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humberto-minjarez
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Aislamiento del productoAislamiento del producto
Luego de la formación del producto de interés procederemos a su aislamiento.
En este caso particular consideramos como producto:
ProteínaCAROLINA VITA
Aislamiento de una proteínaAislamiento de una proteína
Se requiere conocimiento de la Se requiere conocimiento de la proteínaproteína– De que tipo de célula provieneDe que tipo de célula proviene– De que parte de la célulaDe que parte de la célula– Qué hace esa proteínaQué hace esa proteína
Particularmente útil si se conoce :Particularmente útil si se conoce :– TamañoTamaño– ComposiciónComposición
Aislamiento de una proteínaAislamiento de una proteína
Selección de la fuente proteicaSelección de la fuente proteica
Ej: de tejidos de animalales como pollos, Ej: de tejidos de animalales como pollos, cerdos, vacas, ratas son los elegidoscerdos, vacas, ratas son los elegidos
Distribución de la proteina (mayor Distribución de la proteina (mayor concentración)concentración)
Ej: microorganismosEj: microorganismos1.1. bacterias: bacterias: E. coliE. coli2.2. Levaduras: Levaduras: Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae Tecnicas de clonado molecularTecnicas de clonado molecular
Métodos de solubilizaciónMétodos de solubilización
Es el primer paso obligado de la Es el primer paso obligado de la purificación purificación
la proteína debe estar en la proteína debe estar en solución solución
Estabilizacón de la proteinaEstabilizacón de la proteinaExistencia de agentes que provocan un Existencia de agentes que provocan un
daño irreversible daño irreversible pH pH TT Proteasas Proteasas Interfase agua–aire Interfase agua–aire Adsorción a la pared de los Adsorción a la pared de los
recipientesrecipientes Crecimiento de microorganismos Crecimiento de microorganismos
En el caso de proteína intracelular En el caso de proteína intracelular muy baja concentracion y muy baja concentracion y acompanada de millares de proteinas acompanada de millares de proteinas y otras macromoleculasy otras macromoleculas
En el caso de proteínas En el caso de proteínas extracelulares pueden estar en baja extracelulares pueden estar en baja concentración y también concentración y también acompañada o ser el principal acompañada o ser el principal producto extracelularproducto extracelular
EstrategiaEstrategia
Remover del organismo la proteína Remover del organismo la proteína pura en la menor cantidad de pasos pura en la menor cantidad de pasos con la menor pérdida de actividad con la menor pérdida de actividad posibleposible
ObjetivoObjetivo Purificación de una proteína de interésPurificación de una proteína de interés
Para ello se cuenta con Para ello se cuenta con métodosmétodos de de purificaciónpurificación
Los métodos se utilizan en etapas Los métodos se utilizan en etapas Serie de pasos independientes que Serie de pasos independientes que
utilizan las caracteristicas utilizan las caracteristicas fisicoquimicas de las proteínas para fisicoquimicas de las proteínas para separarlas de otras proteínas o de otras separarlas de otras proteínas o de otras sustanciassustancias
Metodos de purificaciónMetodos de purificación
Basado en las siguientes propiedades Basado en las siguientes propiedades proteicas:proteicas:
Tamaño Tamaño SolubilidadSolubilidad CargaCarga AdsorciónAdsorción Afinidad Afinidad
CaracterístiCaracterística ca
ProcedimientosProcedimientos
Tamaño Dialisis – ultrafiltración Electroforesis en gel Cromatografia de exclusión molecular Ultracentrifufacion
Solubidad Precipitación con Sales “ Solventes organicos ‘’ por pH
Polaridad Cromatografia de absorción C. En papel C. En fase reversa C. De interaccion hidrofóbica
Carga Cromatografia de intercambio iónico Electroforesis Isoelectroenfoque
Selectividad Cromatografia de afinidad
TamañoTamañoDiálisisDiálisis
Utiliza membrana semipermeable donde Utiliza membrana semipermeable donde
moleculas de agua y las de solutos moleculas de agua y las de solutos pequeños la atraviesenpequeños la atraviesen
LAS LAS PROTEÍNAS PROTEÍNAS SON SON
RETENIDASRETENIDAS
DiálisisDiálisis
TamañoTamaño
UltrafiltracionUltrafiltracionSe utiliza una membrana semipermeable Se utiliza una membrana semipermeable
que retiene las proteínasque retiene las proteínas
La presión o fuerza centrífuga se usa La presión o fuerza centrífuga se usa para separar por filtración el medio para separar por filtración el medio acuoso y las moléculas de tamaño acuoso y las moléculas de tamaño pequeñopequeño
• Uso de celofán o membranasUso de celofán o membranas
CentrifugaciónCentrifugación
Método separación y análisisMétodo separación y análisis
Centrifugation en gradiente de Centrifugation en gradiente de densidaddensidad
Gradientes continuos de sacarosaGradientes continuos de sacarosa tubo de centrifugatubo de centrifuga
Recuperación del materia:Recuperación del materia:
Se perfora el tubo o bien se congela y Se perfora el tubo o bien se congela y se corta en capasse corta en capas
CentrifugaciónCentrifugación
Los componentes de la mezcla se Los componentes de la mezcla se separan por:separan por:
PesoPeso TamañoTamaño DensidadDensidad FormaForma
Coeficiente de Coeficiente de sedimentaciónsedimentación
S = M (1-VS = M (1-V) ) N fN f
M: peso molecularM: peso molecularV: Volumen espécificoV: Volumen espécifico: : densidad de la solucióndensidad de la soluciónN : numero de avogadroN : numero de avogadroF: coeficiente de fricciónF: coeficiente de fricción
Las proteínas migran de forma proporcional Las proteínas migran de forma proporcional a este coeficientea este coeficiente
SolubilidadSolubilidad
Muy utilizados en los primeros pasos Muy utilizados en los primeros pasos de la purificaciónde la purificación
Mantiene nativa a la proteinaMantiene nativa a la proteina Redisolucion sin perdida de actividadRedisolucion sin perdida de actividad
SolubilidadSolubilidad
Proteina composicion de aa Proteina composicion de aa le le otorga un comportamiento diferenteotorga un comportamiento diferente
La solubilidaad de la proteína La solubilidaad de la proteína depende:depende:
Interacción intraproteinaInteracción intraproteina Interaccíon proteína-proteínaInteraccíon proteína-proteína Interacción proteína- disolvente Interacción proteína- disolvente
SolubilidadSolubilidad
Interacciones mencionadas dependen Interacciones mencionadas dependen de:de:
pHpH Fuerza iónicaFuerza iónica DisolventeDisolvente TemperaturaTemperatura
Solubilidad-pHSolubilidad-pH
La carga neta de las proteína depende del La carga neta de las proteína depende del contenido de aa ácidos y de aa básicoscontenido de aa ácidos y de aa básicos
El valor del pH donde la carga neta de la El valor del pH donde la carga neta de la proteína es cero proteína es cero pI pI (punto isoelectrico)(punto isoelectrico)
Solubilidad es míninaSolubilidad es mínina
Ej: Ej: contenido de aa ácidos contenido de aa ácidos pI bajo (4-5)pI bajo (4-5)
Solubilidad-pHSolubilidad-pH
Solubilidad-Fuera iónicaSolubilidad-Fuera iónica
Salting inSalting in
Salting outSalting out
Salting inSalting in
Solubilidad a baja fuerza ionica (0.001 – 0.02 M)
aumenta con la [ sales] Salting inSalting in
Las proteínas en HLas proteínas en H22O tienden a formar O tienden a formar
COMPLEJOS electrostáticos COMPLEJOS electrostáticos precipitan precipitan
Al aumentar la [sales]
proteina se rodea de contraiones
más soluble por > interacción proteína-solvente
Salting outSalting out
La solubilidad a alta fuerza iónica (mayor a 0.02 M) disminuye con la [sales] Salting outSalting out
La alta [sal] remueve la esfera de La alta [sal] remueve la esfera de solvatación de la proteínasolvatación de la proteína
Sales capturan el H2O > interacción prot-prot
Solubilidad-DisolventesSolubilidad-Disolventes
Adición de disolventes neutros miscibles Adición de disolventes neutros miscibles en agua en agua (ACETONA, ETANOL)(ACETONA, ETANOL)
Se usan en distintas proporcionesSe usan en distintas proporciones Bajan el poder de solvatación de las Bajan el poder de solvatación de las
soluciones acuosassoluciones acuosas
Solubilidad- TemperaturaSolubilidad- Temperatura
0-40 0-40 ooC C >T > solubilidad.>T > solubilidad. 40-5040-50ooC C inestabilidad inestabilidad
DESNATURALIZAN (DESNATURALIZAN ( solubilidad) solubilidad)