Aislamiento de los alcaloides de los extractos crudos de Sedum

oxipetalum y Sedum praealtum y estudiar la actividad antifúngica del

extracto etanólico de cultivo de células en suspensión de Fouquiera

splendens sobre hongos de importancia médica

RESUMEN

Debido al incremento inmoderado de la población se puede observar en la actualidad.

Se han iniciado una serie de proyectos científicos que plantean posibles soluciones para

el control de la sobrepoblación, tomando en cuenta la salud de los consumidores.

Debido a esto el interés principal de esta investigación es encontrar un anticonceptivo

espermicida que no produzca efectos secundarios y que tenga un 100% de efectividad,

estudiando el extracto clorofórmico de Sedum oxipetalum y el extracto etanólico de

Sedum praealtum D.C. en donde se aislo una fracción de Sedum praealtum que

presenta una actividad contra los espermatozoides del 90% en comparación a la del

testigo positivo Nonoxinol-9 que presentó una actividad del 68%. También se aislaron

dos alcaloides del extracto clorofórmico de Sedum oxipetalum, pero no se pudo probar

su actividad espermicida, debido a que no fueron solubles en solución salina.

Asimismo se estudió la actividad antifúngica del cultivo de células en suspensión de

Fouquiera splendens sobre hongos de importancia médica, en donde se encontró que los

callos obtenidos del cultivo de células en suspensión la presencia de los siguiente

metabolitos secundarios: alcaloides, flavonoides, azúcares reductores principalmente.

El extracto obtenido de cultivo de células en suspensión de Fouquiera splendens es

capaz de ejercer un efecto antifúngico en un 36% contra 17 cepas de interés médico.

INTRODUCCION

El uso de plantas para tratar enfermedades es posible que sea tan antigua

como la humanidad misma.

Desde hace muchos años atrás el hombre ha recurrido al empleo de las

plantas, con la finalidad de aliviar sus malestares, apoyándose de igual manera

del uso de sustancias de origen animal y junto a esto diversos ritos mágicos.

(7)

Conforme al paso del tiempo fueron surgiendo grandes tratamientos empíricos,

y casi al mismo tiempo la medicina tuvo avances muy importantes, naciendo un

concepto en donde se mencionaba que cuanto más drástico fuera el

tratamiento, mejores eran los efectos.

Uno de los mitos que han nacido concierne a los medicamentos, en el

momento en que la industria farmacéutica moderna empezó a fabricar

productos sintéticos, fue la idea de que solo los medicamentos de este tipo

resultan eficaces.

Esto es basado en las diferentes pruebas que se realizan a los laboratorios de

investigación (8)

Cuando hablamos de la sobre valoración de los medicamentos de patente,

hace que olvide una gran verdad, como son los remedios que proporciona la

herbolaria los cuales también son eficaces, en ocasiones mejores en

comparación de los sintetizados que se investigan en los laboratorios.

Al surgir la industria farmacéutica, se les obligo a los químicos descubrir y

aprender nuevas técnicas de aislamiento, con la finalidad de poder obtener los

principios activos de las plantas y luego poder sintetizarlos. (8,9)

De este modo la industria farmacéutica comenzó a crecer en el mercado, con el

tiempo el químico logro desarrollar la síntesis de nuevas sustancias, y por lo

tanto el aumento de nuevos medicamentos de patente, lo cual producía que

fuera menguando el interés por la herbolaria.

En la actualidad un grupo de científicos se han dado a la tarea de realizar

estudios e investigaciones sobre los efectos secundarios que llegan ha producir

los ingredientes activos purificados de algunos fármacos “nuevos”, que en

comparación a los medicamentos vetustos sin purificar no tenían, y la pregunta

de ellos es si habrán pasado por alto otras sustancias producidas por la misma

planta, que minimicen los efectos colaterales de los principios activos. (9)

Argumentan que las posibles soluciones es saber el momento adecuado para

poder recolectar la planta, sugiriendo que la actividad máxima es en el

momento de la floración, sin embargo no solo ese es uno de los puntos

principales ya que depende en la época en la que recolecta, el uso de la planta

en su estado fresco o seco, emplear distintas poblaciones de una especie o

especies relacionas alterando la eficiencia y la estabilidad de los principios

activos.

Las empresas farmacéuticas al comprender el gran provecho que se puede

obtener de la herbolaria, se han puesto a estudiar seriamente las plantas

medicinales para determinar cueles son las plantas que presentan una

actividad farmacéutica y como es que lo presentan y el por que, ya teniendo los

puntos anteriores solo queda poderlas aprovechar. Las plantas siguen

proporcionando la materia prima da gran numero de fármacos que son usados

actualmente en el tratamiento de las enfermedades. (8, 9,10)

En el campo de herbolaria, botánicos, médicos y farmacólogos trabajan juntos

con la finalidad que sea posible que esta área se transforme en un recurso mas

valioso enfocado a los miles y millones de personas que no pueden contar con

otros medios para la cura de sus males. (10, 11)

Actualmente científicos han comprobado el valor de 90 especies que sirven

como medicamentos, y los han ordenado según 62 categorías terapéuticas que

incluyen remedios para aliviar las afecciones cardiacas, la gota y la

hipertensión arterial, laxantes, descongestivos de las vías respiratorias,

analgésicas, anestésicos, sedantes, antidepresivos, anticonceptivos etc. (11).

En el futuro, se podrán utilizar nuevas tecnologías que podrán facilitar la

obtención de metabolitos secundarios que posteriormente se podrían utilizar

como fármacos (10,11).

CULTIVODECÉLULASENSUSPENSIÓN

Estatécnicaserealizamedianteunadisgregacióncelularpormediosmecánicos(agitacióncon

stante)enunmediodecultivolíquidoelcualposeeloselementosesenciales(macronutrientes,micronut

rientesyhormonas)disueltosenagua,loquepermitiráunaumentodelamasacelulardelcultivodurantel

aincubación.[6]

Loscultivospuedendiluirseparaobtenersub-

cultivosconunpatrónsimilardecrecimientoydarunrendimientosimilaraldelmaterialcelularsiempreyc

uandosesometaalasmismascondicionesyperiodosdeincubación.[2]

Lasíntesisdemuchosmetabolitossecundariosnoescosteableporloquelabiotecnologíaesun

abuenaalternativa.Ladecisióndeproducirunasustanciapormediosbiotecnológicosdepende,nosolo

delacuestióneconómica,sinotambiéndelacapacidadbiológicayaquedebe

elegirseadecuadamenteelsistemaproductorylascondicionesóptimasdecrecimientodelascélulasve

getales.[3]

Contodoloanteriorplanteado,sepresentandiferentesventajasenproducirsustanciaspormed

iodecélulasvegetales,encomparaciónconlasíntesisquímica;entreellastenemos:

Controlprecisoyfinodelmedioambiente. Fácilobtencióndereplicasidénticas(líneahomogénea). Costeables. Condicionesdeproducciónmenosseveras(reducciónenelusodeaparatoscostosos). Aportedelosnutrientesnecesariosparaelcrecimientoóptimodelaplanta. Evitarsobreexplotaciónderecursosnaturales,enestecasolaplantadeinterés.

Todaslasespecies,incluyendoaquellasa

únsindescubriroactualmentepercibidascomo"si

nningúnvalor",tienenelpotencialdeproporcionar

nosproductosquesalvenvidas.[4]

FouquieriasplendensCOMOALTERNATIVADEESTUDIO

Elsabertradicionalsobreelusomedicinaldelasplantasnoshallevadoalabúsquedadenuevosr

ecursosmedicinales;debidoaestosedecidiórealizarelestudioenunaplantadelafamiliadelasfouquier

aceas.

Lascactáceassonplantasperennes,suculentas;generalmenteespinosas;lasespinassonvar

iablesentamaño,forma,consistencia,colorydisposición;presentanunfrutosecoojugosoconnumero

sassemillas.Poseen

3

hermosasfloresconinteresanteanatomíadesus

estructuras,lasmodalidadesdesufisiología,indic

adorasambasdesuadmirableadaptaciónalaseq

uíayenlosúltimosañossondegraninteréscientífi

codebidoalavariedaddesustanciasquesepuede

nextraerdeellasyquetienenunampliousoenlasin

dustriasalimentaría,farmacéuticayquímica.Alg

unascactáceasproducenungrupodesustancias

químicasdeespecialinterésporsuspropiedades

farmacológicasconocidascomoflavonoides,loscualespresentanunaactividadantifúngica;u

naespeciedeFouquieraceaequepresentadichaactividadesFouquieriasplendensconocidatrivialme

ntecomoOcotillo,RotillaoAlbarda.

Fouquieriasplendens

esunarbustobajo,de2-

10mdealtura,troncobasalcorto,de(7)15a25(40)cmdediámetro,ramificadocercadelabase

en6a30(100)talloserectosorecurvados,cortezaexternaverdeacafé-

amarillenta,exfolianteenpequeñastiras,

espinasde(5)15

25(42)mmdelargo,rectasocurvas;hojasdelosbrotescortos(2)4-

11mmdeancho,agudasaredondeadasyemarginadasenelápice,cuneadasenlabase;panículaestre

chamente

de(9)1020(30)cmdelongitud,raquisdecolorpúrpuraarojizo;sépalosanaranjado-

rojizos,rosadosablancoamarillentos,ampliamenteovados,oblongosacasireniformes,de4.5-

6(9)mmdelongitud,3.55.5mmdeancho,obtusosaemarginadosenelápice;corolaanaranjado-

rojiza,rosadopurpúrea,rosadoamarillentaaamarillaclara,de10.528mmdelargo,tubode6.5-

22mmdelargo,por3.5a6mmdeanchoenlagarganta,pubescenteensuinteriorconunabandade2-

5mmdepelosunicelularescercadelabase,lóbulosfuertementereflejos,de4.5-

7mmdelongitudy3.5a5mmdeancho,ampliamenteovadosaelípticos;estambres(12)14-

16(20),filamentosde(8)12a25(34)mmdelargo,ensanchadosenlabase,conunespolóntruncadoadax

ialde1.5mmdelargo,anterasde45mmdelargo;ovariode1.52mmdealto,óvulos12-

16,estilode8.5a32mmdelargo;cápsulaslanceoladasaovadolanceoladasencontorno,de(12)14-

22mmdelongitudy57mmdediámetro;semillas513,blancas,de7a13mmdelongitud,4-

6mmdeancho,conalashastade5mmdeancho.Suaprovechamientocomoartesanal,construcciónya

grícolaseregulaporlanormaoficialmexicanaNOM005RECNAT1997

ysuaprovechamientocomocomestibleymedicinalesmásbiendeautoconsumoesreguladoporlanor

maoficialmexicanaNOM007RECNAT1997. [ 10 ]

Principalmenteesusadaenlassiguientesactividades:Agrícola:comocercasvivas.Artesanal:seusae

nlaelaboracióndeartesanías.Comestible:losfrutossoncomestibles.Construcción:comopostesyvig

as.Medicinal:untintefrescodelacortezaesútilparasíntomaspresentadosdebidoalacongestiónflúida;

otrasaplicacionesincluyenlarelevacióndelafatigabañándoseenelaguaquecontienelasfloresolasraí

cesmachacadas.Muchastribusindiasdivulganquelasfloresylasraícesdelocotillosoncomúnmentec

olocadasenlasheridasfrescasexcesivas,ayudandoasanarmásrápidamente.Ocotillotambiénseutili

zaparaaliviarlatos,lasvenasvaricosas,lasinfeccionesdelazona

urinaria,yloscrecimientosbenignosdelapróstata.[12]

MICOSISPRODUCIDASPORHONGOSDEINTERESMEDICO

Lasmicosissoninfeccionescrónicas,causadasporhongos.Puedenafectarlapiel,peloyuña

s(micosissuperficiales),asícomoinvadirtejidosyórganos(micosisprofundas)causandoenocasion

eslamuerte.Algunosgruposdehongos,deinterésmédicoson:

Dermatofitos Candidaspp. Cryptococcusspp. Hongossaprobios

MICOSISOPOTUNISTAS

• Candidosis

InfeccióncausadaporlevadurasoportunistasdelgéneroCándida,(Tabla1.)afectamucosas(

Figura5.),piel,uñasyocasionalmenteórganosinternos.Sinonimia:candidiasis,moniliasis,muget,alg

odoncillo,blastomicosisLascandidasagrupan80especies;lasdeimportanciamédicason:

Cándidaalbicans,Cándidatropicalis,Cándidaparapsilosis,Cándidakrusei,Cándidaguillliermondii,

CándidaglabratayCándidakefyr.[13]Agentesetiológicos

albicanstropicallisCándida kruseiglabrata

Tabla1.MuestrauncuadrodelasespeciesdeCandidaca

usantesdelascandidosis.

Víasdecontagio

Lacandidosisnoestálimitadageográficamente,porquelaenfermedadocurreprincipalmente

enpacientespropensosaunsobre-

crecimientodesupropiabiotalevaduriformeporfactorespredisponentescomoSIDA,procedimientos

quirúrgicos,iatrogeniasinmunosupresivas,catéteresintravenosos,administraciónprolongadadeag

entesantimicrobianos,quimioterapiacitoreductiva,neutropenia,enfermedadeshematológicasmalig

nasyabusodedrogasintravenosas.

Lesionescausadas

Figura5.MuestraunalesióncausadaporelgéneroCandida,conocidacomoalgodoncilloocandidosisbucalen

• Criptococosis niño.

Infecciónfúngicasubagudaocrónicacausadaporlalevaduracapsulada,oportunistaymonom

órficadenominadaCriptococcusneoformans.Lasespeciescausantesdelacriptococosissemuestran

enlaTabla2.[14]

AgentesEtiológicosneoformansvar.neoformanss.

Criptococcus neoformansvar.gattii

Tabla2.MuestralasEspeciesdeCripococcuscausantes

delascriptococósis.

Víasdecontagio

Laprincipalvíadeinfeccióneselexcrementodepalomaysueloscontaminadosconexcretasde

gallina,otrasavesyelcontactoconEucaliptoscamaldulensis.Laslesionescausadasporunameningiti

scriptococosicasemuestranenlasFiguras6y7.

Lesionescausadas

Figura6.AspectodelaafecciónencefálicaconalteraciónextensadelaestructuracorticalyFigura7

.LesionesenelPallidum,deaparienciadelasustanciablancasubcort

ical,quemucoideycontornosredondeados

adoptanunaaparienciagelatinosaen

unanítidoscorrespondientesacoloniasde

meningitiscriptococósica.Lasflechascr

iptococosenunameningitis

anexas,muestranelsitiodelalesión.criptococósica.Laflecham

uestraelsitiodelalesión.

Dadalaparticularresistenciadelasmicosisacualquiertratamiento,laprevenciónconstit

uyeunamedidaprimordialparaevitarlasdesagradablesconsecuenciasdeestetipodeenferme

dades.Muchasafeccionesfúngicassetransmitenpormediodelosanimales,enespecial,atravé

sdelosperros,peroloquesusdueñosdeberáncuidardelasaluddelanimalparaevitarcontagios.

Enlosclimastropicales,dondelascondicionesambientalessonóptimasparaeldesarrollodetod

otipodehongos,sedeberátomarlaprecaucióndedesinfectarcualquierheridaconprontitudyefic

acia.Enverano,esnecesarioextremarlasmedidashigiénicas,enparticular,allavarselospies,s

edebensecaraconciencialaszonasinterdigitales.

Encuantoaltratamiento,enelcasodeunamicosissuperficial,sellevaacabomediantelaaplicac

iónlocaldecremasylocionesfungicidas;cuandolainfecciónesextensayresistente,elmédicopuedepr

escribirlaadministracióndeantibióticos,comolagriseofulvina,entreotros.Lasmicosisinternassonde

difíciltratamiento,sibienalgunasrespondenconrelativaeficaciaalaaccióndelaanfotericinaB.[15]

Aislamiento de los flavonoides del extracto crudo de etanol de sedum

praealtum D.C. (Silvestre) con actividad eseprmicida

La planta fue recolectada en el Estado de Morelos, posteriormente se peso, se

lavo y fragmento, después se somete a una extracción, por el método de

maceración, el cual consiste en dejar a la planta sumergida en un disolvente

apropiado para que penetre bien en la estructura celular y disuelva los

metabolitos solubles, esto se efectúa durante un periodo largo, a temperatura

ambiente. Generalmente se usa la maceración cuando la planta contiene

principios activos que se perderían o quedarían modificados por acción del

calor. En este caso, la especie vegetal Sedum praealtum DC, estará en

contacto con etanol a temperatura ambiente durante un tiempo determinado,

posteriormente se evapora el disolvente por presión reducida.

Una vez obtenido el extracto etanólico, se procede a una extracción de este

con acetona, mediante evaporaciones.

ANÁLISIS FITOQUÍMICO

En la búsqueda de plantas con principios activos se requiere que el recolector

viaje varias horas a veces se conoce de antemano la especie que será

recolectada. Cuando se esta inseguro se busca material perteneciente al

genero de planta hallada. En dichas situaciones es muy útil en el campo, las

pruebas químicas sencillas, sensibles, especificas, lapidas y que requieran

equipo mínimo, económico y fácil de transportar. Para este proyecto se

realizaron pruebas químicas para la determinación de metabolitos secundarios.

(28)

PESAR Y FRAGMENTAR LA ESPECIE VEGETAL

REALIZAR EXTRACCIÓN CON AGUA, ETANOL, CLOROFORMO,

SOMETER A REFLUJO POR 30 MINUTOS

METABOLITOS

Alcaloides; compuestos principalmente nitrogenados lo cual les confiere

basicidad y por lo tanto pueden ser protonados con facilidad con acido. En las

plantas son encontrados en forma de sales orgánicas. Poseen actividad

farmacológica y son biosintetizados a partir de aminoácidos (28).

Flavonoides; se encuentran ampliamente distribuidos en la planta de forma

libre o como glucósidos, son los que contribuyen a darle color a la flor y al resto

de la planta (28).

Cumarinas; son benzo- - pironas, inhiben la germinación de la semilla y en

pequeñas concentraciones favorece el crecimiento de la raíz (28).

Saponinas; son grupo de glucósidos, los cuales se disuelven en agua y

disminuyen la tensión superficial del agua (28).

CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA SEPHADEX

Su fundamento se basa en la separación de sustancias puras de mezclas

complejas. Esta técnica depende del principio de absorción selectiva. En un

principio se utilizo para la separación de los pigmentos de las plantas (clorofila).

En el proyecto fue utilizado para la separación de los metabolitos que presenta

la planta en este caso la extracción de las flavonoides. En donde a medida que

se va filtrando la disolución por la columna, cada componente precipita a

diferentes velocidades, los cuales son recolectados en distintos viales ya

previamente etiquetados.

La cromatografía es un método analítica de separación de mezclas de

compuestos químicos con fines cualitativos y cuantitativos, mediante el cual los

componentes se distribuyen entre dos fases, móvil y estacionaria.

fase móvil; es el solvente o eluyente, el cual puede ser liquido o

gas.

Fase estacionaria; es absorbente o soporte del tamaño de partícula fina, generalmente se utiliza sílica gel, celulosa, alumina.

una muestra es introducida en la parte superior de la columna de resuspende

con un solvente adecuado que en este caso su utilizo metanol y se deja correr

la muestra durante un cierto tiempo determinado, se coloca la lámpara de

ultravioleta en la columna para observar que la muestra se este corriendo

adecuadamente y que la muestra salga por completo sin dejar restos en la

columna, la muestra se recolecta en viales los cuales tienen que estar ya

rotulados y por ultimo se almacena a temperaturas bajas.(29)

PRUEBAS BIOLÓGICAS.

Para la toma de la muestra biológica se debe de considerar:

Edad del donador, por lo general debe de estar entre los 20 y 24 años.

No haber tenido relaciones sexuales, 3 días antes. Se recoge la muestra en un cristalizador estéril. Todo se trabaja inmediatamente y a temperatura ambiente.

Esto según el Manual de Laboratorio de la OMS. Viabilidad de los espermatozoides.

La viabilidad espermática refleja la proporción de los espermatozoides totales

que están vivos de acuerdo al criterio de exclusión de algún colorante vital o

mediante la expresión de su capacidad osmorreguladora cunado se le somete

a condiciones hipo-osmóticas .

Después de la viabilidad se hace un conteo de espermatozoides teñidos con

eosina al 0.5% con el fin de observar a los muerto (se colorean de color rojo)

vivos e inmóviles(30).

TABLAS DE LOS RESULTADOS

DE LA CUENTA ESPERMICIDA A DISTINTAS CONCENTRACIONES EN UNA CUENTA TOTAL DE 100

ESPERMATOZOIDEZ

Concentración g/ml Concentración 3.5 g/ml

Cuenta total Cuenta total

36 42 22

25 54 21

Concentración 5 g/ml

Concentración 10 g/ml

Cuenta total

17 60 20

GRAFICA DE RESULTADOS

VIVOS INMOVILES MUERTOS

6 7 3

8 8 3

6 4 4

2 4 2

2 5 3

3 6 3

9 8 4

VIVOS INMOVILES MUERTOS

5 4 1

2 15 4

7 12 3

2 4 2

4 7 4

2 9 3

3 1 4

VIVOS INMOVILES MUERTOS

10 76 14

VIVOS INMÓVILES MUERTOS

5 16 6

3 7 2

5 14 3

3 6 1

1 17 8

0

20

40

60

80

100

% d

e la a

cti

vid

ad

esp

erm

icid

a

1 3.5 5 10

Concentracion en g

Efecto espermicida de Sedum

praealtum DC comparado con el

estandar (Nonoxinol-9)

Nonoxinol

Sedum

praealtum

GRAFICA 1:

Se muestra en la grafica el % de la actividad espermicida de los flavonoides del extracto Sedum praealtum DC en las muestras biológicas de humano (semen), comparando estos resultados con el % de actividad espermicida del estándar (Nonoxinol-9) y visualizando que los metabolitos extraídos (flavonoides) de la planta poseen una mayor y mejor efectividad espermicida por lo que satisface nuestros objetivos principales.

GRAFICA 2:

En la grafica podemos observar el incremento de espermatozoides en humano

inmóviles conforme se tiene un aumento en la concentración del extracto de

Flavonoides de Sedum praealtum D.C. en comparación del estandar

(nonoxinol-9) por lo que se cumple en uno de los objetivos planteados.

ElpresentetrabajosedesarrollaráenlasinstalacionesdeloslaboratoriosdeFisiologíaVegetal

deldepartamentodebotánica,deFitoquímicadeldepartamentodeFarmacia,deMicologíaMédicadel

0

10

20

30

40

50

60

70

80

Nu

me

ro d

e e

sp

erm

ato

zo

ide

s

10 35 50 100

Concentración en g/ml

CUENTA DE LA ACTIVIDAD ESPERMICIDA A

DISTINTAS CONCENTRACIONES DEL EXTRACTO

Sedum praealtum D.C.

VIVOS

INMOVILES

MUERTOS

departamentodemicrobiologíayenlacentraldeinstrumentacióndeespectroscopiadelaENCB,siguie

ndolasiguientemetodología:

MetodologíarealizadaenellaboratoriodeFisiologíavegetal.

• PreparacióndeagarysolucionesparaelmediodecultivoymediodecultivoMS.

• MACRONUTRIENTES

Composición:(NH4)NO3(16.5g),KNO3(19.0g),CaCL2⋅2H2O(4.4g),MgSO4⋅7H2O(3.7g)

,KH2PO4(1.70g),NaH2PO4⋅H2O(0.85g).

Procedimiento:Pesarcadaunodelosreactivosmencionados,ydisolverlosenunvolumen

deaguaaproximadode100ml,aforarhastaunvolumende250ml.

• SOLUCIONEDTA

Composición:Na2EDTA⋅2H2O(0.744g),FeSO4⋅7H2O(0.556g)

Procedimiento:Pesarcadaunodelosreactivosmencionados,ydisolverlosenunvolume

ndeaguaaproximadode50ml,aforarhastaunvolumende100ml.

• MICRONUTRIENTES

Composición:MnSO4⋅4H2O(2.23g),ZnSO4⋅7H2O(0.86g),H3BO3(0.62g),KI(0.083g),N

a2MoO4⋅2H2O(0.025g),CuSO4⋅5H2O(0.0025g),CoCl2⋅6H2O(0.0025g)

.

Procedimiento:Pesarcadaunodelosreactivosmencionados,ydisolverlosenunvolumen

deaguaaproximadode100ml,aforarhastaunvolumende250ml.

• AGAR

Composición:Macronutrientes(12.5ml),Micronutrientes(0.625ml),EDTA(1.25ml),Soluciónde

Vitaminas(0.25ml),Mioinositolsólido(0.1g),Sacarosasólida(15.0g),ANA(1.0ml)

,BAP(25ml).

Procedimiento:Medirypesarcadaunodelosreactivosmencionados,disolverlosenunvolumend

eaguaaproximadode500ml,ajustarelpHa5.7conayudadeunasolucióndeH2SO4

concentradoparadisminuirloyunasolucióndeNaOHparaaumentarlo,aforarhast

aunvolumende1L.Enunmatrazerlenmeyerdisolver8gdeagarenlasoluciónanter

ior,calentarhastaebulliciónsinquesesubalaespuma.Ambientarsindejarenfriar.

• MEDIODECULTIVOSÓLIDO

Composición:Macronutrientes(12.5ml),Micronutrientes(0.625ml),EDTA(1.25ml),Soluciónde

Vitaminas(0.25ml),Mioinositolsólido(0.1g),Sacarosasólida(15.0g),ANA(1.0ml)

,BAP(25ml)yagar.

Procedimiento:Verterenvasosdegerberaprox.2.5mldelagarpreparado,taparconpapelalumini

oyesterilizar.

•

Obtencióndematerialfoliarparamétododemaceracióneidentificacióndemetabolitospresentesenelextracto. SeleccióndelaespecieFouquieriasplendens. Desprenderlashojasdeltalloquenopresentaranunaaparienciaóptima(lasdemejoraparienciasemantieneneneltallo). Cortarlashojasen3partes. Pesarlashojasobtenidas. Lavarlasconaguadestilada. Colocarlashojasenunmatrázerlenmeyercon100mldeetanoldetalmaneraquesecubranporcompleto. Dejarreposardurante1mes.

• ObtencióndetejidocallosodeFouquieriasplendens. Separardelaramalashojasquefueronseleccionadasdemejorapariencia. Lavarlascondetergenteyenjuagarlasconaguacorriente. Prepararlazonaestéril(campana). Yaenlacampana,colocarlashojasenunvasoconhipocloritoestérilconelfindedesinfectarlos. Realizar3lavadosconaguadestiladaestéril. Realizarcortesdelosextremosalashojasysembrarlazonacentral. Colocar6hojasencadarecipienteconmediodecultivo. Etiquetarelmaterial. Colocarlosrecipientessembradosencondicionesdetemperaturayluzóptimosparasucrecimiento.

Figura8.Muestraladistribucióndelashojasdentrodelosrecipientesconmediosólido.Siembraenmediosólido.

Figura9.Muestraelcrecimientodelcultivocelularenmediosólido.

• CultivodecélulasenSuspensión. Prepararmatracesconaprox.25ml.demediodecultivolíquido(sinagar). Cubrirlosconpapelaluminioyesterilizar. Seleccionarloscallosquepresentenmejorcrecimiento(quenoencuentrenoxidadosnipodridos)ypesarlacantidaddecallopresenteenéstos. Transferirloscallosalosmatracesantespreparadosencondicionesdeesterilidad. Cubrirlosmatracesconpapelaluminioycolocarlosenagitaciónconstanteybajocondicionesdefotoperiodo(24x24luzsombra)parasuóptimocrecimiento.

• VerificacióndeCrecimientodelascélulasensuspensión. Seleccionar3delosmatracesconmediolíquidosembrados TransferiramatracesNefelométricos. Medirladensidadópticaportriplicado. Incubarenlasmismascondicionesparaobtenerlaproliferacióndelacélulasensuspensión Tomar3lecturascadatercerdíaportresocasionesparaverificarelcrecimiento.

Metodología realizadaenellaboratorio de Fitoquímica.

PruebasfitoquímicaspreliminaresdelextractoetanólicodelmaterialfoliardeFouquieriasplendens Filtrarelmaterialfoliarcontenidoenetanolconayudadeunalgodón Realizar3lavadosconetanalalmaterialfoliaryvolverafiltrar Conayudadeunrotavapor,evaporareletanolhastaunvolumenaproximadode5ml Realizarlasiguientespruebasfitoquímicaspreliminares: Alcaloides FlavonoidesGlucósidoscianogenéticosSaponinasTaninosQuinonasCumarinas-

GlucósidoscardiacosSesquiterpenlactonas

• Obtencióndelabiomasadelextractodelcultivodecélulasensuspensión. Filtrarelcultivodecélulasensuspensióndetodoslosmatracessembradosconayudadepapelfiltromillipore Realizar1lavadosconetanolalmaterialcelularyfiltrar. Conayudadeunrotavapor,evaporareletanolhastaunvolumenaproximadode5ml. Secarcompletamenteeletanolcongasdenitrógeno Pesarlabiomasaobtenidadecadamatraz. Mantenerenrefrigeraciónlabiomasaobtenida.

MetodologíarealizadaenellaboratoriodeMicologíamédica.

• Determinacióndelacapacidadantifúngicadelextractoetanólicodelascélulasen

suspensióndeFouquieriasplendens.Lapruebadesusceptibilidadaantifúngicosserealizasiguie

ndoelprotocolodeldocumentoM27-

ATheNacionalComitéforClinicalLaboratoryStandards,porelmétododelamicrodilución(CLSIM27-

A2,1997;EUCASTFungi,1999;IVCursoHispanoArgentino,2001).

ParaéstapruebaseutilizacomocepasdecontrolC.kruseiATCC,C.albicansATCC,C.parapsilosisAT

CC,C.dubliniensisUNAM;estoconlafinalidaddetenercertezaenlosresultadosobtenidos,lapruebade

scritaacontinuaciónserealizóporduplicado:

1. PREPARACIONDELMEDIORPMI

Composición:NaHCO3(2.0g),RPMI1640(10.4g),MOPS(Ácidomorfolinopropanosulfónico)(34

.53g),Glucosa(2.0g)

Procedimiento:Disolveren900mldeaguadestiladaestérilelmedioRPMI,añadirelMOPSparaalc

anzarunaconcentraciónde0.165mol/L,agitarhastadisolverse,ajustarelpHa7au

natemperaturaambienteusandoNaOH1mol/L;esterilizarporfiltraciónalvacío.Al

macenara4ºCantesdeusarlo.

2. PREPARACIONDELEXTRACTO

Pesar64/mgdebiomasaobtenidadeFouquieriasplendenseneltuboeppendorf. Encondicionesestériles;disolverelextractoen1mldeetanol(disolventedelextracto). Adicionar4mldeaguaparaobtenerunadilución1:5,[]=128000g/ml Filtrarpormediodeunamembranamilliporede0.22m(soluciónmadre). Realizarunaseriededilucioneshorizontales1:2delextractoconeldisolvente(agua),partiendodelasoluciónmadrehastaobteneruna[]=25g/ml(10dilucioneshorizontales). Apartirdelasdilucionesrealizadasenelpasoanterior,realizarunaseriededilucionesverticalesdecadatubo1:50conmedioRPMI(5ml),obteniendoconéstasconcentracionesde256g/mlhasta0.5g/ml.Detalmaneraqueeldiagramadeflujoeselsiguiente:

TECNICACLSIM27A2DIAGRAMA

ClinicalandLaboratorystandardInternational

PreparacióndeExtracto

Filtraciónpormembranamillipore

etanol4mlagua [12800g/ml]

[6400g/ml][25g/ml]

Diluciones1:50

128,64,32,16,8,4,2,1g/mlDiagrama1Muestraeldiagramadeflujodel

ametodologíarealizadaparalatécnicaCLSIM27A2paralasdilucionesdelfluconazolydelextracto. 3. PREPARACIONDELINOCULO

Teneruncultivode24hrs.delascepasincubadasa35ºC.Asegurándosedesupureza.Lacepasesembrarápor24hrsantesenmedioPDAparapromoversucrecimiento. PrepararunasuspensióndelevadurasenmedioRPMI,ajustandolaturbideza0.5;estoselograrápreparandoconanterioridaduntubode0.5unidadesdeMcFarlanda530nm,demaneraqueseusecomopuntodecomparaciónparaobtenerlaturbidezdeseadaconelfindeahorrartiempo,yaqueelextractopodríaperdersuefecto. Unavezobtenidalaturbidezdeseada,agitarvigorosamentedurante15seg.Estasuspensiónc

ontieneentre1–5x106

UFC/ml. Realizarlospasosanterioreshastaprepararlascepasdesignadas,lascualessonlassiguientes:

C E P A S E M P L E A D A S

Cándidaalbicans9aisladoclínico Cándidaglabrataaisladoclínico

Cándidaalbicans5aisladoclínico CándidadubliniensisUNAM

Cándidaalbicans8aisladoclínico CándidaalbicansATCC

Cándidaalbicans3aisladoclínico Cándidatropicalisaisladoclínico

Cándidadubliniensis2aisladoclínico CándidakruseiATCC

Cándidadubliniensis4aisladoclínico Geotrichums.p.aisladoambiental

Cándidadubliniensis9aisladoclínico Cryptococcus.gattii

Cándidadubliniensis8aisladoclínico Cryptococcusneoformansvar.neoformans

CándidaparapsilosisATCC

Tabla3.Muestralascepasempleadasduranteeltrabajodeinvestigación.

DIAGRAMA

Cepa

D.O.0.5RPMI

Diagrama2MuestraeldiagramadeflujodelametodologíarealizadaparalatécnicaCLSIM7-

A2paralapreparacióndelinóculo. 4. LLENADODEMICROPLACAS

Paraelmicrométodoutilizarmicroplacasde96pozos,fondoplanoyestériles.Sellenaránlasmicroplacasporcolumnasyseusaránpipetasmulticanaldemodoqueseaposiblellenarlas8filasdelasqueconstaunacolumnasimultáneamente.Parausarlaspipetasmulticanalesnecesariocolocarlassolucionesaunrecipientedereactivos,demaneraquetodaslaspuntasdelapipetapuedancargaralmismotiempo.

• Enlacolumna1secolocarán100ldeextractoconlamayorconcentración,enlacolumna2elextractoconlaconcentración128g/ml,yasíconsecutivamentehastallegaralaconcentraciónmásbajaenlacolumna 10. Lacolumna11seráelblancodereactivosocontroldeesterilidad,porlotantosolosecolocarámedioRPMI(200l),lacolumna12seránuestrocontroldecrecimientodelmicroorganismoporloqueúnicamenteseinocularálacepaempleadaenesafila(200l) Enlas2primerasfilas(A,B)secolocaráelinóculodeunacepa,yasísucesivamente,detalmaneraquelas17cepaspreparadasanteriormentequedeninoculadasporduplicado.Detalmaneraquelaplacaquedecomoseveenelsiguienteesquema:

Figura11.Muestraunesquemadelamicroplacaespecificandoelno.decolumnasyfilas,asícomolama

neraenquesesembróelextractoylacepa.

METODOLOGÍAINTEGRAL

Diagrama3.Muestraeldiagramadeflujodelametodologíaintegraldelproyecto.

.

RESULTADOS

Resultadosobtenidoseneldepartamentodebotánica.

• ObtencióndetejidocallosodeFouquieriasplendens.

Elcrecimientodeltejidocallosodelmaterialvegetalempleadotuvounrendimientodel76.92%,

estodebidoaquedelos13frascossembradosdelespécimen1frascodeellosfuecontaminado,tresfras

costuvieronpocoonulocrecimientoy10fueronlosfrascoscrecidosenóptimascondiciones(Grafica1),

porloqueseprocedióatrabajarconelmaterialcallosoobtenidosdeéstos10frascos

CRECIMIENTODECALLOS

14

12

10

10

8

6

4

2

2 1

0

TOTAL DE FRASCOS

FRASCOSCONC1

FRASCOS

CONTAMINADOSFRASCOSCON

SEMBRADOSPOCOONULO

CALLOOBTENIDOSCRECIMIENTO

Gráfica1.Muestraelcrecimientodecallosobtenidosdeltotalinicialdefrascossembradosconmaterialf

oliar.

CRECIMIENTODECALLO

Delos10frascosmencionadosanteriormenteseretiróelmaterialcallosoysepesó,obteniendol

osresultadosmostradosenlaTabla4.Lospesosreportadossondematerialcallosohúmedo.

No.DEFRASCO MASAOBTENIDA(g)

TOTAL

Tabla4.Muestraeltotaldemasadematerialcallosoobtenidadelosdiezfrascoscrecidaencondicionesóptimas.

•

ObtencióndebiomasaobtenidaapartirdelCultivodecélulasenSuspensión.Lo

sdatosdelabiomasaobtenidaencadaunodelos10frascosobtenidoscontejidocal

losoóptimoseobservanenlaTabla5.Lospesosreportadoscorrespondenalabiom

asasecadaconnitrógeno.

BIOMASAOBTENIDA

No.DEFRASCO BIOMASAOBTENIDA(mg)

TOTALDEBIOMASA

Tabla5.Muestraeltotaldebiomasaobtenidadelosfrascosempleadosconmaterialcalloso.

• Verificacióndelaproliferacióndelcultivodecélulasensuspensión.

PRUEBANEFFELOMÉTRICA

Alos3matracesNefelométricosempleadosselesmidióladensidadóptica,al1º

,3ºy5ºdíadesusiembra,observandoquealpasodelosdíasladensidadópticaibaenau

mento.TeniendolosresultadosmostradosenlaTabla6.

MATRAZ

PRIMERDIAD.O TERCERDIAD.O QUINTODIAD.O.

1 34 35 45

2 40 42 50

3 38 40 44

Tabla6.Muestralosdatosobtenidosdedensidadópticadelastreslecturasrealizadas

alosmatracesNefelométricosconcélulasensuspensión.

50 D E 45

N S 40 I D 35 A D 30

25 O P 20

T I

15 C A 10

5

0

DIA

MATRAZMATRAZMATRAZNEFELOMETRICONEFELOMETRICONEFELOMETRICO123

Gráfica2.Evidencíaelcrecimientodelascélulasensuspensiónamedidaquetranscurreeltiempomedi

antelatendenciadeunapruebaNefelométrica.

ResultadosobtenidosenellaboratoriodeFitoquímica

•

PruebasfitoquímicaspreliminaresdelextractoetanólicodelmaterialfoliardeFouquieriasplen

densobtenidoporelmétododemaceración.

Aplicandolastécnicascorrespondientesparalaidentificacióndelosmetabolitospresentesen

elmaterialfoliardelespécimenvegetalanalizadoseobtuvieronlosresultadosmostradosenlatabla7.

METABOLITOANALIZADO RESULTADO

OBTENIDO

ALCALOIDES

FLAVONOIDES +(Flavonasyxantonas)

GLUCOSIDOSCIANOGENETICOS

SAPONINAS

TANINOS +(Compuestosfenólicos)

QUINONAS

CUMARINAS

GLUCOSIDOSCARDIACOS +

SESQUITERPELACTONAS

Tabla7.Muestralosresultadosdelaspruebasfitoquímicasrealizadasalextractoetan

ólicodelmaterialfoliardeFouquieriasplendens.

• Pruebasfitoquímicasdelextractoetanólicodelcultivodecélulasensuspensiónde

Fouquieriasplendens.

Aplicandolastécnicascorrespondientesparalaidentificacióndelosmetabolito

spresentesenelextractoetanólicodelcultivodecélulasensuspensiónseobtuvieronlo

sresultadosmostradosenlatabla8.

METABOLITOANALIZADO RESULTADO

OBTENIDO

ALCALOIDES

FLAVONOIDES +(Flavonasyxantonas)

GLUCOSIDOSCIANOGENETICOS

SAPONINAS

TANINOS +(Compuestosfenólicos)

QUINONAS

CUMARINAS

GLUCOSIDOSCARDIACOS +

SESQUITERPELACTONAS

Tabla8.Muestralosresultadosdelaspruebasfitoquímicasrealizadasalextractoetan

ólicodelcultivodecélulasenuspensióndeFouquieriasplendens.

Resultadosobtenidosenellaboratoriodemicologíamédica

•

Determinacióndelacapacidadantifúngicadelextractoetanólico

delascélulasensuspensióndeFouquieriasplendens.

Laactividadpresentadadecadacepafueconsideradaenbasealospuntosdec

ortedelFluconazolparalevadurasdeCandidayaestablecidosloscualesson:

PUNTOSDECORTE

≤8g/mLS16-

32g/mLSDD64–128g/mLR

Detalmaneraqueúnicamenteserealizóunacomparacióndelosporcentajesdeinhibiciónpres

entadosdecadacepatratadaconelextractocontralamismacepatratadaconelantifúngicoFluconazolp

araobservardemaneracomparativalaacciónelespécimenenestudio.

Enbasealosresultadosdelporcentajedeinhibiciónpresentadoenlasgráficasanterioreslosre

sultadosobtenidosdelapruebaantifúngicarealizadaconsiderandolaactividadquepresentacadacep

aeslasiguiente:

CEPAEMPLEADA RESPUESTAALFLUCONA

ZOL

FLUCONAZOLCMI

50%

CMIEXTRACTOFouquierasplendensAL50%

g/ml

%DEINHIBICIONDELCRECIMIEN

TO

Cándidaalbicans9 S 1 mg/ml 1mg/ml32–1mg/ml

36,24

Cándidaalbicans5 R 128mg/ml 8 mg/ml 24,06

Cándidaalbicans8 R 128mg/ml 1mg/ml32–0.5mg/ml

17,37

Cándidaalbicans3 S 1 mg/ml 1 mg/ml 26,51

Cándidadubliniensis2

SDD 16 mg/ml 0.5mg/ml 32,75

Cándidadubliniensis4 R 128mg/ml

8mg/ml328mg/ml 36,02

Cándidadubliniensis9

S 8 mg/ml 32 mg/ml 36,21

Cándidadubliniensis8 R 128mg/ml 8 mg/ml 27,63

CándidaparapsilosisATCC S 8 mg/ml 64 mg/ml 12,2

Cándidaglabrata SDD 16 mg/ml 32 mg/ml 10,28

CándidadubliniensisUNAM S 4 mg/ml 64 mg/ml 18,66

CándidaalbicansATCC S 0,5mg/ml 0.5mg/ml 9,32

Cándidatropicalis R 64 mg/ml 64 mg/ml 12,21

CándidakruseiATCC R 64 mg/ml 2 mg/ml 21,68

Geotrichums.p. 4 mg/ml 25,18

Cryptococcusneoformansvar.gattii S 4 mg/ml 32 mg/ml 33,91

Cryptococcusneoformansvar.neoformans

S 4 mg/ml 0,25mg/ml 34,84

Tabla9.Muestralosresultadosobtenidosduranteladeterminacióndelaactividadantif

úngicadel extractoenlas17cepasempleadas.S=SensibleR=ResistenteSDD=Sensible

DependientedelaDosisCMI=Concentraciónmínimainhibitoria RESPUESTADELASCEPASALANTIMICÓTICODEREFERENCIA

Losresultadosobtenidosdelarespuestadelas17cepasempleadasalantifúngi

codereferencia(Fluconazol),considerandoqueelantibióticomencionadopresentai

nhibicióndel50%delcrecimientocomosemuestraenlagrafica20.

RESPUESTADELASCEPASALFLUCONAZOL

Gráfica20.Muestralarespuestadelas17cepasempleadasantelapresenciadelfluconazol,elcualfueelantifúngicodereferencia.Indicandoque:el38%delascepasempleadasmostraronresistenciaanteelantimicótico,el13%fuerencepassusceptiblesdependientesdeladosisyel49%deéstas,resultaronsersusceptiblesanteelfármacoempleado

PORCENTAJEDEINHIBICIÓNPRESENTADOCONELEXTRACTOETANOLICODEL CULTIVODECELULASENSUSPENSION

ElporcentajedeinhibiciónqueprodujoelextractodelcultivodecélulasensuspensióndeFouqui

erasplendenssemuestraacontinuaciónenlagráfica;sinembargocabemencionarquesepartióderefer

enciadelospuntosdecorteyaestablecidos,loscualesson:

%DEINHIBICIONDELCRECIMIENTOCONEXTRACTODEFou

quierasplendens

6% 29%

>30% 2029%

1019% 19%

Gráfica21.Muestralosporcentajesdeinhibicióndadasenlas17cepasempleadas,detalmaneraque:el36%delascepasmostróunporcentajedeinhibicióndemenordel30%;el29%delascepasmostródel20–29%deinhibición;el29%delascepasmostróunporcentajedeinhibicióndel10al19%yporúltimoel6%delascepasmostródel1al9%deinhibición.

Aislamiento y posible actividad espermicida de los

alcaloidesde Sedum oxipetalum

Se pesaron 100 g de extracto crudo etanólico y se disolvió en una mezcla de etanol-

agua, se adiciona cloroformo y ácido clorhídrico hasta un PH de 2 : la mezcla se dejó

agitar durante una hora. Posteriormente se le adicionó a la mezcla una solución de

hidróxido de amonio hasta un PH de 8. la mezcla se extrajo 3 veces con cloroformo y se

evaporó el cloroformo a presión reducida y de este modo se obtuvieron los alcaloides de

la plante,

Al extracto crudo se le efectuaron pruebas químicas preliminares, pruebas espermicidas

y se le practicó una cromatografía en columna para aislar los alcaloides.

Resultados

Se identificaron alcaloides del extracto crudo cloroformico. En la cromatografía en

columna se obtuvieron 249 fracciones de las cuales la fracción 1-19 y 170-229 se

aislaron 2 alcaloides.

Las pruebas farmacológicas del extracto crudo cloroformico a las siguientes

concentraciones presentaron los siguientes resultados: 10 µg/mL se observó 62% de

espermatozoides vivos y 37.1 de espermatozoides vivos a 35 µg/mL se observó 57.6 %

de espermatozoides vivos y 42.3 de espermatozoides muertos a 50 µg/mL se observó

57.5% de espermatozoides vivos y 42.0 % de espermatozoides vivos a 100 µg/mL se

observó 52.5% de espermatozoides vivos y 47.5% de espermatozoides muertos.

IMPACTO

Es importante haber identificado la fracción del extracto crudo etanólico de Sedum

praealtum D.C. que tiene una actividad espermicida del 90% en comparación al testigo

positivo Nonoxinol-9 que presentó una actividad espermicida del 68%.

También haber aislado dos alcaloides del extracto crudo de cloroformo de Sedum

oxipetalum, las cuales se enviaron al Depto. de Química del CINVESTAV para su

análisis de resonancia magnética nuclear y poder elucidar sus estructura químicas.

Asimismo, el extracto obtenido de cultivo de células en suspensión de Fouquiera

splendens es capaz de ejercer un efecto antifúngico en un 36% contra 17 cepas de

interés médico, estos resultados son muy importantes ya que no todas las plantas se

pueden obtener cayos y que éstos tengan actividad farmacológica.