del floema y las células que mueren en su madurez, como las células del
xilema. (Taiz & Zeiger, 2002)
2.2 Multiplicación asexual en plantas
La multiplicación vegetativa in vivo (por esquejes, división, acodo, acodo alto y distintos
tipos de injertos), ha jugado un papel fundamental en la agricultura, y ha permitido durante
muchos años la multiplicación de especies de interés como lo son la papa, manzana, pera, plantas
26
ornamentales y plantas tuberculosas, cultivos leñosos claveles y crisantemos (Pierik 1990). La
reproducción vegetativa ha sido a su vez indispensable para los primeros procesos de mejora
vegetal.
A pesar de su amplio uso en la agricultura tradicional, los métodos clásicos de
reproducción in vivo resultan insuficientes para suplir las necesidades reales que exige el
mercado, ya que pueden llegar a ser muy lentos, complejos o costosos (Shahzad et al., 2016).
Con el desarrollo de las técnicas de cultivo in vitro de tejidos vegetales fue posible generar
plantas clonadas de forma mucha más rápida en comparación con la regeneración in vivo. Es por
esto que el cultivo in vitro de plantas se ha convertido en una de las metodologías estrella para la
multiplicación de plantas. (Shahzad et al., 2016,Pierik, 1990)
2.2.1 Cultivo in vitro de tejidos vegetales
El cultivo in vitro de tejidos vegetales es un término amplio que abarca el cultivo de
cualquier parte de la planta (células, tejidos u órganos) en un medio artificial, en condiciones
asépticas, y en ambiente controlado (Layola-Vargas & Ochoa-Alejo, 2018).
Una de las contribuciones más importantes del cultivo in vitro de tejidos vegetales es la
demostración de la capacidad única de las células vegetales de regenerar una planta completa,
vía organogénesis o embriogénesis, independientemente de la fuente del tejido utilizado (Raíz,
Hoja, Tallo, Partes florales, endospermo) y de su nivel de ploidía (haploide, diploide, triploide).
El cultivo in vitro permite explotar la totipotencia celular de las plantas para un gran
número de aplicaciones prácticas, y ofrece la posibilidad de mejorar cultivos, propagar plantas
clonadas (micropropagación), eliminación de virus (cultivo de meristemos apicales),
conservación de germoplasma, producción de fitoquímicos industriales, regeneración de plantas
transgénicas y fusión celular (Layola-Vargas & Ochoa-Alejo, 2018).
27
Dentro de las principales ventajas del cultivo in vitro de tejidos vegetales (i)La necesidad
de un tamaño pequeño del explante como material inicial (la porción utilizada para la
reproducción), (ii)la producción de múltiples plantas sin necesitar semillas o polinizadores, (iii)
la producción de plantas maduras en un espacio pequeño y en corto tiempo, (iv)cultivo que
minimiza la posibilidad de transmitir enfermedades, plagas o patógenos, (v) producción de
plantas a partir de semillas que poseen una proporción de germinación baja, (vi) permite la
regeneración de plantas completas a partir de células modificadas genéticamente, (vii) fácil
mantenimiento, movimiento y almacenamiento sencillo, independientemente de la estación o el
clima y finalmente esta técnica de reproducción vegetal se caracteriza por aumentar el
rendimiento y la calidad de los cultivos, lo que lleva a una posible disminución de costos los
producción en comparación con los métodos de reproducción tradicional. (Bhojwani & Dantu,
2013). Sin embargo, bajo ciertas condiciones la micropropagación puede llegar a ser más costosa
que los métodos de propagación convencional, y el costo por unidad es inasequible. Debido a
esto se resulta indispensable adoptar estrategias que permitan bajar los costos de producción para
reducir el costo individual de cada planta (Shahzad et al., 2016).
2.2.1.1 Micropropagación
La propagación clonal de plantas, se refiere a la multiplicación de individuos
genéticamente idénticos por medio de métodos de regeneración asexual a partir de tejidos
somáticos u órganos. Esta es una práctica común en la agricultura que permite conservar las
características deseables de genotipos o variables de interés comercial. Sin lugar a dudas la
micropropagación es una de las aplicaciones comerciales más utilizada en la actualidad en el
cultivo de tejidos vegetales, puesto que presenta una excelente herramienta para la multiplicación
28
sexual de especies que son reproducidas de forma asexual en la naturaleza. Adicionalmente, es
una buena alternativa para la multiplicación de plantas recalcitrantes.
Aunque el cultivo in vitro de tejidos vegetales puede ser aplicado para la
micropropagación de casi todas las especies vegetales, se recomienda solamente para aquellas
que son de importancia económica. Desde del punto de vista comercial, las plantas ornamentales
ocupan el primer lugar a nivel mundial (Villalobos, V.M y Thorpe T.A.1991)
2.2.1.2 Técnicas básicas de micropropagación.
La micropropagación puede ser alcanzada por medio de cuatro métodos, dependiendo de
la especie vegetal y las condiciones de cultivo: (1) Cultivo de yemas axilares (cultivo de
segmentos nodales), (2) Cultivo de meristemos apicales, (3) Regeneración directa o indirecta de
meristemos adventicios (organogénesis directa o indirecta) y (4) Por vía embriogénesis somática
(directa e indirecta) (Shahzad et al., 2016). Cada una de estas alternativas puede ser aplicada en
varias especies vegetales con diferente eficiencia dependiendo de sus características genéticas y
capacidad regenerativa, el medio de cultivo y las condiciones de incubación (Layola-Vargas &
Ochoa-Alejo, 2018).
2.2.1.3 Fases de la Micropropagación
El proceso de micropropagación presenta varias etapas que deben ser tenidas en cuenta
para asegurar la calidad y cantidad de plantas deseables: (a) Fase 0. Etapa preparatoria. La planta
madre debe tener un buen genotipo, higiene y estatus fisiológico, (b) Fase 1. Iniciación del
cultivo. Brotes axilares o segmentos de hojas, tallos, raíces o tejido nuclear según se sea el
camino de regeneración organogénesis o embriogénesis somática, deben ser desinfectados y
29
evitar oxidación del explante, (c) Fase 2. Multiplicación. Los medios empleados deben tener
balance hormonal para estimular la formación de brotes sea a través de masas callosas y
posterior formación de embriones somáticos hasta formar la planta con raíces primarias; o
estimular la formación directa de brotes adventicios a partir de explantes que tienen fidelidad
genética; o producción forzada de brotes axilares masivos a partir de yemas, (d) Fase 3.
Elongación de brotes y enraizamiento. La formación de brotes formados al estar expuestos a las
citoquininas puede permanecer cortos y requieren un paso intermedio de elongación antes de ser
transferidos al medio de enraizamiento con bajos niveles de citoquininas y auxinas o sin ellas, (e)
Fase 4. Trasplante y aclimatación. El contenido elevado de humedad presente en los recipientes
provoca alteraciones en la morfología foliar tales como una cutícula poco desarrollada por la
escasa deposición de cera, los estomas crecen alargados y no responden a los estímulos para su
apertura y cierre, hay pobre diferenciación del mesófilo, se presenta desarrolló bajo de
cloroplastos y clorofila junto con granas desorganizadas. Todas estas anomalías reducen su
capacidad de sobrevivencia, por eso deben ser transferidas al invernadero de manera cuidadosa
antes de ser transferidas al campo. (Shahzad, 2017.; Pierik, R.LM, 1990; Elsherif 2017)
2.2.1.4 Factores que garantizan el éxito del cultivo
Teniendo en cuenta que los procesos de regeneración vía cultivo in vitro de tejidos
vegetales se realizan en condiciones controladas, la correcta interacción entre estos factores
determina el protocolo exitoso de producción de una planta.
Uno de los aspectos fundamentales es la composición del medio de cultivo. El medio
debe cumplir con los requerimientos nutricionales básicos de la planta y a su vez debe contener
la cantidad necesaria de hormonas vegetales u otros sustancias inductoras de la vía de
regeneración seleccionada (Bhojwani & Dantu, 2013). Hay dos grupos importantes de hormonas
30
vegetales que juegan en la composición del medio de cultivo: las auxinas y las citoquininas.
Aunque los explantes puede que posean ciertos niveles endógenos de hormonas vegetales,
usualmente es necesario agregar un suplemento exógeno para activar ciertas respuestas. Auxinas
como el ácido indolacético (AIA) y el ácido naftalenacético (ANA), promueven la diferenciación
de la raíz y citoquininas como la kinetina y adenina promueven la diferenciación del brote. Un
balance entre las auxinas y citoquininas usualmente resulta necesario para la formación de callos.
También se ha establecido que la diferenciación de la raíz y brote de la planta depende de la
relación e interacciones cuantitativas que ocurren entre las auxinas y citoquininas.
Otro factor importante es el pH del medio ya que influencia la captación de sus
ingredientes por la planta, la solubilidad de las sales así como al agente gelificante (en medios
sólidos y semisólidos). A grandes rasgos, los factores ambientales en los que las plantas son
incubadas, tales como la intensidad lumínica, periodos de luz-oscuridad, humedad y temperatura
influencian el crecimiento de la planta.
2.2.1.5 Problemas asociados con el cultivo in vitro de tejidos vegetales
Se han identificado cuatro inconvenientes asociados al proceso de micropropagación
como: (a) La hiperhidratación, un fenómeno ocasionado por las condiciones de humedad que
ocasiona anormalidades anatómicas, morfológicas, fisiológicas y metabólicas que hace que las
plantas exhiben vitrificación o hiperhidratación, generalmente ocurren en cultivos en medio
líquido; (b) Contaminación, especialmente en los laboratorios comerciales pueden ocurrir
pérdidas económicas alrededor del 20 %, es necesario tener estrategias de asepsia y en algunos
casos adicionar antibióticos u otros agentes antimicrobianos al medio de cultivo para prevenirla;
(c)Oxidación, algunas plantas recalcitrantes no son capaces de tener un respuesta in vitro,
especialmente en especies de árboles como Prunus, Eucalyptus, Pinus y Sequoia; (d) Otro
31
aspecto negativo del cultivo in vitro es la posible mutación y presencia de variación somaclonal
en el cultivo.
Las anormalidades desarrolladas en las plantas cultivadas in vitro, están relacionadas por
el tipo de explante, la composición del medio, reguladores de crecimiento, periodos de
exposición, condiciones del cultivo y el genotipo de la planta.
Todos estos problemas son considerados por la comunidad de investigadores y por ello se
debe ampliar los conocimientos alusivos al proceso de regeneración a partir de los explantes
utilizados y la respuesta que tienen frente a estos factores inherentes a su desarrollo.
32
Capítulo 3.
Conceptos asociados a la regeneración vegetal
Todos los organismos vivos en la naturaleza se enfrentan a ciertos niveles de estrés
biótico y abiótico y para ello deben desarrollar estrategias que les permita asegurar su
supervivencia ;ante estos retos la capacidad de regenerar tejidos y/o órganos es fundamental
(Landge, Radhakrishnan, Kareem, & Prasad, 2018). Las plantas cuentan con una enorme
plasticidad en éste aspecto ya que poseen la capacidad de no solo regenerar un tejido dañado
sino también de generar una planta completa a partir de células preexistentes (Birnbaum &
Sánchez Alvarado, 2008) .Esta capacidad ha sido observada en todo el reino vegetal, desde
plantas inferiores como las algas y briofitas hasta las plantas superiores con semilla (Birnbaum &
Sánchez, 2008; Ikeuchi, Ogawa, Iwase, & Sugimoto, 2016; Pulianmackal, Kareem, Durgaprasad,
Trivedi, & Prasad, 2014). En los últimos veinte años la biología del desarrollo vegetal ha
realizado grandes avances en pro del entendimiento de los procesos de regeneración en plantas,
lo cual ha llevado a replantear varios conceptos de los cuales se tenía una información limitada y
dependían en su mayoría de observaciones morfológicas y observaciones empíricas. El presente
capítulo pretende brindar una actualización de dichos conceptos que permitan aceptar o refutar el
antiguo postulado de que todas las células de la planta son totipotentes.
3.1. Totipotencia celular: el dogma de la biología vegetal
El desarrollo embrionario de una planta comienza con la fertilización del óvulo y la
formación de un cigoto que presenta totipotencia, es decir que el cigoto puede autónomamente
33
desarrollarse en todos los linajes posibles de la planta adulta. Adicional a esto las plantas
presentan crecimiento post embrionario el cual les permite regenerar sus tejidos y formar otro
nuevos estando ya en la fase adulta. (Kumar & Van Staden, 2017; Sugimoto et al., 2011).
Uno de los intentos pioneros que demostró el potencial regenerativo de las plantas, fue
realizado por Duhamel (1756) al observar la formación de brotes tras el descortezado de un árbol
de olmo (Gautheret 1985 citado por Kareem et al., 2016). Posteriormente Nobécourt, Gautheret y
White (1939) realizaron varios experimentos para confirmar los postulados planteados por
Haberlandt (1902) obtuvieron exitosamente regeneración de brotes bajo condiciones in vitro, lo
cual hizo posible confirmar la capacidad totipotente de las células vegetales diferenciadas
(pierik 1990). Desde entonces el término totipotencia se define como la habilidad de una célula
en un organismo multicelular, de desarrollarse independientemente en un nuevo individuo
completo (Atta et al., 2009). Lo anterior permitió que la comunidad científica aceptara la
afirmación de que “todas las células vegetales son totipotentes”, principio que puede
considerarse como uno de los dogmas centrales de la biología vegetal (Sugimoto et al., 2011).
Sin embargo, investigaciones recientes consideran que no todas las células de la planta se
consideran totipotentes. En teoría la única célula que puede formar un embrión autónomamente
como el cigoto puede ser totipotente, ya que solo el embrión tiene la capacidad de desarrollar un
organismo completo de forma directa (Sugimoto et al., 2011; J. L. Verdeil, Alemanno,
Niemenak, & Tranbarger, 2007). La creencia de que todas o al menos varias células vegetales
son totipotentes ha sido evidenciado por diversas observaciones, por lo tanto, se puede inferir
que el desarrollo embrionario en las plantas puede ser alcanzado a partir de varios tipos de
tejidos diferenciados de células somáticas. Sin embargo, la totipotencia celular es difícil de
considerar que sea posible en aquellos casos en donde ocurre regeneración de brotes y posterior
34
formación de raíces adventicias (Su, Liu, & Zhang, 2011), e incluso si la embriogénesis
comienza a partir de células no cigóticas forzada por cambios drásticos dentro de la planta tales
como el estrés o una herida o en las condiciones in vitro para desviar la célula de su camino de
desarrollo definido. Esto significa que estas células son no inherentemente embrionarias pero
pueden convertirse en ellas en respuesta a factores internos o externos. Por lo tanto, las células
no pueden ser consideradas totipotentes per se, pero solo algunas células pueden conservar
totipotencia bajo condiciones apropiadas (Fehér, 2015a; J. L. Verdeil et al., 2007)
Actualmente las investigaciones relacionadas con el desarrollo vegetal plantean que
existen diferentes niveles de capacidad de diferenciación celular. Se afirma que algunas células
presentan capacidad pluripotente, es decir, la habilidad de una célula para desarrollar todos los
tipos celulares que conforman el cuerpo de la planta, exceptuando las células embrionarias (He,
Chen, Huang, & Xu, 2012; J. Verdeil, Alemanno, Niemenak, & Tranbarger, 2007).
Acorde a los planteamientos anteriores, se considera que las células vegetales pueden
recuperar su totipotencia de dos maneras: (a) vía inducción, recobrando la identidad celular
embrionaria o (b) vía reversión, con la pérdida de la identidad celular vegetativa/somática. Sin
embargo aún necesita ser considerado el hecho que las células vegetales puedan ser inducidas
o revertidas a un estado parecido a un cigoto o directamente a un estado embrionario (Layola-
Vargas & Ochoa-Alejo, 2012)
3.2. Células madre vegetales
El estudio de las células madre vegetales ha tenido una historia mixta, hace tiempo que se
conoce que las plantas contienen células “iniciales” en zonas de división celular ubicadas en las
zonas apicales. Sin embargo, curiosamente, estas células iniciadoras usualmente no se
35
consideraban especiales debido a la creencia exagerada de que todas las células vegetales eran
totipotentes(Byrne, Kidner, & Martienssen, 2003; Scheres, 2005). Resultados recientes sugieren
que las células madre podrían ser las responsables de la dramática habilidad regenerativa de las
plantas (Sugimoto et al., 2011).
Actualmente, se considera que las células madre son unas masas de células
indiferenciadas que se mantienen a sí mismas, aunque proveen de una fuente estable de células
precursoras para desarrollar diferentes tipos de células o tejidos (células diferenciadas) en plantas
o animales (Sablowski, 2004). El concepto convencional de célula madre se basa en la definición
de las células madres animales, confinadas en un ambiente celular particular, generalmente
llamado “nicho de células madre” el cual regula la actividad del desarrollo (Warghat, Thakur, &
Sood, 2018). El nicho de las células madre (NCM) está normalmente confinado dentro del
meristemo, en zonas proliferativas que brindan un microambiente específico donde la
diferenciación es inhibida por señales de células circundantes (Perez-garcia & Moreno-risueno,
2018; Tucker & Laux, 2007). Teniendo en cuenta que las células vegetales son inmóviles, las
células madre están identificadas por su posición dentro de los meristemos y dado que existen
varios tipos de meristemos en las plantas (apical, radicular y vascular) cada uno de ellos posee
su propio grupo de células madre especializadas. Se ha encontrado que hay regulación de células
madres en el meristemo y pueden adquirir identidad en el meristemo (Sang, Cheng, & Zhang,
2018; Stahl & Simon, 2005; Williams & Fletcher, 2005).
Una función central del nicho de células madre es permitir la amplificación controlada de
linajes celulares originados a partir de un pequeño número de células madre, se requiere un
control preciso de la característica espacio temporal del meristemo, ya que estos poseen
subpoblaciones de células capaces de generar una planta completa y mostrar actividad mitótica
36
divergente (Gaillochet & Lohmann, 2015). Debido a que los tejidos son generados a partir de
células madre, las células madre también son designadas como tejido iniciador, aunque
estrictamente hablando las células iniciadoras de tejidos representa el origen de todos los linajes
de tejidos. Las células madre de tejido se dividen asimétricamente para regenerarse a sí mismas
y formar una célula madre hija que prolifera, crece y eventualmente se diferencia (Greb &
Lohmann, 2016).
Aunque las células madre poseen una alta capacidad de autorrenovación y son esenciales
para la producción y/o regeneración, se dividen con poca frecuencia. En la mayoría de los casos,
las descendientes de las células madre no se diferencian directamente, sino que forman una
población celular intermedia de células progenitoras comprometidas que se dividen a mayor
velocidad. Estas células transitorias amplificadoras (células TA) tienen una capacidad
proliferativa limitada y un potencial de diferenciación restringido. Su tarea principal es
incrementar la población de células regeneradas a partir de una única división de la célula madre.
(Stahl & Simon, 2005).
Adicionalmente se ha observado que varias células en la planta poseen propiedades de
células madre. Las poblaciones de células madre no meristemáticas comprenden las células
pericíclicas y el procambium (J. Liu et al., 2014; Sugimoto et al., 2011) las cuales han mostrado
que regeneran estructuras post embrionarias tales como raíces laterales y tejido vascular
respectivamente. De hecho, las células a partir de las cuales los callos forman raíces, hipocótilo,
cotiledones y pétalos son en realidad células específicas que rodean el tejido vascular. (Sugimoto
et al., 2011; Sugimoto, Jiao, & Meyerowitz, 2010), en raíces e hipocótilo específicamente a
partir de las células pericíclicas del polo del xilema. En otros órganos, las células formadoras de
callos comparten la expresión de al menos un gen con las células pericíclicas del polo de xilema;
37
debido a que estas células no han sido descritas previamente en órganos aéreos, aún carecen de
un nombre estandarizado (Sugimoto et al., 2010), hasta el momento son llamadas células
similares a las células pericíclicas (CSP).
3.3. Células pericíclicas y similares a las pericíclicas (CSP)
Recientemente se ha encontrado que los callos pueden existir durante regeneración de
novo bajo condiciones inductivas no hormonales (Bustillo-Avedaño et al., 2017; Perez-Garcia &
Moreno-Risueno, 2018). El callo también es formado endógenamente cuando ocurre una herida
y aunque este mecanismo regenerativo no parece llevar a la formación de nuevos órganos (Iwase
et al., 2011), esta información indica que los callos no solo presentan regeneración inducida
exógenamente. Más recientemente, se ha encontrado que solo las células con identidad de
células pericíclicas que expresan el marcador genético J0121, parecen ser reprogramables
generando callo bajo suplementación hormonal o por inducción endógena (Bustillo-Avedaño et
al., 2017; Sugimoto et al., 2010) y no como se consideraba anteriormente desde el punto de vista
de la totipotencia, que todas las células eran capaces de generar un callo con inducción hormonal
(Trinh, Laplaze, & Guyomarch, 2018).
Se ha observado que la formación de callos es derivada de células que poseen el
marcador genético J0121, un marcador de las células pericíclicas polares del xilema en raíces y
en células adyacentes al xilema en tejidos aéreos (Sugimoto et al., 2010). Esta información
sugiere que las células de tipo pericíclicas (marcadas con J0121) fueron las responsables en la
formación de callos. Debido a este amplio potencial de desarrollo, las células pericíclicas y las
células similares a las pericíclicas se han venido considerando como un tipo (o una reserva) de
células madre durante el desarrollo postembrionario.
38
Particularmente las células similares a células pericíclicas retienen una habilidad
significativa para re especificarse dinámicamente su propia identidad bajo las condiciones
adecuadas con el fin de generar un callo (Sugimoto et al., 2010) o nuevos órganos como raíces
laterales o adventicias (Bustillo-Avedaño et al., 2017; Perez-Garcia & Moreno-Risueno, 2018).
Se ha encontrado que hay un regulador de transcripción MINIYO encargado de iniciar los
procesos de diferenciación en el núcleo celular, confiere la capacidad a las células pericíclicas y
CSP de mantener a MINIYO por fuera de su núcleo. Esto podría explicar el estado ligeramente
indiferenciado de las células madre no meristemáticas y su capacidad de re especificar su destino
celular (Perez-Garcia & Moreno-Risueno, 2018).
3.4. Las diversas estrategias de regeneración vegetal
La multiplicación vegetativa in vivo (esqueje, división, acodo) o por métodos in vitro
(esquejes de segmentos nodales, ramas axilares, regeneración de órganos adventicios (raíces o
vástagos) sobre explantes conduce a la formación de órganos adventicios mediante
organogénesis directa o indirecta por embriogénesis somática sobre callo. Estos procesos en la
actualidad están siendo ampliamente estudiados con el fin de comprender las bases celulares y
genéticas que ocasionan dichos procesos de diferenciación (Ikeuchi et al., 2016).
La distinción inicial de los eventos morfológicos que ocurren en el cultivo in vitro, son
difíciles de entender, por lo tanto, se requiere de estudios ultra estructurales, morfológicos y/o
moleculares para distinguir entre organogénesis y embriogénesis en el laboratorio (Akhtar &
Shahzad, 2018). La regeneración de novo de brotes es un prerrequisito para la propagación y el
mejoramiento genético de cultivares elite (Liu et al., 2017). La reprogramación celular inducida
39
por una herida puede ocurrir por ataques de bacterias, virus y/o insectos, así como por abrasiones
físicas (Tuskan et al., 2018).
Organogénesis. Comprende el desarrollo de yemas o de meristemos radicales a partir de
los explantes directamente o a partir de ellos. La organogénesis puede ocurrir directa e
indirectamente .Desde que White observó la formación de raíces adventicias y Nobécourt las
raíces principales en 1939, fue Skoog en 1944 quien ratificó el papel de las auxinas en la
formación de ellas y el efecto inhibidor hacia la formación de yemas (Su et al., 2011). Más
adelante la adición de sulfato de adenina al medio promovió el desarrollo de yemas, lo cual le
permitió considerar cierto control en la formación de órganos in vitro. Los ensayos posteriores
se enfocaron en determinar el efecto que tendrían diferentes concentraciones y tipo de hormonas,
demás suplementos del medio sobre la capacidad de afectar el proceso de diferenciación y
desarrollar medios para la organogénesis. Algunos factores endógenos también podrían estar
involucrados en modificar la respuesta organogénica.
Thorpe (1980) introdujo el término organogénesis de Novo en cultivo de tejidos, el cual
hace referencia a la diferenciación dentro del explante. Se observó que a partir de floema externo
en segmentos de tallo de tabaco se desarrollaron meristemos primarios; es por ello que la
capacidad regenerativa de algunos tejidos puede pasar desapercibida debido a que se asocian
estos tejidos diferenciados dentro de un sistema organizado.
La organogénesis indirecta puede ocurrir a partir de un callo, se deben producir cambios
que lleven a la organización celular. Thorpe (1983) afirmaba que en la formación del callo se
establecían unas regiones de mayor división celular de aspecto meristemoide o regiones
localizadas de células en división activa, capaces de responder a las señales de desarrollo. Se
40
asemejaban a los meristemos porque tenían conexión vascular con el callo o tejido circundante.
(Roca, 1991).
La organogénesis indirecta involucra la formación de una masa regenerativa intermedia
llamada callo a partir de células madre no meristemáticas que se encuentran distribuidas a través
del cuerpo de la planta en el tejido vascular (Ikeuchi, Sugimoto & Iwase, 2013; Sugimoto et al.,
2011, 2010). El callo a su vez produce raíces o brotes en respuesta a niveles apropiados de
hormonas vegetales claves, auxinas y citoquininas (Gordon et al., 2007; Atta et al., 2009). El
paso inicial hacia la regeneración es la adquisición de la competencia. Se entiende por
competencia la capacidad de las células para reconocer señales hormonales o de otra naturaleza
que activan una ruta específica de diferenciación (Azcón-Bieto & Talón, 2013), una vez las
células adquieren competencia, se define el destino celular del primordio en nuevos meristemos
y órganos por medio del ensamble dinámico causado por una serie de interacciones moleculares
(Kareem, et al., 2016).
Adicional a la organogénesis de novo, la regeneración in vitro también se puede lograr
por medio de embriogénesis somática (Pulianmackal et al., 2014). Aunque ambos métodos
permiten regenerar plántulas completas pueden distinguirse entre sí por lo siguiente: los
embriones somáticos (ES) son formados mediante el tratamiento de células somáticas con altas
concentraciones de auxinas como 2,4-D (Su et al., 2011) e involucra la formación de estructuras
bipolares que contienen los meristemos apicales y radiculares ; en la organogénesis de novo se
salta por completo la fase de desarrollo embrional para producir estructuras monopolares de
origen multicelular que poseen identidad celular de raíz o de brote (Roca, 1991). Además en la
embriogénesis somática, el embrión no mantiene ninguna conexión vascular con el tejido del
41
explante mientras que en la organogénesis de novo si se presenta dicha conexión en los brotes
o raíces formados.
En estudios relacionados con la embriogénesis somática cabe mencionar que se ha
detectado el factor de transcripción básico Helix-lopp-helix bHLH109 que en un alto nivel
induce la embriogénesis somática, mientras que niveles bajos de dicho factor de transcripción
han sido asociados con la organogénesis de novo (Nowak & Gaj, 2016 citado por Kareem et al.,
2016). Se ha podido evidenciar de igual manera que durante la embriogénesis somática el polo
apical y radicular están preespecificados al no mostrar dependencia con el ensamble de
interacciones reguladoras para su información posicional.
En contraste, la reconstitución de células madre y el ensamblaje de interacciones
reguladoras controladas espacio-temporalmente son esenciales para la información posicional
durante la organogénesis de novo (Ikeuchi et al., 2013; Sugimoto et al., 2011).
3.4.1 Organogénesis directa
Los avances en la biología del desarrollo vegetal plantean ciertas explicaciones en la
comprensión de la organogénesis de Novo en plantas, dado que puede ser alcanzada
directamente o indirectamente (Kareem, et al., 2016; Sultana & Gangopadhyay, 2018). Se
considera que en ambos caminos ocurre reprogramación celular de manera inevitable en ambos
métodos y que durante la regeneración directa, las células sufren transdiferenciación (cambio del
destino celular hacia otro sin pasar por un proceso de dediferenciación) ya que las células
radiculares son reprogramadas hacia brote y viceversa. (Kareem, Roy, et al., 2016; J. Liu et al.,
2014). Atta y colaboradores (2009) en sus ensayos aportan que no todas los tipos celulares
poseen la misma capacidad de mantener su pluripotencia. Se sugiere que la iniciación directa
42
ocurre cuando un explante contiene células que han retenido su capacidad de dividirse y de
regenerar una raíz o un brote rápidamente después de re-ingresar el ciclo celular (Gordon et al.,
2007). Cuando estas células predeterminadas no están presentes los explantes deben
dediferenciarse a través de división celular antes de poder formar meristemos (Atta et al., 2009).
La reprogramación directa de raíces a brotes y de brotes a raíces ocurre en la naturaleza
así como bajo condiciones de cultivo in vitro. Aunque las raíces y los brotes se generan a partir
de regiones diferentes del embrión, se demuestra con ello que las plantas aún tienen la capacidad
de regenerar órganos en zonas diferentes al lugar de formación original. Este fenómeno podría
deberse sustancialmente al origen evolutivo común de las raíces y los brotes al parecer por
considerar que las raíces de las plantas modernas evolucionaron a partir de brotes de plantas
primitivas (El-sherif, 2018; Kareem, Roy, et al., 2016). Por lo tanto, estas dos estructuras tanto
raíces y brotes tienen más posibilidades de mantener el potencial de ser reprogramadas hacia otro
destino celular.
Este potencial de reprogramación ha sido explotado ampliamente en la horticultura por
ejemplo en fresas y gerberas, dado que la regeneración directa de raíces a brotes y viceversa
bajo condiciones in vitro puede ampliar los límites de la propagación vegetal al producir una
gran número de plántulas en el mejor tiempo posible. Otra ventaja de cultivo in vitro en
comparación con la propagación vegetativa, es que incluso partes de la planta que no son
considerados propágulos vegetativos pueden ser usados como explantes bajo tratamientos
hormonales apropiados. A diferencia de la regeneración indirecta, la regeneración directa no
necesita pasar por la fase de callo y por lo tanto ayuda a evitar o reducir la variación somaclonal
asociada con el cultivo de callos (Kareem, Radhakrishnan, et al., 2016). Además, el proceso de
43
regeneración directa puede servir como un modelo general para estudiar los mecanismos de
transdiferenciación (conversión de un tipo de célula a otra).
3.4.1.1 De raíz a brote
Un ejemplo ideal de la reprogramación directa es la inducción de brotes a partir de
semillas. Cultivar un explante de raíz en un medio rico en citoquininas promueve la conversión
directa de primordio de raíz lateral (PRL) en brotes (Atta et al., 2009; Kareem et al., 2015;
Kareem, Radhakrishnan, et al., 2016). El monitoreo en tiempo real de los eventos celulares
dinámicos utilizando imágenes posibilita el entender los acontecimientos moleculares tempranos
durante la conversión de PRL a brote. Altas concentraciones de citoquininas inducen la
expresión de genes específicos de brote, como el WUS en el PRL lo que lleva a la
reprogramación de la célula radicular a su nuevo destino de brote. Durante las etapas tempranas
de la transición de destino celular, la célula pasa por una fase transitoria de desarrollo en la cual
tanto genes específicos de la raíz como genes específicos de brote son expresados (Kareem,
Radhakrishnan, et al., 2016). Subsecuentemente, hay una elevación en la expresión de genes
específicos de brotes y desaparecen los genes específicos de raíz. Las interacciones de múltiples
moléculas reguladoras específicas del brote establecen la identidad de meristemo de brote en la
estructura regenerada seguido de la iniciación del órgano (Chatfield et al., 2013 citado por
Kareem, Radhakrishnan, et al., 2016). Sin embargo, este proceso de conversión está altamente
influenciado por un número de factores como la etapa del PRL, el ecotipo de la planta, la
concentración de citoquininas y las condiciones externas como luz y temperatura (Kareem, Roy,
et al., 2016). También se ha evidenciado que la vía de WOX11-LBD16 promueve la adquisición
de pluripotencia en células de callo durante la regeneración de novo de brotes (B. Liu et al.,
2018).
44
3.4.1.2 Brote a raíz
Similar a la conversión de raíz a brote, la conversión directa de brote a raíz también es
posible en condiciones de cultivo in vitro. Este enfoque es de alta significancia por cuanto se ha
observado que no todos los propágulos utilizados para la propagación vegetativa generan raíces
con la misma facilidad durante el endurecimiento de plantas en micropropagación. Por lo tanto,
entender los factores que afectan la formación de raíces a partir de explantes de brote puede
ayudar a superar el carácter recalcitrante de regenerar raíces que presentan algunas plantas de
interés. La formación de raíces a partir de explantes de brote requiere de la suplementación
externa de auxinas, responsables de la iniciación de la reprogramación de procambium o de
células similares a las del periciclo del brote hacia un destino celular de raíz. (Kareem, Roy, et
al., 2016). Además de las auxinas existen otros factores que ejercen gran influencia durante la
organogénesis de la raíz tales como la adición de otras fitohormonas como el etileno, giberelinas
y ABA; junto con parámetros intrínsecos del cultivo tales como la nutrición, luz, temperatura y
el ecotipo del explante. (Atta et al., 2009). Es interesante señalar que algunos estudios han
mostrado la inducción de raíces de hojas cortadas sin el tratamiento externo de auxinas (J. Liu et
al., 2014).El estudio de Lee y Seo demostraron que cuando ocurre una herida en la planta, el gen
YUCCA (YUC) mediaba la biosíntesis de auxinas en el sitio de la herida mecanismo esencial
para la regeneración de novo de raíz (Lee & Seo, 2018). Paralelamente se ha encontrado también
que los factores de transcripción WUSCHEL-RETLATED HOMEOBOX 11 (WOX11) y
WOX12 responden a ese máximo de auxinas regulando positivamente LBD16 y LBD29
responsables del cambio del procambium y células del parénquima cercanas hacia el destino
celular de raíz (J. Liu et al., 2014).
45
Se ha encontrado que “LBSs (Dominio limite de órganos laterales) pueden también
involucrar la consecuente transición hacia primordio radicular. Así que la formación de raíces
adventicias inducida por herida en la ausencia de la aplicación de hormonas externas resalta que
la vía que adoptada LBSs direcciona el destino celular de raíz. La herida induce la vía NAC que
es independiente del (auxina máxima) cambio de destino celular mediado por auxina máxima
(Muhammad et al., 2018). La vía de respuesta a heridas también puede iniciar la organogénesis
directa de raíces como ocurre durante la formación de callos inducidos por herida y su
subsecuente regeneración (Xu, 2018).
Adicionalmente a las señales inductoras externas, la transición del destino celular también
puede ocurrir por activación ectópica de factores genéticos intrínsecos. Por ejemplo, inducir la
sobreexpresión ectópica de WUS puede disparar la formación de un brote a partir de raíz en un
medio libre de hormonas (Kareem et al., 2015). Similarmente la inducción ectópica de PLT2
puede activar la formación de raíces a partir del meristemo apical (Kareem, et al., 2016).
Acorde con lo anteriormente expuesto se puede establecer que la organogénesis directa
de brotes y raíces está bajo control de factores tanto extrínsecos e intrínsecos. El estudio
molecular profundo de la reprogramación celular durante la transición de destinos celulares
puede ser de gran importancia para comprender los mecanismos básicos de la
transdiferenciación; Conocimiento que puede ser usado en la mejora de la capacidad de
regeneración directa de especies recalcitrantes.
3.4.2 Organogénesis indirecta
El proceso de organogénesis indirecta es evidencia de la impresionante habilidad de las
plantas de reprogramar su identidad celular. Este tipo de organogénesis es una de las más
46
estudiadas en el campo del cultivo in vitro de tejidos vegetales. Durante este proceso el explante
es pre incubado en un medio inductor de callo MIC para inducir la generación de un callo y
posteriormente es transferido a un medio inductor de brote (MIB) rico en citoquininas que
permite la formación del brote (Che, Lall, & Howell, 2007) (Growth, Yang, Poretska, Sieberer,
& Growth, 2018)
3.4.2.1 El origen celular del callo
Durante la transición de destino celular se forma una masa celular desorganizada de
carácter pluripotente (Shin & Seo, 2018). Se ha podido observar dos tipos de callos dependiendo
del estímulo externo aplicado: sea una herida mecánica por sí sola o una herida seguida de la
incubación en un medio inductor de callos (MIC) suplementado con altas concentraciones de
auxinas (Ikeuchi et al., 2013). Los dos tipos de callo son similares en su capacidad pluripotente
que asegura la regeneración celular, sin embargo, la identidad pluripotente de un callo inducido
por herida y la de un callo inducido por un MIC no es análoga. (Li et al., 2018; Shin & Seo,
2018).
El término callo se origina de la palabra en latín Callum, la cual significa duro. En los
inicios de la biología vegetal, el término callo era otorgado al crecimiento masivo de celular y su
acumulación callosa asociada con las heridas. Hoy en día esta palabra es utilizada más
ampliamente y las masas celulares desorganizadas son llamadas callos de forma colectiva. Los
callos pueden ser generados a partir de una única célula diferenciada, varios tipos de callos son
capaces de regenerar plantas completas (Ikeuchi et al., 2013); así como bajo ciertas condiciones,
un callo puede llevar a cabo embriogénesis somática. (Fehér, 2015b).
47
La herida de la planta activa la formación del callo por vías hormonales dinámicas y
cambios transcripcionales (Heyman, Canher, Bisht, Christiaens, & Veylder, 2018; Ikeuchi et al.,
2017). La inducción de callos está altamente influenciada por las concentraciones endógenas y
exógenas de auxinas (Lavenus et al., 2013; Li et al., 2018; Y. Liu et al., 2015; Xu, 2018)).
Adicional a la inducción hormonal, los callos pueden ser inducidos por metales pesados,
fármacos, nano partículas u otros elementos (Chutipaijit & Sutjaritvorakul, 2018)
De acuerdo a sus características macroscópicas los callos se pueden clasificar en
subgrupos; algunos tipos de callo no presentan regeneración de un órgano y típicamente es
friable y compacto mientras que otros muestran cierto nivel de regeneración llamados callos
radiculares, de brote o embrionales dependiendo del destino. Iwase et al. (2011) determinaron
que en Arabidopsis thaliana se formaron diferentes tipos de callos con perfiles de expresión
genética distintos, que permite inferir que los callos incluyen células con varios grados de
diferenciación (Ikeuchi et al., 2013). La herida de la planta activa la formación del callo por vías
hormonales dinámicas y cambios transcripcionales (Heyman et al., 2018; Ikeuchi et al., 2017).
3.4.2.2 Características y organización celular del callo.
Por mucho tiempo se pensó que todas las células somáticas eran totipotentes y que podían
desdiferenciarse para generar un callo (Birnbaum & Alvarado, 2008). Pero descubrimientos
recientes en la compresión de la especificidad celular y el estatus de diferenciación durante la
formación del callo han redefinido el concepto de potencia celular y reprogramación (Atta et al.,
2009; Ikeuchi et al., 2013; Sugimoto et al., 2011, 2010). Contrario a lo que se creía no todas las
células somáticas pueden formar callos. Ahora es evidente que la formación de callos es iniciada
por la activación de una población celular especializada que se encuentra parcialmente
diferenciadas y que se esparcen a través del cuerpo de la planta (Sugimoto et al., 2011).
48
Sugimoto et al (2010) demostraron que la formación de callo a partir de diferentes órganos
aéreos, no es un proceso de reprogramación a un estado indiferenciado, sino la dediferenciación
de una célula similar a una célula pericíclica presente en el órgano aéreo hacia un tejido similar a
un meristemo radicular. En este caso las células similares a células pericíclicas (CSP) son
funcionalmente análogas a las células madre animales por 0encontrarse en varios tejidos a través
del cuerpo, poder dividirse y diferenciarse en otros tipos de células especializadas.Contrario a lo
que sucede con el tipo de células madre animales varían dependiendo del tejido de origen y
generalmente están limitadas a diferenciarse dentro de su linaje de original. Es interesante notar
que en el caso de las CSP están presentes en diferentes órganos y se diferencian en un tejido
similar a un meristemo radicular independientemente tanto de su tejido de origen como de las
variaciones en la concentración de hormonas en el medio de cultivo. Dado que las células
pericíclicas han sido descritas como tejido radicular, el descubrimiento de células similares a las
pericíclicas en tejidos aéreos puede darnos un nuevo entendimiento de las células madre
vegetales (Dubrovsky et al., 2008; Ikeuchi et al., 2013; Laplaze et al., 2005).
3.5 Diferenciación celular
La diferenciación en la regeneración vegetal ha sido históricamente inferida
indirectamente a través de la observación de la habilidad renovada de células previamente
inactivas de dividirse y por la inducción de cambios estructurales y morfológicos dentro de
células en división. Durante el desarrollo postembrionario diversos tejidos son creados a través
de la acción de células madre pluripotente dentro de los meristemos. Las células dentro de los
meristemos son pequeñas, con un citoplasma denso y vacuolas pequeñas. En contraste, las
células inactivas dentro de un tejido maduro que se diferencian a partir de un meristemo
49
usualmente son grandes en tamaño, contiene grandes vacuolas con diferentes residuos y
productos de almacenamiento contrario a las células meristemáticas.
La iniciación de callos durante la regeneración lleva a la adquisición de características
celulares similares a las de las células meristemáticas y la consecuente pérdida de una morfología
células diferenciadas. Estos cambios en la morfología celular han sido tomados como evidencia
del proceso de desdiferenciación. Por otro lado, estos cambios en la estructura celular no
necesariamente equivalen a un regreso a un estado fundamentalmente embrionario o a una etapa
de desarrollo temprana en el linaje usual de la célula. Igualmente, los resultados de Atta y
colaboradores (2009) han mostrado que el callo no es desdiferenciado. De hecho, el callo
inducido en estos estudios es similar a tejido radicular y la expresión de sus patrones genéticos,
así como su organización multicelular. Sugimoto y colaboradores (2010) confirmaron que aun
cuando están generados a partir de órganos aéreos, se encuentran separados del linaje radicular
desde la división temprana en la etapa de embriogénesis (Atta et al., 2009; Sugimoto et al.,
2010). El transcriptor del callo es más similar al tejido de un meristemo radicular que al de un
meristemo apical/aéreo o un tejido embrionario. Por esto, se considera que la formación de callo
no es un simple proceso de reprogramación a un estado desdiferenciado o a un estado
embrionario.
La regeneración de una planta completa a partir de una sola célula somática podría
posiblemente involucrar el retorno a un estado más embrionario, por esto resulta fácil aceptar
que la desdiferenciación podría jugar un papel generalizado en varios procesos de regeneración.
Esta asunción es reforzada por la habilidad de las plantas de realizar embriogénesis somática en
la que células somáticas son estimuladas para formar embriones (Ikeuchi et al., 2013; Nor et al.,
2018)
50
3.5.1 Desdiferenciación
Históricamente, la discusión de la regeneración vegetal ha envuelto el concepto de
desdiferenciación. De hecho, una de las definiciones más antiguas de desdiferenciación se
encuentra en el diccionario inglés de Oxford, ingresada en 1917 (Sugimoto et al., 2011) que dice:
"dediferenciación o regreso a una condición más embrionaria probablemente precede todos los
tipos de regeneración”. Sin embargo, hay poca evidencia de este concepto más allá de la
morfología celular y el concepto de desdiferenciación en sí mismo es vago. Durante las últimas
décadas la palabra dediferenciación ha tomado una variedad de significados alternativos, tales
como la falta de características de diferenciación celular, o la reiniciación del ciclo celular de
células en no división y su consecuente habilidad de crecer, cada uno de los cuales está
involucrado en el proceso de revertir a un estado temprano de diferenciación, pero esto
representa solo partes del evento completo (Haque, Ahmad, Clark, Williams, & Sozzani, 2019;
Rybel, Mähönen, Helariutta, & Weijers, 2015).
3.5.2 Transdiferenciación
La transdiferenciación fue definida por Okada como el cambio irreversible de una célula
diferenciada a otra y en algunos casos la presencia de cambios en la identidad celular,
combinado con la aparente falta de procesos de desdiferenciación sugiere que la
transdiferenciación podría ser una mejor opción para explicar los cambios moleculares que
ocurren cuando una célula de un tipo de tejido cambia su estado a las características de otro
linaje celular (Sugimoto et al., 2011).
51
En estudios recientes se ha considerado que en la regeneración vegetal la
transdiferenciación parece ser el proceso que se presenta. Soportado por experimentos de
imágenes en tiempo real durante la regeneración del ápice radicular se muestra que marcadores
celulares específicos para la pérdida del tipo celular son inducidos rápidamente, durante las
primeras horas después de la herida (Sena et al., 2009) y sucesivamente las células con una
nueva diferenciación son completamente funcionales a las 24 horas de la regeneración. Tales
evidencias permiten cuestionar si las células realmente llevan a cabo un proceso de
desdiferenciación y se trate más probablemente de un proceso de transdiferenciación, por lo
menos es estos sistemas de regeneración.
Esto también parece ser el caso de la formación de nuevos brotes meristemáticas que
aparecen en la superficie del callo. En Arabidopsis, los linajes celulares de la raíz y del brote se
encuentran separados desde las etapas tempranas del crecimiento embrionario y normalmente no
son convergentes (Iwase et al., 2011). Dado que el callo en su mayoría posee identidad de raíz
como se mencionó anteriormente, la inducción de brotes a partir de callos mediante la aplicación
de citoquininas puede ser un proceso de transdiferenciación. Por lo anterior los eventos que se
presentan durante estos procesos de regeneración parece ser más complejo que lo que envuelve
el término mismo de dediferenciación y quizás sea necesario cambiar dicho término por otro
de mayor precisión (Ikeuchi et al., 2018).
3.6 Fases intermedias de la regeneración vegetal
Kadokura y colaboradores (2018) plantean una pregunta central que aún permanece sin
respuesta en todo el reino vegetal , se trata de si la regeneración procede a través de fases
intermedias de desarrollo y a su vez, si estas pueden ser separadas. Durante estudios
morfológicos de regeneración en callos de Arabidopsis se observó la existencia de fases
52
intermedias potenciales (Kadokura, Sugimoto, Tarr, Suzuki, & Matsunaga, 2018), no obstante el
verdadero reto reside en descubrir los mecanismos celulares y moleculares que permitan generar
esta separación.
Un paso clave para entender los mecanismos de regeneración fue el descubrimiento de
distintivos módulos regulados del factor de transcripción PLETORA (PLT) que separa la
adquisición de competencia para generar progenitores de brote a partir de la regeneración
completa del brote (Kareem et al., 2015). Este estudio utilizó un mutante que presentaba el
bloqueo de una de las fases intermedias de regeneración del brote y al mutante se le
reintrodujeron, paso a paso, reguladores de células madre radiculares y factores promotores del
brote resultó un evidente bloqueo secuencial de las fases intermedias. Lo que permitió concluir
que estos módulos reguladores o fases intermedias fueron requeridos para la culminación exitosa
de la regeneración del brote (Kareem et al., 2015).
Pero a pesar de haber sido constatado que en los fenómenos regenerativos en vegetales
existen varios elementos continuos o secuenciales , se ha considerado de gran importancia que
cada uno de estos eventos difieren entre sí especialmente al inicio o al final del proceso
regenerativo y se ha dificultado dar una definición exacta a cada evento. Sin embargo
revisiones actuales apoyan la separación de esta regeneración continuum en eventos celulares
principales constitutivos (Galliot et al., 2017).
Como muchos otros procesos del desarrollo el proceso de regeneración requiere varios
pasos que comprenden diferentes eventos celulares y moleculares que a su vez pueden llevar a la
progresión de la regeneración hacia etapas del desarrollo intermedias. Es probable que las fases
para llegar a una etapa de desarrollo intermedio, están asociados por un módulo de regulación
distintivo los cuales soportan el surgimiento de éste planteamiento reciente (Kareem et al., 2015),
53
por lo tanto separar las fases intermedias del desarrollo será de gran ayuda para comprender y
diseccionar los mecanismos esenciales de la regeneración.
Langde y colaboradores (2018) coinciden con Kadokura (2018) quien propone que las
fases intermedias de desarrollo se pueden separar de manera didáctica en:(1) adquisición de
competencia para la regeneración, (2) formación de progenitores, (3) especificación del destino
celular y patrones de desarrollo celular (Landge et al., 2018).
3.6.1 Adquisición de competencia para la regeneración
A través de la evolución, la presión de heridas infringidas por factores bióticos y
abióticos impulsó a desarrollar una variedad de respuestas regenerativas en plantas y animales,
siendo la regeneración un activador común frente a las heridas en los dos reinos. En respuesta a
la percepción de la pérdida o daño de una parte del cuerpo se genera una señal inducida tanto en
plantas como en animales, ha sido probado que la herida es un desencadenador de la producción
de especies reactivas al oxígeno (ROS). En plantas se ha evidenciado que tras una herida se
induce la producción de fitohormonas como auxinas y etileno pero aún está por ser demostrado
la función definitiva de ROS durante la regeneración. La reprogramación celular inducida por
una herida puede ocurrir por ataques de bacterias, virus y/o insectos, así como por abrasiones
físicas (Tuskan et al., 2018). Se ha evidenciado que la señalización de una herida puede
promover la biosíntesis de auxinas vía inducción de gen YUCCA durante la organogénesis de
raíz a partir de un explante de hoja. Similarmente estos patrones dinámicos de respuesta de
auxinas y citoquininas ocurren tras una herida en la punta de la raíz. Por lo tanto, la señalización
inducida por herida y las fitohormonas juegan un papel esencial en inducir señales tempranas
punto clave en la regeneración. Por ejemplo, la formación de una masa celular regenerativa
competente originada a partir de células madre o de células de diferenciadas (Iwase, Mita,
54
Nonaka, & Ikeuchi, 2015). Un ejemplo de este tejido competente incluye los callos en las plantas
y el blastema en animales, hay adquisición de la competencia embrional (Birnbaum & Alvarado,
2008; Ikeuchi et al., 2013; Sugimoto et al., 2011). Denay (20179 afirmó de acuerdo a lo anterior
que el tejido competente está conformado por las células cercanas al sitio de la herida, el cual
tiene la habilidad de proliferar y re-especificar nuevos destinos celulares para reemplazar el
órgano dañado o regenerar otro órgano de novo.
De igual manera el rol de las fitohormonas es evidente en varios modelos de
regeneración. Por ejemplo, la formación de brotes a partir de primordio de raíz lateral LRP se
aumenta con la aplicación externa de auxinas, durante la regeneración natural de la punta de la
raíz, impulsan señales de fitohormonas que junto con los factores de transcripción inducidos por
la herida tales como ETHYLENE RESPONSE FACTOR115 (ERF115) contribuyen en
adquisición de la competencia para la regeneración. La etapa inicial en la que las células del
corte de raíz progresivamente pierden la expresión de los marcadores de su linaje celular se ha
considerado una fase de adquisición de competencia. Estas células actúan como un tejido
competente para regenerar la parte perdida al inducir la proliferación celular y su subsecuente
recuperación del destino celular (Chahtane & Tichtinsky, 2017).
Es interesante recalcar que la formación de tejido competente en plantas no requiere la
migración celular mientras que los animales lo hacen por medio de la migración celular y el
reclutamiento de células al sitio de regeneración. Puede que las plantas hayan evolucionado
generando mecanismos como el transporte polar de auxinas a los sitios de regeneración para
compensar por la inhabilidad de migrar a nichos conductivo de las células vegetales.
55
3.6.2 Formación de células progenitoras
Una vez el tejido competente percibe el grupo de señales inductivas indicadas, se activa
una cascada de señales reguladoras que continúan la proliferación celular seguida de la re-
especificación del nicho de células madre. La necesidad de reguladores de células madre en los
procesos de regeneración ha sido conocido por décadas en animales, pero su papel en la
regeneración vegetal fue descubierto hasta hace poco. Una evidencia genética concreta de la
necesidad de re -especificación del nicho de células madre y de sus reguladores durante la
regeneración en plantas emergió a partir del fracaso a la hora de regenerar la punta de la raíz en
una planta mutante plt1, 2, a la cual se le extrajo las células inactivas (Xu et al., 2006; Landge
2018), en este estudio permitió obtener las bases moleculares para la regeneración de órganos
donde los reguladores de células madre son componentes centrales. Adicional a esto, durante la
conversión de LRP a meristemo apical (MA) en Arabidopsis, el Nicho de Células Madre (NCM)
de la raíz apical es esencial para la conversión de LRP a brote. La generación de un grupo de
progenitoras conformadas por células madre son claves en la regeneración. La pérdida de la
capacidad de regenerar brotes de una planta mutante que ha perdido la función de WUSCHEL
(WUS), confirma el papel indispensable de las células progenitoras del NCM para asegurar la
regeneración de un brote completo. (Kareem et al., 2015; Zhang, Tucker, Hermann, & Laux,
2017). La formación de progenitores a partir de células fundadoras también contribuye a la
regeneración de raíces a partir de un explante de hoja herida. Tras un análisis cuidadoso de los
fenotipos mutante y la expresión de patrones de caja homeobox que contiene factores de
transcripción como WUSCHEL RELATED HOMEOBOX11 (WOX11), WOX12 y el regulador
de células madre WOX5 así como el factor de transcripción LATERAL ORGAN
BOUNDARIES DOMAIN, sugiere la presencia de múltiples pasos desde el inicio de la
56
especificación de las células fundadoras de la raíz. Durante el proceso, las auxinas promueven la
formación de progenitores de raíz y la reconstrucción del NCM de la raíz. (Liu et al., 2014;
Chen, tong, 2016, Xu et al., 2017, citados por landge et al., 2018). La formación de progenitores
y la participación de las células madre en la regeneración de tejidos también se hace evidente con
estos ensayos. Aunque los mecanismos esenciales que permiten el origen de progenitores y su
formación en diferentes sistemas modelo durante la regeneración aún permanecen sin resolver, el
trazado de linajes utilizando transcriptomas de células individuales ha permitido hacer
observaciones iniciales de estos mecanismos en plantas y en animales (Efroni et al., 2016, landge
et al., 2018).
3.6.3 Destino celular y patrones de desarrollo
La re -especificación del destino celular apropiado y la regeneración de patrones de
desarrollo de órganos u organismos completos a partir de progenitores puede ser fácilmente
emparejado como un solo paso final para conseguir la regeneración. No obstante, estos procesos
van mano a mano con el fenómeno poco entendido del establecimiento de la polaridad de los
tejidos y la adquisición de la correcta identidad posicional de los mismos. La señal Wnt es una de
las vías más conservadas responsable de determinar las polaridades anteroposteriores en
animales. En planarias, la señalización de Wnt inducida por herida, al parecer interpreta la
polaridad del tejido existente en el sitio de amputación para promover el crecimiento del
blastema con la identidad correcta, por ejemplo, cabeza versus cola (Petersen y Reddien, 2009;
Owlarn y Bartscherer, 2016; citados por Landge et al., 2018). Se plantea entonces la pregunta de
si la señalización de Wnt también juega un papel en la adquisición de la polaridad de los tejidos
en otros organismos modelo (Gaillochet & Lohmann, 2015; Nor et al., 2018; Wang &
Schiefelbein, 2014)
57
En las plantas, la regeneración de la punta de la raíz provee un buen modelo para adquirir
conocimiento de los mecanismos de especificación del destino celular y de los patrones de
desarrollo al retirar la punta de la raíz, las células cercanas al sitio de corte inicialmente pierden
la expresión de los marcadores de su respectivo linaje celular, para recuperarla en etapas
posteriores y así poder reconstruir el nicho de células madre (NMC) (Efori2016). Mientras que la
reconstitución del NCM es considerado como un proceso de adentro hacia afuera, la
recuperación del destino celular ocurre como un proceso de afuera hacia adentro. Así mismo,
pocas células en el sitio de corte muestran una "identidad celular mixta" la cual se separa
progresivamente en identidad de células inactivas y células de columela de una forma espacio
temporal regulada (Efroni et al., 2016). Así la recuperación del destino celular distal sigue una
secuencia similar a la embrionaria y es posible que señales cruzadas entre auxinas y citoquininas
la regulen. Ha resultado de gran interés observar que la regeneración de la punta radicular de
Arabidopsis, presente dominios de auxinas y citoquinas similares al desarrollo embrional de
raíces y la manipulación de estos dominios espacio temporales dentro de una ventana de tiempo
temprana causa un cambio en el axis próximo-distal (Efroni et al., 2016; landge et al., 2018).
Esta señalización de Auxinas-citoquininas parece ser la que gobierna la polaridad próxima distal,
y resulta similar a la señalización de Wnt realizando funciones similares en la regeneración
animal.
Parece ser que en el desarrollo y regeneración de raíces, los dominios de auxinas-
citoquininas codifican la información posicional y este código es interpretado por las células en
división para adquirir la identidad posicional y el destino celular. Descubrir los mecanismos
mediante los cuales la punta radicular se remodela en respuesta a una herida podría requerir la
separación de unos cuantos eventos reguladores, en particular; la reconstitución del NCM, la
58
recuperación del destino celular y los procesos reguladores que ocurren en respuesta a
citoquininas y auxinas endógenas. Mientras que la re -especificación del destino celular de
progenitores de brote es esencial para generar un brote completo de novo, aún es necesario
investigar cómo ocurre este proceso en la ausencia de señales de posicionamiento embrional
(Kadokura et al., 2018; Landge et al., 2018).
Las modificaciones epigenéticas se refieren a los cambios mitóticamente heredables en la
cromatina sin que haya cambios en la secuencia de ADN. (Lee2018). Los cambios epigenéticos
acompañan la transición del destino celular. La modificación de la estructura de cromatina ocurre
principalmente durante la formación de callo vía cultivo in vitro, es por esto que las células
pluripotentes de callo tienen características epigenéticas únicas. (Lee2018) Los elementos
transponibles (ETs) pueden generar una evolución mediante el control de la expresión genética y
a través de transposiciones mutagénicas. Hace tiempo se reconoce que los TEs y los genes
muestran una diferenciación epigenética marcada en el genoma vegetal, varias modificaciones
epigenéticas contribuyen al control de la transcripción y transposición de los TEs.
(Underwood2017). La droga 5-Azacytidina promueve los cambios epigenéticos que mejoran la
embriogénesis somática (Osorio-montalvo, Sáenz-Carbonell, & De-la-peña, 2018; Schmitz &
Ecker, 2012).
59
4. Resumen y Análisis
La pregunta que dio lugar al presente documento fue ¿Son todas la células somáticas
totipotentes? Tras leer y analizar la información actualizada de estos conceptos quedó claro que
para ciertos autores como Sugimoto et al., no todas las células somáticas se consideran
totipotentes. Indudablemente ciertas células somáticas pueden recuperar su totipotencia cuando
se encuentran bajo condiciones de estrés y son inducidas con altas concentraciones de auxinas
(endógenas o exógenas), sin embargo no se considera en teoría como una verdadera totipotencia,
puesto que los embriones somáticos producidos por esta vía de regeneración, no son formados de
forma autónoma y directa, como ocurre en los embriones cigóticos. Está aún en discusión si
estos requisitos son realmente los que determinan la totipotencia de la planta, puesto que para
algunos autores como Kadokura, el hecho de que las células somáticas logren recuperar su
identidad embrionaria vía embriogénesis somática es suficiente para afirmar que todas las células
del cuerpo de la planta poseen totipotencia. Desde mi punto de vista, el llamar a todas las células
somáticas totipotentes puede limitar la visión que se tiene de la regeneración vegetal, dado que el
considerar que los procesos de regeneración pueden darse a partir de tejidos pluripotentes,
especialmente a partir de células madre vegetales abre las puertas al planteamiento de aún más
preguntas que conduzcan a nuevas y esclarecedoras investigaciones.
De igual manera, las evidencias experimentales obtenidas sobre la identidad molecular
de callos formados a partir de tejidos radicular y aéreo en Arabidopsis thaliana de Atta et al.,
(2009) y Sugimoto et al, (2010) cambiaron la perspectiva que se poseía de los procesos de
organogénesis de novo y ha ampliado el concepto de células madre vegetales. Este concepto
relativamente nuevo, podría sugerir que las células pericíclicas y las células similares a las
60
pericíclicas poseen una identidad similar a la de las células madre meristemáticas y que al igual
que los meristemos, poseen condiciones de nicho dentro del tejido vascular en el que se ubican.
Con esto se puede plantear que las células somáticas sólo se regeneran vía embriogénesis
somática y que los demás procesos de organogénesis se dan a partir de células madre contenidas
en los meristemos primarios y secundarios. Esto respalda la noción de que los procesos de
regeneración que se dan en la naturaleza obedecen a la capacidad pluripotente de las plantas y
que la totipotencialidad de las células vegetales es posible de demostrar mediante las técnicas
de cultivo in vitro de tejidos vegetales y no es la vía inherente por la que la planta mantiene y
regenera sus tejidos y órganos.
En general, el panorama de la biología del desarrollo se está enfocando en entender los
mecanismos moleculares que regulan, inducen y participan en general en los diversos tipos de
regeneración existentes en plantas. Las tecnologías disponibles, de biología molecular e
imágenes microscópicas, muy seguramente nos permitirán llegar paulatinamente a un
entendimiento total de los mecanismos moleculares que ocurren en los procesos de formación de
las planta.
Los diversos y enormes avances realizados en las últimas décadas y los que se continúan
publicando son de vital importancia para la biotecnología vegetal. Conocer los mecanismos
mediantes los cuales las plantas realizan las complejas interacciones en sus procesos de
regeneración, se vuelven indispensables para optimizar aún más la producción vegetal para tener
respuestas tecnológicas que estén acordes con la sobrepoblación y los cambios climáticos a los
que nos enfrentamos desde ya y de forma irremediable en los próximos años . Con ello la
biotecnología vegetal podría garantizar la disponibilidad de alimentos, no sólo por
micropropagación sino también, mediante alimentos modificados genéticamente. No es
61
descabellado pensar que el ser humano llegará a un nivel de conocimiento de los procesos de
regeneración vegetal que le permita manipular y editar la expresión de genes vegetales.
Desde una perspectiva académica y profesional, el presente trabajo ha permitido realizar
un ejercicio arduo de lectura y actualización de literatura científica, así como de procesos de
búsqueda, selección y análisis de la información científica, actividades inherentes a la profesión.
Independientemente de la rama o disciplina, el mantenerse actualizado en los últimos avances
científicos le permite al investigador, profesional o estudiante estar a la par con la comunidad
científica internacional.
Este documento nació de la curiosidad que hace parte de la naturaleza de cualquier
investigador, la necesidad de comprender los procesos que ocurren dentro de la planta, dentro de
cada célula, cada interacción molecular es lo que mueve a la comunidad científica a desarrollar
investigaciones que den respuesta a las constantes preguntas que no dejan de aparecer en la
biología. Es por eso que las bases que se dejan en este trabajo, con suerte llevarán a quien lo lea,
a querer profundizar estos conceptos y en el mejor de los casos a plantear investigaciones que se
conviertan en un aporte para esta rama del conocimiento.
62
5. Conclusiones
Los últimos avances de la investigación en los procesos de regeneración vegetal permiten
concluir que:
● Los callos inducidos por medio de organogénesis de novo, ya sea a partir
de explantes radiculares o de explantes aéreos, no poseen identidad embrional. Sino que
son muy similares a primordio de raíces laterales.
● Los callos formados por organogénesis de novo en tejido radicular y tejido
aéreo, se forman a partir de células pericíclicas y células similares a las pericíclicas
respectivamente.
● El proceso mediante el cual las células pericíclicas y las células similares a
las pericíclicas generan un callo, se considera un proceso de transdiferenciación y no de
dediferenciación
● No todas las células somáticas de la planta son totipotentes.
● Tanto las células madre meristemáticas como las células madre no
meristemáticas, son pluripotente, ya que no tienen la capacidad de generar tejido
embrional directa y autónomamente.
● Los procesos intermedios de regeneración vegetal, pueden separarse en
tres categorías para facilitar su estudio: (a) adquisición de competencia celular, (b)
formación de células progenitoras y (c) destino celular y patrones de desarrollo.
● El comprender los procesos moleculares mediante los cuales una planta se
regenera son de vital importancia para los avances de la biotecnología vegetal.
63
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