ANOMALÍAS EN EL PERFIL DE METILACIÓN COMO … · tesis doctoral anomalÍas en el perfil de metilaciÓn como bio-marcador en el cÁncer de mama joaquina martÍnez galÁn oncología

TESIS DOCTORAL

ANOMALÍAS

EN EL PERFIL DE METILACIÓN COMO

BIO-MARCADOR EN EL CÁNCER DE MAMA

JOAQUINA MARTÍNEZ GALÁN

Oncología Médica y Radioterápica

UNIVERSIDAD DE GRANADA

DEPARTAMENTO DE RADIOLOGÍA

Y

MEDICINA FÍSICA

Editor: Editorial de la Universidad de GranadaAutor: Joaquina Martínez GalánD.L.: GR 2002-2011ISBN: 978-84-694-0204-7

Joaquina Martínez-Galán Índice

ii

ÍNDICE

1. INTRODUCCIÓN ………………………………………………………………………………… 1

1.1. EPIDEMIOLOGÍA ………………………………………………………………………… 2

1.2. ETIOLOGÍA …………………………………………………………………………………. 7

1.2.1. Historia familiar ……………………………………………………………….. 9

1.2.2. Edad ………………………………………………………………………………….. 11

1.2.3. Historia menstrual y reproductiva …………………………………… 11

1.2.4. Terapia hormonal …………………………………………………………….. 13

1.2.5. Exposición a radiación ionizante………………………………………. 15

1.2.6. Historia de lesiones benignas …………………………………………… 16

1.2.7. Otros Factores de Riesgo …………………………………………………... 18

a) Dieta …………………………………………………………………………….. 18

b) Ingesta de alcohol ………………………………………………………… 18

c) Obesidad ……………………………………………………………………… 19

1.3. FACTORES PRONÓSTICOS Y PREDICTIVOS DE RESPUESTA EN EL

CÁNCER DE MAMA ……………………………………………………………………….

20

1.3.1. Factores dependientes del paciente. Edad ….……………………. 23

1.3.2. Factores dependientes de las características histológicas

del tumor …………………………………………………………………………. tumor

23

a) Estadio ganglionar “N” …………………………………………………. 23

b) Tamaño tumoral “T” ……………………………………………………. 25

c) Grado histológico “G” …………………………………………………… 26

d) Invasión linfovascular …………………………………………………. 27

e) Tipo histológico …………………………………………………………… 28

1.3.3. Factores dependientes de las características moleculares

del tumor ………………………………………………………………………….

29

a) Expresión de receptores hormonales ………………………….. 30

b) Expresión de Her-2/neu (erb-2) ………………………………….. 30

c) Proteína p53………………………………………………………………… 31

d) Ki-67 (mi 1) …………………………………………………………………. 32

e) Otros factores moleculares pendientes de validar.

Perfil génico …………………………………………………………………

33


iii

1.4. PRUEBAS DIAGNÓSTICAS EMPLEADAS EN EL DIAGNÓSTICO DEL

CÁNCER DE MAMA. LIMITACIONES ACTUALES EN EL

DIAGNÓSTICO PRECOZ ………………………………………………………………..

35

1.4.1. Autoexploración ……………………………………………………………….. 36

1.4.2. Exploración mamaria por un clínico experto ………………….. 37

1.4.3. Ecografía mamaria ……………………………………………………………. 38

1.4.4. Mamografía ………………………………………………………………………. 38

1.4.5. Resonancia Nuclear Magnética ……………………………………….. 40

1.5. ALTERACIONES EPIGENÉTICAS EN EL CÁNCER …………………………… 42

1.5.1.Biología de las regiones CpG, metilación del ADN y

acetilación/desacetilación de las histonas ……………………… acetilación/desacetilación de las histonas

46

1.5.2. Aplicación del estudio del perfil de metilación aberrante

del ADN en el cáncer de mama ………………………………………….

52

1.5.3. Muestras y fluídos en los que se puede estudiar el perfil de

metilación ………………………………………………………………………...

56

a) Detección de ADN libre extraído de suero o plasma ….. 56

b) Detección del ADN tumoral a partir del lavado de los

conductos galactóforos …………………………………………………

57

1.5.4. Posibles campos de aplicación del estudio del ADN

metilado de forma patológica …………………………………………..

58

a) ADN metilado como marcador de riesgo en cáncer ……. 58

b) ADN metilado como marcador pronóstico en cáncer .… 60

c) ADN metilado como factor predictivo de respuesta

clínica en cáncer …………………………………………………………..

61

d) Aplicación del ADN metilado a la terapéutica del cáncer 63

1.6. GENES UTILIZADOS EN ESTE TRABAJO DE INVESTIGACIÓN. RUTAS METABÓLICAS EN LAS QUE INTERVIENE …………………………

65

1.6.1. Metilación en genes supresores de tumores ………………….. 65

1.6.2. Metilación en genes relacionados con los mecanismos de

control celular ………………………………………………………………….

67

1.6.3. Metilación de genes implicados en la reparación del ADN 69

1.6.4. Metilación de genes implicados en la adhesión celular … 69

1.6.5. Metilación en genes implicados en la prolferación celular 71


iv

2. HIPÓTESIS Y OBJETIVOS …………………………………………………………………… 73

2.1. HIPÓTESIS ………………………………………………………………………………… 75

2.2. OBJETIVOS ………………………………………………………………………………… 77

3. MATERIAL Y MÉTODOS …………………………………………………………………….. 79

3.1. DISEÑO ………………………………………………………………………………………. 81

3.2. PERIODO DE ESTUDIO ……………………………………………………………….. pág. 81

3.3. MATERIAL …………………………………………………………………………………. 82

3.3.1. Fuentes del material de estudio ……………………………………… 82

a) Fuentes de los datos biográficos, clínicos y anatomo-

patológicos …………………………………………………………………...

82

b) Fuente de datos analíticos ………………………………………….. 84

3.3.2. Instrumentación ………………………………………………………………. 85

a) Centrífugas …………………………………………………………………. 85

b) Baño termostatizado …………………………………………………… 86

c) Congeladores ……………………………………………………………….. 86

d) pH-Metro ……………………………………………………………………… 87

e) Balanza de precisión ……………………………………………………. 87

f) Termociclador ……………………………………………………………... 87

g) Sistema de electroforesis …………………………………………….. 87

h) Transiluminador …………………………………………………………. 87

i) Sistema de reproducción fotográfica y video …………….. 88

j) Análisis de imagen ………………………………………………………. 88

k) Otros ……………………………………………………………………………. 88

3.3.3. REACTIVOS QUÍMICOS ………………………………………………………. 88

a) Etanol 99%, Pellets de NaOH, β-mercaptoetanol y

Buffer TE ………………………………………………………………………

88

b) Agarosa ………………………………………………………………………... 88

c) Tampón de carga …………………………………………………………. 88

d) Bromuro de etidio ……………………………………………………….. 89

e) Otros reactivos químicos …………………………………………….. 89

f) Solución de ClONa al 10% …………………………………………… 89

3.3.4. REACTIVOS BIOLÓGICOS PARA PCR ………………………………… 89

a) DNA estándar CpGenomeTM ………………………………………… 89

b) Extracción del ADN ……………………………………………………… 89

c) Modificación del ADN metilado ………………………………….. 90

d) Amplificación ………………………………………………………………. 91

92


v

3.3.5. MATERIAL FUNGIBLE ………………………………………………………..

a) Material plástico para el aislamiento del ADN, modificación bisulfítica del ADN metilado y amplificación por PCR- RT ……………………………………………

92

3.4. MÉTODO …………………………………………………………………………………….. 93

3.4.1. Obtención de las muestras sanguíneas incluidas en el

estudio ……………………………………………………………………………

93

3.4.2. Extracción del ADN de la muestra de suero de los sujetos 95

3.4.3. Modificación Bisulfítica …………………………………………………… 97

3.4.4. Procedimiento experimental …………………………………………… 99

3.4.5. PCR en tiempo Real QMS-PCR utilizando SYBR Green………. 101

3.5.6. Análisis estadístico ………………………………………………………….. 106

4. RESULTADOS ……………………………………………………………………………………. 107

4.1. CARACTERÍSTICAS DEL GRUPO CASOS Y CONTROLES INCLUIDOS EN ESTE ESTUDIO ……………………………………………………………………….

107

4.1.1. Análisis descriptivo univariante del grupo control ………...... 107

a) Datos Epidemiológicos-biográficos ……………………………… 107

b) Datos histopatológicos en grupo control con patología benigna ………………………………………………………………………...

110

4.1.2. Análisis descriptivos univariante del grupo casos ……………. 110

a) Datos Epidemiológicos-biográficos ……………………………… 110

b) Datos referentes a las características clínicas del tumor 113

c) Datos referentes al tipo de cirugía ………………………………. 114

d) Datos referentes al resultado anatomo-patológico ……… 115

e) Datos referentes al tratamiento Adyuvante ……………….... 120

f) Datos del seguimiento …………………………………………………. 122

4.2. METILACIÓN DE LOS PROMOTORES DE LOS GENES ESTUDIADOS EN ESTE TRABAJO ……………………………………………………………………..

126

4.2.1. Determinación del estado de metilación en el grupo control ……………………………………………………………………………...

126

4.2.2. Determinación del estado de metilación en el grupo de pacientes con cáncer de mama …………………………………………

127

4.2.3. Análisis inicial de los resultados ……………………………………….

127

4.2.4. Determinación del estado metilación en el grupo de mujeres afectas de cáncer de mama …………………………………

130

4.2.5. Estadística descriptiva general por grupo ………………….......... 132


vi

4.3. ESTUDIO DE LA RELACIÓN ENTRE LAS VARIABLES EPIGENÉTICAS ………………………………………………………………………….

134

4.3.1. Contraste de la hipótesis …………………………………………………. 136

4.3.2. Análisis multivariante …………………………………………………….. 138

4.3.3. Validación de la capacidad discriminatoria del test ………… 140

4.3.4. Sensibilidad y especificidad del test diagnóstico ……………… 143

4.4. CORRELACIÓN PERFIL METILACIÓN DE RE METILADO (+) EN SUERO CON EL SILENCIAMIENTO DE EXPRESIÓN RE EN TUMOR

147

4.5. VARIACIÓN PERFIL DE METILACIÓN PRE Y POST-TRATAMIENTO 150

4.6. ESTUDIO CORRELACIÓN VARIABLES CLÍNICO-PATOLÓGICAS CON EL PERFIL DE METILACIÓN DE LOS GENES RE, 14-3-3 SIGMA, E-CADHERINA, APC Y RAR- BETA…………………………………………………….

153

4.7. ANÁLISIS DE SUPERVIVENCIA ……………………………………………………. 155

4.7.1. Análisis univariante de los factores pronósticos clínico- patológicos relacionados con la supervivencia libre de enfermedad ………………………………………………………………………

155

4.7.2. Análisis univariante de los niveles de metilación de los genes RE y 14-3-3-sigma en relación con la supervivencia libre de enfermedad …………………………………………………………

161

4.7.3. Análisis univariante de los factores pronósticos clínico- patológicos relacionados con la supervivencia global del cáncer de mama ………………………………………………………………..

162

4.7.4. Análisis univariante de los niveles de metilación de los genes RE y 14-3-3-sigma en relación con la supervivencia global del cáncer de mama……………………………………………….. cáncer de mama

170

4.7.5. Modelo de regresión multivariante de Cox ………………………. 170

5. DISCUSIÓN ………………………………………………………………………………………… 175

5.1. DIAGNÓTICO PRECOZ EN EL CÁNCER DE MAMA. JUSTIFICACIÓN 175

5.1.1. Despistaje del cáncer de mama mediante las técnicas actuales. Sus ventajas, limitaciones, costes y riesgos ………..

175

5.1.2. Papel de los Marcadores Tumorales empleados actualmente en la clínica, sus ventajas y limitaciones ………

179

5.2. NECESIDAD DE BUSCAR NUEVOS BIOMARCADORES EN EL CÁNCER DE MAMA …………………………………………………………………….

182


vii

5.3. JUSTIFICACIÓN DEL ADN METILADO COMO BIOMARCADOR EN EL CÁNCER DE MAMA ………………………………………………………………….

186

5.3.1. Discriminación entre casos - controles y entre controles sanos/controles con patología benigna ……………………………

192

5.3.2. Monitorización y respuesta biológica de los biomarcadores en sangre periférica tras tratamiento ……..

200

5.3.3. Correlación de los Biomarcadores hipermetilados y las variables clínico patológicas ………………………………………… variables clínico patológicas

202

5.4. CORRELACIÓN DE FENOTIPOS LUMINALES EN CÁNCER DE MAMA Y METILACIÓN …………………………………………………………………………….

208

6. CONCLUSIONES ………………………………………………………………………………… 211

7. PUBLICACIONES Y COMUNICACIONES EN CONGRESOS ……………………… 215

8. ABREVIATURAS ………………………………………………………………………………... 226

9. BIBLIOGRAFÍA ………………………………………………………………………………… 229

INTRODUCCIÓN

Joaquina Martínez-Galán Introducción

- 1 -

1. INTRODUCCIÓN

Hace veinte años el cáncer era considerado una enfermedad maligna de etiología

desconocida y de carácter invariablemente mortal. Esta concepción fatalista se ha

modificado en las últimas décadas gracias al avance producido especialmente en el

campo de la biología molecular, que han permitido encontrar nuevas dianas

moleculares sobre las que desarrollar nuevos fármacos, lo que ha a su vez ha

permitido una mejor aproximación al pronóstico de la enfermedad y un mejor

manejo en el tratamiento de los pacientes diagnosticados de cáncer.

La palabra cáncer, es un término genérico que se emplea para designar un grupo

de entidades que difieren de forma variable en su histogénesis, morfología,

evolución clínica, pronóstico y tratamiento, presentando particularidades

morfológicas y biológicas que permiten clasificar e identificar por separado

diferentes tipos de tumores.

Hoy día y como consecuencia del desarrollo de la proteómica, genómica y la

incorporación de técnicas de biología molecular a la práctica clínica y asistencial, se

ha podido encontrar una explicación genética y molecular para muchas de las

alteraciones celulares que acontecen en esta patología, con la consiguiente

repercusión en los aspectos clínicos que afectan al diagnóstico, pronóstico y el

tratamiento de los pacientes con cáncer.

Uno de los avances más relevantes en el estudio de la carcinogénesis ha sido

poder conocer y explorar las diferentes rutas de señalización y transducción de

señales que tiene lugar en la célula en respuesta a un estímulo inicial y como esta

puede ocasionar en determinadas circunstancias la pérdida de equilibrio entre

genes encargados de velar por el correcto funcionamiento del ciclo celular y

aquellos otros de cuya transcripción se deriva la activación desorganizada y

patológica de cascadas moleculares que pueden favorecer el desarrollo de un

proceso tumoral. Por tanto, identificar las vías y rutas de señalización específicas

que las células tumorales utilizan para promover procesos relacionados con

proliferación, supervivencia y capacidad metastásica junto con la identificación de


- 2 -

nuevos marcadores moleculares en suero u otros fluídos corporales que puedan ser

de utilidad en el diagnóstico precoz y en la predicción de respuesta tumoral al

tratamiento oncológico establecido, supondría un importante objetivo que podría

ayudar a alcanzar un diagnóstico más temprano con el consiguiente mejor

pronóstico de los pacientes así como aplicar tratamientos más personalizados y por

tanto menos tóxicos a los pacientes diagnosticados de cáncer.

En la práctica habitual se dispone de la posibilidad de poder realizar en algunos

tipos de tumores, determinaciones de sustancias que, conocidas como marcadores

tumorales, son producidas o inducidas por las células neoplásicas, o por células del

huésped, y cuya presencia anómala puede ser detectada en el suero o en otros

fluídos corporales. Su concentración en el suero o su detección en el tejido

pretenderían reflejar el crecimiento o la actividad del tumor y así ser de utilidad

para establecer el pronóstico, realizar el seguimiento o comprobar la eficacia del

tratamiento realizado. Sin embargo la mayoría de estas sustancias no son

específicas de un tumor, por lo que se sabe que su utilidad en el diagnóstico es

relativa aunque en algunos casos se ha demostrado su valía en la detección

temprana de recidiva y en el control evolutivo de la enfermedad.

Por tanto, dada la alta prevalencia de cáncer a nivel mundial y la importancia de

realizar un diagnóstico precoz, se hace necesaria la búsqueda de nuevos

marcadores moleculares que ayuden a discernir pacientes afectados de cáncer,

conocer mejor el grado de extensión de su enfermedad, y diferenciarlos de los

sujetos sanos o de aquellos afectos de procesos tumorales benignos.

1.1. EPIDEMIOLOGIA

El cáncer sigue siendo un problema de salud de primer orden en Europa donde,

aunque las tasas de incidencia específicas por edad se mantienen estables, el

número total de casos aumenta lentamente debido a las mejores técnicas

diagnósticas y sobre todo al envejecimiento de la población. En 2008, se

diagnosticaron aproximadamente 3.2 millones de nuevos casos de cáncer en


- 3 -

Europa; esto supone un aumento del número anual de nuevos casos de cáncer del

orden de 300.000 casos desde el 2004 (10.5%) [1].

Considerando la incidencia global de cáncer tanto en hombres como en mujeres,

el cáncer más frecuentemente diagnosticado en Europa en el año 2008 fue el cáncer

colo-rectal con una incidencia aproximada de 436.000 nuevos casos (13.6% del

total), seguido del cáncer de mama con 421.000 casos (13.1%), el cáncer de pulmón

con 391.000 casos (12.2%) y finalmente el cáncer de próstata con un total de casos

de 382.000 (11.9%). Gráfica 1.

2

5

24

25

21

39

6

25

60

42

42

54

22

20

38

39

42

95

51

117

89

342

129

212

18

16

33

37

40

45

50

55

60

62

67

78

83

84

88

88

92

96

140

149

382

391

421

436

0 100 200 300 400 500

Testicular

L.H.

Vesícula

Mieloma Múltiple

Laringe

Esófago

Tiroides

Cérvix

Hígado

SNC

Ovario

Leucemia

Endometrio

Melanoma

LNH

Riñón

C. oral y Faringe

Páncreas

Vejiga

Estómago

Próstata

Pulmón

Mama

Colo-rectal

Casos

Muertes

Gráfica 1. Número estimado de casos y muertes por cáncer en Europa en 2008.


- 4 -

No obstante si analizamos solamente la incidencia ocurrida en el sexo femenino,

el cáncer más frecuentemente diagnosticado fue el cáncer de mama con una

incidencia aproximada del 28.2% en toda Europa y del 23% en España [1, 2].

Gráfica 2.

420.845; 28%

204.233; 14%

99.590; 7%82.527; 5%66.734; 4%

59.753; 4%

54.753; 4%

47.246; 3%

44.839; 3%

413.534; 28%

Casos de Cáncer en mujeresMama

Colo-rectal

Pulmón

Endometrio

Ovario

Estómago

Cérvix

Páncreas

Melanoma

Otros

En cuanto a las tasas de mortalidad por cáncer en global en Europa, el tipo de

cáncer con mayor mortalidad fue el cáncer de pulmón con 342.000 muertes lo que

representa el 19.9 % del total, seguido del cáncer colo-rectal con 212.000 casos de

muerte por cáncer (12.3 %), el cáncer de mama con 129.000 casos (7.5 %) y por

último el cáncer de estómago con 117.000 (6.8 %), gráfica 1. Sin embargo cuando

analizamos lo que sucede en el género femenino, el cáncer de mama se sitúa como

la principal causa de muerte por cáncer siendo su porcentaje del 17 % en Europa y

del 18.4 % en España [2]. Gráfica 3.

Gráfica 2. Distribución de los casos de cáncer más frecuentes esperados en el año 2008 en Europa.


- 5 -

129.309; 17%

101.604; 13%

86.846; 12%

21.670; 3%41.929; 6%47.495; 6%

25.025; 3%

46.918; 6%

9.964; 1%

249.555; 33%

Muerte por Cáncer en mujeres

Mama

Colo-rectal

Pulmón

Endometrio

Ovario

Estómago

Cérvix

Páncreas

Melanoma

Otros

La epidemiología por tanto del cáncer de mama adquiere una gran relevancia

por tratarse de la neoplasia maligna más frecuente entre las mujeres y tener una

morbi-mortalidad que si bien no es de las más elevadas sí constituye un importante

problema de salud pública. El cáncer de mama representa la primera causa de

muerte por cáncer en la mujer en los países industrializados siendo en los países

latinoamericanos y africanos la segunda causa de muerte por cáncer tras el cáncer

de cérvix uterino. También en los países del continente asiático el cáncer de mama

es el segundo tipo de cáncer más frecuentemente diagnosticado, seguido del cáncer

gástrico [3].

Concretamente en España, el cáncer de mama representa la neoplasia maligna

más frecuente entre las mujeres exceptuando el cáncer de piel no melanoma,

estando la probabilidad de que una mujer española desarrolle esta enfermedad

antes de los 75 años de edad comprendida entre un 5% y un 8%, lo que significa

que aproximadamente 1 de cada 10- 12 mujeres desarrollarán la enfermedad [4].

En los países industrializados, en las últimas décadas, se ha producido un

incremento estable e importante en la incidencia de esta enfermedad. Quizás este

incremento en la incidencia esté en relación con la mejora de la atención sanitaria y

Gráfica 3. Distribución de los tipos de cáncer más frecuentes esperados en el año 2008 en Europa por mortalidad.


- 6 -

con una mejor estrategia diagnóstica que permite una detección de la enfermedad

más eficaz.

Los datos recopilados entre 1988 y 1990 indican que el riesgo de desarrollar

cáncer de mama a lo largo de la vida de las mujeres es del 12.2% [5]. El número de

casos nuevos estimados a nivel mundial viene a ser de 720.000 por año, cifra que

representa un 20% de todos los casos de cáncer, concretamente en 2006, se

diagnosticaron unos 319.900 de nuevos casos de cáncer de mama.

En términos de mortalidad, el cáncer de mama representa el tumor que más

mortalidad causa en el sexo femenino. En el año 2006, un total de 85300 mujeres

diagnosticadas de cáncer de mama fallecieron por esta causa, lo que equivale a un

16.7% de todas las causas por cáncer.

Es la primera causa de muerte por neoplasia en las mujeres de 35 a 65 años,

siendo también en mujeres norteamericanas la neoplasia diagnosticada con más

frecuencia y la segunda causa más frecuente de muerte por cáncer. El riesgo de

muerte por cáncer de mama a lo largo de la vida es del 3.6%, o lo que es lo mismo

una de cada 282 mujeres. Esta relativa constancia en la mortalidad a pesar del

incremento en la incidencia puede deberse a los mejores programas de detección

precoz y a los avances en el tratamiento [4, 6].

Datos recopilados en EEUU en cuanto a mortalidad han puesto de manifiesto

una disminución anual del 2% en el índice de mortalidad lo que ha supuesto una

reducción total del 25% de muertes de cáncer en 2007 comparadas con 1990 [7].

Por tanto y a pesar de existir una tendencia gradual de aumento en la incidencia

del cáncer de mama, datos derivados de la vigilancia personal, programas de

“screening” y avances en el diagnóstico, así como en el correcto seguimiento de la

enfermedad y los avances terapéuticos han dado como resultado una disminución

en la mortalidad por cáncer de mama del 2% por año [8]. Por tanto parece claro

que el diagnóstico más temprano de la enfermedad nos conduciría a una

disminución de la mortalidad por cáncer de mama y por ello es necesario insistir

en la importancia de obtener mejores programas de “screening”, con mayor


- 7 -

capacidad para detectar potenciales casos de cáncer de mama y de esta forma

poder anticiparnos a su abordaje terapéutico probablemente de forma menos

agresiva y con mayores porcentajes de curación.

1.2. ETIOLOGÍA

El cáncer se considera una patología compleja resultado de múltiples

alteraciones debidas al acúmulo de distintos acontecimientos genéticos dentro de

una célula. La célula en su proceso de crecimiento y proliferación carente de

regulación hacia el desarrollo tumoral adquiere nuevas características tanto

funcionales como morfológicas distintas a las que caracterizan a la célula de la que

derivaba, dando lugar a un clon celular con capacidad de crecer de forma

desorganizada, carente de control y progresivamente con mayor grado de displasia

celular hasta que finalmente, puede desencadenar el desarrollo del proceso

canceroso [9].

Estudios en el campo de la carcinogénesis apoyan la hipótesis que propone que

estos cambios neoplásicos se desarrollan durante un largo periodo de tiempo en el

cual se van acumulando mutaciones somáticas en la célula, resultando de todo ello

un paso progresivo desde un fenotipo celular normal a un fenotipo hiperplásico,

posteriormente displásico y finalmente neoplásico [10]. Este daño genético que se

va acumulando en la célula, ocasiona cambios transcripcionales a favor de genes

que inducen proliferación y supervivencia celular incontrolada conocidos como

oncogenes, suprimiendo la expresión de otro grupo de genes llamados genes

supresores de tumores que por el contrario actuarían regulando el ciclo celular,

inhibiendo el crecimiento e induciendo fenómenos apoptóticos [11].

Sin embargo la genética por sí sola no puede explicar la diversidad de fenotipos

que se encuentran dentro de una misma población así como tampoco puede

explicar cómo seres homocigotos o clonados a pesar de tener secuencias de ADN

idénticas, pueden tener fenotipos y susceptibilidades diferentes a una enfermedad.

Hoy día sabemos que el cáncer también puede ser resultado de acontecimientos

epigenéticos que conducirían al desarrollo de un tumor por producir cambios


- 8 -

hereditarios de la expresión génica de la célula sin que con ello se deriven cambios

en la secuencia del ADN [12]. Molecularmente este hecho se relaciona con un

patrón de metilación aberrante que ocurre en la región promotora del gen, que está

fuertemente vinculada con la represión transcripcional de la cromatina y,

consecuentemente, con la pérdida de función de este gen sin producirse por ello

cambios en la secuencia de nucleótidos [13].

Este evento conocido como “epigenético” que fue acuñado por primera vez en

1939 por C.H. Waddington y fue definido como “Interacciones ocasionales entre los

genes y sus productos que determinan el fenotipo celular” , no fue hasta años más

tarde cuando se entendió que este tipo de alteraciones hereditarias de la expresión

génica no son debidos a cambio alguno en la secuencia del ADN [14].

De todos los eventos epigenéticos el más conocido es el de la metilación del ADN

cuyo descubrimiento, unido a su relación con la falta de actividad de genes tumor

supresor permitió la identificación de distintos genes supresores de tumores cuyos

promotores se encontraban metilados en el tumor y no metilados en los tejidos

peritumorales sanos, así como más recientemente su relación con la inactivación

génica mediante microARN (miARN) por metilación de su material genético [15].

No obstante, además de las alteraciones genéticas y epigenéticas que explican la

cascada de eventos que median en el desarrollo de un proceso neoplásico, se han

descrito otros factores conocidos como “factores de riesgo” que por estar en

relación con la exposición a carcinógenos ambientales, o ligados a cierta

predisposición genética, se les considera como factores que aumentan la

probabilidad de que la persona expuesta o predispuesta desarrolle el cáncer. En

este sentido son varios los factores de riesgo descritos como parcialmente

responsables del desarrollo del cáncer de mama, aunque ninguno de ellos ha sido

identificado como causa fundamental de la misma.

Entre los factores que, etiológicamente han sido relacionados con el cáncer de

mama se describen los siguientes:


- 9 -

1.2.1. Historia familiar

La mayoría de los cánceres de mama, se desarrollan en mujeres sin

antecedentes familiares considerándose por ello esporádicos. Sin embargo el

presentar antecedentes familiares de primer grado (madre o hermana), y a una

edad de presentación inferior a 40 años, o la existencia de varios casos en la

familia, se asocia con un mayor riesgo para desarrollar esta enfermedad [16]. De

hecho entre un 15% a un 20% de los casos de cáncer de mama se presentan en

pacientes con antecedentes familiares de esta enfermedad, aunque desconocemos

en qué medida esta agregación familiar es fruto del azar, de una susceptibilidad

genética, de determinados factores ambientales o de alguna combinación de todos

estos factores. En estos casos hablamos de cáncer de mama familiar [17, 18].

Dentro de este subgrupo de pacientes con cáncer de mama familiar, alrededor de

un 5-10% de los casos se atribuyen a mutaciones en células de la línea germinal

que se transmiten con carácter autosómico dominante y alta penetrancia [19].

Estas mutaciones producen la falta de expresión de genes tumor supresor y de

genes implicados en la reparación del ADN dañado, lo que ocasiona un acúmulo de

mutaciones en oncogenes y pérdida de control en sitios claves del ciclo celular lo

cual se asocia al desarrollo de un tumor. Entre los genes implicados en este

subgrupo de pacientes con mayor susceptibilidad al cáncer de mama se

encuentran el gen BRCA1 y BRCA2 [20]. Cuando tal anomalía genética se encuentra

hablamos de cáncer de mama hereditario. Generalmente, se trata de casos de

cáncer de mama que se caracterizan por presentarse a edades más tempranas y/o

estar asociados a antecedentes familiares muy importantes [21].

Por tanto en la historia del cáncer de mama distinguimos:

a) Cáncer esporádico: Pacientes sin historia familiar en dos o más

generaciones. Representa el 68% de todos los cánceres de mama.

b) Cáncer familiar: Cuando en una determinada familia aparece dicha

neoplasia en dos o más casos en parientes de primer grado (madre o

http://www.infodoctor.org/www/meshg.htm?idos=38102

http://www.infodoctor.org/www/meshg.htm?idos=38103


- 10 -

hermana) o segundo grado (abuela, tía o prima) en ausencia de cáncer de

mama hereditario. Representa el 23%.

c) Cáncer de mama hereditario: Presentan varias características distintivas

cuando se compara con el cáncer de mama no hereditario o somático. Así, se

asocia con mutaciones en la línea germinal que se transmiten con un patrón

autosómico dominante y fuerte penetrancia [22, 23]. Representa un 5-10% [24]

de todos los casos de cáncer de mama y la edad de presentación es

considerablemente inferior a la que corresponde a los casos esporádicos. Otra

de las diferencias es que la prevalencia de cáncer de mama bilateral es más alta,

y suelen ser tumores preferentemente con pobre grado de diferenciación

celular, receptor de estrógenos negativos y tener con mayor frecuencia

afectación ganglionar [25].

En las familias de los individuos con este tipo de herencia se pueden presentar

otros tipos de tumores asociados, entre ellos: cáncer de mama y ovario

relacionados con la mutación en BRCA1 [26] y alteraciones en BRC2 asociadas al

síndrome del cáncer de mama en el varón. La suma de todos estos casos suponen

el 85% de todos los cánceres de mama hereditarios [27]. Otros síndromes

asociados a mutaciones genéticas son el síndrome Li-Fraumeni debido a

mutaciones del gen TP53 [22], y el síndrome de Cowden debido a mutaciones del

gen PTEN [28] entre otros.

De los estudios epidemiológicos también sabemos que alrededor de un 5-10 %

de las pacientes con cáncer de mama tienen un familiar de primer o segundo grado

diagnosticado también de cáncer de mama. Estas pacientes tienen un riesgo

relativo >50% de padecer cáncer de mama antes de los 70 años [29]. Este riesgo

varía en función de la edad en el momento del diagnóstico y número de familiares

afectos. Así para pacientes con edad al diagnóstico inferior a 40 años y familiares

de primer grado afectadas antes de los 50 años de edad este riesgo es mayor [30].

Dicho de otra manera en los países donde el cáncer de mama es frecuente, el riesgo

de desarrollarlo, aumenta el riesgo en un 5.5% para mujeres con un familiar de


- 11 -

primer grado afecto y en un 13% para mujeres con dos familiares afectos de cáncer

de mama [31].

1.2.2. Edad

El riesgo acumulado de desarrollar cáncer de mama aumenta con la edad. La

incidencia más alta de cáncer de mama ocurre después de los 35 años; en edades

posteriores la frecuencia aumenta progresivamente hasta alcanzar una meseta

entre los 45-55 años para finalmente aumentar de forma manifiesta. No obstante

en mujeres con mayor carga genética, el cáncer tiende a ocurrir en edades más

tempranas que en los casos esporádicos [16, 32] con el 83 % de los casos en

mujeres mayores de 50 años y sólo el 1.5 % en mujeres con menos de 30 años [33].

Es importante conocer que la edad, en el momento del diagnóstico, se

considerada como uno de los factores pronósticos más importantes en el cáncer de

mama. En efecto se ha observado que la presentación del cáncer en mujeres

menores de 40-45 años se asocia con factores pronósticos negativos, como son:

tumores que no expresan receptores hormonales y sobreexpresan HER-2/EGFR, y

sabemos que ambas circunstancias se asocian con mayores porcentajes de recaída

y con una menor supervivencia global [34]. Todo esto ha hecho pensar que el

cáncer en pacientes jóvenes sea una entidad biológica distinta con sus propias

rutas de señalización [35].

1.2.3. Historia menstrual y reproductiva

Muchos son los estudios epidemiológicos que han analizado el papel de la

historia menstrual y reproductiva de la mujer en la historia natural del desarrollo

del cáncer de mama. La mayoría de ellos, han proporcionado datos que apoyan que

factores reproductivos como son la edad de la menarquía temprana, edad de la

menopausia tardía, la edad del primer embarazo a término precoz, el número de

hijos y el haber dado o no lactancia materna son factores asociados con la

modulación del riesgo de desarrollar cáncer de mama [36, 37].


- 12 -

Esta asociación podría estar relacionada con el periodo de tiempo de exposición

de la mujer a niveles de estrógenos endógenos a lo largo de su vida y por ello, en

relación con el número de ciclos ovulatorios y por tanto con factores hormonales

que están firmemente relacionados con un mayor riesgo de desarrollar cáncer de

mama [38]. Los estrógenos actuarían estimulando la proliferación del epitelio

ductal así como la angiogénesis ocasionando una hiperplasia e hipertrofia de las

células ductales mamarias durante la primera fase del ciclo menstrual, pudiendo

así contribuir a la transformación neoplásica que puede derivar en el desarrollo

del cáncer de mama a lo largo de su vida [39].

La importancia que la influencia estrogénica tiene como inductor de

proliferación celular en la mama se observó al comprobar que aproximadamente

1/3 de las pacientes con cáncer de mama experimentaban una remisión del tumor

cuando se las sometían a tratamientos que implicaban el descenso en los niveles de

estrógenos circulantes en sangre periférica [40]. Así mismo, en células en cultivo se

ha observado que los estrógenos estimulan la secreción de factores de crecimiento

mitogénicos (TGF-α, IGF-1, EGF) e inhiben la secreción de factores represores de la

mitosis como el TGF-β mediando como factores paracrinos a nivel del estroma

mamario y favoreciendo la proliferación celular sobre la mama [41].

También se ha descrito que la exposición en etapas concretas de la vida de una

mujer a altos niveles estrogénicos “ventana estrogénica de Koreman”, como ocurre

al inicio de ciclos ovulatorios y durante los periodos anovulatorios que suceden a

lo largo de la vida menstrual o durante la perimenopáusia por insuficiencia

luteínica, podría ser otro factor favorecedor en la carcinogénesis del cáncer de

mama. En cambio otras variables como serían la edad temprana de paridad y la

lactancia materna, favorecen la diferenciación de los conductos terminales del

lobulillo que se produce durante el embarazo y la liberación de hormonas

autocrinas y paracrinas asociadas a cada embarazo a término, fenómenos que

pueden explicar los efectos beneficiosos que de la paridad temprana y la lactancia

tienen sobre el riesgo de padecer cáncer de mama [38]. Sin embargo estas ideas

siguen siendo controvertidas por existir estudios que no han encontrando relación

entre paridad y factor pronóstico del cáncer de mama [42, 43] mientras que otros


- 13 -

en cambio sí han encontrado asociación al describir que el desarrollo de un cáncer

de mama en una mujer nulípara se asocia con un factor pronóstico adverso al igual

que el tener un primer embarazo a una edad tardía [44]. Otros factores de riesgo

relacionados con la historia reproductiva son; la nuliparidad, el nacimiento del

primer hijo después de los 30 años y la ausencia de lactancia materna [45].

En resumen entre los factores que pueden aumentar la probabilidad de

desarrollar cáncer de mama están; edad temprana de presentación de la

menarquia (antes de los 12 años) y edad de presentación de la menopausia tardía

(después de los 55 años), ambos asociados a mayor exposición estrogénica. Por el

contrario, entre los factores reproductivos que se relacionan con una disminución

en la probabilidad de desarrollar cáncer de mama están la presentación de la

menarquia a una edad tardía (después de los 12-13 años) y la presentación precoz

de la menopausia (antes de los 45 años), ambos relacionados con una menor

exposición a niveles de estrógenos prolongados [46].

En recientes revisiones de la literatura, y a pesar que esta asociación sigue

estando confusa, es cada vez con más frecuente la publicación de nuevos datos que

demuestran un posible incremento del riesgo de desarrollar cáncer de mama en

relación con factores hormonales en función de la expresión de los receptores de

estrógenos (RE) y receptores de progesterona (RP) en el tumor [47]. Así algunos

autores [48] han descrito que la multiparidad y la edad temprana del primer

embarazo se asocian con una disminución del riesgo relativo de desarrollar

tumores RE/ RP (+) pero no mostraba ninguna relación con el desarrollo de

tumores RE/ RP (-) mientras la lactancia se asociada con un riesgo reducido para el

desarrollo de tumores que fuesen RE/ RP (+) y RE/ RP (-), lo que podría sugerir

que paridad y lactancia actúan por mecanismos diferentes [47, 49].

1.2.4. Terapia hormonal

Son muchos los estudios epidemiológicos que han analizado la relación entre la

terapia hormonal sustitutiva (THS) y el riesgo de desarrollar cáncer de mama. La

mama no hay duda que es un órgano estrógeno-dependiente y muestra de ello es

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=pubmed&cmd=Retrieve&dopt=AbstractPlus&list_uids=15986762&query_hl=2&itool=pubmed_docsum


- 14 -

que durante las etapas del desarrollo puberal y durante el embarazo, son altas las

tasas de hormonas circulantes intervienen de forma activa [50]. Concretamente en

relación con el cáncer, existen datos que apoyan la teoría según la cual la

exposición a tratamientos basados en estrógenos y especialmente cuando se

administran a mujeres postmenopáusicas y durante periodos de tiempo superiores

a 5 años, puede aumentar el riesgo relativo de desarrollar cáncer de mama hasta

en un 1.3 y un 1.7 [51]. Este hecho parece que está en relación con una mayor

sensibilidad de las células de la mama en las mujeres postmenopáusicas, a causa de

su deprivación estrogénica previa lo que ocasiona un proceso reactivo que

incrementa el índice de proliferación y favorece la atipia celular que podría

conducir al desarrollo del proceso tumoral [52]. Se ha sugerido que este proceder

sustitutivo triplica el riesgo relativo de padecer cáncer en mujeres con

antecedentes familiares de esta enfermedad [53]. Así y de acuerdo con los

resultados recientemente publicados del estudio “HABITS” tras un seguimiento de

5 años se observó que el empleo de THS en mujeres que habían sido tratadas

previamente por un cáncer de mama provocaba un incremento significativamente

superior del riesgo de desarrollo de segundos tumores de mama con un HR = 2.4

(95% CI = 1.3 a 4.2) del respecto a las mujeres que no realizaban este tratamiento

y una incidencia acumulada en 5 años del 22.2 % en el brazo que habían recibido

HT frente al 8.0 % del grupo control [54].

Sin embargo este hallazgo no ha podido ser confirmado en otros de los muchos

estudios que se han realizado en los últimos 25 años de una manera concluyente.

Por ello son numerosos los autores que opinan que seguir esta terapia durante 10

años, o menos, no implica riesgo de cáncer, o es tan pequeño que merece la pena

asumirlo, dado los beneficios que aporta la THS en la mujer menopáusica. Otros

investigadores indican que a partir de los 10 años de la toma de THS es cuando

puede aumentar el riesgo de cáncer, mientras que otros destacan que es

indiferente el tiempo de administración por afirmar que el riesgo de cáncer existe

entre las que siguen la terapia hormonal [55].

No obstante la actualización del ensayo clínico “Women’s Health Initiative”, en el

que se incluyeron 16600 mujeres de edades comprendidas entre 50-79 años de 40


- 15 -

centros diferentes entre 1993-1998 y en el que se aleatorizaban a recibir

tratamiento con estrógenos equinos y acetato de medroxiprogesterona frente a

placebo, se observó un exceso de riesgo para el desarrollo de cáncer de mama para

las pacientes expuestas al tratamiento hormonal [56].

Las conclusiones que pueden extraerse de los estudios y metaanálisis realizados

es que actualmente no está suficientemente establecido el riesgo asociado al

empleo de hormonas exógenas y el desarrollo de cáncer de mama, si bien parece

que hay una mayor frecuencia de presentación de tumores de mama en mujeres

que han utilizado terapia hormonal sustitutiva durante más de 5 años que entre las

mujeres que no lo han hecho, y que esta circunstancia se describe

fundamentalmente en pacientes con tumores de mama que expresan receptores

hormonales [49]. En cualquier caso, la terapia hormonal sustitutiva, requiere de un

análisis preciso de los beneficios y los riesgos que puedan derivarse de su

prescripción y solicitar de la persona a la que se le vaya a indicar el tratamiento su

consentimiento. Esto exige una postura responsable tanto por parte del médico

como del paciente [57].

1.2.5. Exposición a radiación ionizante

El conocimiento que hoy día se posee sobre el mayor riesgo de desarrollar

cáncer de mama que presentan las mujeres expuestas a radiación ionizante a lo

largo de su vida procede fundamentalmente de los estudios epidemiológicos

realizados en pacientes que recibieron radiación con fines diagnósticos o

terapéuticos así como de aquellos sujetos que sobrevivieron a catástrofes

nucleares [58]. De estos estudios se ha derivado que la exposición reiterada a

radiaciones ionizantes, principalmente en etapas de la vida donde existe gran

proliferación y recambio celular como ocurre con edades inferiores de 20 años, se

acompaña de mayor riesgo de daño sobre el ADN y esto es un factor de riesgo para

el desarrollo de un carcinoma de mama especialmente en aquellas personas que

reciben radiación en la región torácica [59, 60]. Los datos epidemiológicos

disponibles han precisado que esta asociación entre dosis de radiación y cáncer

sigue un modelo lineal tal que el riesgo es mayor cuanto mayor es la dosis recibida

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=pubmed&cmd=Retrieve&dopt=AbstractPlus&list_uids=8570961&query_hl=39&itool=pubmed_docsum


- 16 -

[61]. Sin embargo otros factores emergieron como posibles factores involucrados y

moduladores del efecto lesivo que podría tener la exposición a la radiación

ionizante prolongada, si bien no existe unanimidad en las conclusiones de los

estudios publicados [62]. Entre estos factores se ha descrito que la presencia de

patología benigna de la mama o historia familiar de cáncer de mama podría estar

asociada al incremento de riesgo de padecer cáncer tras la exposición a radiación

ionizante a dosis relativamente bajas [63-65], también se ha publicado un

incremento del riesgo asociado a la exposición de la radiación durante el embarazo

[66] y una mayor susceptibilidad genética en relación con polimorfismos de los

genes encargados de la reparación del ADN [67, 68].

Por tanto múltiples factores como dosis total de radiación recibida, la edad al

inicio de la exposición, y el tiempo desde la primera exposición, son parámetros

relacionados con la incidencia de cáncer de mama después de la exposición a la

radiación ionizante. Sin embargo, estos riesgos han de ser considerados en el

contexto individual de sujetos que se pueden beneficiar de pruebas de cribado

poblacional para la detección precoz de un tumor de mama en situaciones en

donde el beneficio aportado por dichas pruebas es superior a los riesgos

estadísticos descritos [65].

1.2.6. Historia de lesiones benignas

El hallazgo de lesiones benignas en la mama representa la histopatología más

frecuentemente diagnosticada en el curso del diagnóstico de un tumor de mama.

La frecuencia de presentación a partir de análisis realizados en muestras de

autopsia dada la dificultad para conocer su prevalencia real por tratarse en la

mayoría de los casos de lesiones asintomáticas, se estiman que ésta podría ser

superior al 50% a partir de los 20 años de edad [69], existiendo una gran variedad

histológica. Dentro de esta gran variedad de tipos histológicos podemos encontrar

atendiendo al carácter proliferativo de las mismas; lesiones no proliferativas, como

son fibroadenomas, quistes, ectasias ductales y metaplasia apocrina, que

representarían el 66.7% de las lesiones encontradas, y un segundo grupo de

patología benigna que estaría constituído por lesiones proliferativas sin atipia


- 17 -

como el papiloma intraductal, hiperplasia moderada y adenosis esclerosante

(29.6%), y un tercer grupo que estaría representado por lesiones proliferativas con

atipia entre ellas la hiperplasia ductal con atipia y a hiperplasia lobular con atipia

(3.7%) [70].

Si bien la mayoría de estas lesiones no son precursoras de lesiones invasivas, en

algunas ocasiones y especialmente cuando se trata de lesiones proliferativas, o con

hiperplasia atípica, así como cuando se aíslan múltiples lesiones tras realizar una

biopsia de una lesión benigna de mama, se ha descrito que eventualmente pueden

evolucionar hacia el desarrollo de un cáncer de mama [71-75]. Autores como Page

y Dupont han encontrado que las lesiones proliferativas con atipias tienen un

riesgo relativo (RR) de 4-5 para cáncer de mama, en las lesiones proliferativas sin

atipias este riesgo disminuye al valor de 1.5-2 mientras que no han encontrado

asociación entre las lesiones benignas de tipo no proliferativo y el riesgo de

padecer cáncer de mama [70]. Sin embargo y a pesar de los múltiples estudios

realizados en este campo, aún siguen existiendo algunos aspectos controvertidos

[76]. Así en otros trabajos como los realizados por Wang y col. no se ha encontrado

asociación entre la presencia de lesiones benignas de mama, cualquiera que sea su

número y su histología, y el mayor riesgo para desarrollar cáncer de mama [74].

Recientemente se ha descrito que el riego para desarrollar cáncer a partir de

lesiones benignas de mama podría estar influenciado no sólo por la multiplicidad y

número de lesiones proliferativas y atípicas aisladas en una biopsia de mama, sino

también por la edad de presentación. Esta relación se ha descrito al encontrarse un

mayor riesgo de derivar en cáncer de mama las lesiones benignas cuando,

asociadas a los factores anteriormente expuestos, se detectan en mujeres con

edades comprendidas entre los 46-55 años frente a presentarse en mujeres con

edades menores a 45 años. Este hecho podría estar en relación con el mayor

número de ciclos ovulatorios y por tanto con la mayor duración del ambiente de

estímulo de la proliferación celular de la mama que conlleva un consiguiente

incremento del riesgo para desarrollar atipias celulares [73, 77].


- 18 -

No obstante lo que sí parece estar claro, es que las lesiones no proliferativas no

parecen incrementan el riesgo de cáncer de mama en mujeres sin historia de

cáncer mamario o con una débil historia familiar. Tan solo en mujeres con

importante carga familiar de cáncer de mama, estos hallazgos parecen asociarse al

aumento del riesgo, aunque tal aumento se podría explicar por la historia familiar

más que por la presencia de lesiones en la mama. Cabe sin embargo mantener que

las lesiones proliferativas, particularmente aquellas con atipia, sí parecen predecir

un sustancial aumento de riesgo de cáncer de mama [78].

1.2.7. Otros factores de riesgo

a) Dieta: El papel de la dieta y su relación con el cáncer, ha sido sugerido por

distintos autores, debido a la importante variabilidad en la prevalencia de cáncer

de mama entre distintos países. La hipótesis según la cual la obesidad, la ingesta

elevada de productos derivados de grasas animales y el alcohol aumentan el riesgo

del desarrollo de cáncer de mama mientras que la ingesta de frutas, fibra,

antioxidantes y fitoestrógenos son factores protectores, puede ser atribuida en

parte, a las propiedades antioxidantes de determinados alimentos, así como a la

influencia de estos en la reparación del ADN [79, 80]. El aumento de los niveles

circulantes de estrógenos endógenos, de insulin-like growth factor 1 y de otros

factores de crecimiento, producidos por algunos nutrientes también han sido

relacionados con el desarrollo del cáncer de mama.

b) Ingesta de alcohol: La asociación entre el consumo de alcohol y el

incremento del riesgo de desarrollar cáncer de mama ha sido una constante

descrita en numerosos estudios epidemiológicos realizados en las últimas dos

décadas, especialmente en mujeres postmenopáusicas [81]. Esta hipótesis parece

que está sustentada por distintas teorías. Una de ellas se basa en la hipótesis según

la cual el alcohol induciría un aumento de los niveles endógenos de estrógenos que

estimularía la proliferación del epitelio mamario pudiendo favorecer el desarrollo

de un cáncer de mama RE (+) pero no en casos de tumores RE (-) [82]. Otro de los

posibles mecanismos por los que la ingesta de alcohol podría favorecer el

desarrollo del cáncer de mama se apoya en la susceptibilidad de la mama al daño


- 19 -

producido al ADN por el alcohol [83, 84]. Sin embargo cuando se realiza una

revisión sistemática de la literatura analizando los resultados obtenidos se observa

que la asociación entre el consumo de alcohol y riesgo de desarrollar cáncer de

mama es débil y que la precisión de la estimación del riesgo relativo es baja en la

mayoría de los estudios [85]. Por tanto y como consecuencia de otros factores de

confusión [86] no se pueden extraer conclusiones sobre el riesgo padecer de

cáncer de mama en relación a la ingesta de alcohol.

c) Obesidad: Es bien conocido que la obesidad tiene un papel importante en el

desarrollo de graves problemas de salud, especialmente en enfermedades

cardiovasculares y en enfermedades endocrino-metabólicas como la diabetes

mellitus entre otras. Sin embargo su implicación en el desarrollo del cáncer si bien

se ha descrito en numerosos trabajos, sigue siendo controvertida y aunque no está

suficientemente probada parece que existe cierta relación entre el riesgo de

padecer cáncer de mama y los hábitos dietéticos [87]. En estudios realizados en

animales existe evidencia que las alteraciones en el equilibrio metabólico pueden

influir en el riesgo de desarrollar cáncer de mama así como en el pronóstico de la

enfermedad a través de distintos mecanismos relacionados con la producción de

hormonas de esteroideas extragonadales/ováricas [1,2], en particular el estradiol,

que han mostrado estar positivamente asociado con el riesgo de cáncer de mama

[3,4].

Este hecho parece estar en relación con la variación en el perfil hormonal que

ocurre en mujeres obesas especialmente durante la menopausia lo que podría

representar un estímulo importante para el crecimiento de células tumorales [88].

De hecho en mujeres sanas con alto índice de masa corporal (IMC) se ha descrito

que la obesidad se asocia con un estado de hiperinsulinismo e hiperandrogenismo

que contribuye a aumentar los niveles de insulin-like growth factor 1 (IGF-1),

implicado en procesos que inducen proliferación, crecimiento celular, mutagénesis

y que activan fenómenos antiapoptóticos [89, 90]. Parece ser que tanto IGF-1 como

los estrógenos actúan sinérgicamente aumentando los niveles de IGF-1 y su

receptor (IGF-1R) estimulando cascadas de señalización intracelulares que

estimulan la proliferación celular del epitelio mamario y con ello el aumento del


- 20 -

riesgo de desarrollar cáncer de mama [76]. En relación con ello se ha descrito, en

mujeres premenopáusicas, un aumento en el riesgo de desarrollar cáncer de mama

con peor supervivencia [87, 88, 90, 91]. De los estudios realizados puede extraerse

que un elevado IMC en mujeres que han desarrollado cáncer de mama parece

relacionarse con peor pronóstico, por lo que se aconsejan medidas destinadas a

controlar el peso de estas pacientes aún cuando es necesaria la realización de

nuevos estudios para clarificar esta cuestión [87].

1.3. FACTORES PRONÓSTICOS Y PREDICTIVOS DE RESPUESTA DEL CÁNCER

DE MAMA

El cáncer de mama sigue siendo en la actualidad una importante causa de

muerte en mujeres en los países industrializados, a pesar de los avances en el

diagnóstico precoz y tratamiento que se han producido en las últimas décadas.

Esto ha supuesto que junto a la necesidad de desarrollar tratamientos más

efectivos y específicos que consigan mayores tasas de curación, sea importante y

necesario la búsqueda y el estudio de nuevos marcadores pronósticos y predictivos

de respuesta que, sumados a los ya conocidos, permitan predecir de forma

individualizada cuál es el beneficio terapéutico de tratar a una paciente con cáncer

de mama, así como conocer cuál es el riesgo que tiene de recaída y qué tratamiento

es el más adecuado administrar de acuerdo no sólo con las características clínico-

patológicas sino también de acuerdo con el perfil molecular del tumor.

Históricamente la decisión terapéutica de aplicar un determinado tratamiento

oncológico a una paciente ha estado determinada por factores clínicos como la

edad y por factores anatomo-patológicos como son el tamaño tumoral, la

afectación ganglionar, el grado de diferenciación tumoral y la expresión de

receptores hormonales en el tumor [92, 93]. Sin embargo fue a partir del consenso

de expertos celebrado en Saint Gallen en el año 2005 [94], y como consecuencia de

los ensayos clínicos realizados al añadir al tratamiento estándar, un anticuerpo

monoclonal humanizado (Trastuzumab) se pudo demostrar que esta asociación

conseguía mejorar tanto el intervalo libre de enfermedad como la supervivencia

global de aquellas pacientes con cáncer de mama en cuyo tumor se sobreexpresaba


- 21 -

el receptor del factor de crecimiento epidérmico HER2. Este resultado se ha

explicado como una consecuencia de la inhibición de la proliferación tumoral, a

través de un mecanismo de citotoxicidad dependiente de los anticuerpos utilizados

que ha supuesto un cambio en la historia natural de uno de los tipos de cáncer de

mama de peor pronóstico [95-97].

Este hallazgo ha supuesto un importante avance en el tratamiento del cáncer de

mama al incorporar a la práctica clínica diaria las determinaciones moleculares

por medio de métodos como la inmunohistoquímica (IHQ), técnicas de hibridación

in situ (FISH) o la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), que permiten

conocer marcadores moleculares que las células tumorales expresan y que

representan potenciales dianas terapéuticas contra las que es posible diseñar

fármacos biológicos que asociados a los tratamientos citotóxicos clásicos

consiguen alcanzar una mejor tasa de respuestas tanto en supervivencia como en

intervalo libre de enfermedad [98].

Desde entonces hasta nuestros días nuevas dianas moleculares han sido objeto

de estudio dando como resultado el desarrollo de nuevos agentes biológicos y

pequeñas moléculas que dirigiéndose contra los receptores de membrana que

expresa la célula tumoral, consiguen bloquear la unión del ligando al receptor y

con ello bloquean las distintas cascadas de transducción de señales que la célula

tumoral pone en marcha, permitiéndonos así impedir la transcripción de genes

implicados en supervivencia, proliferación celular y angiogénesis tumoral. Muestra

de ello son fármacos como Lapatinib un anticuerpo monoclonal contra los

dominios tirosín quinasa de HER1 y HER2 que ha demostrado ser eficaz en

pacientes con cáncer de mama metastásico que sobreexpresan HER2 y no

responden a Trastuzumab [99], o fármacos antiangiogénicos como bevacizumab un

anticuerpo contra el receptor del factor de crecimiento derivado del endotelio

vascular VEGFR [100]. Algunos de estos factores tienen un doble papel pronóstico

y predictivo, como es el caso del HER2/neu cuya amplificación se ha asociado por

un lado a un peor pronóstico, a la resistencia al Tamoxifeno y una mayor

sensibilidad a dosis altas de Antraciclinas y, por otro lado, a un factor predictivo de

respuesta al Trastuzumab especialmente cuando se combina con quimioterapia.


- 22 -

Paralelamente y gracias al desarrollo de tecnologías con microarrays de ADN se

han efectuado estudios que, analizando el perfil génico del tumor, consiguen

determinar aquellos genes que se correlacionan con el pronóstico y la respuesta

terapéutica. Esto ha favorecido la creación de una nueva clasificación pronóstica

del cáncer de mama de acuerdo con el llamado fenotipo molecular. En esta

clasificación se han descrito 5 tipos de cáncer de mama en función a la expresión

molecular de determinados receptores de membrana; Luminal A, Luminal B, Basal

Like (triple negativo) y subtipo Her2+ [101]. Estos perfiles génicos están siendo

utilizados en la actualidad como factores pronóstico y también como factores

predictivos de respuesta a la quimioterapia y al tratamiento hormonal.

Por tanto cada vez más nuevos factores pronósticos y predictivos de respuesta

al tratamiento oncológico se van añadiendo a los establecidos por las

recomendaciones consenso del National Institutes of Health Consensus

Development Conference Statementun 2000 (NIH) [102] y de la conferencia

consenso de St. Gallen 2009 [103]. Estos es consecuencia del mayor conocimiento

y de la caracterización de las múltiples vías de transducción de señales y de las

cascadas de señalización intracelular implicadas en la carcinogénesis que a su vez

ha facilitado la identificación de nuevas dianas terapéuticas sobre las que

desarrollar nuevos fármacos para aplicar al tratamiento del cáncer de mama.

No obstante no todos los factores anteriormente comentados están validados en

la actualidad como factores pronósticos a partir de los cuales poder estimar el

riesgo de recidiva y mortalidad que tiene una paciente diagnosticada de cáncer de

mama ni tampoco todos ellos son reconocidos como factores predictivos de

respuesta al tratamiento oncológico.

Por tanto y atendiendo a los factores pronósticos y predictivos de respuesta

actualmente validados se pueden establecer tres 3 categorías de elementos que

nos ayudan en la actividad clínica a planificar un tratamiento oncológico adecuado

[102].


- 23 -

1.3.1. Factores dependientes del paciente. Edad

El cáncer de mama se suele presentar en mujeres a partir de los 50 años de

edad, siendo poco frecuente su diagnóstico en mujeres de menos de 35 años [104].

Son muchos los estudios epidemiológicos que relacionan este dato con un factor

pronóstico adverso al correlacionarlo con una menor supervivencia global y una

mayor tasa de recidiva tumoral en las pacientes jóvenes respecto a las mujeres con

edad de presentación mayor a 35 años [105]. En este sentido y aunque no está

suficientemente aclarada la relación entre edad de presentación menor a 35 años y

mal pronóstico de cáncer de mama, algunos investigadores describen como

posibles causas que el cáncer de mama que se presenta en mujeres más jóvenes,

tienen una características biológicas comunes caracterizadas por tener un mayor

grado de indiferenciación histológica, una fracción de proliferación celular más

elevada, mayor frecuencia de invasión vascular así como mayor frecuencia de

afectación ganglionar y una menor expresión de receptores hormonales de

estrógenos y progesterona en comparación con los casos de cáncer de mama que

se presentan en mujeres de mayor edad [34]. Todos ellos factores que le confieren

mayor agresividad tumoral [106].

1.3.2. Factores dependientes de las características histológicas del tumor

a) Estadio ganglionar (N): El grado de afectación ganglionar en las pacientes

diagnosticadas de cáncer de mama con independencia del área ganglionar afecta

(axilar, supraclavicular etc.) así como del número de ganglios infiltrados (≥ 4 vs

<4) [107], se ha demostrado en numerosos estudios que representa el factor

pronóstico más importante para predecir tanto la supervivencia global (SG) como

la supervivencia libre de enfermedad (SLE) [108-110]. Aquellas pacientes con

afectación ganglionar tendrán un pronóstico más desfavorable que aquellas otras

pacientes en donde no se haya producido tal infiltración. De hecho se estima que el

70% de las pacientes con ganglios axilares positivos recidivarán a los l0 años

mientras que, en los pacientes con ganglios axilares negativos, el porcentaje de

recidivas se reduce a un 20-30% [111].


- 24 -

Para establecer con rigurosidad cuál es el grado de afectación axilar en estas

pacientes, se recomienda que sea examinado un número suficiente de ganglios. Los

estudios dirigidos a dilucidar esta cuestión indican que se deben obtener al menos

10 ganglios de la axila para definir el estado ganglionar, especialmente si este

resulta negativo [112-114].

Hoy día gracias a los avances quirúrgicos y técnicos, se dispone de una técnica

alternativa a la clásica disección axilar que se realizaba de forma sistemática en la

cirugía oncológica del cáncer de mama que es la biopsia del ganglio centinela. Esta

técnica actualmente ha reemplazado al vaciamiento ganglionar axilar como

método de elección para el estadiaje ganglionar de las pacientes afectas de cáncer

de mama en prácticamente la totalidad de los centros hospitalarios [115]. En los

últimos años numerosos estudios realizados para analizar si el estudio del ganglio

centinela podría reemplazar a la clásica estadificación por disección ganglionar,

han concluido que el procedimiento es seguro, factible y con menor morbilidad que

la técnica clásica de la disección ganglionar axilar [116]. Así estudios recientes en

este campo como los realizados por Turner ó Weaver afirman que aislar un ganglio

centinela negativo predice de forma significativa la ausencia de afectación del resto

de ganglios por ser este el ganglio que con mayor probabilidad será positivo en el

caso de existir afectación axilar, con una sensibilidad estimada en el 100% y una

tasa de recurrencias del 0.3% [117].

Sin embargo aún quedan algunos aspectos controvertidos por analizar entre

ellos es necesario saber cuál es el significado pronóstico de las micrometástasis

aisladas en el análisis por inmunohistoquímica del ganglio centinela y cuál es su

repercusión pronóstica [118].

Al analizar los ganglios extirpados en una disección ganglionar podemos hallar

la presencia de focos microscópicos metastásicos que según su tamaño se definen

como pN1mi cuando su tamaño está comprendido entre 2 mm y 0.2 mm y pN0 (i+)

cuando éste es menor de 0.2 mm [115, 119]. Estos pequeños focos de células

tumorales se han descrito que pueden detectarse entre el 9 y el 13% de los casos

con "axila negativa" con el análisis por técnicas de hematoxilina-eosina, y entre un


- 25 -

15% a un 20% de los casos con técnicas inmunohistoquímica [120]. Sin embargo,

actualmente siguen existiendo controversias acerca del valor pronóstico de estos

focos microscópicos metastásicos así como de la actitud terapéutica a seguir, si

bien se ha observado que su presencia se asocia de forma significativa a una peor

supervivencia cuando se compara con pacientes que no presentan afectación

ganglionar [110, 121].

En estudios realizados en Europa se considera de importancia pronóstica el

identificar la presencia de estos microscópicos focos metastásicos axilares; a esta

característica se le atribuye un mayor riesgo relativo (RR= 1.7) de desarrollar

metástasis a distancia en comparación con las pacientes sin metástasis

ganglionares ocultas [122]. Así mismo en otras investigaciones realizadas se ha

descrito una correlación significativa entre la presencia de micrometástasis en el

ganglio centinela con tumores de tamaño superior a 2 cm (T2-T3), grado tumoral

GIII y con invasión vascular como factores independientes para predecir la

afectación del resto de ganglios [123]. Por ello hay autores que aconsejan cuando

se detectan micrometástasis en el análisis del ganglio centinela, realizar una

disección axilar reglada aunque este recomendación sigue siendo motivo de

controversia [124].

Por lo tanto son necesarios nuevos estudios que investiguen factores

moleculares que asociados a los factores clínico-patológicos conocidos, ayuden a

identificar un subconjunto de pacientes en el grupo de pacientes con ganglio

centinela negativo, con alto riesgo de afectación ganglionar microscópica y así

omitir la disección axilar con la consecuente menor morbilidad en determinados

subgrupos de pacientes [125].

b) Tamaño tumoral (T): Es uno de los factores pronósticos más importantes

junto con la afectación ganglionar; en efecto el valor de “T” es uno de los tres

criterios utilizados para el estadiaje TNM (T: tamaño tumoral, N: número de

ganglios afectos y M: presencia de metástasis).


- 26 -

El tamaño tumoral se correlaciona con la presencia y el número de ganglios

linfáticos afectos, siendo además un factor pronóstico independiente que influye

sobre el riesgo de desarrollar metástasis a distancia en proporción directa al

tamaño del tumor [126]. Así en pacientes con tumores menores a 1 cm la

supervivencia global estimada a los 5 años es del 99 % comparado con el 89 %

para tumores entre 1- 3 cm y el 86 % para tumores entre 3-5 cm. Autores como

Rosen han estudiado la relación entre el tamaño tumoral y el intervalo libre de

enfermedad a los 20 años, encontrando una asociación significativa, con la

supervivencia sin recurrencia a los 20 años del 88 % para tumores de 1 cm, del 72

% para tumores 1.1 cm a 3 cm, y el 59 % para tumores entre 3.1 cm y 5 cm [127].

Se acepta de manera generalizada que las pacientes en las que el tumor es de 2 cm

o menos de diámetro máximo, tienen un pronóstico y una supervivencia

significativamente mejor comparada con las pacientes con tumores de mayor

tamaño [128, 129].

Así mismo en pacientes con tumores de pequeño tamaño se ha analizado el

papel del vaciamiento axilar con la intención de predecir en qué casos se podrían

evitar realizar disecciones axilares, observándose que tumores de tamaño < 0,5cm

no suelen presentar metástasis axilares en las series estudiadas, de manera que

son varios los autores que afirman que en estos casos, y en aquellos

correspondientes a tumores de bajo grado nuclear y de 0,6 a 1cm, podría ser

innecesario el vaciamiento axilar [130].

Por todo ello, la indicación precisa del tamaño tumoral debe de ser considerada

obligatoria en los informes anatomo-patológicos de patología quirúrgica mamaria.

c) Grado histológico (G): El grado histológico del tumor es otro de los

factores pronóstico utilizados en la clínica como criterio para considerar la

indicación de tratamiento adyuvante en las pacientes con cáncer de mama. Su

importancia como factor pronóstico independiente del tamaño tumoral y de la

afectación ganglionar, ha sido evaluada en números estudios tanto por la mayor

frecuencia de aparición de metástasis a distancia como por la menor supervivencia

global encontrada en aquellas pacientes que presentan tumores con mayor grado


- 27 -

histológico [131, 132]. Sin embargo y a pesar de requerir para su estudio de una

técnica sencilla como es la técnica de hematoxilina-eosina, no está exenta de

problemas derivados por un lado de los distintos sistemas de clasificación del

grado histológico que han ido apareciendo conforme nuevas revisiones y criterios

se han ido evaluando, así como de la subjetividad del observador a la hora de

evaluar los resultados [133].

Desde el primer sistema de clasificación histológica establecido por Bloom y col.

en 1950 [134, 135] que consideraba que el grado de formación tubular,

regularidad en el tamaño, forma y carácter de tinción del núcleo, y la

hipercromasia nuclear junto con la actividad mitótica, eran las características a

considerar hasta nuestros días, han ido apareciendo sucesivas clasificaciones

histológicas, la última de ellas la propuesta por Helpap en 1989 [136] que incluye

hallazgos nucleolares tales como su frecuencia, tamaño, número y localización.

De todas ellas una de las clasificaciones más usadas es la de Scarff-Bloom-

Richardson [137] que incluye el análisis del índice mitótico, el grado de

diferenciación y el pleomorfismo celular, asignando una puntuación de 1 a 3 a cada

variable siendo la suma de estas la que definiría el grado histológico en;

Grado 1 (Bien diferenciados): tumores con puntación final entre 3 a 5

puntos.

Grado 2 (Moderadamente diferenciados): tumores con puntación

final comprendida entre 6 a 7 puntos.

Grado 3 (Pobremente diferenciados): tumores con puntación final de

8 a 9 puntos.

d) Invasión linfovascular: La invasión linfovascular actualmente reconocida

como factor pronóstico de riesgo intermedio a partir del consenso de Saint Gallen

celebrado en 2007 [138], se sabe que representa uno de los eventos más

tempranos que se ponen en marcha en la cascada de la progresión del tumor

primario hacia los tejidos situados en su vecindad (invasión locoregional) como a

distancia (metástasis) [139]. La capacidad que tiene el tumor primario para


- 28 -

desarrollar nuevos vasos sanguíneos a través de los ya existentes e infiltrarlos

descrita inicialmente por Folkman en 1991, facilita que las células tumorales

penetren a través de ellos bien en los vasos sanguíneos o en los vasos linfáticos que

hay alrededor del tumor primario permitiendo que pequeños émbolos de células

tumorales pasen al torrente circulatorio y/o linfático y den lugar al desarrollo de

implantes metastásicos [100]. En diferentes estudios la identificación de este

evento de invasión linfovascular en el tumor primario ha sido relacionada como un

factor pronóstico independiente tanto para el riesgo de recidiva como para el

riesgo de muerte por cáncer de mama [140]. De igual forma se ha relacionado con

una mayor frecuencia de afectación ganglionar así como una mayor probabilidad

de desarrollar metástasis a distancia y menor supervivencia global con

independencia de la afectación ganglionar [141].

Sin embargo y a pesar de su importancia pronóstica, su determinación por la

técnica de hematoxilina-eosina no está libre de dificultades especialmente

relacionadas con la variabilidad inter-observador que existe en la identificación de

los pequeños racimos de células tumorales que se pueden aislar entre el espacio

vascular y las células endoteliales. Por ello nuevos estudios actualmente en curso

están evaluando el empleo de técnicas de inmunotinción para nuevos marcadores

antigénicos específicos de endotelio y vasos linfáticos, como D2-40 que hagan

posible diferenciar entre invasión vascular y linfática y ayuden a unificar y

estandarizar criterios de interpretación y análisis [142].

e) Tipo Histológico: El cáncer de mama es una enfermedad heterogénea

constituida por múltiples entidades histopatológicas asociadas cada una de ellas

con distintos factores biológicos y clínicos que le confieren significados

pronósticos diferentes [143]. La Organización Mundial de la Salud ha reconocido

hasta la fecha un total de 17 entidades histológicas cada una de ellas con

características moleculares distintas que le otorgan un comportamiento biológico

y pronóstico variable de acuerdo con el tipo histológico [101, 144]. No obstante

para simplificar y llevar a la práctica clínica esta clasificación, los parámetros que

en ella se incluyen se agrupan en 4 categorías que ayudan a precisar, e informar,

del pronóstico clínico en función de los datos histológicos [145];


- 29 -

Pronóstico Excelente: Supervivencia a 10 años > 80%. Incluye a los

subtipos: Tubular, Cribiforme, Mucinoso, Carcinoma Túbulo-lobulillar y

Adenoide Quístico.

Buen Pronóstico: Supervivencia a 10 años 60- 80%. Comprende a los

subtipos: Tubular Mixto, Ductal Mixto y Lobulillar Clásico.

Pronóstico Intermedio: Supervivencia a 10 años 60-50%. Constituído

por: Lobulillar Mixto, Medular y Medular Atípico.

Mal Pronóstico: Supervivencia a 10 años > 50%. Incluye; Ductal

Infiltrante, Ductal Mixto, Carcinoma Lobulillar Sólido, Micropapilar

Infiltrante y Carcinoma Inflamatorio.

1.3.3. Factores dependientes de las características biológicas y moleculares

del tumor

a) Expresión receptores hormonales (RH): La determinación de receptores

estrogénicos (RE) y receptores de progesterona (RP) por técnicas de

inmunohistoquímica (IHQ) en el estudio anatomopatológico del cáncer de mama,

se ha convertido en la actualidad en una práctica obligada por la repercusión tanto

pronóstica como predictiva de respuesta que tiene a la administración de

tratamientos hormonales [146, 147]. Aproximadamente entre un 55% a un 65%

de los carcinomas primarios de mama diagnosticados en la actualidad y entre un

45% a un 55% de las metástasis derivadas del tumor primario expresan

receptores hormonales. Clínicamente este hallazgo se ha correlacionado con un

moderado factor pronóstico a la vez que un importante factor predictivo de

respuesta al tratamiento hormonal tanto en adyuvancia como en pacientes en

estadio metastásico por ayudar a predecir la probabilidad de recidiva y

supervivencia de estas pacientes [148].

De hecho han sido muchos los estudios que han relacionado el estado de

expresión de receptores estrogénicos en el tumor como factor pronóstico al

asociar su falta de expresión con tumores de mayor grado histológico, mayor


- 30 -

riesgo de recidiva, menor supervivencia global y resistencia a terapia hormonal

[149], aunque existen algunas excepciones como ocurre con el carcinoma adenoide

quístico [150] y el carcinoma medular que a pesar de ser RH (-) tienen buen

pronóstico[151]. En relación a este parámetro se acepta que aquellas pacientes con

ausencia de expresión de RE (-) y/o RE-/RP- tienen un supervivencia a los 5 años

entre un 8% a un 35% más baja que aquellas pacientes con tumores RE (+) [148,

152].

De igual forma y aunque algunos autores cuestionan el valor del RP [153] se ha

descrito la importancia que tiene la expresión de RP como factor pronóstico ya que

los datos extraídos de los estudios clínicos realizados sugieren que en aquellos

pacientes que expresan RE+/RP- frente a los que expresan RE+/RP+ se observa una

menor respuesta al tratamiento hormonal con fármacos como el Tamoxifeno

describiéndose que sólo el 40% responden a dicho tratamiento [147]. Así mismo

se cree que la expresión de sólo uno de ellos en comparación con la positividad

para ambos receptores, se relaciona con tumores de mayor grado y mayor

porcentaje de expresión de HER2, por lo que se consideran entidades clínico-

patológicas distintas [154].

b) Expresión de Her-2/neu (erb-2). Oncogen cerb2: El oncogén HER2/neu

es un oncogén localizado en el cromosoma 17q21 que codifica una proteína de

membrana de 185 kD denominada p185, perteneciente a la familia de los

receptores tirosín quinasa del factor de crecimiento epidérmico (EGFR). Consta de

4 miembros denominados HER1 (EGFR), HER2, HER3 y HER4 y la proteína que

forma el receptor del factor de crecimiento epidérmico [155]. Posee un dominio

extracelular de 650 aminoácidos con dos regiones ricas en cisteína, que se enlazan

con el ligando, una región transmembrana y otro dominio intracelular de 580

amino ácidos con actividad de tirosín quinasa involucrada en la transducción de

señales relacionadas con procesos de proliferación y diferenciación celular [156].

Cuando el dominio extracelular de HER2 es ocupado por su ligando se produce una

dimerización del mismo que permite que se una a otro miembro de la familia HER

formando un complejo homo/ heterodímero que posibilita su fosforilación y


- 31 -

puesta en marcha de la cascada de transducción de señales responsable de un

determinado efecto biológico [157].

En el cáncer de mama esta proteína se ha observado que se encuentra

amplificada en alrededor del 20-30% de los casos, estableciéndose tras los

resultados obtenidos en múltiples estudios como un factor pronóstico

independiente tanto para la supervivencia global como para el intervalo libre de

enfermedad en pacientes con cáncer de mama, especialmente si presentan

ganglios linfáticos positivos [158]. La sobreexpresión de HER2 está relacionada

con mayor frecuencia con tumores RE (-) [159], con pobre grado de diferenciación

histológica y con una mayor proporción de pacientes con afectación axilar e

invasión vascular, todo lo cual explica el menor intervalo libre de enfermedad y

menor supervivencia global que caracterizan este grupo de pacientes [160].

También se ha descrito que la expresión de esta proteína se relaciona con la

respuesta al tratamiento con quimioterapia y hormonoterapia [161],

especialmente con la sensibilidad del tumor a tratamientos citotóxicos que

contengan Antraciclinas y Taxanos así como con la respuesta a terapias dirigidas

contra HER2; por otra parte los tumores que expresan esta macromolécula son

menos sensibles a esquemas con Ciclofosfamida, Metotrexate y 5-Fluorouracilo, y

muestran mayor resistencia al tratamiento con radioterapia y mayores niveles de

expresión de VEGF [162].

c) Proteína P53 (p53): El gen p53 se encuentra localizado en el brazo corto del

cromosoma 17 en la banda 17p. Es un gen tumor supresor que interviene en la

reparación del ADN por lo que se le ha denominado "guardián del genoma"

actuando como regulador negativo del crecimiento celular. Codifica una

fosfoproteína nuclear de 393 aminoácidos, cuya expresión se induce cuando se

ocasiona un daño en el ADN cualquiera que sea el mecanismo por el que tal daño se

induce -substancias carcinogénicas, radiaciones u otros-; tras este proceso la

proteína p53 que produce ocasiona la parada de la célula en fase G1 del ciclo

celular, induce la reparación del ADN y estimula la apoptosis de la célula cuando

no es posible la reparación del daño ocasionado al ADN. Por tanto alteraciones en


- 32 -

la función de p53 podrían dar lugar a que células que presentan alguna aberración

génica, proliferen y adquieran el carácter de transmisibilidad del daño a sus

descendientes dando como resultado el desarrollo del cáncer [163].

La mutación del gen p53 se ha descrito en el 20-50% de los cánceres de mama

aumentando su frecuencia en aquellos pacientes con antecedentes familiares. Se

asocia con un factor de mal pronóstico por causar la pérdida de la función

supresora y permitir el crecimiento celular ilimitado.

d) Ki-67 (mib 1): Es una proteína nuclear de 349kD que se aísla en aquellas

células que se encuentran en fases activas del ciclo celular como son la fase G1, S,

G2 y M, mientras que es imperceptible en aquellas células que se encuentran en

fase G0 ó quiescentes [164]. Por tanto su marcaje permite la identificación de la

proporción de células de un tumor que se encuentran en fase de proliferación

celular. Es decir, a través de su determinación por citometría de flujo nos informa

de cuál es la fracción de células de un tumor que se encuentran en división o que se

están preparando para duplicar su ADN, y es fácil entender que su presencia sea un

marcador de la actividad proliferativa celular [165]. Por esa razón se entiende su

valor como factor pronóstico adverso de la enfermedad, puesto que a mayor

proporción de Ki-67 aislado en una pieza tumoral, mayor índice mitótico y de

proliferación celular tienen las células del tumor y por tanto se considera que la

mayor agresividad y peor pronóstico se asocian con la presencia de este marcador

en niveles elevados mientras que un pronóstico más favorable podría asignarse a

los tumores que expresan Ki-67 en baja proporción [166].

También se sabe que la positividad de Ki-67 está relacionada con tumores mal

diferenciados, con la presencia de invasión vascular y metástasis en los ganglios

linfáticos mientras que es poco frecuente en tumores con receptores hormonales

positivos [167].


- 33 -

e) Otros factores moleculares pendientes de validar. Perfil Génico

La mama está formada por unidades funcionales denominadas unidad terminal

ducto-lobular (UTDL), constituidas por dos grupos principales de células; las

células epiteliales (luminales) y las células mioepiteliales (basales) yuxtapuestas a

la membrana basal denominadas así porque expresan características tanto de

células epiteliales como de músculo liso [168].

Las células luminales se caracterizan desde el punto de vista

inmunohistoquímico (IHQ) por expresar citoqueratinas (CK) del epitelio simple

como son CK7, CK8, CK18 y CK19, integrina α6 y moléculas de adhesión epitelial.

En cambio las células basales se caracterizan por expresar una serie de

marcadores propios como son las citoqueratinas 5 y 14, receptor del factor de

crecimiento epidérmico (EGFR), actina del musculo liso, S-100, p63 y 14-3-3 sigma

entre otros y no expresar las CK que expresan las células luminales como tampoco

expresan receptor de estrógenos ni receptor de progesterona [168-170].

Recientemente diversos trabajos publicados en la literatura han puesto de

manifiesto como los cánceres de mama asociados a expresión de marcadores tipo

basal se relacionan con peores resultados en términos de supervivencia y recaídas

más precoces frente a aquellos que expresaban marcadores tipo luminal [171,

172].

Atendiendo a estos hallazgos se ha desarrollado una clasificación molecular del

cáncer de mama que ayuda a predecir a partir de características moleculares del

tumor el pronóstico y sensibilidad a los tratamientos administrados y por lo tanto

contribuye a seleccionar tratamientos más personalizados.

Esta clasificación distingue 4 subtipos de cáncer de mama que se caracterizan

por persistir después de los tratamientos administrados y correlacionarse con las

características moleculares entre el tumor primario y las metástasis que puedan

aparecer secundariamente: [173, 174]:


- 34 -

Subtipo Basal (Triple negativo): Representan el 15-20% de los cánceres de

mama [175]. Se caracterizan por ser tumores de alto grado (G III), no expresar

receptores hormonales (RE y RP negativos) ni sobreexpresar HER2, presentar

marcadores mioepiteliales en la mayoría de los casos [176] y sobreexpresar

EGFR (HER1) y p53 [177, 178]. Se asocian a resistencia a tratamientos contra

dianas HER2 como Trastuzumab así como a terapia hormonal, tanto con

Tamoxifeno como con inhibidores de la Aromatasa, por lo que son tumores

donde la quimioterapia representa el pilar del tratamiento sistémico. Se dice

que hasta el 29% de los tumores RE (-) expresan receptores tipo mioepitelial

[179, 180]. Los cánceres de mama relacionados con mutaciones en BRCA

suelen tener este fenotipo molecular [181].

Subtipo Luminal A: Junto con el subtipo Luminal B representan el subgrupo de

mejor pronóstico. Se caracteriza por expresar RE y RP fuertemente positivos y

ser HER2 negativos [182], por lo que son muy sensibles a tratamientos

hormonales. Expresan marcadores de células epiteliales fundamentalmente CK

7,8, 18, y 19 [183].

Subtipo Luminal B: Se caracterizan por una expresión moderada de RE y una

expresión baja o negativa de RP. Pueden sobreexpresar HER2 y muestran

marcadores epiteliales. Se asocian a peor pronóstico [184, 185].

Subtipo HER2: Junto con el subtipo triple negativo se asocia a peor pronóstico.

Desde el punto de vista inmunohistoquímico se caracteriza por sobreexpresar

HER2 por lo que son tumores sensibles a terapia contra dianas HER y ser

negativo para la expresión de RE y RP [185].


- 35 -

1.4. PRUEBAS DIAGNÓSTICAS EMPLEADAS EN EL DIAGNÓSTICO DE CÁNCER

DE MAMA. LIMITACIONES ACTUALES EN EL DIAGNÓSTICO PRECOZ

La detección en etapas precoces del cáncer de mama sigue siendo unos de los

principales objetivos a alcanzar para conseguir mayores tasas de supervivencia y

de curación en las pacientes diagnosticadas de esta patología. Actualmente

conocemos que existen lesiones precursoras de cáncer que diagnosticadas

precozmente y tratadas de forma adecuada en etapas donde la enfermedad aún no

es invasiva son potencialmente curables. De igual forma se sabe que cuando la

enfermedad se hace invasiva y es diagnosticada en estadios iniciales la tasa de

supervivencia es mayor que cuando el cáncer se detecta en estadios más

avanzados.

En la actualidad gracias a las campañas de “screening” y a su mayor y mejor

difusión poblacional, junto con los avances producidos en técnicas de diagnóstico

por imagen así como al empleo de tratamientos oncológicos más eficaces, se ha

conseguido que alrededor de 2 millones de mujeres hayan sobrevivido tras el

tratamiento de un cáncer de mama [186, 187]. No cabe duda que parte de ese

incremento en la curación está en relación con la detección precoz de tumores de

mama en mujeres asintomáticas que consiguen llegar a un diagnóstico más

temprano y por tanto a la aplicación de tratamientos en estadios más incipientes lo

que hace que la enfermedad sea potencialmente curable.

No obstante y paralelamente a los métodos por imagen que clásicamente se

utilizan en las campañas de “screening”, cada vez son más los estudios en el campo

de la Proteómica y Genómica que están analizando el perfil molecular y genético a

partir del tejido tumoral y/o de la sangre de los sujetos diagnosticados de cáncer

para predecir poder ofrecer una aproximación al pronóstico de la enfermedad

[188] y por tanto administrar tratamientos más personalizados, como son el Kit

Oncotype DX [189] y el estudio Mammaprint [190]. Sin embargo la aplicación de

estos test genéticos a la práctica clínica aún dista de ser utilizados de forma

rutinaria.


- 36 -

Por ello todavía hoy día siguen siendo los métodos de diagnóstico por imagen y

exploración física, con sus limitaciones, los medios actualmente disponibles y

utilizados en clínica para llegar a un diagnóstico precoz. Estos métodos

principalmente son; la mamografía y la exploración física realizada por

profesionales expertos, seguidos de ecografía, autoexploración y resonancia

nuclear magnética (RNM).

1.4.1. Autoexploración

En décadas anteriores la autoexploración mamaria constituía uno de los

métodos por el que se diagnosticaban muchos de los casos de cáncer de mama. Hoy

día esta situación ha cambiado de forma significativa gracias a la divulgación de

nuevas técnicas de imagen como la mamografía, la resonancia magnética (RM) y la

ecografía mamaria que se han llevado a cabo a través de las campañas de cribado

poblacional y que han conseguido detectar lesiones de menor tamaño con la

consiguiente repercusión en un mejor pronóstico y supervivencia del cáncer de

mama [191-193].

A pesar de ello la autoexploración sigue teniendo su papel en el algoritmo de

cribado, de diagnóstico precoz y de recidiva, por ser una técnica de fácil uso, no

cruenta, asequible a toda la población y que no requiere de ningún tipo de

instrumentación compleja para su realización. La autoexploración mamaria

permite a la mujer familiarizarse con su propia anatomía pudiendo apreciar

cambios de textura, tamaño o apariencia de la mama como un signo de alarma a

partir del cual consultar al médico quien determinará la conveniencia, o no, de

realizar otras pruebas complementarias. Incluso se ha insistido que mediante este

procedimiento, en ocasiones, se han podido detectar tumores de tamaño inferior a

los que puede percibir el clínico. Sin embargo y a pesar de existir campañas

educativas y gran divulgación para conseguir su aplicación, son muchas las mujeres

que no la realizan de forma rutinaria por lo que junto con la existencia de mejores

técnicas diagnósticas y la disminución significativa en el tamaño de presentación al

diagnóstico de los tumores de mama, ha hecho que su uso quede desplazado por las

nuevas técnicas de imagen [194].


- 37 -

No obstante es necesario enfatizar que la autoexploración exclusiva no ha

demostrado ser un método eficaz para disminuir la mortalidad ni mejorar la

detección precoz del cáncer de mama [195, 196]. De hecho en recientes revisiones

se cuestiona su recomendación por ocasionar un aumento importante del número

de biopsias sin que de ello se derive un beneficio en supervivencia en el cáncer de

mama [197, 198]. Sí ocasiona en cambio, un incremento en el diagnóstico de

patología benigna y por tanto un mayor número de biopsias sin que con ello

podamos predecir si con posterioridad va a desarrollarse o no un proceso tumoral

[195, 199].

Aún así donde parece que la autoexploración mamaria tiene un papel más

importante es en el subgrupo de mujeres con historia familiar de cáncer de mama

hereditario especialmente las portadoras de la mutación en BRCA1 ya que con

frecuencia se acompañan de tumores pobremente diferenciados con mayor

velocidad de crecimiento y por lo tanto más fácilmente detectables por este

procedimiento [200].

1.4.2. Exploración mamaria por un clínico experto

Es junto con la mamografía una de las técnicas empleadas en la consulta diaria

para el diagnóstico precoz así como para el seguimiento postratamiento de las

paciente diagnosticadas de cáncer de mama. Cuando a ésta exploración clínica se le

une la mamografía se consigue detectar un mayor número de ganglios clínicamente

negativos y tumores de menor tamaño que si es realizada de forma exclusiva [201].

Por otra parte en pacientes más jóvenes donde la mamografía tiene menor

sensibilidad y no es realizada de forma habitual, la exploración física de la mama

adquiere un parel importante en la detección precoz de esta patología [202]. Sin

embargo no se ha podido demostrar que de su aplicación de derive un descenso en

los índices de mortalidad por cáncer de mama [203, 204].


- 38 -

1.4.3. Ecografía Mamaria

El uso de ultrasonidos en el campo de la Senología fue descrito inicialmente por

Kikuchi. K. y col. en el año 1957 [205]. Desde entonces hasta nuestros días, el

empleo de la ultrasonografía ha ido adquiriendo progresivamente un papel cada

vez más relevante por su amplia aplicación tanto como técnica de “screening” como

en el diagnóstico de la patología tumoral de la mama. Esta técnica está exenta de

efectos secundarios y que en muchos casos proporciona al clínico información que

puede sugerir si se trata de una lesión de características benignas o malignas.

Incluso en aquellos casos que es de difícil interpretación, puede ser utilizada como

guía para la realización de una punción aspiración o biopsia [206].

Una de las principales indicaciones de uso es en el “screening” de las mujeres de

edad comprendida entre los 30 y 39 años, en las cuales por la mayor densidad

radiológica del tejido mamario tiene menor resolución [207, 208]. Es en este rango

de edad donde la ecografía ha demostrado en estudios retrospectivos tener mayor

sensibilidad que la mamografía en el diagnóstico de carcinoma invasivo con un

99% frente al 85% respectivamente. Sin embargo cuando se trata de detectar la

presencia de microcalcificaciones características de ciertos tipos de lesiones

mamarias malignas la ventaja de la mamografía es indudable frente a la ecografía

con una sensibilidad aproximada del 22% [209].

A pesar de lo expuesto uno de los principales inconvenientes que tiene la

ecografía es que su sensibilidad al diagnóstico disminuye cuando se trata de

lesiones no palpables [210], que posee una baja especificidad y que hasta ahora no

hay estudios que demuestren que mediante su uso como test de despistaje tumoral

se haya conseguido disminuir la mortalidad por cáncer de mama [206, 211].

1.4.4. Mamografía

Son muchos los estudios randomizados que han analizado y evaluado el papel

que tiene el empleo de la mamografía como técnica diagnóstica en el “screening”

poblacional del cáncer de mama. De ellos se ha sugerido que de su uso se puede

derivar una reducción significativa de la mortalidad por esta enfermedad [212]. Y


- 39 -

hoy día se acepta que aplicada en programas de cribado poblacional sistemáticos la

mamografía ha supuesto un importante avance al conseguir disminuir los índices

de mortalidad por cáncer siendo este beneficio máximo en mujeres de edad

comprendida entre 60 y 69 años con un beneficio en términos de mortalidad

acumulada que sigue existiendo incluso después de 10 años [213].

La mamografía es una exploración no invasiva que utiliza radiación ionizante

(rayos X) de baja energía para detectar anomalías estructurales en la mama.

Actualmente se la considerada como una de las técnicas disponibles hoy día más

importantes para el diagnóstico precoz del cáncer de mama ya puede detectar

alteraciones en el parénquima mamario sospechosas de malignidad antes de que

sean evidentes en la exploración física. Presenta una sensibilidad en general de un

75%, encontrándose comprendida entre un 54% a un 58% para mujeres menores

de 40 años y entre un 80% a un 94% para aquellas mujeres de más de 65 años

[204].

Los programas de “screening” poblacional incluyen actualmente la mamografía

como una de las pruebas más importantes a realizar recomendando su realización

de forma bianual a partir de los 50 de edad. Son varios los metaanálisis que han

comparado las diferencias en cuanto a la mortalidad por cáncer de mama tras

realizar campañas de cribado que incluyesen la exploración mamográfica de forma

anual frente a realizarla cada 2 años. De esos estudios se sabe que el beneficio en

supervivencia en términos absolutos estaba en torno al 0.6% en 5 años y 1.2% en

10 años para aquellas pacientes que se realizaban una mamografía cada año en el

“screening” lo que no justifica la frecuencia anual en su empleo [214-216].

Actualmente una nueva modalidad de mamografía, la mamografía digital DMIST

(Digital Mammographic Imaging Screening Trial) parece que si bien tiene una

sensibilidad similar a la mamografía convencional, parece que es más exacta en

mujeres menores de 50 años y en perimenopáusicas, con mamas radiológicamente

más densas [217].


- 40 -

Sin embargo, por sí sola la mamografía no confirma el diagnóstico de malignidad,

siendo necesaria la realización de una prueba invasiva como es la biopsia para

alcanzar la confirmación histopatológica.

1.4.5. Resonancia Nuclear Magnética (RM)

El “screening” de cáncer de mama por mamografía ha conseguido disminuir la

mortalidad de la misma entre un 25 a un 30% en la población general como lo han

puesto de manifiesto numerosos estudios. Sin embargo existe un subgrupo de

pacientes de alto riesgo, especialmente si ocurre a edades jóvenes en donde el

diagnóstico precoz por mamografía no tiene una adecuada sensibilidad. Incluso en

aquellos casos de mujeres de alto riesgo donde la mamografía consigue detectar la

presencia de un tumor, en muchas ocasiones los detecta en un estadio subóptimo

[218].

La resonancia nuclear magnética (RM) es una técnica diagnóstica de gran

utilidad en la detección y la caracterización de la patología mamaria [219-221].

Inicialmente se empezó a realizar sin emplear medios de contraste hace más de 30

años [222]; posteriormente y como resultado de los estudios realizados se ha

indicado la importancia de emplear contraste como el gadolinio para conseguir

una mayor resolución y calidad de imagen y así poder discriminar mejor entre

lesiones benignas y malignas de la mama.

Presenta algunas ventajas sobre otras técnicas diagnósticas empleadas en el

“screening” del cáncer de mama. Entre ellas su alta sensibilidad de alrededor del

70-100% frente al 13-59% de la mamografía y al 13-65% de la ecografía para

detectar tumores de pequeño tamaño [223]. Sin embargo no está exenta de

algunas desventajas, entre las que destaca su moderada especificidad para

diferenciar entre lesiones benignas de aquellas que son de carácter maligno

obteniéndose alrededor de un 5% falsos positivos que requieren de la realización

de nuevas pruebas como la biopsia, así como su alto coste, largo tiempo de examen

y una menor disponibilidad de uso comparada con la mamografía y ultrasonido

[224].


- 41 -

Estos resultados propiciaron la puesta en marcha de 11 estudios prospectivos

que comparaban la adicción de la RM anual a la mamografía en los programas de

detección precoz del cáncer de mama. El resultado que se obtuvo fue un

incremento en la sensibilidad de la mamografía en cuanto a la detección precoz

superior al 90% (más del doble que la mamografía sola). Aunque los datos de

supervivencia no estén aún disponibles, la distribución por estadios de los tumores

diagnosticados predice una reducción significativa del índice de mortalidad de

cáncer de mama comparado con la obtenida al realizar sólo mamografía [218].

Por todo ello actualmente la recomendación de realización de una RM de mama

en las guías de práctica clínica son fundamentalmente en aquellas mujeres de alto

riesgo por ser portadoras de una mutación genética en BRCA relacionada con el

cáncer de mama hereditario [225-227], en aquellas otras en donde no se ha

descrito esta mutación pero si tienen antecedentes de primer grado portadores de

la mutación y por lo tanto también tienen un mayor riesgo de desarrollar cáncer de

mama, en aquellas mujeres que fueron sometidas a irradiación torácica entre los

10 a 30 años de edad y en las que su riesgo estimado de desarrollar cáncer de

mama al aplicarle un modelo estadístico de riesgo (ej. BRCAPRO) se encuentra

entre el 20-25% [228]. Sin embargo todavía hoy no se considera que existan

suficientes datos para recomendar su uso en mujeres con historia familiar de

cáncer de mama, con mamas densas mamográficamente, o con una biopsia previa

de alto riesgo de hiperplasia ductal o lobulillar atípica o de carcinoma lobular in

situ [229, 230]. También se recomienda en la revaluación de la respuesta del

tratamiento neoadyuvante y en pacientes que debutan con metástasis axilares de

origen desconocido [229].

Sin embargo hasta el momento no hay estudios sobre el impacto protector que

tiene la RM en términos de supervivencia [231].

Por todo ello se debe seguir en la búsqueda de nuevos métodos de “screening”

que puedan optimizar los resultados obtenidos en la detección precoz del cáncer

de mama bien asociando técnicas como ecografía y mamografía o quizás


- 42 -

incorporando determinaciones moleculares a las clásicas técnicas de imagen

conocidas.

1.5. ALTERACIONES EPIGENÉTICAS EN EL CÁNCER

El cáncer se produce como consecuencia de la pérdida de regulación del

crecimiento celular normal dando lugar a un clon celular con capacidad para crecer

de forma desorganizada e independiente de los mecanismos de regulación que en

condiciones fisiológicas rigen el correcto funcionamiento celular normal. Esta

cadena de eventos hace que la célula vaya adquiriendo progresivamente capacidad

para diseminar, invadir y dañar tejidos y órganos situados a distancia del lugar

donde se originó inicialmente el tumor produciendo metástasis.

En tejidos normales y en condiciones fisiológicas, existe un riguroso y complejo

control del crecimiento y la diferenciación celular perfectamente regulado

existiendo un equilibrio entre los factores que estimulan la proliferación y

diferenciación celular, de aquellos que estimulan la muerte celular programada o

apoptosis. Cuando este equilibrio se altera a favor de los procesos de proliferación

y supervivencia celular, los mecanismos de control que regulan la multiplicación y

la muerte celular dejan de actuar correctamente, iniciándose un proceso de

crecimiento y multiplicación celular anárquico carente de control y orden, que

puede derivar en el desarrollo de un proceso tumoral.

La expresión de la información genética a nivel celular que va a determinar el

fenotipo y diferenciación de un individuo va a estar sujeta a múltiples

acontecimientos a nivel molecular que van a influir en la expresión de proteínas

funcionales y en su funcionamiento. A lo largo de la vida, las células pueden ir

acumulando daños en el ADN como consecuencia de deleciones, translaciones,

mutaciones derivadas entre otras causas de la exposición a agentes químicos,

radiaciones y virus, que si bien en la mayoría de las ocasiones no tienen

repercusiones futuras, otras en cambio producen alteraciones en la maquinaria

genética que otorgan a la célula propiedades conductuales y de funcionamiento

como la capacidad de reproducirse de forma indefinida, ser indiferentes a las


- 43 -

señales que regulan el crecimiento celular normal tanto factores positivos como

factores inhibitorios, evasión de la muerte celular programada y desarrollo de

capacidad angiogénica lo que otorga a la célula tumoral y a su progenie la capacidad

para invadir y producir metástasis así como ventajas en supervivencia sobre las

células normales [232].

Durante décadas se ha cuestionado si la iniciación y progresión del cáncer, se

debía sólo a eventos genéticos. Actualmente se considera que el proceso de

carcinogénesis es el resultado de no sólo cambios en la secuencia de nucleótidos de

la cadena del ADN sino que también procesos epigenéticos (modifican la función

de un gen, sin modificar la secuencia de nucleótidos del ADN) van a intervenir a

través de modificaciones de la función de un gen, en la proliferación celular

pudiendo contribuir a la aparición de alteraciones moleculares responsables del

desarrollo de las enfermedades neoplásicas [233].

El código genético consta de 2 tipos de información: genética y epigenética. La

información contenida en el primero de los casos consiste en 64 tripletes de

nucleótidos llamados codones, tal que cada codón codifica para uno de los 20

aminoácidos utilizados en la síntesis proteica. Esta información genética contenida

en dichos genes puede sufrir alguna alteración como ocurre cuando se produce

una mutación, lo que provoca un cambio permanente en la secuencia del ADN y

consecuentemente la síntesis proteica anormal. Este hecho ocasiona dependiendo

de qué proteína está alterada y cuál es la función que realizaba en condiciones

fisiológicas, una alteración en la replicación, supervivencia celular etc. que puede

propiciar la puesta en marcha de la cascada de la carcinogénesis.

El otro tipo de información estaría representada por la epigenética donde

residen las instrucciones de cómo, dónde y qué información genética debe ser

utilizada en cada momento. Es decir aunque el genoma contiene toda la

información necesaria para poner en marcha la transcripción del código genético,

la expresión de esta información está regulada por la información epigenética

fundamentalmente representada hasta lo que sabemos hoy día, por el patrón de


- 44 -

metilación de las secuencias CpG contenidas en la región promotora del gen en

cuestión y la desacetilación de las histonas.

Sin embargo entre ambos tipos de información existen algunas diferencias que

son importantes conocer ya que nos podrían permitir su empleo en la

investigación y en la búsqueda de nuevas dianas terapéuticas en el cáncer. Así

mientras que los eventos genéticos como las mutaciones producen cambios

permanentes en la secuencia del ADN, la metilación de las regiones CpG de la

región promotora de un gen sólo silencia su expresión proteica sin modificar la

secuencia de nucleótidos. Esta característica unida a que hoy conocemos que es un

proceso reversible hace que sea un interesante mecanismo a desarrollar para

revertir el funcionamiento celular anormal de una célula tumoral.

El término epigenética se refiere a un cambio heredable en el patrón de

expresión génica, mediado por mecanismos diferentes a los eventos genéticos

como son las translocaciones, mutaciones, deleciones etc., que pueden producir

modificaciones secundarias de los componentes de la cromatina a través de

cambios en el patrón de metilación del ADN y de la acetilación/desacetilación de las

histonas. Ambos mecanismos pueden ocasionar cambios en la expresión proteica

de la célula anulando sus funciones fisiológicas por silenciamiento transcripcional

de un gen determinado sin cambiar con ello el código genético [234, 235]. Hoy se

sabe que estas aberraciones epigenéticas, pueden estar implicadas en etapas

tempranas de la carcinogénesis y que su estudio como biomarcador en la detección

precoz del cáncer podría tener determinadas ventajas frente al estudio de

alteraciones genéticas: i) en cáncer, la frecuencia de metilación aberrante en las

islas CpG situadas en la región promotora de numerosos genes es mayor que la

frecuencia con la que se encuentran alteraciones en el ADN ocasionadas por

mutaciones así como que este perfil de metilación aberrante se puede cuantificar;

ii) la metilación aberrante en las islas CpG puede ser detectada incluso cuando esta

anomalía está acompañada de gran cantidad de ADN normal y iii) las técnicas para

detección las islas CpG metiladas son relativamente sencillas [232, 236].


- 45 -

Durante la década de 1980 y 1990 disminuyó considerablemente el interés en el

estudio de los cambios epigenéticos en la carcinogénesis, al ponerse de manifiesto

que existía gran cantidad de cambios en la estructura primaria del ADN como

posibles responsables del desarrollo de procesos como el cáncer. Sin embargo

actualmente este enfoque ha cambiado sustancialmente debido a la observación de

que el silenciamiento de la región promotora de genes por metilación de las

citosinas en las células tumorales está claramente relacionada con la puesta en

marcha de mecanismos moleculares implicados en carcinogénesis a través de

alteraciones en la regulación del ciclo celular, la reparación del ADN, la interacción

célula a célula, la apoptosis o la angiogénesis tumoral [237-239].

El papel por tanto que ocupa el proceso de metilación del ADN y su implicación

en la fisiopatología del cáncer, se ha convertido en uno de los hallazgos de mayor

importancia en la investigación del cáncer. Uno de los principales avances en este

campo en los últimos 5 años, ha sido el reconocimiento del papel clave que

desempeña el estado de la cromatina como mediador entre la metilación del ADN y

el silenciamiento transcripcional de numerosos genes como son los genes tumor

supresor [240, 241].

Por lo tanto hoy día gracias a los trabajos en el campo de la Biología Molecular,

sabemos que el cáncer, es en parte una enfermedad de origen genético es decir,

debida a la aparición de alteraciones en el genoma celular pero también a la

aparición de cambios en la expresión de genes, o en la actividad biológica de

proteínas codificadas por ellos [8]. La mutación de oncogenes específicos o genes

supresores de tumores, debida a la presencia de lesiones de ADN no reparadas,

ocasiona una pérdida en la regulación normal del ciclo celular que favorece la

proliferación celular incontrolada lo que junto con el silenciamiento de genes

involucrados en regular la supervivencia y apoptosis celular podrá dar lugar al

desarrollo de un cáncer [8]. Estas alteraciones genéticas en ocasiones se producen

en la línea germinal (las mutaciones hereditarias son una excepción) pero la

mayoría de las veces son mutaciones somáticas (cambio genético en la secuencia

del ADN en células no derivadas de la línea germinal) que de no ser reparadas

correctamente pueden dar lugar a alteraciones en el ADN como son;


- 46 -

translocaciones, deleciones, inversiones, amplificaciones o mutaciones puntuales

[242].

Por tanto el estudio epigenético del cáncer en humanos desde su descubrimiento

en 1983, ha permitido avanzar en el conocimiento etiopatogénico del cáncer

incluyendo procesos de hipometilación global de la molécula de ADN, la

hipermetilación de las regiones promotoras de los genes, la pérdida de

“imprinting”, la modificación de la cromatina y estudios de microARNs [243]

poniendo todo ello en relación con la situación clínica de los pacientes afectos de

enfermedades neoplásicas.

1.5.1. Biología de las regiones CpG, metilación del ADN y acetilación/

desacetilación de las histonas

El ADN es la molécula responsable de almacenar la información genética; en ella

residen las claves para regular la diferenciación celular de los diferentes tejidos y

órganos que conforman un individuo. Estructuralmente está constituído por una

doble cadena de ADN enrollada sobre sí misma de tal manera que cada cadena

sencilla está dirigida en sentido antiparalelo (considerando la dirección de su

polimerización o crecimiento) formando una estructura en espiral con grupos

azúcar-fosfato orientados hacia el exterior constituyendo el esqueleto y bases

nitrogenadas que están orientadas hacia el eje central de la espiral. Esta molécula

de ADN no se encuentra en la célula como una molécula desplegada, sino que

habitualmente se repliega sobre sí misma asociándose a otras moléculas

fundamentalmente proteínas denominadas histonas formando una estructura más

estable y compleja llamada cromatina.

En condiciones fisiológicas cuando un estímulo extracelular llega a la célula, éste

se une a su receptor de membrana produciendo la activación de distintas vías de

transducción de señales intracelulares que finalmente conducen a la activación de

factores de transcripción y la síntesis proteica derivada de la activación de un

determinado gen. En este contexto la cromatina que estructuralmente está

condensada en el núcleo de las células (forma inactiva), se “descompacta” ante la


- 47 -

llegada de señales intracelulares permitiendo así que las ARN polimerasas inicien

el proceso de transcripción y transducción proteica en respuesta a un determinado

estímulo extracelular. De esta forma se activan o inhiben rutas de señalización

implicadas en los procesos fisiológicos de proliferación, diferenciación,

supervivencia, transformación y muerte celular necesarios para mantener la

homeostasis tisular [244].

En esta cadena de eventos que ocurren en el interior de la célula, son de gran

importancia determinadas fenómenos epigenéticos que tienen un peso importante

en la maquinaria de regulación de los procesos de transcripción génica. Entre ellos

se encuentran las modificaciones covalentes que suceden en las histonas por

procesos de acetilación-desacetilación de las mismas, así como las reacciones de

metilación/desmetilación de las citosinas en el ADN. En el primer caso se sabe que

cuando se produce la acetilación de los residuos de lisina (unión grupo acetilo) de

los extremos amino-terminales de las histonas (NH2-terminal) realizados por

enzimas con actividad histona-acetilasa (HAT), se produce una reducción de la

carga positiva de estas proteínas lo que disminuye por tanto su afinidad de unión

al ADN (cargado negativamente) “descompactando” la cromatina y permitiendo la

transmisión de señales y la entrada de los factores de transcripción a la cadena de

ADN. Así se puede iniciar la síntesis proteica. Por contra, cuando se producen los

procesos de desacetilación de las histonas mediados por enzimas con actividad

desacetilasas se provoca el efecto inverso, es decir se mantiene la estructura

cerrada de la cromatina impidiendo la transcripción proteica [245].

El segundo de los caso representa otro de los eventos decisivos en la regulación

transcripcional y expresión génica conocido como metilación del ADN, mecanismo

fisiológico esencial para el desarrollo normal de mamíferos y plantas. Este evento

en el genoma de los seres vertebrados tiene lugar en las secuencias CpG localizadas

en la región promotora de los genes. Hoy conocemos que la metilación del ADN es

un fenómeno epigenético que tiene un papel decisivo en la regulación de los

procesos de transducción de señales actuando a dos niveles; a) directamente sobre

la secuencia promotora del gen que al ser metilada ocasiona el silenciamiento de la

transcripción proteica de dicho gen y por tanto anula su función, y b)


- 48 -

indirectamente actuando sobre la transcripción génica al favorecer que la

cromatina se encuentre en su forma inactiva (cerrada/ compacta) cuando la región

promotora del gen se encuentra metilada; de esta manera se impide la unión de

factores de transcripción al ADN. En condiciones fisiológicas este evento

epigenético tiene un papel fundamental a la hora de dictaminar qué genes se

activan durante el proceso de diferenciación de la célula comprometida normal

[246], así como en el mantenimiento del “imprinting” genético [247], inactivación

del cromosoma X [248], represión transcripcional genética [249] y en la supresión

de regiones “parasitarias” del ADN [250]. Sin embargo, también juega un papel

determinante en el desarrollo de un proceso tumoral maligno cuando se produce

de forma aberrante [251].

La metilación del ADN consiste en la adicción covalente de grupos metilos

generalmente al carbono 5´ de residuos de citosinas (C) del ADN situadas previa y

contiguamente a bases de guanina (G) por medio de unas enzimas denominadas

ADN-Metiltransferasa (DNMTs). Hasta la fecha se han descrito dos tipos de

enzimas ADN Metiltransferasas: una inicial que se conoce como ADN

Metiltransferesa de “novo” y un segundo tipo conocida como ADN Metiltransferasa

de “mantenimiento”. La primera de ellas, las DNMTs de “novo” (DNMT3A y

DNMT3B) serían las encargadas de establecer el perfil de metilación del genoma en

etapas tempranas del desarrollo mientras que las DMNTs de mantenimiento

(DNMT1) se encargan posteriormente de propagar con rigurosa fidelidad este

perfil de metilación CpG en cada una de las generaciones posteriores derivadas de

la célula progenitora [252].

Estas enzimas es muy importante que actúen correctamente ya que cuando se

altera su función y se produce una metilación aberrante puede favorecer el

silenciamiento génico y por tanto la falta de transcripción proteica de

determinados genes reguladores encargados de controlar el adecuado

funcionamiento celular y así permitir la expresión de oncogenes que ponen en

marcha la cascada de la carcinogénesis. De hecho en estudios experimentales

realizados en ratón se ha descrito que la ausencia de función de cualquiera de estas

enzimas DNMTs (DNMT1, DNMT3A y DNMT3B) ocasiona la muerte del ratón


- 49 -

durante el periodo embrionario o inmediatamente después. En células tumorales

humanas también se ha descrito que la deficiencia en DNMT1 induce mitosis

atípicas que provocan la muerte celular mientras que las enzimas DNMT3A y 3B

parece que median en la transformación neoplásica y la progresión tumoral [253].

La metilación de las “citosinas” en el ADN ocurre en regiones del gen ricas en

dinucleótidos de citosina y guanina (CpG), que aparecen agrupados en formaciones

de unas 1000-1500 pb conocidas como “islas CpG” y que se encuentran localizadas

en regiones que son decisivas para la regulación de la transcripción génica.

En efecto aún cuando el dinucleótido CpG se distribuye de forma repetitiva y al

azar por todo el genoma humano, esta secuencia se encuentra preferentemente

ubicada en la región promotora del gen (secuencia del gen donde tiene lugar la

iniciación para la síntesis de ARNm), en los exones y en las regiones 3´. Así cuando

la ADN-Metiltransferasa durante la replicación del ADN metila el carbono 5´ de las

citosinas de la cadena recién sintetizada, la conversión de citosina en 5-

metilcitosina de los islotes CpG de la región promotora, puede causar cambios en la

conformación estructural de la cromatina que impidan su descompactación,

bloqueando la entrada de los factores de transcripción y con ello provocando el

silenciamiento y no expresión de un determinado gen [254, 255].

En la célula normal en aproximadamente el 70% de los casos estas secuencias

CpG se encuentran de forma fisiológica en estado no metilado es decir funcionante,

con expresión proteica derivada de la transcripción de dicho gen. Sin embargo, en

las células tumorales estas regiones CpG se encuentran en la mayoría de los genes

relacionados con actividades supresoras de tumores y de control del crecimiento

celular normal en estado metilado es decir, silenciado, determinando con ello que

genes que en condiciones fisiológicas se expresan actuando como genes supresores

de tumores, a causa de la metilación de su promotor dejen de estarlo permitiendo la

expresión de oncogenes que ponen en marcha la cascada de la carcinogénesis

aunque aún no son bien conocidas las circunstancias por las que esto sucede [256-

258].


- 50 -

Actualmente sabemos que tanto la metilación del ADN como la acetilación/

desacetilación de las histonas son procesos que están interrelacionados entre sí, ya

que según se ha descrito la metilación del promotor favorece la desacetilación de

las histonas y con ello el que la estructura de la cromatina esté cerrada y por tanto

inaccesible a los factores de transcripción, y viceversa, cuando las histonas están

acetiladas la cromatina se descompacta y permiten la entrada del complejo de

transcripción si bien el ADN parece ser más sensible a la metilación aunque estos

mecanismos no son bien conocidos. Además cuando existen bajos niveles de

acetilación de las histonas se sensibiliza el ADN a los procesos de metilación [259]

y aún cuando en este proceso de interrelación entre cambios epigenéticos en el

ADN y en la cromatina hay todavía cierto nivel de incertidumbre se acepta que la

modulación de la transcripción génica de acuerdo con la acetilación de las histonas

puede actuar produciendo una acetilación global de las histonas o bien acetilando

las histonas de la región promotora. En el primer caso este proceso se

correlacionaría con la actividad general transcriptional, mientras que la acetilación

específica del promotor representaría un mecanismo crítico para el control de

actividad específica del gen, existiendo un nivel de acetilación equilibrado de

acuerdo con los mecanismos de regulación entre enzimas desacetiladoras y

acetiladoras [260].

Según los trabajos de Felsenfeld y col. [261] la acetilación de las histonas actúa

como mecanismo de protección frente a la metilación de la región promotora del

gen que ha de expresarse manteniendo su estado no metilado. Esto parece que es

debido a que al metilarse la región promotora de un determinado gen, existen

enzimas metiladoras de histonas que pueden reconocer citosinas metiladas y

metilar las histonas próximas. Del mismo modo, encimas que metilan el ADN

pueden reconocer histonas metiladas, y así seguir con la metilación a nivel de ADN.

El resultado final derivado de todo ello que se produzca un cambio en el perfil de

metilación del gen que da lugar al silenciamiento del gen metilado y por lo tanto la

ausencia de expresión derivada de su transcripción [236].

Cuando un determinado gen se expresa en un tejido normal las secuencias CpG

de la región promotora de ese gen, se encuentran no metiladas y las histonas en


- 51 -

torno a la cromatina están acetiladas. Sin embargo cuando acontece un evento

epigenético que favorece la progresión hacia un tejido preneoplásico y

posteriormente tumoral, gradualmente se producen reacciones de desacetilación

de las histonas y metilación de las regiones CpG favoreciendo el silenciamiento

génico de genes encargados de regular la correcta homeostasis celular

ocasionando la pérdida de expresión de genes supresores de tumor [259]. Estos

acontecimientos tienen un papel importante en la regulación de la expresión y

silenciamiento de los genes, ya que se sabe que aunque todos los genes están

presentes en las células de un determinado tejido, sólo una pequeña proporción de

ellos se expresarán mientras que la mayoría permanecerán silentes. Es decir, los

genes que se deben expresar en los tejidos en condiciones fisiológicas tienen las

regiones de sus promotores no metiladas, mientras que los genes que se deben

desactivar en los tejidos diferenciados tienen estos islotes metilados (silenciados).

Por tanto el que se expresen determinados genes y se silencien otros tendrá un

papel determinante tanto en el desarrollo normal de los tejidos como en la

aparición de un proceso tumoral al silenciarse genes implicados en la regulación

de fenómenos de proliferación, regulación del ciclo celular, reparación del daño al

ADN etc. [255].

Este hecho, ha revelado una importante relación entre cambios epigenéticos con

patrones anormales de metilación y enfermedades como el cáncer. Esta relación

entre metilación aberrante y cáncer se ha hecho evidente al encontrarse hace pocos

años que la ausencia de metilación conducía a la activación de oncogenes mientras

que la metilación anulaba la acción protectora de los genes supresores de tumores

[237, 262-264].

Por tanto, el mantenimiento del perfil de metilación de los dinucleótidos CpG en

el genoma es crucial para la homeostasis celular adecuada, de forma que cuando

este equilibrio se altera, ocasiona patrones de metilación aberrantes que producen

silenciamiento de genes que deberían expresarse como son los genes tumor

supresores y en cambio permite la expresión de genes que deberían estar

silenciados como los oncogenes pudiendo resultar de todo ello la aparición de un

proceso tumoral [265].


- 52 -

Este mecanismo por el que la metilación del ADN afecta a la expresión de los

genes sigue siendo un tema de intenso estudio, al que se han propuesto dos

explicaciones. La primera es que la metilación de las islas de CpG en los sitios de

unión del promotor con los factores de transcripción bloquearía dicha unión, con la

consiguiente falta de expresión del gen. La segunda se basa en la existencia de una

familia de proteínas nucleares específicas, las proteínas de unión a metilcitosinas,

que reconocen y se unen a las secuencias metiladas del ADN (dmCpG). Estas

proteínas podrían inhibir las interacciones con los factores de transcripción

necesarios para que el gen se exprese; además, podrían atraer hacia sí otros

elementos –por ejemplo, histona-desacetilasas– que, al eliminar los grupos acetilos

de las histonas, inducirían la compresión de los nucleosomas imposibilitando la

transcripción. Este proceso puede ser revertido mediante histona-

acetiltransferasas y desmetilación del ADN [266, 267].

Estos cambios epigenéticos que ocurren debido a cambios de la conformación de

la cromatina, acetilación de las histonas, y la metilación de las islas CpG, podrían ser

potencialmente utilizados para identificar las diferentes etapas del desarrollo del

cáncer, especialmente en el diagnóstico precoz, pronóstico y tratamiento [268-

271].

Especialmente en el cáncer, los patrones de metilación aberrante pueden

contribuir al desarrollo de esta enfermedad por facilitar la expresión de genes que

en condiciones fisiológicas no se expresarían como los oncogenes e inhibir en

cambio la expresión de otros que actuarían regulando el correcto funcionamiento

como son los genes tumor supresor de tumores.

1.5.2. Aplicación del estudio del perfil de metilación aberrante del ADN en el

cáncer de mama

El cáncer de mama es una enfermedad que diagnosticada precozmente es

potencialmente curable. Sin embargo y aún en estadios iniciales, hasta un 30 % de

las mujeres diagnosticadas de cáncer de mama localizado a lo largo de su vida, la


- 53 -

enfermedad se hace metastásica sin haberse podido anticipar a su detección con las

técnicas que habitualmente disponemos en la clínica [272].

En los últimos años, gracias al avance en técnicas de Biología Molecular, se han

desarrollando nuevos procedimientos que dirigidos fundamentalmente a su

aplicación en el diagnóstico precoz de distintas patologías incluyendo las

propiamente infecciosas, especialmente virales, pasando por las estrictamente

hereditarias hasta las enfermedades neoplásicas están ofreciendo resultados

prometedores que nos aproximan a un diagnóstico más precoz, un tratamiento y

pronóstico cada vez más personalizado y en definitiva un mejor abordaje

terapéutico [273]. En el cáncer y hasta fechas recientes, desde las primeras

determinaciones de marcadores tumorales característicos de determinados tipos

de tumores mediante su análisis en sangre periférica por técnicas de RIA o ELISA,

se ha dispuesto de cierta información que nos ha orientado hacia el posible origen

del tumor y también en el seguimiento de la respuesta a los tratamientos aplicados

[274]. Sin embargo, y aunque la utilización en la práctica clínica de estas técnicas

suponen un aporte sustancial, su especificidad y sensibilidad es limitada en la

mayoría de los casos [275]. Esta característica unida a que los niveles de

marcadores cuantificados en sangre periférica rara vez se encuentran elevados en

las etapas preinvasivas de la enfermedad, hace que su utilidad como método de

diagnóstico precoz tenga relativamente poco valor.

Sin embargo actualmente conocemos que sucesos como la metilación aberrante

de las regiones de promotoras de múltiples genes ocurren en etapas tempranas de

la carcinogénesis y que su determinación es posible a través del análisis del ADN

aislado en sangre periférica o fluídos naturales (como el aspirado de los ductos

mamarios) por técnicas poco cruentas, lo que permitiría ser utilizado como un

potencial biomarcador en el diagnóstico precoz y quizás de recidiva de un proceso

tumoral así como en la identificación temprana de aquellos individuos con alto

riesgo de desarrollar cáncer de mama [276, 277]. Una de las técnicas de la que

disponemos para este estudio del perfil de metilación es la reacción en cadena de la

polimerasa o PCR, con la que podemos amplificar pequeñas cantidades de ácidos

nucleicos circulantes en sangre periférica, mejorando así las limitaciones tanto de


- 54 -

sensibilidad como de especificidad que tenían técnicas anteriores y abrir una

puerta más al diagnóstico molecular de la enfermedad neoplásica. De hecho por

medio del estudio de metilación por PCR (MSP) se describe que es posible detectar

una única célula tumoral con ADN aberrantemente metilado de entre 104 células

normales [278]. Además el estudio de la metilación del ADN frente al estudio de

proteínas o moléculas como el ARN presentan algunas otras ventajas a parte de

poder ser amplificadas por PCR y son su mayor estabilidad y el que puede ser

aislado del tejido fijado con formol e integrado en parafina.

Las alteraciones genéticas y epigenéticas que inician y promueven cascadas

intracelulares relacionadas con la carcinogénesis en su etapa más temprana,

podrían ser por tanto utilizadas para predecir la presencia de enfermedad tumoral

en pacientes que desde el punto de vista clínico aún no presenta síntomas ni signos

relevantes que hagan sospechar el diagnóstico de una determinada enfermedad

tumoral pudiendo aproximarnos al mismo tiempo a información sobre su

pronóstico y tratamiento necesario [279].

En la actualidad ya han sido descritas alteraciones específicas en suero de perfil

de metilación de regiones promotoras de genes tanto supresores de tumores como

de genes implicados en la proliferación y supervivencia celular relacionadas con el

cáncer de mama que en los pacientes con cáncer se encuentran metilados y en

cambio se encuentran no metilados en personas sanas. La detección de este perfil

de metilación a través del estudio de fluídos corporales como el aspirado de los

ductus mamarios o de su análisis en sangre periférica, son técnicas poco cruentas y

accesibles en la práctica diaria a través de las cuáles podríamos analizar este patrón

de metilación en un subgrupo de población de mayor riesgo para a partir de él

anticiparnos a un diagnóstico más precoz [280].

En este sentido recientes estudios realizados han mostrado que es posible

observar alteraciones específicas derivadas de la presencia de un tumor a través

del estudio del ADN disuelto en suero en tumores del área de cabeza y cuello,

pulmón, cáncer de colon etc. en etapas precoces [263, 281] e incluso en el cáncer de

mama se ha descrito este hallazgo en tumores in situ [272]. Estos avances pueden


- 55 -

derivar en un importante impulso para el desarrollo de nuevas terapias contra el

cáncer así como en el estudio individualizado de los pacientes que podrían resultar

beneficiados de un tratamiento más específico adaptado a su tumor en particular

[282].

Por lo tanto el estudio del patrón de metilación del ADN, podría ser aplicado al

estudio molecular del cáncer de acuerdo las siguientes hipótesis:

• En primer lugar, si la metilación aberrante de las islas CpG de la región

promotora de un determinado gen, se encuentra metilada en un alto

porcentaje de las células tumorales y no en células sanas, esta característica

podría ser utilizada para detectar la presencia de células cancerígenas a

partir de muestras obtenidas de biopsia o tejido tumoral o bien a través del

análisis del ADN libre en el plasma del paciente [283].

• En segundo lugar, si un conjunto de genes se encentran metilados de forma

patológica en un determinado tipo histológico de tumor, y a su vez se

relaciona con un determinado comportamiento en cuanto a la sensibilidad a

distintos tratamientos de quimioterapia u hormonoterapia, o al pronóstico

de la enfermedad, estas determinaciones podrían ser utilizadas como un

marcador molecular que ayude a orientarnos sobre el origen del tumor, a

predecir un pronóstico más preciso, a decidir el tratamiento más adecuado

de acuerdo con las características moleculares del mismo y quizás poder ser

utilizado como marcador de recidiva precoz [283].

• Por último, si la metilación de la región CpG de un determinado gen/genes

en tejido no tumoral se asocia con un riesgo aumentado para el desarrollo de

un tumor, estas determinaciones podrían ser utilizadas como un futuro

marcador de riesgo para desarrollar cáncer [283] lo que nos podría permitir

realizar mejores campañas de “screening” en la población avanzando en los

métodos de diagnóstico precoz.


- 56 -

1.5.3. Muestras y fluídos en los que se puede estudiar el perfil de metilación

El análisis del estado de metilación del ADN se puede efectuar en cualquier

fluido biológico: en el supuesto de que con este estudio se busque el despistaje de la

presencia de un tumor hay que aceptar que la lisis celular en el seno del tumor

produce detritus que en su proceso normal de eliminación pasan a los fluidos

biológicos, donde pueden ser identificados.

Se ha descrito la aplicación del estudio de biomarcadores de ADN metilado en los

siguientes medios:

a) Detección de ADN libre extraído de suero o plasma

La presencia de ADN libre en plasma/suero de pacientes con cáncer fue descrita

inicialmente en la década de los 70 [284]. Este hallazgo describió como parte del

ADN disuelto en plasma procedía del ADN liberado al torrente circulatorio como

consecuencia de los fenómenos de apoptosis y necrosis celular que sufrían las

células tumorales [285]. Sin embargo su estudio analítico con fines diagnósticos no

avanzó hasta décadas después cuando, gracias a la investigación translacional se

asociaron las técnicas de PCR y PCR específica de metilación al estudio del ADN

circulante en pacientes diagnosticados de cáncer. Sólo así se pudo distinguir ADN

procedente del tumor y ADN procedente de los tejidos sanos y por ello hasta

entonces el hallazgo inicial de mutaciones en el ADN asociadas al cáncer concentró

el mayor interés científico [286]. Sin embargo, este planteamiento no estaba exento

de limitaciones ya que localizar una mutación concreta en un gen generalmente

desconocido y amplificar específicamente esa secuencia del ADN que contiene la

mutación a partir del material genético obtenido de una muestra en donde

predominaban células normales suponía un complejo y difícil proceso [283].

Hoy día los avances en el campo de la epigenética han permitido mediante el

análisis del patrón de metilación del ADN aislado en suero de sujetos afectos de

cáncer, poder determinar si este sigue un patrón de metilación fisiológico o, como

sucede con las células tumorales, es un patrón de metilación aberrante [287, 288].

Este tipo de estudios nos han permitido saber que en el cáncer se encuentran


- 57 -

metilados ciertas secuencias de promotores de genes que en la población sana y en

condiciones fisiológicas se encuentran no metilados, y además que estas

alteraciones epigenéticas están presentes en etapas tempranas de la carcinogénesis

[289-291]. Para la detección del perfil de metilación de las regiones CpG a partir del

análisis en suero por PCR cualitativa se han sometido a estudio grupos de pacientes

con tumores de diferentes orígenes, entre ellos: cáncer de pulmón [292-294],

cabeza y cuello [295], esófago [296], hígado [297], colo-rectal [298], próstata [299],

vejiga [268, 300], melanoma y mama [301].

De los resultados de estos trabajos se ha podido constatar la importancia de la

técnica en el detección de las anomalías de la metilación y del papel de la metilación

como biomarcador en la detección temprana y el diagnóstico del los distintos tipos

de cáncer.

b) Detección del ADN tumoral a partir del lavado de los conductos

galactóforos

El análisis del perfil de metilación a partir de células tumorales aisladas de

fluídos naturales como la orina, el esputo, el lavado bronquiolo-alveolar (BAL) o el

lavado de los ductos galactóforos de la mama, saliva etc. puede ser especialmente

interesante asociada al estudio citológico puesto que utilizando ambas

metodologías se puede confirmar el diagnóstico especialmente cuando el material

que se aísla procede de restos de células tumorales que están degradadas o es

escaso. Como ejemplo de ello en algunos trabajos se ha correlacionado el análisis

del estado de metilación aberrante de Ciclina D2, RARb, Twist, GSTP1, p16, p14,

RASSF1A y DAPK en el aspirado de los ductos de mujeres con cáncer de mama y

con una citología sugerente de malignidad para cáncer de mama en un alto

porcentaje [302, 303].

A continuación describimos los posibles campos de aplicación del estudio del

ADN metilado de forma patológica:


- 58 -

1.5.4. Posibles campos de aplicación del estudio del ADN metilado de forma

patológica

a) ADN metilado como marcador de riesgo en cáncer

Los marcadores tumorales que habitualmente se emplean en clínica son

fundamentalmente proteínas que medidas en el suero o en el plasma pueden

ayudar a identificar precozmente población afecta de un proceso tumoral.

Igualmente son de utilidad en aquellas personas diagnosticadas de cáncer para

determinar el pronóstico de la enfermedad, monitorizando la respuesta terapéutica

y el seguimiento de acuerdo con su determinación periódica en sangre periférica.

Sin embargo tienen algunas limitaciones importantes como es que en la mayoría de

las ocasiones no es órgano-específica e incluso se puede detectar elevada en

patología no tumoral [188].

En la práctica habitual además del empleo de estos marcadores tumorales,

existen distintos modelos matemáticos capaces de estimar el riesgo individual que

una mujer sana tiene de desarrollar cáncer de mama; este tipo de modelos de

riesgo están basados en datos epidemiológicos y etiológicos obtenidos de estudios

llevados a cabo incluyendo grandes muestras de población de mujeres afectas de

cáncer de mama. Bajo el denominador común de modelos predictivos de riesgo se

apoyan en el método matemático de la regresión logística multivariante. Entre ellos

uno de los más usados es el modelo de Gail, que basado en factores de riesgo

epidemiológicos, utiliza la edad al diagnóstico del tumor, edad de la menarquia,

edad del primer embarazo, número de biopsias previas, y número de familiares en

primer grado (madre o hermana) con cáncer de mama, para estimar dicho riesgo.

Así se considera que una mujer es de riesgo elevado cuando el riesgo de desarrollar

cáncer de mama es superior al 1,7% en los próximos 5 años [304]. Sin embargo,

estos modelos predictivos de riesgo presentan también algunas limitaciones,

incertidumbres y omisiones. Entre estas últimas señalaremos que en la

aproximación matemática predictiva no se consideran la edad a la que se

diagnosticaron los casos de cáncer de mama en la familia, no se incorporan los

resultados de test genéticos ni se considera a los familiares de segundo grado.


- 59 -

Además los estudios de validación realizados han demostrado que el modelo

sobreestima ligeramente el riesgo en poblaciones sin “screening” mamográfico,

especialmente en mujeres premenopáusicas [305], así como en poblaciones con

menor incidencia basal y que incluso en el mejor de los casos la estimación del

riesgo se encuentra entre el 58-59% [304]. Por lo tanto es necesario desarrollar

nuevos modelos predictivos que añadieran y/o modificaran otros factores de riesgo

a los ya descritos. [306].

Actualmente se ha descrito que el estudio molecular de las alteraciones

epigenéticas en sangre periférica podría ser de utilidad para predecir el riesgo de

desarrollar cáncer [307]. El dogma según el cual el cáncer es una enfermedad de

origen genético fue el principal pilar que lideró el campo de la investigación del

cáncer durante muchas décadas [308]. Ese paradigma ha contribuido al avance de

la investigación y del conocimiento y, gracias a él, hoy conocemos la secuencia del

Genoma Humano así como gran cantidad de información molecular en la que se

describen mapas de mutaciones genéticas relacionadas con las enfermedades, entre

ellas el cáncer, junto con potenciales marcadores moleculares que posteriormente

podrían ser utilizados en el diagnóstico y tratamiento del cáncer [309]. Sin embargo

y considerando que cada vez existen más evidencias de que en el cáncer los eventos

epigenéticos contribuyen tanto en la patogénesis como en la progresión de la

enfermedad se ha puesto de manifiesto que en el cáncer además de alteraciones

genéticas hay cambios epigenéticos de singular importancia [278, 281, 299, 310-

315].

En este sentido conviene precisar que, quizás, el primer evento en la cascada de

la carcinogénesis reside en el daño producido al ADN bien por alteraciones

genéticas como son mutaciones, pérdida de heterocigosidad, inestabilidad en los

microsatélites o bien por eventos epigenéticos como es la metilación del ADN. Hoy

día sabemos que tanto las alteraciones genéticas como epigenéticas son fenómenos

que realmente están interrelacionados entre sí. Esto se ha observado en el cáncer

colo-rectal donde se ha demostrado que la metilación la región promotora de los

islotes CpG en un gen silencia exclusivamente el alelo no mutado (wild type) [316]

y que la metilación puede potenciar que se produzcan mutaciones al contribuir al


- 60 -

silenciamiento durante la evolución de la especie de las secuencias CpG y dar lugar

a una mutación por ej. CG a TG frecuentemente aislada entre las mutaciones del gen

p53 [317, 318]. Además, se sabe que el silenciamiento transcripcional tanto de

genes tumor supresor como de aquellos otros encargados de reparar el daño

producido al ADN es un hallazgo frecuente en estadios precoces y subclínicos de la

enfermedad [319, 320]. Por ejemplo, en algunos estudios tanto p16ink4A como el

gen MGMT han sido encontrados metilados en el ADN de esputo 35 meses antes de

que pudiese clínicamente ser demostrada la presencia del cáncer de pulmón [321];

o como la metilación patológica del ADN que parece inducida por la infección de la

bacteria Helicobacter pylori en el antro gástrico, ha sido propuesta como un factor

predictivo del riesgo para el desarrollo del cáncer gástrico [322].

Si tenemos en cuenta estos resultados observacionales se podría sugerir que los

cambios epigenéticos ocurren antes que los eventos genéticos y que la combinación

de ambas alteraciones en el genoma desencadena la inducción de los mecanismos

carcinogénicos. De hecho la pérdida de impresión genética (LOI), un hecho

importante en la regulación de la homeostasis, en el gen IGF2 que promueve

proliferación celular y que se ha descrito en el coriocarcinoma y teratocarcinoma

[323], fue aislada tanto en el epitelio colónico normal como en los linfocitos

circulantes de individuos con riesgo aumentado de desarrollar cáncer de colon

[307].

b) ADN metilado como marcador pronóstico en cáncer

La afectación ganglionar y el tamaño del tumor son los factores pronóstico más

importantes hasta hoy día conocidos en el cáncer de mama [324-327]. Sin embargo,

aproximadamente 1/3 de mujeres con cáncer de mama sin afectación ganglionar

recaen a lo largo del seguimiento de la enfermedad, mientras que otro tercio de

pacientes no recaen tras 10 años de evolución a pesar de tener afectación

ganglionar en el momento del diagnóstico [328, 329]. Esto resultados podrían

indicar que los factores pronóstico utilizados actualmente para predecir qué

pacientes recaerán y, por consiguiente, cuáles necesitan realizar tratamiento

sistémico más agresivo, no son suficientes a la hora de identificar a aquellos


- 61 -

pacientes en los que se puede obviar dicho tratamiento y con ello las toxicidades

que de él derivan, por tener un bajo riesgo de recidiva de la enfermedad. En este

sentido debemos esperar que el estudio de nuevos marcadores moleculares

dependientes del tumor, asociados a los ya conocidos, nos permitan discernir con

mayor sensibilidad y especificidad en qué subgrupo de pacientes existe un mayor

riesgo de recaída de la enfermedad y por lo tanto cual es el tratamiento a

administrar en función de su nivel de riesgo [330, 331].

Este objetivo se ha intentado alcanzar en muchas ocasiones a partir del estudio y

aplicación de test genéticos diseñados para buscar en pacientes afectos de cáncer

datos moleculares que ayuden a predecir e identificar el grado de agresividad de un

tumor. Sin embargo los estudios realizados hasta el momento se han encontrado

con dos importantes problemas. El primero de ellos es que el porcentaje de

mutaciones somáticas que se aíslan en los tumores sólidos es muy bajo, de ellos la

mutación del oncogén K-Ras y del gen tumor supresor p53 son las más conocidas.

En segundo lugar el que las poblaciones de células tumorales del tumor primario

son muy heterogéneas, por lo que ningún marcador puede por sí solo predecir con

exactitud cuál será el comportamiento de un determinado tumor [332].

La aplicación de técnicas basadas en el análisis de la metilación de los islotes CpG

de genes implicados en procesos de apoptosis, adhesión celular, reparación de ADN

y el ciclo celular no ha permitido hasta el momento resolver el problema de la

heterogeneidad celular; sin embargo, analizando la metilación del ADN como

marcador molecular en pacientes con cáncer de pulmón y cáncer de colon se han

observado un peor pronóstico en aquellos pacientes en los que en los que fue

posible identificar alteraciones en la metilación en los promotores de los genes

DAPK y p16INK4a respectivamente [333, 334].

c) ADN metilado como marcador predictivo de respuesta clínica en cáncer

La identificación de nuevos marcadores predictivos de respuesta que añadidos a

los ya utilizados en clínica, ayuden a seleccionar el tratamiento más adecuado de

acuerdo con factores moleculares y biológicos del tumor, representa en la


- 62 -

actualidad una importante área de investigación hacia el que la práctica oncológica

avanza paralelamente con el desarrollo de las nuevas tecnologías en el campo de la

Biología Molecular. Poder conocer las posibilidades de respuesta a los tratamientos

con QT, HT y nuevas dianas moleculares en las pacientes candidatas de recibir un

tratamiento adyuvante o paliativo, es un reto que todavía hoy sólo está resuelto

parcialmente.

En el cáncer de mama, los métodos que actualmente están disponibles para

determinar con precisión la agresividad de la enfermedad y la probabilidad de

respuesta a un determinado tratamiento de forma individualizada son todavía

insuficientes. En la actualidad la QT adyuvante debe ser considerada en la mayoría

de las pacientes con cáncer de mama a excepción de un pequeño subgrupo con una

predicción de riesgo de recaída muy bajo basado en factores clínicos y moleculares

conocidos hasta el momento. Sin embargo, no todas las pacientes se beneficiarán de

estos tratamientos ya sea porque tienen un pronóstico excelente o porque su tumor

no responde a determinada QT y en cambio sí estarán expuestas a presentar

efectos secundarios derivados de dicho tratamiento [335]. Por tanto es necesario la

búsqueda de nuevos marcadores predictivos de respuesta que sumados a los

actualmente conocidos nos ayuden a indicar tratamientos más individualizados y

selectivos para cada paciente.

En el cáncer de mama concretamente la identificación de 5 subtipos moleculares

y la expresión en tumor de RE y/o RP, representan uno de los factores más

importantes predictivos de respuesta al tratamiento hormonal y con valor

pronóstico [172, 336]. En este sentido también se ha descrito que la metilación

también puede tener un papel predictivo de respuesta importante. Así se ha

descrito que la metilación de ESR1 es factor predictivo de respuesta en aquellas

pacientes tratadas con Tamoxifeno y la metilación de ARH1 es predictivo de

respuesta para las pacientes no tratadas con antiestrógenos, mientras que la

metilación de CYP1B1 es factor predictivo de supervivencia [337].


- 63 -

d) Aplicación de la metilación aberrante del ADN a la terapéutica del

cáncer

La metilación del ADN es uno de los eventos epigenéticos más frecuente e

importantes que ocurre durante etapas tempranas de la caricinogénesis y que

incidiendo directamente en la inactivación de genes supresores de tumores

ocasiona una pérdida de control del ciclo celular y un déficit en los procesos de

reparación del ADN dañado que promueve, fenómenos de proliferación celular

incontrolada y confiere ventajas a la supervivencia celular a través de la función de

genes involucrados en el desarrollo tumoral [338, 339]. Actualmente se sabe que

las alteraciones genéticas que se van acumulando en el ADN añadidas a las

alteraciones epigenéticas que si modificar la secuencia de nucleótidos ocasionan

cambios postranscripcionales contribuyen a desarrollar un fenotipo tumoral. Los

eventos epigenéticos son un mecanismo de regulación fisiológico y necesario que

posee el organismo para definir la expresión génica y para conferir estabilidad

genómica al asegurar el adecuado orden y funcionamiento celular. Sin embargo,

este patrón de metilación que por otra parte puede heredarse [340], en

determinadas situaciones patológicas deja de regular el correcto funcionamiento de

la división y desarrollo celular, confiriendo ventajas a la célula a favor de una

proliferación celular descontrolada carente de control y de la pérdida de los

fenómenos apoptóticos que favorece el desorden celular y en el desarrollo de los

procesos tumorales.

Este fenómeno ha sido descrito en varios distintos tipos de tumores lo que ha

permitido establecer patrones específicos de metilación en diferentes subgrupos

de tumores [341, 342]. Por tanto probablemente la adecuada comprensión de los

perfiles de metilación tumoral puede tener un impacto positivo y ayudar en la

búsqueda de soluciones a importantes problemas clínicos como son; la detección

precoz del cáncer, quimioprevención, pronóstico y tratamiento de las

enfermedades neoplásicas [338].

Se ha demostrado en experimentos llevados a cabo en modelos de ratón, que si

se revierte o disminuye el nivel de metilación existente en los promotores de


- 64 -

determinados genes se consigue prevenir la aparición de tumores. Este resultado es

demostrativo de la importancia del papel de la metilación aberrante sobre el

crecimiento tumoral in vivo y su papel patogénico [257, 343, 344]. En estudios

iniciales que trataran de explicar el papel de la metilación en células tumorales

humanas, se ha observado al analizar comparativamente el tejido tumoral y el

tejido sano que en tejido tumoral existen cuantitativamente mayor cantidad de

grupos 5-metilcitosina, que en el tejido sano que rodeaba al tumor y este hallazgo

se ha asociado al predominio del silenciamiento de genes en el especimen tumoral

[345]. Posteriormente se pudo demostrar que este mecanismo de silenciamiento

génico también existía en las células sanas como mecanismo regulación de

expresión de proteínas y que la ausencia de metilación permitía que un

determinado gen se expresara, sugiriendo que la metilación actúa como un

mecanismo de regulación génica fisiológico. Sin embargo y a diferencia de lo que

ocurre en células sanas, en las células tumorales, existe un predominio de genes

encargados de regular el ciclo celular que se encuentra metilados mientras que tal

metilación está ausente en oncogenes. Es decir existe por tanto una desregulación

del ciclo celular y un aumento de expresión oncogénica.

Todo esto llevó a plantear como hipótesis de una futura diana terapéutica, que

revirtiendo el estado de metilación y, por tanto, el silenciamiento génico derivado

de este mecanismo, se podría favorecer la expresión y recuperar la funcionalidad

de aquellos genes encargados de regular el ciclo celular normal que, debido a una

alteración en el patrón de metilación se encuentran anormalmente silenciados. Esto

dio lugar a la aplicación en terapéutica oncológica de dos moléculas análogas de

citosina; la 5-Azacitidina y la 2-Deoxicitidina que dirigidas contra la enzima DNAMT

impiden la transferencia de grupos metilos y por tanto el silenciamiento de los

genes a través de la metilación de sus promotores [346]. Los datos acumulados en

la actualidad demuestran un efecto beneficioso de estos fármacos con respuestas

clínicas positivas en estudios realizados en pacientes especialmente en el

tratamiento de procesos hematológicos, aunque el mecanismo exacto de actuación

de dichos fármacos no está aun totalmente aclarado [347, 348].


- 65 -

Quizás el campo de la terapia epigenética represente un futuro esperanzador en

el tratamiento del cáncer. De hecho ya se han descrito estudios in vitro en los que

agentes como Decitabina (5-Azacitidina-2-Deoxicitidina) revierten la resistencia a

varios agentes citotóxicos utilizados en el tratamiento del cáncer como Cisplatino,

Epirrubicina y Temozolamida en líneas celulares de cáncer en humanos [349-351].

1.6. GENES ANALIZADOS EN ESTE TRABAJO Y RUTAS METABÓLICAS EN LAS

QUE INTERVIENEN

En el presente trabajo de investigación analizamos el perfil de metilación por

PCR cuantitativa de la región promotora de un panel de 5 genes implicados cada

uno de ellos en distintas rutas de regulación celular para estudiar su posible

utilidad como biomarcador en el cáncer de mama.

1.6.1. Metilación en genes supresores de tumores

Uno de los mecanismos implicados en el proceso de carcinogénesis es la pérdida

de función de genes supresores de tumores, que en condiciones fisiológicas actúan

como un regulador negativo de la proliferación celular o regulador positivo de la

diferenciación celular en respuesta al daño producido en el ADN. Así suprime la

división celular cuando no existe necesidad de reparar un daño en el ADN. La

inactivación de estos genes supresores de tumores por tanto contribuye al proceso

de carcinogénesis por conferir ciertas ventajas al crecimiento celular indefinido

estimulando la activación de la división celular desorganizada carente de

retrocontrol negativo.

Esta anulación de la actividad de estos genes en parte, está relacionada con el

proceso de metilación de citosinas de las islas CpG situados en la región promotora

de dichos genes supresores de tumores, produciendo un silenciamiento de su

expresión por anulación en la transcripción del ADN, favoreciendo así una pérdida

de control del ciclo celular al hacer que las células sean insensibles al control de

señales antiproliferativas.


- 66 -

En el cáncer de mama existe una amplia lista de genes supresores de tumores

que se han encontrado metilados en etapas tempranas de la carcinogénesis. Entre

ellos se encuentran; BRCA1 y BRCA2, p16 INK4a, RAR-Beta, p53, FHIT [352, 353]

De todos ellos nosotros cuantificamos el estado de metilación del promotor de

RAR- Beta.

a) RAR-Beta: Constituye una familia de receptores del ácido retinoico (RAR)

situados en el núcleo de la célula, que tienen como función intervenir en los

mecanismos de control del crecimiento y diferenciación celular, estableciendo un

equilibrio entre procesos de proliferación y apoptosis. Actúan como factores de

transcripción activados por ligandos que uniéndose a la región promotora de

numerosos genes diana, dan lugar a su expresión o represión transcripcional[354].

Dentro de cada clase de receptor, existen tres subtipos: α, β y γ. Recientemente se

han localizado los genes que codifican para estos receptores RAR-α, RAR-β y RAR-γ

humanos y se ha visto que se localizan, respectivamente, sobre los cromosomas

17q21.1, 3p24 and 12q13 [355].

El gen RAR-Beta es un importante gen tumor supresor que mientras en líneas

celulares de mama no tumorales se encuentra en estado no metilado y por lo tanto

se expresa regulando que la célula no prolifere de forma indefinida, en cambio en

líneas celulares de cáncer de mama se ha observado que se encuentra metilado en

una 3ª parte de los casos y por tanto no se expresa favoreciendo consecuentemente

el crecimiento celular continuado, en diversos tumores sólidos como son el cáncer

de pulmón, cáncer de cabeza y cuello y cáncer de mama [356, 357]. Concretamente

en el cáncer de mama se ha encontrado metilado hasta en un 43% de los tumores

infiltrantes [352, 358] relacionándose su estado de metilación en pacientes con la

presencia de metástasis óseas, cerebrales y pulmonares [359]. Por tanto el

determinar el estado de metilación en suero de este gen y la consiguiente pérdida

de expresión proteica derivada de la ausencia de su transducción proteica, podría

ser utilizado como biomarcador para predecir el riesgo de metástasis en el cáncer

de mama. Incluso autores como Widschwendter y col. estudiando la repercusión y

papel del estado metilado del gen RAR-Beta en cuatro líneas celulares de cáncer de


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mama, observó que cuando este estaba metilado se confería una situación de

refractariedad al ácido trans-retinoico (ATRA) que hoy día conocemos que actúa

como inductor de su expresión por medio del ARN mensajero del RAR-B2 (ARNm)

y que sólo se podía revertir esta situación y por lo tanto inducir su expresión

cuando estas líneas celulares eran tratadas con agentes desmetilantes como el 5-

aza-28-deoxicitidina (Aza-CdR), consiguiéndose así su expresión [360]. Además, en

diversos trabajos se ha observado que es posible la reactivación endógena de RAR-

B al inducir la reacetilación de histonas en la secuencia promotora RARB P2 en

líneas celulares de cáncer de mama sugiriendo que RAR-B podría ser un objetivo

importante para la terapia contra el cáncer [361, 362].

1.6.2. Metilación en genes relacionados con los mecanismos de control celular

El ciclo celular consiste en una serie de eventos perfectamente coordinados que

permiten el crecimiento y la proliferación celular de forma organizada. Para

asegurar la correcta progresión a través del ciclo, las células han desarrollado una

serie de puntos de control que previenen la entrada en una nueva fase del ciclo

hasta que hayan completado exitosamente la anterior. Los principales

componentes de la maquinaria del ciclo celular son las quinasas dependientes de

ciclinas (CDK), las que, cuando son activadas, permiten a las células pasar de una

fase del ciclo a la siguiente.

Existen puntos de control en el ciclo celular que aseguran la progresión del

mismo:

Punto de control del ADN no replicado, en la entrada de fase M. Actúa

inhibiendo a Cdc25, el cual es un activador de la Ciclina A/B Cdk1.

Punto de control del ensamblaje del huso, antes de la telofase. Se activa una

proteína Mad2 que impide la degradación de la segurina, lo que impide la

segregación de las cromátidas hermanas.

http://es.wikipedia.org/w/index.php?title=Crom%C3%A1tidas_hermanas&action=edit


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Punto de control de la separación de cromosomas, al final de la mitosis. En

el caso de que fuera incorrecto, se impediría la degradación de la Ciclina B

por APC.

Punto de control del daño del ADN, en G1, S o G2. El daño celular activa a

p53, proteína que favorece la reparación el ADN, detiene el ciclo

promoviendo la transcripción de p21, inhibidor de Cdk, y, en el caso de que

todo falle, estimula la apoptosis.

En el cáncer de mama, fundamentalmente resaltar el papel de la Ciclina D2 y

proteína 14-3-3 sigma:

a) Ciclina D2: Se sintetizan en fase G1, siendo responsables de la transición de

G1 a S tras activar a Cdk4 y Cdk6. Las ciclinas de tipo D desempeñan un papel

importante en la integración de las señales mitogénicas y, se puede decir, que

constituyen el punto de conexión entre el medio extracelular y el ciclo celular. Una

vez que los factores de crecimiento interaccionan con sus receptores localizados en

la membrana plasmática, se dispara una cascada de transducción de señales cuyo

eje principal es la vía Ras/Raf/MAPK, uno de cuyos principales lo constituye la

síntesis de Ciclina D. Su estado metilado que implicaría el silenciamiento y por tanto

su no expresión se ha descrito en distintos tumores como el cáncer de mama

provocando una pérdida de regulación del ciclo celular normal [363].

b) 14-3-3 sigma: Pertenece a una familia de genes con hasta 7 isoformas, cuyo

producto proteico actúa a través de la fosforilación de los residuos de serina o

treonina, inhibiendo la progresión del ciclo celular en fase G2/M una vez se ha

producido el daño en el ADN. Después de producirse dicha lesión en el ADN, se

activa un programa transcripcional en el que el interviene el gen tumor supresor

p53 como inductor de 14-3-3 sigma, provocando la detención del ciclo celular y la

muerte celular programada [364].

Se ha descrito que la pérdida de expresión de 14-3-3 sigma por metilación de su

región promotora, está presente en más del 90% de los casos de cáncer de mama.

Este silenciamiento epigenético, puede contribuir al desarrollo de una neoplasia

http://es.wikipedia.org/wiki/P53

http://es.wikipedia.org/wiki/Apoptosis

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=ShowDetailView&TermToSearch=14601057&ordinalpos=10&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_RVDocSum


- 69 -

por impedir la comprobación de la correcta progresión del ciclo celular en G2/M

cuando se produce una lesión en el ADN. De esta forma permitiría la acumulación

de defectos y aberraciones genéticas responsables del desarrollo tumoral. Este

hecho se ha descrito en diversos tipos de tumores, entre ellos el cáncer de próstata,

pulmón, mama y varios tipos de cáncer de piel [364, 365].

1.6.3. Metilación de genes implicados en la reparación de ADN

Los genes reparadores de ADN constituyen un grupo de genes que codifican

proteínas cuya función es corregir errores que surgen cuando las células duplican

su ADN antes de dividirse. Las mutaciones en estos genes, puede conducir al

fracaso en la reparación de ADN, permitiendo que mutaciones posteriores no se

reparen y se acumulen, pudiendo como consecuencia favorecer el desarrollo de un

proceso tumoral.

En cáncer de mama, se ha observado la implicación de la metilación de genes

reparadores del ADN con la aparición del cáncer. De ellos el más destacado, el

hMLH1[366].

a) hMLH1: Gen MM (Human Mut. L. Momolog.), ubicado en el cromosoma

3p21. Codifica una proteína que interviene en uno de los mecanismos de

reparación del ADN al detectar errores en las secuencias de nucleótidos por falta de

complementariedad entre las dos hebras de ADN durante la fase de apareamiento.

Esta proteína reconoce el par de bases erróneas, las separa y reemplaza por el par

correcto, garantizándose la fidelidad del proceso de transmisión de la información

genética. Se conocen al menos 6 genes reparadores; hMLH1, hMSH2, hMSH6,

hMLH3, PMS1 y PMS2 [367].

1.6.4. Metilación de genes implicados en la adhesión celular

a) E-Cadherina: La Cadherina E (CDH1) ubicada en el cromosoma 16q22.1

corresponde a un tipo de molécula de adhesión fuertemente relacionada con el

desarrollo del cáncer especialmente con aspectos asociados a la invasión y

metástasis. El gen CDH1 codifica una glicoproteína transmembrana llamada


- 70 -

E-Cadherina que tiene un papel importante en el mantenimiento de la adherencia

de célula a célula en tejidos epiteliales [368]. La E-Cadherina pertenece a la familia

de moléculas de adherencia Ca2+ dependientes que permiten la asociación

homofílica entre las células, manteniendo así la integridad del tejido.

Las células están interconectadas por "moléculas adhesivas", entre las que se

incluyen dos moléculas claves llamadas beta-catenina y E-Cadherina, que se

encuentran sobre la superficie de las células. Cuando se produce una falta de

función de estas moléculas de adhesión, la célula puede así "desprenderse" del

tejido del que procede y migrar para formar otro tumor en un lugar distante

invadiendo tejidos vecinos hasta entrar en el torrente sanguíneo adquiriendo

capacidad metastatizante. Por tanto, la escasez de E-Cadherina dificultará que la

célula se adhiera a las células adyacentes favoreciendo su migración a un nuevo

tejido donde se podrá multiplicar y originar metástasis confiriéndole a la

enfermedad un comportamiento invasivo.

En el cáncer, se considera que como prerrequisito para que las células epiteliales

malignas invadan el tejido cercano y lleven a cabo la diseminación metastásica, se

requiere que se disocien fácilmente del resto de las otras células tumorales y a la

vez, que se vea incrementada la movilidad celular de las células tumorales. Dichos

eventos son favorecidos por la pérdida de la expresión de la E-Cadherina.

Las alteraciones en la expresión de esta proteína, han sido relacionadas en

varios tipos de cáncer y correlacionadas con rasgos patológicos como la pobre

diferenciación tumoral, crecimiento infiltrante, la presencia de metástasis

ganglionares y la menor supervivencia de los pacientes [369]. Las mutaciones de

línea germinal en este gen predisponen en los individuos afectados al cáncer

gástrico tipo difuso y cáncer de mama de inicio temprano.

Recientemente, fue demostrado que el silenciamiento del gen CDH1 por la

metilación de isla CpG de su región de promotora, ocurre en algunas líneas

celulares de cáncer de mama [370].


- 71 -

1.6.5. Metilación de genes implicados en la proliferación celular

a) Receptor de Estrógenos (RE): El receptor de estrógenos codificado por el

gen ESR1, forma parte de la familia de factores de transcripción activados por

ligandos nucleares que regulan la expresión de genes sensibles a estrógenos en

distintas células diana. Entre sus funciones se encuentran la de controlar distintos

procesos celulares incluyendo el crecimiento, la diferenciación y función del

sistema reproductivo así como ser responsable del crecimiento, mantenimiento del

esqueleto y el funcionamiento normal del sistema cardiovascular y nervioso.

Concretamente en la mama es bien conocida que la interacción entre RE y su

ligando el 17b-estradiol, tiene un papel importante no sólo en su desarrollo normal

sino también en la carcinogénesis del cáncer de mama al poder estimular el

crecimiento celular tumoral en aquellos tumores que expresan RE, lo que también

representa un factor predictivo de respuesta al tratamiento hormonal en este

subgrupo de pacientes [371]. Sin embargo sólo 2/3 de las pacientes diagnosticadas

de cáncer de mama expresan RE al diagnóstico, mientras que el otro 1/3 de los

casos no lo expresan [372]. Incluso en algunas ocasiones, tumores que en el

momento del diagnóstico son RE positivos pasan a ser RE negativos a lo largo de la

enfermedad [373]. Esta ausencia de expresión de RE se asocia a tumores poco

diferenciados, con mayor índice de proliferación celular, pobre respuesta al

tratamiento hormonal y peor un pronóstico.

El gen del RE se encuentra localizado en el cromosoma 6q25.1. Concretamente

en su región promotora consta de una secuencia CpG ubicada en el exón 1, que en

líneas celulares de cáncer de mama que expresan RE como MCF-7, T47-d y ZR75-1

se ha observado que se encuentran en estado no metilado al igual que ocurre en

tejido normal. Sin embargo en líneas celulares de cáncer de mama RE negativo

como MDA-MB-231, MDA-MB-435, MDA-MB-468, Hs578t y MCF-7/Adr se

encuentra en estado metilado en más del 50% de los casos [374]. Por tanto analizar

si la metilación de la región promotora de ERS1 representa uno de los mecanismos

por el que acontece la pérdida de expresión de RE en pacientes diagnosticadas de

cáncer de mama podría representar un importante hallazgo a desarrollar para

http://es.wikipedia.org/wiki/Gen

http://www.genenames.org/data/hgnc_data.php?match=ESR1

http://es.wikipedia.org/wiki/Factores_de_transcripci%C3%B3n


- 72 -

bloquear e incluso revertir dicho proceso en las pacientes con cáncer de mama

[375].

HIPÓTESIS Y OBJETIVOS

Joaquina Martínez-Galán Hipótesis y Objetivos

- 75 -

2.1. HIPÓTESIS.

El cáncer es una enfermedad en la que las células sufren múltiples cambios

genéticos y epigenéticos, cuyo resultado es la expresión aberrante de muchos

genes. Recientes estudios han mostrado que es posible observar alteraciones

específicas derivadas de la presencia de un tumor a través del estudio del ADN

disuelto en suero de los pacientes diagnosticados de cáncer en etapas precoces de

la enfermedad.

La metilación de la región promotora de determinados genes, representan una

alteración epigenética clave en la carcinogénesis por la cual se silencian genes a

través de la unión de un grupo metilo al carbono 5´ de las citosinas de las islas CpG

situadas en su región promotora. Este suceso que otorga a las células tumorales

ventajas en su crecimiento, ocurre en genes que en ausencia de enfermedad

tumoral maligna se encuentran no metilados en sujetos sanos mientras que en

pacientes diagnosticados de cáncer frecuentemente están metilados. El

descubrimiento de conjuntos de genes específicamente metilados asociados a

determinados tipos de cáncer, puede proporcionar nuevas vías en el diagnóstico

precoz, el control evolutivo de los pacientes sometidos a tratamiento e, incluso,

contribuir a la individualización de la terapéutica oncológica. También sabemos

que los fenómenos epigenéticos de metilación de citosinas y de desacetilación de

histonas, en cáncer, son farmacológicamente reversibles.

Los datos, que en nuestra introducción hemos presentado, son demostrativos de

que durante el proceso de oncogénesis, desde la iniciación a la progresión tumoral,

distintos genes pueden sufrir cambios epigenéticos que ocasionan que la expresión

de las proteínas resultantes de su trancripción esté ausente en el tumor. Esto

puede tener consecuencias funcionales (desequilibrio de la homeostasis celular) y

terapéuticas diversas (cambios en la respuesta a los agentes genotóxicos).


- 76 -

Nuestra hipótesis de trabajo se resume en los siguientes postulados:

2.1.1. Es posible detectar en el suero de los pacientes oncológicos, ADN

procedente de su tumor.

2.1.2. Existe una correlación entre las alteraciones genéticas, y epigenéticas,

que se desarrollan en el tumor y las que se pueden encontrar en sangre periférica

de los pacientes.

2.1.3. Los métodos de amplificación del ADN y el estudio del patrón epigenético

de metilación, en pacientes con cáncer, puede proporcionar elementos de valor

para el diagnóstico precoz, el pronóstico y el diseño racional de las estrategias

terapéuticas en pacientes afectos de procesos neoplásicos malignos.

Estudiar la incidencia, y la especificidad, de las anomalías de metilación en el

ADN extraído de pacientes con cáncer de mama mediante su cuantificación por

PCR en tiempo real y comprobar la posible utilidad, de los promotores de

determinados genes aberrantemente metilados, como marcadores tumorales, y/o

de agresividad, de la enfermedad, así como buscar parámetros indicativos de

control tumoral, y de probabilidad de complicaciones asociadas al tratamiento, son

los objetivos generales de este proyecto de investigación.


- 77 -

2.2. OBJETIVOS

2.2.1. Poner a punto los procedimientos de análisis de los promotores de genes

específicos mediante (MS-PCR) para identificar sobre las muestras de ADN extraídas

al grupo casos y control, la presencia y el estado de metilación de: APC, 14-3-3sigma,

RE, RARβ, y E-Cadherina. Preparar las muestras para estudiar específicamente y

mediante amplificación (MS-PCR), la presencia de ADN procedente del tumor en el

suero de pacientes y cuantificar, globalmente, el estado de metilación de las

secuencias correspondientes a las islas CpG ensayadas.

2.2.2. Conseguir de pacientes que vayan a ser tratadas por cáncer de mama, antes

de la cirugía, y previa petición de consentimiento informado, una muestra de sangre

(5ml). De las muestras de suero se extraerá el ADN y se conservará

convenientemente hasta que se proceda a su utilización. Además se conseguirán

muestras de sangre (5 ml) procedentes de mujeres sin ningún tipo de enfermedad

(Grupo Control) y de mujeres con patología mamaria benigna, mastitis fibroquística

esencialmente, (Grupo Patología No-Tumoral).

2.2.3. Cuantificar el ADN en suero de las pacientes diagnosticadas de cáncer de

mama y del grupo control.

2.2.4. Valorar los datos obtenidos y las diferencias existentes al comparar el

patrón de metilación encontrado en el suero de mujeres con cáncer con el que

caracteriza a las mujeres libres de enfermedad. El estudio comparativo de estos

resultados debe permitirnos definir cuáles, de entre los genes estudiados, son

candidatos a ser marcadores tumorales del cáncer de mama.

2.2.5. Comparar los resultados obtenidos tras la valoración de promotores

metilados en el suero de mujeres en las siguientes situaciones clínicas:

a) Mujeres sin enfermedad alguna (grupo control).

b) Mujeres con patología benigna de mama.

c) Pacientes con cáncer de mama (grupo casos).


- 78 -

d) Mujeres tratadas de cáncer de mama sin evidencia de enfermedad

tumoral clínica que durante el seguimiento desarrollan recurrencia de la

enfermedad o metástasis. De esta manera pretendemos identificar cuales,

de entre los genes seleccionados, pueden ser útiles como marcadores de la

presencia y/o la extensión del tumor.

2.3.7. Estudiar la evolución del estado de metilación de esos genes antes de

cualquier maniobra terapéutica y al final del tratamiento, para conocer si existe

correlación o no con el estado clínico-patológico de curación en el caso de

descenso de dicho nivel de metilación en suero de la paciente o de persistencia

tumoral en el caso de ascenso o persistencia de los niveles de proteínas metiladas

al final del tratamiento.

2.3.8. Correlacionar el perfil de metilación con las variables clínico-patológicas

habitualmente empleadas en la clínica para conocer su relación con los factores

pronóstico y predictivos de respuesta que se utilizan en la actualidad.

2.3.9. Contrastar la relación entre la presencia o ausencia de la proteína

resultado de la metilación de la región promotora del gen RE (receptor

estrogénico) en el suero de la paciente y el estado RE negativo en pieza tumoral, ya

que la pérdida de expresión de RE en tumor está asociada con la metilación de su

región promotora 5´CpG y a su vez con tumores de mama de peor evolución y

pronóstico.

MATERIAL Y MÉTODOS

Joaquina Martínez-Galán Material y Métodos

- 81 -

3. MATERIAL Y MÉTODOS

3.1. DISEÑO

El presente trabajo de investigación es un estudio de tipo prospectivo. Se ha

efectuado sobre un grupo de pacientes diagnosticadas de cáncer de mama, que

fueron incluidas y seguidas desde el momento inmediato a iniciar el primer

tratamiento oncológico, que en todas ellas fue la cirugía, hasta la fecha final de

estudio. Así mismo, se ha incluido un grupo control formado por dos subgrupos de

mujeres. Un primer subgrupo constituído por mujeres sanas sin patología alguna

de mama (Grupo Control Normal) y un segundo subgrupo formado por mujeres

con patología benigna de mama (Grupo Control con Patología Benigna).

3.2. PERIODO DE ESTUDIO

El estudio comenzó en Mayo 2001 y concluyó en Julio de 2008; periodo de

tiempo en el que hemos conseguido incluir un total de 107 pacientes con cáncer

de mama y 110 mujeres sin cáncer de mama. Durante el tiempo de observación y

de estudio, se realizó una primera extracción de 5 ml de sangre justo antes de la

cirugía. Esta muestra se tomó en todas las pacientes incluidas en el grupo casos y

en todas las mujeres que fueron incluidas en el grupo control. Al final del

tratamiento se obtuvo una segunda muestra de sangre de 5 ml en

aproximadamente, la tercera parte de las pacientes diagnosticadas de cáncer de

mama. En algunos casos se realizó una determinación intermedia que podría

coincidir con el final del tratamiento con Radioterapia (RT) o de Quimioterapia

(QT). En este subgrupo de pacientes cuando el tratamiento prescrito se completó

se obtuvo una nueva muestra de sangre. En el grupo control sólo se realizó una

única extracción sanguínea inicial.


- 82 -

3.3. MATERIAL

3.3.1. FUENTES DEL MATERIAL DE ESTUDIO

Este trabajo de investigación, ha sido aprobado por el Comité Ético del Hospital

Universitario Virgen de las Nieves y la Universidad de Granada. En todos los casos,

fue condición indispensable que todas las pacientes, y las personas que se

incluyeron como controles, conocieran y aceptaran participar en el estudio de

forma voluntaria y que hubiesen firmado el documento del consentimiento

informado que se facilitaba en la primera entrevista, antes de proceder a la

extracción de la muestra de sangre.

La inclusión de pacientes y la recogida de datos de las pacientes diagnosticadas

de cáncer de mama, se efectuó en el periodo de tiempo comprendido entre Mayo

de 2001 y Junio de 2005. El procesamiento de las muestras y el análisis de los

datos resultantes del estudio, incluyendo el seguimiento clínico de las enfermas,

se realizó entre Junio 2006 y Mayo 2009. El seguimiento medio fue de 56 meses.

El grupo control estuvo compuesto por mujeres sin patología oncológica

reclutadas entre las mujeres que acuden al Servicio de Medicina Preventiva del

Hospital Virgen de las Nieves. A dichas mujeres se les propuso entrar en el estudio

y tras explicarles los objetivos y obtener su consentimiento se les realizó una

pequeña historia clínica y se les extrajo una muestra de 5 ml de sangre.

a) Fuentes de los datos biográficos, clínicos y anatomo-patológicos

La recogida de los datos clínicos y biográficos de las pacientes, se realizó a

través de tres fuentes: i) el análisis de las historias clínicas convenientemente

archivadas en el Servicio de Documentación Clínica del Hospital Virgen de las

Nieves; ii) la entrevista clínica que realizamos de forma sistemática a todas las

pacientes que son valoradas en las consultas externas del Servicio de Oncología

Radioterápica del mismo Hospital, y iii) los informes anatomopatológicos e

inmunohistoquímicos aportados por el Servicio de Anatomía Patológica como

documentos de diagnóstico y estudio del espécimen tumoral extraído tras la


- 83 -

cirugía efectuada sobre las pacientes afectas de tumoraciones mamarias (Grupo

Casos y Grupo Patología Benigna).

Para proceder de forma sistemática al inicio de nuestro proyecto de Tesis

Doctoral, diseñamos una ficha de recogida de datos en las que se incluían distintos

parámetros, entre ellos:

• Datos Biográficos:

- Edad.

- Edad de la menarquia.

- Edad primer embarazo.

- Lactancia materna.

- Fórmula obstétrica.

- Edad de la menopausia.

- Antecedentes familiares de primer y segundo grado con cáncer de

mama.

• Datos Clínicos:

- Localización por cuadrante del tumor.

- Estadio clínico cTNM.

• Datos Anatomo-patológicos:

- Histología.

- Grado de diferenciación celular.

- Estadio patológico pTNM.

- Invasión perineural, rotura capsular ganglionar y trombos.

endolinfáticos.

• Datos Inmuno-histoquímicos en tumor:

- Cerb2/ FISH.

- P53

- Receptor de Estrógenos (RE) y Receptor de Progesterona (RP).


- 84 -

• Datos referentes a los tratamientos administrados:

- Tratamiento con Quimioterapia (QT).

- Tratamiento con Radioterapia (RT).

- Tratamiento Hormonal (HT).

Las fichas fueron rellenadas de forma sucesiva a lo largo del tiempo incluyendo

los correspondientes datos conforme se podía disponer de ellos.

b) Fuente de datos analíticos

Los datos analíticos se obtuvieron a partir de las muestras de sangre que se

tomaron a las pacientes (grupo casos) y a las personas sanas (grupo control)

incluidas en el estudio. El procesamiento de las muestras y los estudios

epigenéticos sobre el ADN extraído de las muestras de sangre, se realizaron en el

Laboratorio de Investigaciones Médicas “Mora Lara” del Hospital Universitario

“San Cecilio” de Granada.

La metodología seguida se resume a continuación;

• En todas las mujeres afectas de cáncer de mama las extracciones de

sangre se realizaron en los quirófanos del Servicio de Ginecología antes de

la cirugía y de la administración de cualquier medicación intravenosa.

Posteriormente las sucesivas extracciones pertenecientes a cada paciente

se efectuaron en la Unidad de Braquiterapia, en el Hospital de día del

Servicio de Ginecología o en el Servicio de Oncología Médica del Hospital

Virgen de las Nieves.

• Se recogieron muestras de un total de 107 mujeres con cáncer de mama

(grupo casos), a las que se les realizó una primera extracción de sangre

antes de cualquier maniobra terapéutica y una segunda extracción a las dos

semanas de finalizar el tratamiento oncológico (QT o RT) indicado en cada

caso.

• Las muestras sanguíneas una vez obtenidas, se guardaron a temperatura

ambiente en recipientes que las preservaban de la luz y eran transportadas


- 85 -

lo más rápidamente posible al laboratorio de Investigaciones Médicas

“Mora Lara” del Hospital Clínico Universitario “San Cecilio” donde se

procedía a la centrifugación de las mismas y la separación del suero para

proceder a su posterior almacenamiento en congelador a una temperatura

de -80oC. Las muestras sólo se descongelaron para proceder a su análisis

por PCR en Tiempo Real.

• Simultáneamente a la toma de estas muestras, se incluyeron en el estudio

las muestras pertenecientes a 36 mujeres con patología benigna de mama y

a 74 mujeres sin evidencia de patología mamaria alguna. Ambos grupos

fueron reclutados de entre las mujeres que por cualquier causa (no

tumoral) acudían al Servicio de Medicina Preventiva. Las muestras

tomadas en estas mujeres fueron incluidas y estudiadas con los mismos

métodos que se emplearon para el estudio de las personas pertenecientes

al Grupo Casos.

• Sobre todas las muestras de suero se estudió, por PCR Cuantitativa en

Tiempo Real, la concentración de amplificados de ADN representativos de

la región donde se sitúa el promotor del gen de cada uno de los

biomarcadores investigados en este trabajo.

• Mediante la técnica de PCR específica de metilación se cuantificó el nivel

de hipermetilación en las islas CpG de la región de los promotores de los

siguientes genes: Receptor de Estrógenos (RE), RAR-Beta, 14-3-3 Sigma, APC

y E-Cadherina.

3.3.2. INSTRUMENTACIÓN

A lo largo del presente trabajo de investigación hemos utilizado entre otros, los

instrumentos que a continuación se refieren:

a) Centrífugas

Centrífuga refrigerada: Para el proceso de extracción del ADN y para la

concentración de las soluciones agitadas previamente se ha utilizado una


- 86 -

centrífuga convencional marca Beckman, modelo TJ/6, dotada con una

unidad adicional de refrigeración que permite centrifugar muestras a baja

temperatura. La centrífuga consta de un rotor con soportes

intercambiables para la centrifugación simultánea de un número de

muestras variable (entre 4 a 120 muestras). La máxima velocidad de

centrifugación depende del rotor utilizado.

Micro-centrífuga: Para la técnica de modificación con bisulfito de las

muestras de DNA se ha usado una centrífuga "microfuge" marca DESAGA

de Sarstedt-ccuppe MC2, con capacidad para 18 muestras, programable en

tiempo hasta 15 minutos y de una velocidad máxima de centrifugación de

13.000 rpm.

Centrífuga convencional: Se ha utilizado una centrífuga Orto (Clino)

para la obtención de los sueros a partir de las muestras de sangre,

trabajando a 3.500 rpm durante 5-7 minutos.

b) Baño termostatizado: Para someter las muestras a incubación a las

temperaturas indicadas en el protocolo de modificación del DNA metilado se ha

utilizado un baño digital marca Accu BlockTM, con un bloc específico para tubos

eppendorf de 1.5ml y otro para tubos eppendorf de 0.5ml, con capacidad para 48

muestras en total.

c) Congeladores: Para el almacenamiento de muestras de suero y de DNA y

DNA modificado se ha usado un arcón congelador, marca Selecta, modelo 455,

capaz de alcanzar la temperatura de -80C. La temperatura de operación durante

todo el tiempo de almacenamiento de las muestras fue de -70C.

Para almacenar los reactivos, las enzimas y tampones se ha usado un

congelador, marca Liebherr, capaz de alcanzar la temperatura de -20C. Se han

utilizado también congeladores y frigoríficos convencionales para el

almacenamiento de otros reactivos y disoluciones.


- 87 -

d) pH-Metro: Para la regulación del pH de las soluciones de tampón

empleadas se ha usado un pHmetro suministrado por la firma Orion Research,

modelo 501, cuya precisión se estima en 0.01 unidades de pH.

e) Balanza de precisión: Para la preparación de reactivos y disoluciones

tampón se ha utilizado, cuando fue necesario, una balanza de precisión Mettler

Toledo AB 104 capaz de alcanzar la décima de miligramo.

f) Termociclador: Todas las reacciones necesarias para completar el proceso

de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se han realizado de manera

automática utilizando un equipo de PCR a tiempo real iCyclerTM Optical Module

Serial Nº 584BR-02159 (Bio Rad). Parte fundamental del protocolo es la

utilización de un dispositivo para regular las modificaciones de la temperatura de

la reacción y su control. Para ello el equipo cuenta con block capaz de admitir

placas multi-well de 96 pocillos. Mediante el ordenador que controla el sistema se

puede programar la temperatura y el tiempo de cada uno de los pasos de la

reacción.

g) Sistema de electroforesis: Se ha utilizado un equipo para electroforesis

convencional suministrado por TDI, con cubeta de electroforesis sumergida,

marca Minicell, modelo EC370 M, con el que nos fue posible separar, en función de

su tamaño, fragmentos de ADN. El sistema incluye además de la cubeta de

electroforesis, la fuente de alimentación (modelo Ps-1-VC), y permite alcanzar los

150 voltios, 500mA.

Para la preparación del gel se ha utilizado el mismo soporte de la cubeta

suministrada. El "pocillo" en el gel se prepara utilizando un "peine" apropiado

(peines de 8 ó 12 pocillos). Como norma general se establecieron los parámetros

de voltaje y tiempo siguientes: 100 V durante 30 minutos.

h) Transiluminador: Para la visualización de geles teñidos con bromuro de

etidio se ha usado un transiluminador ultravioleta 20 x 20 (312nm de longitud de

onda) suministrado por TDI, modelo TC-312 A. En todos los casos, para la


- 88 -

visualización de los amplificados se ha empleado una pantalla de protección UV

facial completa.

i) Sistema de reproducción fotográfica y video: Los geles, bajo iluminación

ultravioleta, fueron fotografiados utilizando una cámara Polaroid, modelo CU-5

88-48 y una cámara de vídeo SONY CCD IRIS, estando ésta última acoplada a un

sistema de análisis de imagen.

j) Análisis de imagen: Para la evaluación de los geles obtenidos en el

desarrollo de los métodos descritos, se ha empleado un sistema de análisis de

imagen compuesto por una videocámara, acoplada a un ordenador que almacena

la información y la procesa utilizando el programa de análisis de imagen "Visilog

Geles", comercializado por Microoptic. El programa permite analizar la

distribución de bandas en los geles y estimar el tamaño de la molécula de DNA

amplificado por comparación con marcadores de tamaño conocidos.

k) Otros: Se han usado otros pequeños aparatos existentes en el laboratorio

como son: microondas, picadora de hielo, vortex, etc.

3.3.3. REACTIVOS QUÍMICOS

a) Etanol 99%, Pellets de NaOH, β-mercaptoetanol y Buffer TE: Para

diluir los buffer AW1 y AW2 y para realizar el paso nº 5 del protocolo del Kit de

extracción de DNA QIAAmp Blood Midi/Maxi, así como para la modificación con

reactivo bisulfito sódico del ADN, se ha usado etanol al 96-100%.

En el mismo protocolo del kit de modificación de DNA se usó hidróxido sódico

4M (Panreac Química SA), β-Mercaptoetanol (Merck) y tampón TE (10mM Tris-

HCl; 0.1nM EDTA; pH 7.5).

b) Agarosa: En la preparación de geles para electroforesis se ha utilizado

Agarosa (Promega) al 2-2.5%.

c) Tampón de carga: Las muestras se cargaron en el gel junto con un tampón

de carga compuesto por: azul de bromofenol 0.25% y sacarosa en 50mM de EDTA


- 89 -

40%. Este tampón se preparó a una concentración 6x añadiendo en el momento

de la carga 1.5μl de tampón por cada 10μl de muestra. La sacarosa precipita la

muestra hasta el fondo del pocillo impidiendo que se salga de la matriz del gel y el

colorante nos permite observar el frente de la electroforesis.

d) Bromuro de etidio: Para la tinción del DNA sometido a electroforesis en

gel se ha utilizado una disolución de bromuro de etidio (Serva) de concentración

0.5μg/ml. Se incorporó tanto al gel como al tampón de electroforesis.

e) Otros reactivos químicos: Para la regulación del pH de las disoluciones

tampón se han utilizado, cuando fue necesario, disoluciones de HCl, NaOH y de

ácido acético glacial para ajustar el pH del acetato sódico.

f) Solución de ClONa al 10%: Todas las superficies del laboratorio sobre las

cuales se trabajó así como todos los materiales que estuvieron en contacto con el

suero, fueron lavados con una solución de hipoclorito sódico al 10% (que debe

prepararse cada día); seguido de un aclarado con etanol al 70% o similar. Se

extremaron las medidas higiénicas siendo obligado el uso de guantes en todo

momento.

Todos los restos bio-contaminantes (restos de sueros, células sanguíneas, etc.)

se vertieron en contenedores destinados a tal fin para su posterior incineración.

3.3.4. REACTIVOS BIOLÓGICOS PARA PCR

a) DNA estándar CpGenomeTM: Para la preparación de las muestras que

definieron la recta estándar en la PCR en tiempo real hemos empleado ADN

universalmente metilado (Bio. Rad. Cat. nº 57821). Alícuotas preparadas a partir

del vial se conservaron entre -15 oC y -25 oC hasta el momento de su uso.

b) Extracción del ADN: Para la extracción del ADN se a empleado el Kit de

QIAGEN QIAamp® DNA Blood Midi/Maxi. (Cat. nº 51185). El kit contiene

suficientes reactivos para 100 muestras de suero, sangre total, plasma, fluidos

corporales o células mononucleares de sangre periférica a partir de las que se

extrae el ADN siguiendo los procedimientos recomendados por el fabricante.


- 90 -

El producto de la extracción final queda en 200µl de solución de ADN con una

concentración estimada de 3.0µg/ml de ADN cuando en el inicio de la extracción

se parte de 2ml de suero. El proceso de extracción completa del ADN de las

muestras se sitúa en torno a las dos horas de duración.

Los reactivos que contiene el kit se enumeran a continuación:

Producto Unidades

QIAamp Midi Spin Columnas 100

Tubos recolectores (15ml) 100

Buffer AL 265ml

Buffer AW1 (concentrado) 95ml

Buffer AW2 (concentrado) 66ml

Buffer AE 60ml

QIAGEN®Protease 4 viales

El contenido del kit no incluye los reactivos químicos que se han descrito en el

apartado anterior de protocolo de extracción del ADN. Todos los reactivos son

estables a 4 oC.

c) Modificación del ADN metilado: Para la modificación bisulfítica del ADN

se ha utilizado el kit CpGenomeTM Modification Kit (Cat. nº S7820) de CHEMICON

International. Este sistema contiene suficiente reactivos para la modificación del

ADN de aproximadamente 70 muestras de DNA. El producto final debe quedar en

un volumen de, aproximadamente, 20µl de solución de ADN modificado. El tiempo

necesario para realizar toda la secuencia de reacciones necesaria es de 28 horas.

Los reactivos contenidos en el kit son:

Producto Cantidad

DNA Modification Reagent I 23g

DNA Modification Reagent IV 200µl

DNA Modification Reagent II 135g

DNA Modification Reagent III 700µl


- 91 -

El contenido del kit no incluye los reactivos químicos que se han descrito en el

apartado anterior de protocolo modificación del ADN. Todos los reactivos son

estables a -20 oC.

d) Amplificación

iQTM SYBR® Green Supermix: Esta mix contiene los reactivos

suficientes para la realización de la reacción de PCR, usando la enzima

térmica iTaqTM DNA Polymerase que es activada después de una etapa de

desnaturalización inicial de 3 minutos a 95oC. Contiene 100mM KCl,

40mMTris-HCl, pH 8.4, 0.4mM de cada uno de los dexosirribonucleótidos

(dATP, dCTP, dGTP y dTTP), iTaq polymerase, 50 units/ml, 6mM MgCl2,

SYBR Green I, 20nM fluoroseína y estabilizantes. La adición de fluoroseína

no afecta ni a la eficiencia ni a la sensibilidad de la reacción. Esta mezcla de

reactivos (mix) contiene la cantidad suficiente para la realización de la

reacción de PCR, usando la enzima térmica iTaqTM DNA Polymerase. Las

alícuotas de la mezcla se conservan a -20oC para evitar congelaciones y

descongelaciones repetidas. A 4oC una alícuota de supermix es estable

durante 6 meses.

Primers (cebadores): Las secuencias de los primers necesarios para

amplificar el fragmento de ADN se obtuvieron de la literatura científica

relacionada con el tema: E-Cadherina [376]; 14-3-3 sigma [377]; retinoic-

acid-receptor- (RAR-) [363]; adenomatous polyposis coli (APC) [378] y

receptor de estrógenos-α (ER-α) [379]. Las secuencias de los primers

utilizadas en este estudio se han incluido en la tabla 1:


- 92 -

Tabla1. Secuencias de los primers y datos de la reacción de PCR

Primer Secuencia

Sentido/ Antisentido pb*

Tª

anniling

Tª

add oC

E- Cad.

5’-GCGTTTGGTCGCGGAGTTC

5’-TTCCCTCAAAAATCGTCCCCAC

144 62 oC no

14-3-3σ

5´-TGGTAGTTTTTATGAAAGGCGTC

5’-CCTCTAACCGCCCACCACG

107 62.3 oC 78

RAR-β

5’-GAACGCGAGCGATTCGAGT

5’-GACCAATCCAACCGAAACG

142 63.5 oC no

APC

5’-TATTGCGGAGTGCGGGTC

5’-TCGACGAACTCCCGACGA

108 63 oC no

REα

5´-GATACGGTTTGTATTTTGTTCGC

5’-CGAACGATTCAAAAACTCCAACT

123 62.2 oC 74

*pb: pares de bases

Marcadores de tamaño de peso molecular: Para determinar el

tamaño en pb. (pares de bases) de los fragmentos amplificados para cada

uno de los primers se usó el marcador: 50pb DNA Step Ladder (Promega nº

G452A). Consiste en 16 fragmentos de ADN comprendidos entre 50pb y

800pb incrementándose su tamaño de 50 en 50pb.

Se suministra a una concentración final de 340µg/ml. Viene disuelto en el

tampón: 10mM Tris-ClH (pH 8.0), 1mM EDTA. Es estable a -20 oC .

3.3.5. MATERIAL FUNGIBLE

a) Material plástico para el aislamiento del ADN, modificación bisulfítica

del DNA metilado y amplificación por Real Time PCR

Como norma general, todo el material fungible fue utilizado en condiciones de

esterilidad y limpieza para asegurar la calidad de las reacciones previas y de la

PCR final.

Tubos de ensayo: Se usaron tubos de ensayo convencionales de

plástico, de 10 ml de capacidad, y estériles.


- 93 -

Tubos eppendorf: Se usaron tubos de polipropileno de 1500μl, 500µl y

de 200µl estériles de capacidad marca BIO-RAD® para la realización de las

técnicas biológicas.

Puntas de pipetas con filtro (Tips): Estas puntas de pipetas son de

plástico y estériles y están protegidas con filtros de algodón para evitar el

arrastre de contaminación con amplificados de unas muestras a otras ya

que dicho algodón ejerce de barrera contra los aerosoles que propagan los

amplificados. Este material fue suministrado por Eppendorf® y dispusimos

de puntas para dispensar volúmenes comprendidos entre 1 a 10µl, 2 a

100µl, 20 a 300µl y 100 a 1000µl.

Puntas de pipetas sin filtro: Se usaron puntas estériles de 1250μl de

capacidad, suministradas por GILSON®.

Otro material: Micropipetas: se usaron micropipetas graduadas

convencionales de volumen variable: 1-2.5µl, 2-20µl, 10-100µl, 20-200µl y

100-1000µl; suministradas por Eppendorf®. Igualmente se usó una pipeta

suministrada por Gilson® graduada de 1-1250µl que permite dispensar

alícuotas entre 10µl hasta 125µl.

También se ha utilizado diverso material tanto de vidrio como de plástico para

la realización de las técnicas. Entre este material cabe citar: gradillas, vasos de

precipitado, probetas, matraces Erlenmeyer y otros dispositivos.

3.4. MÉTODOS

3.4.1. Obtención de las muestras sanguíneas incluidas en el estudio

El procedimiento empleado para la obtención de las muestras fue por veno-

punción, utilizando heparina sódica como anticoagulante. La cantidad de muestra

obtenida por extracción fue de 10 ml que se depositaron en 2 tubos de bioquímica

con 5 ml de muestra cada uno de ellos.


- 94 -

Posteriormente una vez en el Laboratorio de Investigaciones Médicas, las

muestras fueron centrifugadas a 3500 rpm durante 10 minutos a temperatura

ambiente. La cantidad de suero recuperada tras la centrifugación nunca fue

inferior a 2ml por tubo, el suero resultante fue a continuación transferido a tubos

eppendorf (≈ 1ml de suero por tubo eppendorf) donde permaneció almacenado a

-80 oC hasta su análisis. A cada muestra se le asignó un número por orden de

llegada para identificar a quién pertenecía cada una de ellas. Las muestras se

almacenaron en el congelador a -80 oC hasta su análisis por PCR.

Este mismo procedimiento fue utilizado para las muestras procedentes del

grupo control.

El suero obtenido de los grupos casos y control, fueron codificados y

randomizados antes de los análisis y la interpretación de los resultados, para

asegurar el adecuado tratamiento doble ciego de la información clínica y de los

estudios de epigenética.

Las muestras recogidas, correspondían a los siguientes grupos:

a) Grupo Casos

1ª determinación: Se han conseguido las muestras sanguíneas a 107

pacientes diagnosticadas de cáncer de mama sin evidencia de enfermedad

metastásica (grupo precirugía de casos), justo antes de realizar cualquier

tratamiento oncológico. En todos los casos el primer tratamiento realizado

fue la intervención quirúrgica.

2ª determinación: Se realizó unas 2 semanas tras finalizar el tratamiento

oncológico indicado en cada caso fuese este cirugía seguida de

quimioterapia y radioterapia, cirugía seguida de quimioterapia o cirugía

seguida de radioterapia. En total de se recogieron 58 muestras de sangre.


- 95 -

b) Grupo Control sin patología benigna de mama

Para el Grupo Control se han acumulado muestras de sangre de un total de

74 mujeres sanas elegidas al azar entre los profesionales del Hospital

cuando acudían al Servicio de Medicina Preventiva para realizar la revisión

anual reglamentaria, así como de otras mujeres sin antecedentes

personales oncológicos, las cuales eran derivadas al Servicio de Medicina

Preventiva por otros servicios del Hospital. De todas ellas se obtuvo el

consentimiento informado, por escrito, y en todos los casos se facilitó la

pertinente información a la persona antes de la extracción de la muestra.

Las muestras de sangre, fueron tratadas con la misma metodología

anteriormente expuesta en el grupo casos.

c) Grupo control con patología benigna de mama

Durante el tiempo de realización de nuestro estudio hemos podido recoger

muestras de sangre de 38 mujeres con patología mamaria benigna que

fueron intervenidas quirúrgicamente en el Hospital de dichas lesiones

benignas. Estas 38 pacientes fueron elegidas al azar y constituyen el grupo

de pacientes afectas de patología benigna de la mama. De ellas, 15 mujeres

fueron diagnosticados de Fibroadenoma, 14 de Mastopatía fibroquística, 6

de Hiperplasia Ductal DIN 1 y un caso de Papiloma. En todos estos casos

previamente a la exéresis de la lesión, se obtuvo el consentimiento

informado y la muestra de sangre. Las muestras fueron codificadas y

procesadas con la misma metodología comentada en los apartados

anteriores.

3.4.2. Extracción del ADN de la muestra de suero de los sujetos

Para la extracción del ADN se procede a la descongelación de las muestras y su

tratamiento utilizando el Kit QIAamp Blood Kit (Quiangen Inc. CA) siguiendo el

protocolo recomendado por el fabricante. Al final del procedimiento se obtiene un

volumen aproximado de 200 µl de disolución de ADN cuya concentración se

cuantificó por espectrofotometría (260/280) en todos los casos.


- 96 -

El procedimiento seguido se resume a continuación:

1.- Pipetear 200µl de proteasa en tubos de centrífuga de 15 ml.

2.- Adicionar 2ml de suero.

3.-Adicionar 2.4ml del buffer Al (buffer de lisis) y mezclar vigorosamente

invirtiendo el tubo durante un minuto.

4.- Incubar a 70 oC durante 10 minutos.

5.- Adicionar 2ml de etanol (96-100%) y mezclar invirtiendo el tubo y agitando

vigorosamente.

6.- Seguidamente transferir la mitad de la solución obtenida en el paso 5 a una

columna de las suministradas en el kit con cuidado de no mojar los bordes.

Cerrar la tapa y centrifugar a 3000rpm durante 3 minutos.

7.- Descartar el filtrado y colocar otro tubo de 15ml bajo la columna con filtro y

transferir la solución restante obtenida en la etapa 5 sobre esta misma

columna. Cerrar la tapa y centrifugar a 3000 rpm durante 3 minutos.

8.- Descartar el filtrado y colocar otro tubo de 15ml bajo la columna con filtro.

9.- Cuidando de no mojar los bordes, adicionar 2ml de Buffer AW1 y

centrifugar a 5000rpm durante 1 minuto.

10.-Cuidando de no mojar los bordes, adicionar 2ml de Buffer AW2 y

centrifugar a 5000rpm durante 15 minutos.

11.- Descartar el filtrado y colocar la columna en otro tubo de 15ml.

12.- Añadir 200µl de Buffer AE o agua destilada y estéril, cerrar la tapa, incubar

a temperatura ambiente (15-25oC) durante 5 minutos y centrifugar a

5000rpm durante 2 minutos.


- 97 -

13.- Trasvasar el DNA así obtenido a un tubo eppendorf de 1400µl y congelar a

-20oC. Se obtuvo un volumen final de 200 µl.

El ADN extraído, fue cuantificado por espectrofotometría. La cantidad de ADN

extraído, medido en g/ml suero, fue 0.431 ± 0.019 (valor media ± error estándar

de la media). Las muestras de ADN fueron almacenadas a -80oC hasta posteriores

análisis.

3.4.3. Modificación Bisulfítica

Una vez extraído el ADN se procede a su modificación con bisulfito sódico. Este

procedimiento descrito por Herman y col. [380] en 1996 consiste en la

transformación de los residuos de citosina no metilados en uracilos al tratar el

ADN con bisulfito, permaneciendo sin modificarse los residuos de citosina

metilados. De esta forma las regiones genómicas metiladas y las no metiladas del

ADN tras la modificación bisulfítica, son diferentes y por tanto distinguibles

utilizando primers (cebadores) específicos. Las diferencias en el estado de

metilación de la misma región del genoma pueden ponerse de manifiesto

utilizando la técnica de reacción en cadena de la polimerasa específica de

metilación (MS-PCR) o más recientemente el procedimiento de PCR cuantitativa

específica de metilación (QMS_PCR).

Para la modificación se ha utilizado el kit de reactivos CpGenomeTM

Modification (Chemicon® Internacional). Como se muestra en el esquema que se

presenta a continuación en la reacción bisulfítica todas las citosinas son

desaminadas y desulfonadas convirtiéndose en uracilos, solamente las 5’metil

citosinas permanecen inalteradas. Así, la secuencia del ADN tratado se

diferenciará dependiendo de si el ADN está metilado o no. Además, las cadenas

complementarias volverán a serlo después de la conversión de la citosina. Los

primers usados en la técnica de PCR-metilación específica (MSP) pueden ser

diseñados para amplificar expresamente una cadena no metilada (bisulfito

sensible) y/o una cadena metilada (bisulfito resistente) basándose en estas

diferencias químicamente inducidas.


- 98 -

Fundamento bioquímico de la modificación del ADN con bisulfito:

ADN Metilado

ADN No Metilado

Los reactivos necesarios para esta reacción han sido enumerados en el

apartado de material y métodos. El proceso fue realizado siguiendo las

recomendaciones del fabricante.

El ADN necesario para realizar la reacción en cadena de la polimerasa (PCR),

puede obtenerse a partir de una cantidad inicial de material genético tan pequeña

como 0.001µg. Del total del ADN extraído, un volumen de 100µl se trató con

bisulfito sódico durante 16 horas, de esta manera se convirtieron las citosinas no

metiladas en uracilos, quedando inalteradas las metilcitosinas.

El ADN obtenido fue disuelto en 20µl de tampón TE y el ADN modificado fue

cuantificado por espectrofotometría. La eficacia de recuperación de ADN después

de la modificación bisulfítica ha estado en todas las ocasiones comprendida dentro

del rango del 55-90%. En la reacción de cuantificación mediante PCR se ha

utilizado 1 µl del ADN. Una vez modificado el ADN la muestra es estable durante al

menos 6 meses a -80 oC.

Como ADN de referencia para hacer cuantitativas las determinaciones se ha

utilizado ADN universalmente metilado (ADN Universal Methylated CpGenomeTM

GGG GCm

G GAC Cm

GCm

G

Modificación con

Bisulfito sódico GGG GCm

G GAU Cm

GCm

G

GGG GCG GAC CGC G

Modificación con

Bisulfito sódico GGG GUG GAU UGU G


- 99 -

Nueva York, EE.UU) que fue tratado con bisulfito de la misma manera que las

muestras. Tras cuantificar el ADN espectroscópicamente su concentración final se

ajustó a 2 g/ml. A partir de esta muestra se preparó la curva de calibración

utilizando diluciones sucesivas comprendidas entre 1/1 y 1/128 de la muestra

original utilizando agua destilada de la máxima calidad y esterilizada.

La reacción de PCR se realizó sobre placas de 96 pocillos. En ella se incluían las

muestras de las pacientes, las sucesivas del ADN de referencia para construir la

curva de calibración, dos controles positivos, y dos pocillos sin muestra que

fueron etiquetados como controles negativos. El programa del sistema permite

ajustar la curva de calibración a un modelo lineal y obtener los parámetros

estadísticos del ajuste. En todos los casos, los coeficientes de correlación para las

curvas de calibración fueron iguales o superiores a 0.98, las pendientes de las

rectas de calibración se situaron en el rango de 3.02 a 3.2 y la eficacia de la PCR

resultó estar entre el 85 y el 110%.

A continuación se describe el protocolo de modificación de ADN con bisulfito.

Se recomienda partir de 1µg de ADN aunque el método es sensible para una

cantidad de 0,001µg. En todos los casos en nuestro estudio se ha partido de un

volumen de 100µl de ADN con una cantidad comprendida entre 1-5µg/100µl. Este

procedimiento experimental se describe brevemente a continuación.

3.4.4. Procedimiento experimental

• Reactivos (Día 1)

• Na OH 3M (se debe preparar en el momento de su utilización).

Para ello se disuelven 1 g de Na OH en 8.3ml de agua.

• R.I: Reactivo de Modificación de ADN I (se debe preparar en el

momento de su utilización). Para ello se usan 571µl de agua

destilada a 227mg de R I. Se ajusta el pH a 5 (normalmente es

suficiente con adicionar 20 µl de NaOH 3M por muestra). El pH se

debe comprobar con papel indicador).


- 100 -

• Modificación (Día 1)

• En un eppendorf de 1.5 ml se ponen: 100 ml de muestra (que

contenga al menos 1,0 µg de ADN), 2 µl de Reactivo de modificación

de ADN (IV) y 7 µl de NaOH 3M; la mezcla se incuba durante 10

minutos a 37 oC al cabo de los cuales se adicionan 550µl de reactivo

R.I (recién preparado) y se deja incubar a 50oC durante 16-20 horas.

• Reactivos (Día 2)

• Reactivo de Modficación II: Se prepara la disolución A utilizando

20 ml de agua y 1 µl de 2-mercapto-etanol. Para cada muestra se

utilizan 750 µl de disolución A y 1.35 mg del reactivo R.II, se mezcla

bien y se añade NaOH 20mM/90% Etanol (se debe preparar en el

momento de su utilización). Para ello se mezclan 900µl de etanol

absoluto con 93,4 µl de agua y 6,6 µl de NaOH 3M.

• Modificación (Día 2)

• Reactivo de Modificación III: Resuspender vigorosamente en el

vórtex el DNA y adicionar a cada uno de los tubos 5 µl del mismo.

• Adicionar a cada uno de los tubos 750 ml de R.II y mezclar

suavemente. Incubar 10 minutos a temperatura ambiente.

• Centrifugar 1 minuto a 13000 rpm. Eliminar el sobrenadante.

• Adicionar al pellet 1 ml de etanol 70%. Agitar con vórtex.

• Centrifugar 1 minuto a 13000 rpm. Eliminar el sobrenadante.

• Repetir este paso tres veces más.

• Eliminar el sobrenadante del tercer lavado, centrifugar los tubos 3

minutos a 13000 rpm y la gota de líquido que ha quedado,

eliminarla con una micropipeta con mucho cuidado.


- 101 -

• Adicionar 50 µl de 20 mM NaOH/ 90% Etanol (recién preparado).

Agitar con vórtex suavemente para resuspender el pellet e incubar 5

minutos a temperatura ambiente.

• Centrifugar 1 minuto 1 13000 rpm y adicionar 1 ml etanol al 90%.

Agitar con vórtex.

• Centrifugar 1 minuto 1 13000 rpm. Eliminar el sobrenadante.

• Repetir este paso una vez más.

• Una vez eliminado el sobrenadante del 2º lavado, centrifugar los

tubos 5 minutos a 13000 rpm y la gota de líquido que ha quedado,

eliminarla con una micropipeta.

• Adicionar 25 µl de tampón TE y agitar suavemente e incubar 15

minutos a 50-60 oC para disolver el ADN.

• Centrifugar los tubos 3 minutos a 13000 rpm y transferir el

sobrenadante a un nuevo tubo. Congelar a -20 oC.

3.4.5. PCR en tiempo Real QMS-PCR utilizando SYBR Green

Las reacciones de PCR cuantitativa en tiempo real han sido realizadas

utilizando el Kit iQ SYBR-Green Supermix (Laboratorios de BioRad, Hercules, CA)

según el protocolo del fabricante.

La mezcla de reacción para la PCR cuantitativa en todos los casos contiene:

• l μl de ADN modificado de cada muestra (estándar o desconocida)

como plantilla para cada PCR en tiempo real QMS-PCR.

• 0.5 μM de cada oligonucleótido (primer).

• 12.5 μl de 2X SYBR Green Supermix (Bio-rad).

• Agua estéril hasta completar 25μl.


- 102 -

Todos los experimentos de PCR fueron realizados en un volumen de 25l

utilizando placas de 96 pocillos. Las secuencias de los primers, fueron elegidas a

partir de publicaciones previas.

La amplificación de ADN por PCR, se hizo de acuerdo con el siguiente

procedimiento:

Primera Etapa: 95oC durante 3 minutos.

Segunda Etapa: 40 ciclos compuestos por 30 segundos a 94oC;

30 seg. a la temperatura de hibridación encontrada para cada uno de

los promotores (ER-α: 62.2oC; E-Cad: 62.0oC; 14-3-3-σ: 62.3oC; RAR-

β: 63.5 oC; APC: 63.0 oC) y 30 segundos a 72.

Tercera Etapa: Fue necesario un paso adicional (durante 30 seg.)

a 74oC para el promotor del gen ER-α y a 78oC para 14-3-3-σ.

Mediante esta etapa se consigue disminuir la sobre-estimación del

producto debida a la formación de dímeros de los primers utilizados

(el producto del dímero permanece en forma de doble cadena

cuando se alcanza una temperatura capaz de disociar el dímero).

Cuarta Etapa: En todos los casos se realizó un análisis de la curva

de disociación del ADN para comprobar la especificidad de los

productos obtenidos. Para ello se estudió la fluorescencia relativa en

un gradiente de temperatura comprendido entre 60 y 90 grados

utilizando incrementos sucesivos de 0.5oC.

Quinta Etapa: El valor de fluorescencia correspondiente a cada

muestra se convirtió en unidades relativas de ADN universalmente

metilado (μg/ml) usando la correspondiente recta de calibración

ajustada mediante el programa del equipo de PCR a tiempo real.

De forma general, las medidas para trabajar con ADN requieren, entre otras

consideraciones el uso exclusivo del material y reactivos para PCR; uso de guantes


- 103 -

en todo momento y cambio frecuente (mejor los que no llevan talco pues éste

inhibe la PCR) y material de contacto directo con la muestra (puntas de pipeta y

tubos "eppendorf") esterilizados. Se trabaja siempre sobre hielo picado y

extremando las precauciones para evitar posibles contaminaciones ambientales.

Para preparar la mezcla de la reacción se trabaja en tubos cilíndricos de tapón

verde esterilizados en óxido de etidieno. La mezcla de reacción para el caso de RE

sería (tabla 2):

Tabla 2. Volúmenes apropiados para la PCR de ESR1

ADN

.............................

1.0 μl.

P1 .........................

.... 0.19μl. (50 pmoles)

P2 .........................

.... 0.22 μl (50 pmoles)

SYBR Green I .........................

.... 12.5 μl

H2O .........................

.... 11.0 μl

Seguidamente se transfieren 24µl de dicha mezcla a cada uno de los pocillos de

la placa multiwell, se incorpora 1µl de la solución de DNA modificado y se somete

a agitación suave para, a continuación, someter la mezcla a la acción del

termociclador.

La señal de fluorescencia de amplificación en la PCR cuantitativa, se genera por

la Mx SYBR Green Super Mix (BioRad, Hercules, CA).


- 104 -

3.4.6. ANÁLISIS ESTADÍSTICO

La asociación entre los 5 biomarcadores/genes estudiados, la presencia de

cáncer de mama y la capacidad para discriminar entre mujeres con y sin cáncer de

mama, ha sido analizada de acuerdo con el siguiente procedimiento:

a) Análisis descriptivo de 3 grupos de mujeres (casos, controles y mujeres con

enfermedad benigna) correspondiente a cada biomarcador, para expresar los

resultados a través de su valor medio, medianas, percentiles, rangos y

desviaciones estándar. El coeficiente de correlación de Spearman ha sido

utilizado para analizar la asociación entre las variables de cada grupo.

b) El test de Kruskal-Wallis con la corrección de Bonferroni ha sido utilizado

para estudiar las diferencias entre los grupos (casos, control y enfermedad

benigna de mama).

c) El test de Mann-Whitney ha sido utilizado para analizar diferencias entre

los valores medios encontrados en los grupos pacientes y control.

d) El análisis de regresión logística multivariante ha sido utilizado para

encontrar las variables significativas y la relación óptima entre ellas.

e) Finalmente las curvas ROC (Receiver Operator Curve) han sido usadas para

cuantificar la validez del test de diagnóstico tanto para cada biomarcador aislado

como para la combinación de los que resultan significativos e independientes

entre sí tras el estudio de regresión logística.

RESULTADOS

Joaquina Martínez-Galán Resultados

- 107 -

4. RESULTADOS

4.1. CARACTERÍSTICAS DEL GRUPO CASOS Y CONTROLES INCLUIDOS EN

ESTE ESTUDIO

En esta memoria hemos incluido el estudio de un total de 217 mujeres. En

todas ellas, tras informarles de la naturaleza y de los objetivos del estudio que

estábamos realizando, y una vez obtenido su consentimiento, procedimos a

tomar, por punción intravenosa, una muestra de sangre (aproximadamente 5 ml)

que en se introdujo en un tubo con heparina como anticoagulante para, con la

mayor rapidez posible, trasladarla al Laboratorio de Investigaciones Médicas del

Hospital Clínico San Cecilio donde se realizaron los ensayos de PCR específica de

metilación. En todas esas muestras se han cuantificado las concentraciones

séricas de los promotores de ADN hipermetilados siguientes: APC, E-Cadherina,

14-3-3-Sigma; RAR-beta, y Receptor de Estrógenos (RE).

Las características generales de las personas incluidas en el estudio y su

distribución de frecuencias se resumen a continuación.

4.1.1. ANÁLISIS DESCRIPTIVO UNIVARIANTE DEL GRUPO CONTROL

Para obtener los valores de referencia de los niveles séricos previsibles en las

muestras de sangre hemos incluido dos subconjuntos de pacientes. El primero de

ellos constituido por un total de 74 mujeres sin evidencia de enfermedad

mamaria alguna (Grupo Control Normal) y el segundo formado por 36 mujeres

afectas de patología mamaria benigna (Grupo Patología Benigna).

a) Datos Epidemiológicos-biográficos

Del análisis de los datos obtenidos en este estudio, resulta que el prototipo de

mujer tomada como control, es una mujer premenopáusicas de edad media

superior a 40 años y, en la mayoría de los casos, sin antecedentes familiares de

cáncer de mama.


- 108 -

Edad: Para el grupo control el intervalo de edad abarca desde los 18 hasta

los 79 años, siendo la edad media 43 años (desviación típica S= 13.51). La

distribución de las personas incluidas en cada subgrupo de control en función de

la edad se ha incluido en la tabla 3. La edad media por subgrupos en mujeres sin

patología alguna fue 41años (22-64 años) y de 48 años (37-56 años) en el caso de

considerar el subgrupo de mujeres con enfermedades benignas de la mama. La

distribución de casos de acuerdo con 3 puntos de corte según edad se hizo para

los siguientes intervalos: edad < 35 años, edad entre 35- 50 y, finalmente, edad

≥ 50 años.

Tabla 3. Distribución de los controles según intervalo de edad

(Total de mujeres incluidas como grupo control)

Edad según intervalos

Frecuencia Porcentaje

<35 30 27,3

35-49 45 40,9

≥50 24 21,8

Subtotal 99 90,0

Desconocida 11 10,0

Total 110 100,0

Antecedentes Familiares: Tuvieron antecedentes familiares de cáncer de

mama el 19% de las mujeres incluidas como controles. De acuerdo a que la

persona que padeció cáncer de mama fuese familiar de primer o segundo grado

las mujeres de este grupo se distribuyeron como sigue:

Antecedentes de Primer grado (madre y/o hermana): La proporción de

mujeres en nuestro grupo control con antecedentes de cáncer de mama de

primer grado fue del 6%. Si consideramos el subgrupo de mujeres con patología

benigna esa misma proporción alcanzó la cifra del 8.6%.

Antecedentes de Segundo grado (abuela, tía y prima): En el grupo

control se encontró este antecedente en el 14.5% de las mujeres. Por subgrupos

en el subgrupo con patología benigna la proporción fue de 23% y en el subgrupo

de mujeres sanas del 11%.


- 109 -

Edad de la menarquia: Para el grupo control la edad media de

presentación de la menarquía fue de 12 años (9-18 años) con desviación típica

1.6 años.

Edad de la menopausia: La edad media de presentación de la menopausia,

fue de 50 años (30-59 años) con desviación típica 5.6 años.

Estado menopáusico: El grupo predominante, en el momento de la toma

de la muestra, fue de mujeres premenopáusicas (tabla 4).

Tabla 4. Distribución de los controles según el estado menstrual

Estado menopáusico Frecuencia Porcentaje

PREMENOPAUSICA 72 72,0

POSTMENOPAUSICA 28 28,0

Total 100 100,0

Desconocidos 10

Total 110

Gestación y edad de presentación: El 61% de los controles habían tenido

algún embarazo a término antes de la toma de la muestra. La distribución por

edad de presentación de los embarazos ha sido la siguiente:

Edad del primer embarazo: La edad media de primer embarazo, fue de 25

años (18-38 años) con desviación típica 4.1.

Edad del último embarazo: La edad media del último embarazo para el

grupo casos fue de 30 años (20-44 años) con desviación típica.

Lactancia materna: El porcentaje de controles que dieron lactancia

materna fue de un 54%.

Meses de lactancia materna: La mediana de meses de lactancia materna

en el grupo control fue de 3 meses (1-24 meses).


- 110 -

b) Datos histopatológicos en grupo control con patología benigna

En el grupo control se incluyeron 36 controles con patología benigna. El

diagnóstico histopatológico final figura resumido en la tabla 5.

Tabla 5. Distribución de los controles con patología benigna

Histología Frecuencia Porcentaje

Fibroadenoma 15 41,7

Mastopatía Fibroquística (MFQ) 14 38,9

Hiperplasia Ductal (DIN1) 6 16,7

Papiloma 1 2,8

Total 36 100

4.1.2. ANÁLISIS DESCRIPTIVOS UNIVARIANTE DEL GRUPO CASOS

a) Datos Epidemiológicos-biográficos

A continuación hemos resumido de forma detallada los datos epidemiológicos

y demográficos más relevantes. Esta información ha sido recogida de las historias

clínicas del grupo de 107 pacientes afectas de cáncer de mama que se han

incluido en este estudio.

Del análisis de los datos extraídos en este estudio a partir de las historias

clínicas, resulta que la paciente prototipo, es una mujer postmenopáusica de 58

años de edad media y sin antecedentes familiares de cáncer de mama en la

mayoría de los casos.

Edad: La edad oscila entre 32 y 88 años siendo la edad media de 58 años

(desviación típica 12.4). Para estudiar la curva de distribución de la edad en

nuestra serie se han elegido tres intervalos de edad diferentes que

aproximadamente podemos denominar como: mujeres jóvenes, mujeres en edad

perimenopáusica y mujeres postmenopáusicas. Así hemos encontrado las cifras

que para mujeres con cáncer de mama menores a 35, entre 35 y 50 años y

mayores a 50 años figuran en la tabla 6.


- 111 -

Tabla 6. Distribución de las enfermas incluidas en la serie

según los intervalos de edad

Edad Frecuencia Porcentaje

<35 3 2,8

35-49 34 31,8

≥50 70 65,4

Total 107 100

Antecedentes familiares: Tuvieron antecedentes familiares de cáncer de

mama el 27% de las pacientes. De acuerdo a que la persona que padeció cáncer

de mama fuese de primer o segundo grado los casos de nuestra serie se

distribuyeron como sigue;

Con antecedentes de primer grado (madre y/o hermana): En el grupo

casos un 14% de las mujeres incluidas tuvieron familiares de primer grado

afectos de cáncer de mama.

Con antecedentes de segundo grado (abuela, tía y prima): En el grupo

casos un 13% de las mujeres tuvieron familiares de segundo grado afectos de

cáncer de mama.

Edad de la menarquia: La edad media de presentación de la menarquia fue

de 13 años (10-17 años) con desviación típica 1.4. Se eligieron dos puntos de

corte uno para edad menor o igual que 11 años y otro para edad igual o mayor

que 12 años (tabla 7).

Tabla 7. Distribución de la serie según edad menarquia

Edad menarquia Frecuencia Porcentaje

≥ 12 53 49.5

≤ 11 53 49.5

Total 106 99,1

Desconocidos 1 0.9

Total 107 100.0


- 112 -

Edad de menopausia: La edad media de presentación de la menopausia,

fue de 49 años (39-59 años) con desviación típica 3.8.

Estado menopáusico: El grupo predominante fue de mujeres

postmenopáusicas con un 69% (tabla 8).

Tabla 8. Distribución de los casos según el estado menstrual

Estado menopausia Frecuencia Porcentaje

POSTMENOPAUSICA 74 69,2

PREMENOPAUSICA Total

33

107 30,8

100,0

Gestación y edad de presentación: El 93% de las pacientes habían tenido

algún embarazo a término antes del diagnóstico. La distribución por edad de

presentación fue;

Edad primer embarazo: La edad media de primer embarazo, fue

de 25 años (18-41años) con desviación típica 3.9.

Edad del último embarazo: La edad media del último embarazo

para el grupo casos fue de 32 años (20-42 años) con desviación típica

5.2.

Lactancia materna: El porcentaje de pacientes que dieron lactancia

materna fue de un 78% frente al 23% de los casos que no dieron lactancia

materna.

Meses de lactancia materna: La mediana de meses de lactancia materna

en el grupo casos fue de 5.76 meses (S: 5.11). Tabla 9.


- 113 -

Tabla 9. Distribución de los datos Epidemiológicos-biográficos de casos y controles

Casos

Controles

Media S* Media S*

Edad media 58 años (32-88)

12.4 43años (18-59) 13.5

Antecedentes Familiares

27% 19%

1er Grado 14% 6%

2º Grado 13% 14.5%

Edad Menarquia 13 años (10-17) 1.4 12 años (9-18) 1.6

Estado Menopáusico

Premenopáusicas 30.8% 72%

Postmenopáusicas 69.2% 28%

Edad Menopausia 49 años (39-59) 3.8 50 años (30-59) 5.6

Edad primer embarazo 25 años (18-41) 3.9 25 años (18-38) 4.1

Edad último embarazo 32 años (20-42) 5.2 20 años (30-44) 5.3

Lactancia materna 78% 54%

Meses lactancia materna

5.8 meses (1-36) 5.1 4.87 meses (1-24) 4.7

*S: Desviación típica.

b) Datos referentes a las características clínicas del tumor

Exponemos de forma detallada los datos referentes a las características

clínicas de los tumores de mama de las 107 pacientes incluidas en este trabajo.

Localización del tumor y cuadrante: Por localización el tumor se

presentó en el 48.6% (52 pacientes) en la mama derecha y el 51.4% (55

pacientes) en la mama izquierda.

En cuanto a la situación del tumor en la mama dividida por cuadrantes, hay un

claro predominio de los cuadrantes externos con 57 casos (53.3%) del total,

especialmente el súpero-externo con un 29% de los casos (tabla 10).


- 114 -

Tabla 10. Distribución de los casos según localización del tumor por cuadrante

Cuadrante Frecuencia Porcentaje

CSE 49 29,0

CSI 8 4,7

CIE 8 4,7

CII 6 3,6

OTROS 36 21,3

Total 107 100

Estadio clínico: El estadio clínico más frecuente con el que se diagnosticó

el tumor a las pacientes en nuestro estudio fue el estadio IIA (T2N0M0) de la

American Joint Committe on Cancer (AJCC) con un porcentaje del 43% (tabla 11).

Tabla 11. Distribución de los casos según Estadio Clínico

Estadios Clínicos Frecuencia Porcentaje

ESTADIO 0 15 14,0

ESTADIO I 32 29,9

ESTADIO IIA 46 43,0

ESTADIO IIB 9 8,4

ESTADIO IIIA 3 2,8

ESTADIO IIIB 2 1,9

Total 107 100

c) Datos referentes al tipo de cirugía

La técnica quirúrgica preferentemente realizada fue la tumorectomía con

margen de seguridad y linfadenectomía axilar homolateral en el 73.8%. Sólo se

realizó mastectomía radical modificada tipo Madden en el 6.5 % (tabla 12).

En cuanto al vaciamiento axilar, se realizó en el 93.5% del total, extirpándose

una media de 15 ganglios por caso (Desviación típica S, 5.8). Máximo: 39 ganglios.

Mínimo: 10 ganglios.

CSE: Cuadrante Súpero Externo; CIE: Cuadrante Infero Externo; CSI: Cuadrante

Súpero Interno; CII: Cuadrante Infero Interno; OTROS: Unión de cuadrantes

superiores, unión de cuadrantes inferiores y retroareolar.


- 115 -

Tabla 12. Distribución de los casos según Tipo de Cirugía

Técnica quirúrgica Frecuencia Porcentaje

CONSERVADORA 79 73,8

RADICAL 21 19,6

TUMORECTOMIA 7 6,5

Total 107 100

d) Datos referentes al resultado anatomo-patológico

En este apartado describimos las características anatomo-patológicas

encontradas tras el estudio histológico del tumor y de los ganglios aislados.

Histología: El tipo histológico de cáncer de mama más frecuente

encontrado en el estudio antomo-patológico de la muestra fue el carcinoma

ductal infiltrante con un 76.6% de los casos seguido del carcinoma lobulillar

infiltrante con un 8.4% de los casos. El resto de variedades histológicas suponían

un 14% (tabla 13).

Tabla 13. Distribución de los casos según la histología del tumor

Histología Frecuencia Porcentaje

C.DUCTAL.INFILTRANTE 82 76.6

C.LOBULILLAR INFILTRANTE 9 8,4

CA. APOCRINO INVASOR 1 0,9

CA. COLOIDE 4 3,7

FIBROHISTIOCITOMA MALIGNO 1 0,9

MIXTO 5 4,7

CA. MEDULAR 1 0,9

T.PHYLLODES MALIGNO 2 1.8

CA. METAPLASICO 1 0,9

EPIDERMOIDE 1 0,9

Total 107 100

Grado de diferenciación histológica: El grado de diferenciación GII o

moderadamente diferenciado fue el más frecuente encontrado en este trabajo.

Hubo un 11.21% de valores desconocidos (tabla 14).


- 116 -

Tabla 14. Distribución de los casos según

Grado de diferenciación histológica del tumor

Grado de diferenciación


GI 20 18,7

GII 40 37,4

GIII 35 32,7

NO G 12 11,2

Total 107 100

Tamaño Tumoral: El tamaño medio más frecuente fue menor de 2 cm en el

68% de los casos en nuestra serie de casos (tabla 15).

Tabla 15. Distribución de los casos según el tamaño tumoral

Tamaño Frecuencia Porcentaje

T1 (≤ 2 cm) 62 57,9

T2 (2-5 cm) 38 35,5

T3 (> 5 cm) 3 3,5

T4 4 3,5

Total 107 100,0

Afectación Ganglionar: No hubo afectación ganglionar en la mayoría de las

pacientes de nuestra serie 63.6%. En las que sí hubo afectación ganglionar, la

mayoría fueron N1 (1-3 ganglios afectos). Tabla 16.

Tabla 16. Distribución de los casos según afectación ganglionar

Ganglios afectos Frecuencia Porcentaje

N0/ Nx 68 63,6

N1 (1-3 g) 32 29,9

N2 (≥ 4g) 7 6,5

Total 107 100

Ruptura Capsular: Se observó en el análisis anatomo-patológico del

vaciamiento axilar la presencia de ruptura capsular en el 10% de los casos (tabla

17).


- 117 -

Tabla 17. Distribución de los casos según la presencia de

ruptura capsular

Ruptura Capsular Frecuencia Porcentaje

NO 90 90

SI 10 10

NO DISECCION 7

Total 107 100

Trombos Tumorales Endolinfáticos: La presencia de trombos tumorales

endolinfáticos se describió en el 6% de nuestra serie (tabla 18).


trombos endolinfáticos

Trombos endolinfáticos Frecuencia Porcentaje

NO 94 94

SI 6 6

NO DISECCION 7

Total 107 100

Infiltración perineural: La presencia de trombos tumorales endolinfáticos

se describió en el 1% de nuestra serie (tabla 19).


Infiltración perineural

Infiltración perineural Frecuencia Porcentaje

NO 99 99

SI 1 1

NO DISECCION 7

Total 107 100

Estadio Patológico: El estadio patológico más frecuente tras el tratamiento

quirúrgico fue el estadio IIA (T2N0M0) de la American Joint Commite on Cancer

(AJCC) con un porcentaje del 43% (tabla 20).


- 118 -

Tabla 20. Distribución de los casos según Estadio Clínico

Estadios AJCC Frecuencia Porcentaje

ESTADIO 0 10 9,3

ESTADIO I 34 31,8

ESTADIO IIA 31 29,0

ESTADIO IIB 19 17,8

ESTADIO IIIA 7 6,5

ESTADIO IIIB 4 3,7

Total 105 98,1

2* 1,9

Total 107 100,0

*Fibrohistiocitoma maligno y Ca. Phyllodes.

Estado de Receptores de Estrógenos en el tumor (RE): La mayoría

fueron receptor estrogénico positivo 65.4% (tabla 21).

Tabla 21. Distribución de los casos según estado de RE

Receptor Estrogénico Frecuencia Porcentaje

RE POSITIVO 70 65,4

RE NEGATIVO 27 25,2

NO INDICADO 10 9,3

Total 107 100,0

Estado de Receptores de Progesterona en el tumor (RP): La mayoría de

las pacientes fueron receptor de progesterona positivo 55.1% (tabla 22).

Tabla 22. Distribución de los casos según estado de RP

R. Progesterona Frecuencia Porcentaje

RP POSITIVO 59 55.1

RP NEGATIVO 37 34.6

NO INDICADO 11 10,3

Total 107 100,0

Receptores hormonales en el tumor (RH): El estado del receptor

hormonal en el tumor teniendo en cuenta tanto RE como RP fue

predominantemente positivo 75% (tumores hormono-sensibles). Tabla 23.


- 119 -

Tabla 23. Distribución de los casos según estado de RH

R. Hormonal Frecuencia Porcentaje

NO HORMONOSENSIBLE 22 20,6

SÍ HORMONOSENSIBLE 75 70,1

NO INDICADO 10 9,3

Total 107 100,0

Estado del Cerb2: Los tumores que no sobreexpresaban Cerb2 fueron más frecuentes que los que sí lo hacían (tabla 24).

Tabla 24. Distribución de los casos según estado Cerb2

Estado Cerb2 Frecuencia Porcentaje

Cerb2 NEGATIVO 78 72,9

Cerb2 POSITIVO 19 17,8

NO INDICADO 10 9,3

Total 107 100,0

Fenotipo Molecular: De acuerdo con la clasificación molecular del cáncer

de mama el subtipo más frecuente en nuestra serie fue el fenotipo Luminal A con

un 36.4% (tabla 25).

Tabla 25. Distribución de los casos según Fenotipo Molecular

Fenotipo

Molecular Frecuencia Porcentaje

LUMINAL A 39 36.4

LUMINAL B 22 20.5

TRIPLE NEGATIVO 15 14

HER2+ 10 9.3

Desconocidos 21 19.6

Estado del P53: En nuestra serie la mayoría de los casos fueron P53

negativos (tabla 26).


- 120 -

Tabla 26. Distribución de los casos según estado p53

P53 Frecuencia Porcentaje

P53 NEGATIVO 51 47,7

P53 POSITIVO 44 41,1

NO INDICADO 12 11,2

Total 107 100,0

e) Datos referentes al tratamiento Adyuvante:

Quimioterapia: Se administró QT adyuvante al 63.6% de los casos (68

casos). El esquema de QT más empleado fue EC en el 23.8% de los casos seguido

de EC-Taxol en el 14.3% (tabla 27).

Tabla 27. Distribución de los casos según Esquema de QT

Esquema QT Frecuencia Porcentaje

EC 25 23.4

EC-TAXOL 15 14.0

CMF 14 13.1

FEC 10 9.3

ADM 1 9.0

CDDP+5-FU 1 9.0

NO QT 39 36.4

Sub-Total 105 98.1

Perdidos 2 1.9

Total 107 100

EC: Epirrubicina+ Ciclofosfamida; CDDP+ 5FU: Cisplatino + 5 Fluorouracilo; EC-T: Epirrubicina+

Ciclofosfamida seguido de Taxol; ADM: Adriamicina; CMF: Ciclofosfamida+ Metrotezate+ 5 Fluorouracilo;

FEC: 5 Fluorouracilo+ Epirrubicina+ Ciclofosfamida.

Radioterapia Externa (RTE): Se realizó radioterapia externa en el 90%

de los casos, siendo la irradiación exclusiva con dos campos tangenciales el

campo más realizado en un 77% de los casos. El fraccionamiento estándar de 2

Gy por sesión durante 5 días a la semana hasta completar 50 Gy de dosis total, fue

el fraccionamiento que se empleó en el 100% de los casos. De igual forma en

cuanto a la energía utilizada en los tratamientos con RTE todos ellos fueron


- 121 -

realizados en un Acelerador Lineal de Electrones (ALE) con una energía de 6 Mv

(tabla 28).

Tabla 28. Distribución de los casos según campos de RT realizados

Campos RT Frecuencia Porcentaje

TANGENCIALES 77 72.0

TANGENCIALES-SC 8 7,5

TANGENCIALES-SC-AP 9 8,4

NO RT 11 10,3

Sub-Total 105

Perdidos 2 1.9

Total 107 100.0

Sobreimpresión: La sobreimpresión se realizó en el 52.3% de los casos.

De ellos el 57.14% lo hicieron mediante la aplicación de braquiterapia recibiendo

una media de dosis de 16Gy (tablas 29 y 30).

Tabla 29. Distribución de los casos según Técnica de Sobreimpresión

Tipo sobreimpresión Frecuencia Porcentaje

NO SOBREIMPRESION 48 44.9

BRAQUITERAPIA 32 29.9

ELECTRONES 24 22.4

Sub-Total 104

Perdidos 3 2.8

Total 107 100.0

Tabla 30. Distribución de los casos según Dosis de Sobreimpresión

Dosis Sobreimpresión


10 1 1,8

14 1 1,8

16 52 92,9

18 1 1,8

20 1 1,8

Total 56 100,0

Hormonoterapia (HT): Realizaron tratamiento hormonal tras finalizar el

tratamiento con QT y RT el 79% de las pacientes (83 pacientes). El esquema de


- 122 -

hormonoterapia más empleado fue con inhibidores de la aromatasa en un

61.77%%, seguido de antiestrógenos con un 37% (tabla 31 y 32).

Tabla 31. Distribución de los casos según tipo de Hormonoterapia

Hormonoterapia Frecuencia Porcentaje

SI 83 77.6

NO 22 20.6

Sub-Total 105

Desconocidos 2 1.9

Total 107 100.0

Tabla 32. Distribución de los casos según tipo de Hormonoterapia

Tipo de

Hormonoterapia Frecuencia Porcentaje

NO HT 22 20.6

ANATROZOL 42 39.3

TAMOXIFENO 28 26,2

LETROZOL 9 8,4

TOREMIFENO 2 1,9

GOSERELINA 1 0.9

Total 104

Perdidos 3 2.8

Total 107 100.0

f) Datos del seguimiento.

Recidiva locorregional: No hubo ningún caso de recidiva local en nuestra

serie. El 3.7% recayeron a nivel ganglionar en el área áxilo-supraclavicular (tabla

33).

Tabla 33. Distribución de los casos según Recaída locoregional

Recaída locoregional


LOCAL 0 0

REGIONAL 4 3,7


- 123 -

Recaída a distancia: Un 12% de los casos recayeron a distancia en algún

momento del seguimiento. El 88% restante no presentó recaída a distancia en

nuestro estudio (tabla 34).

Tabla 34. Distribución de los casos según Recaída a distancia

Recaída a distancia


NO 94 87,9

SI 13 12,1

Total 107 100,0

Localización de las metástasis: La mayoría de las metástasis a distancia

se presentaron a nivel óseo y hepático (tabla 35).

Tabla 35. Distribución de los casos según localización metástasis

Recaída Frecuencia Porcentaje

ÓSEAS 6 1,9

HEPÁTICAS 5 1.9

CEREBRALES 3 0.9

PULMONARES 2 0.9

MAMA CONTRALATERAL

1 0.9

Supervivencia libre de enfermedad (SLE): La supervivencia libre de

enfermedad para las pacientes de nuestro estudio fue de 51 meses de media

(Máximo: 74. Mínimo: 4.5 Desviación típica: 18.5). A los 2 años de seguimiento el

100% de los casos estaban libres de enfermedad y a los 5 años lo estaban el 87%.

Si analizamos el patrón de fallo tanto locoregional como a distancia,

diagnosticado durante dicho seguimiento la tasa de fallo fue de 12%, siendo el

tiempo mínimo de recaída de 4.5 meses y el máximo de 48 meses (4 años).

Figura 4.


- 124 -

Supervivencia Libre Enfermedad

Seguimiento en meses

80706050403020100

Supe

rvive

ncia

acu

mul

ada

1,021,00

,98,96,94,92,90,88,86,84,82,80,78,76,74,72,70

Función de

supervivencia

Censurado

Figura 4.- Curva de supervivencia libre de enfermedad (actuarial) para el conjunto de mujeres afectas de

cáncer de mama incluidas en este estudio.

Estado al final del estudio: Si analizamos la situación de los pacientes al

final del estudio; encontramos un porcentaje global de éxitus del 12% de los

casos. El 8.4% fue específicamente por tumor y el resto por enfermedades

intercurrentes. El 94% de los casos estaban vivas siendo el 84% de los casos

pacientes vivas libres de enfermedad y el 3.7% de pacientes vivas pero con

enfermedad (tabla 36).

Tabla 36. Distribución de los casos según Situación al final del Estudio

Situación final estudio Frecuencia Porcentaje

VIVO SIN ENFERMEDAD 90 84,1

VIVO CON ENFERMEDAD 4 3,7

EXITUS TUMOR 9 8,4

EXITUS OTRAS CAUSAS 4 3,7

TOTAL 107 100,0


- 125 -

Supervivencia Global (SG): La supervivencia global media fue de 52.6

meses (Mínimo: 4.5. Máximo: 74. Desviación estándar S: 17.3) con una tasa de

muertes por tumor del 12% (figura 5).

Función de Supervivencia Global

Seguimiento en meses

80706050403020100

Supe

rviv

enci

a ac

umul

ada

1,021,00,98,96,94,92,90,88,86,84,82,80,78,76,74,72,70

Función de supervivencia

Censurado

Figura 5. Supervivencia global (actuarial) para la serie de mujeres afectas de cáncer de mama incluidas en

este estudio.


- 126 -

4.2. METILACIÓN DE LOS PROMOTORES DE LOS GENES ESTUDIADOS EN

ESTE TRABAJO

4.2.1. Determinación del estado de metilación en el grupo control

Para realizar esta parte del trabajo experimental se han dispuesto de muestras

de sangre extraídas a 110 mujeres sin cáncer de mama. De ellas 74 muestras

pertenecían a mujeres sanas sin patología de mama benigna y 36 a mujeres sanas

con algún tipo de patología tumoral benigna de mama. Las muestras fueron

analizadas por PCR cuantitativa en Tiempo Real. Así, a partir de los valores

relativos de fluorescencia, y utilizando la correspondiente recta de calibración,

obtuvimos, para cada una de las muestras estudiadas, un valor cuantitativo cuya

cifra estaba comprendida entre 0 y 2 ng/ml de promotor metilado. Con estos

valores hemos construidos los histogramas de la figura 6.

Figura 6. Valores medios y error estándar de la media de cada uno de los biomarcadores metilados

estudiados. Los datos corresponden a los grupos de personas sin evidencia de enfermedad tumoral mamaria

alguna (Grupo Normal) y a las personas afectas de tumoraciones benignas de la mama (Grupo Patología

Benigna).

RE E-Cadh RAR- APC 14-3-3-0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

Biomarcador

Control Normal

Un

idad

es R

ela

tivas

RE E-Cad RAR- APC 14-3-3-0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30

0.35Enfermedad tumoral benigna

Biomarcador

Un

idad

es R

ela

tivas


- 127 -

4.2.2. Determinación del estado de metilación en el grupo de pacientes con

cáncer de mama

Los datos incluidos en la siguiente figura resumen en idéntica forma gráfica,

los valores medios y el error estándar de la media para el grupo de pacientes con

cáncer de mama en dos situaciones distintas: a) antes de la cirugía y b) al término

del tratamiento.

Figura 7. Histograma de los valores encontrados para cada uno de los biomarcadores estudiados antes y

después del tratamiento de las pacientes afectas de cáncer de mama.

4.2.3. Análisis inicial de los resultados

Con el fin de simplificar esta parte del análisis de resultados, sobre las cifras

cuantitativas obtenidas del análisis del nivel de metilación de los genes

analizados, hemos elegido un valor de corte (véase línea roja punteada en las

figuras 8 y 9, que nos

permite clasificar los

resultados como: a)

presencia en el suero del

promotor aberrantemente

metilado en cantidad

suficiente como para

poder ser definida como

positiva, es decir

patológica y b) presencia

Casos Control

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

VP FP

FN VN

Figura 8. "Distribución de los valores de la concentración sérica del promotoraberrantemente metilado del gen del RE. La línea roja muestra un umbral de decisión. Enbase a él se distinguen las fracciones: VP = verdadero positivo; FN = falso negativo; FP=falsopositivo y VN = verdadero negativo" aberrantemente metilado del gen del RE. La línea rojamuestra un umbral de decisión. En base a él se distinguen las fracciones: VP = verdaderopositivo; FN = falso negativo; FP=falso positivo y VN = verdadero negativo"

Un

idad

es R

ela

tivas

Pacientes con Cáncer

RE E-Cadh RAR- APC 14-3-3-0.0

0.1

0.2

0.3

Biomarcador

Un

idad

es R

ela

tivas

RE E-Cad RAR- APC 14-3-3-0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30

0.35

Pacientes tras tratamiento

Biomarcador

Un

idad

es R

ela

tivas

a) b)


- 128 -

de este biomarcador por debajo del valor mínimo para ser considerado como

nivel fisiológico de metilación. En este segundo caso la muestra será clasificada

como negativa.

Para ello, se tomó como punto de corte para distinguir entre nivel de

metilación “fisiológica” y “patológica” de los promotores de los genes: Receptor de

estrógenos (RE), E-Cadherina, APC,

Rar-βeta y 14-3-3 Sigma, el límite

inferior del intervalo de confianza del

95% de la media calculado a partir

de los resultados cuantitativos

obtenidos del grupo control sano, y

diremos, que las muestras de

aquellos controles con resultados por

encima de este límite se

considerarían metilados positivos

(patológicos) y aquellos otros por

debajo del umbral elegido, se considerarían metilados negativos (fisiológicos). La

tabla 37 contiene un resumen de los parámetros estadísticos de tendencia central

para el conjunto de valores encontrados: media, desviación típica, error estándar

e intervalo de confianza del 95% en la serie de controles sanos y controles con

patología benigna.

Casos Control

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

VP FP

FN VN

Figura 9. Distribución de los valores de la concentración sérica delpromotor aberrantemente metilado del gen del 14-3-3-sigma. La línea rojamuestra un umbral de decisión. En base a él se distínguen las fracciones:VP= verdadera positiva; FN= falsa negativa; FP=falsa positiva y VN=verdadera negativa.

Un

idad

es R

ela

tivas


- 129 -

Tabla 37. Estadística descriptiva de los biomarcadores estudiados en los grupos control

S* : desviación típica. e *: S/n. error típico de la media

De acuerdo con los resultados obtenidos se tomó como punto de corte para

distinguir entre metilación patológica de metilación fisiológica, el límite inferior

del intervalo de confianza del 95% de la media obtenida para cada uno de los

biomarcadores estudiados del grupo de mujeres sin evidencia de enfermedad

tumoral alguna (Controles Normales). Es cierto que el umbral elegido puede ser

criticado como arbitrario, pero consideramos que, para esta parte descriptiva de

nuestro estudio, es un nivel de corte razonable. Estos puntos de corte como se

muestran en la tabla 37 fueron; APC: 0.01, E-Cadherina: 0.01, 14-3-3 Sigma: 0.04,

Rar-βeta: 0.01, RE: 0.01.

Este primer análisis responde a la pregunta: ¿Es diferente el nivel de

biomarcador encontrado en el grupo de pacientes con cáncer de mama del que

caracteriza a las mujeres sin evidencia de enfermedad tumoral alguna?; si esto es

así, ¿Con qué seguridad podemos considerar que el biomarcador discrimina entre

una persona afecta de cáncer y otra que está sana?

Las figuras 8 y 9 muestran la representación en puntos dispersos de los

valores encontrados para las medidas cuantitativas de metilación del promotor

del gen RE y del promotor del gen 14-3-3-sigma para los grupos cáncer y control

normal. En ambas figuras con una línea punteada se ha dibujado el umbral de

decisión. Mediante este umbral pretendemos distinguir la presencia y la ausencia

CONTROLES NORMALES

CONTROLES

CON PATOLOGIA BENIGNA

GENES Media S* e*

IC 95% Media S* e*

IC 95%

APC 0.028 0.056 0.007

0.015-0.04 0.047 0.145 0.024 0.002- 0.09

E-Cadh. 0.024 0.062 0.007 0.009-0.03 0.046 0.093 0.016 0.015-0.07

14-3-3 s. 0.080 0.179 0.021 0.039-0.12 0.247 0.514 0.086 0.079-0.41

Rar-β 0.047 0.164 0.019 0.009-0.08 0.023 0.059 0.010 0.003-0.04

RE 0.018 0.053 0.006 0.006-0.02 0.020 0.031 0.005 0.010-0.02


- 130 -

de cáncer de mama, y diremos que el marcador nos informa correctamente

cuando a valores superiores al marcado le corresponden pacientes con cáncer,

mientras que encontramos que los valores inferiores al considerado como límite

se asocian a personas sin enfermedad. Hablaremos así de Verdadero Positivo

(VP), Falso Negativo (FN), Verdadero Negativo (VN) y Falso Negativo (FN).

Nótese que la modificación del umbral de decisión, hacia arriba o hacia abajo,

cambia de manera importante el porcentaje global de aciertos y de fallos

(verdaderos y falsos resultados positivos y verdaderos y falsos resultados

negativos, del test). La tabla 37 nos permitirá definir ese primer nivel de

discriminación.

Teniendo en cuenta esos valores los resultados del nivel de metilación

cuantificado en el suero para los biomarcadores estudiados en el grupo de

personas tomadas como Controles Normales y en el grupo de mujeres con

Patología Mamaria Benigna fueron los que se resumen en la tabla 38.

Tabla 38. Distribución de Metilación en el grupo control (+/-).

CONTROL NORMAL CONTROL CON PATOLOGÍA BENIGNA

Positivos Negativos Positivos Negativos

Genes % N % n % N % N

APC 44.6 33 55.4 41 58.3 21 41.7 15

E-Cadherina 28.4 21 70.3 52 38.9 14 61.1 22

14-3-3 sigma 35.1 26 64.9 48 44.4 16 55.6 20

Rar-βeta 39.2 29 60.8 45 66.7 24 33.3 12

RE 29.7 22 70.3 52 47.2 17 52.8 19

n: número de casos. %: porcentaje de casos.

4.2.4. Determinación del estado metilación en el grupo de mujeres afectas

de cáncer de mama

Procediendo de manera análoga a lo expuesto en párrafos anteriores en este

apartado describimos los resultados obtenidos, para cada uno de los

biomarcadores epigenéticos analizados, en el grupo de mujeres afectas de cáncer

de mama. El resumen de los resultados obtenidos se ofrece en la tabla 39. En ella


- 131 -

que se incluyen los parámetros estadísticos habituales, Media, Desviación típica,

Error típico de la media e intervalo de confianza del 95% de la media.

Tabla 39. Estadística descriptiva metilación promotores: Casos CASOS

GENES Media S* e* IC 95%

APC 0.037 0.120 0.0116 0.014-0.059

E-Cadherina 0.061 0.273 0.0265 0.009-0.111

14-3-3 sigma 0.205 0.398 0.0386 0.129-0.280

Rar-βeta 0.046 0.202 0.0196 0.007-0.084

R. Estrógenos 0,102 0.326 0.0316 0.040-0.163

S*: desviación típica. ( e*: S/n): error típico de la media

El resultado cuantitativo del análisis se calificó como positivo (o negativo)

tomando en consideración el umbral de decisión elegido sobre el grupo de

mujeres sin evidencia de enfermedad mamaria alguna. Para ello se dispusieron

de un total de 107 muestras de sangre procedentes de mujeres con diagnóstico

de certeza de padecer cáncer. Todas las muestras fueron extraídas antes de

realizar ningún tratamiento oncológico. Los resultados obtenidos se muestran en

la tabla 40.

Tabla 40. Distribución de Metilación en el grupo casos (+/-)

Positivos Negativos

Genes Porcentaje % Frecuencias Porcentaje % Frecuencias

APC 55.1 59 44.9 48

E-Cadherina 43.0 46 57.0 61

14-3-3 sigma 59.8 64 40.2 43

Rar-βeta 38.3 41 61.7 66

R. Estrógenos 52.3 56 47.75 51

Los valores de metilación se consideraron positivos (patológicos) cuando la

cifra superó los niveles siguientes: APC: 0.01, E-Cadherina: 0.01, 14-3-3 Sigma:

0.04, Rar-βeta: 0.01, R.E: 0.01. Por el contrario, la metilación se consideró

negativa (fisiológica) cuando la cifra obtenida para una paciente concreta

quedaba por debajo de ese nivel.


- 132 -

Una vez definido el criterio, y asignado un estado de metilación (positivo o

negativo) para cada uno de los distintos biomarcadores epigenéticos estudiados,

es posible conocer si existen diferencias en cuanto a la presencia (y al nivel) de la

metilación que se cuantifica en las muestras de suero de las personas incluidas en

cada uno de los grupos considerados. Para ello utilizando los datos de las tablas

38 y 40, para construir simples tablas de contingencia y aplicar el test exacto de

Fisher que nos permite conocer el valor del estadístico P. Este análisis nos ha

permitido poner de manifiesto que las diferencias entre la cantidad de resultados

de metilación positiva en el grupo de mujeres con cáncer de mama y de mujeres

sin evidencia de enfermedad mamaria alguna son claramente significativas

cuando se comparan los biomarcadores: RE (P=0.0036) y 14-3-3-sigma

(P=0.0015). No encontramos diferencias significativas para el resto de

biomarcadores estudiados. Las diferencias entre casos y controles para RE y para

14-3-3-sigma pierden validez cuando en la comparación se incluyen los grupos de

casos y de controles con patología mamaria benigna las diferencias carecen de

significación estadística.

4.2.5. Estadística descriptiva general por grupo

Para alcanzar los objetivos propios del estudio se llevó a cabo un análisis

estadístico que incluyó, para cada uno de los grupos el análisis descriptivo de los

cinco biomarcadores. En la tabla 41 que sigue aparecen las medidas básicas de

resumen (número de caso, media, desviación típica y percentiles) para cada una

de las variables (biomarcadores aberrantemente metilados) objeto de nuestro

estudio, en el suero de pacientes afectas de cáncer de mama y en los grupos de

control que hemos establecido.

De los resultados que presentamos llama la atención el hecho de que hay un

gran número de valores a los que se les ha asignado el valor cuantitativo 0

(figuras 8 y 9 y tabla 41, percentiles del 25 y a veces del 50). Estos valores

cuantificados como 0 proceden de las que, tras el ensayo, resultaron

indetectables para cada uno de los biomarcadores y de los que resultaron con un

valor inferior a 0.002 ng/ml; esto lo hemos hecho así por cuanto la sensibilidad


- 133 -

del test de PCR específica de metilación, teniendo en cuenta la recta de

calibración, no permite cuantificar con precisión valores por debajo de esa cifra.

Por la misma razón (límite en la recta de calibración del ensayo) el valor máximo

resultante del test se ha tomado como 2 ng/ml en aquellos casos que el valor

medido superaba esta cifra. Este ajuste de datos explica también, de una manera

indirecta, la asimetría de las variables y por tanto la no normalidad de las

mismas. La tabla 41 recoge estos datos.

Tabla 41. Parámetros estadísticos resultantes del estudio de casos y controles

Grupo RE E-cad. Rar-beta APC 14-3-3 sigma

Control N Válidos 74 73 74 74 74

Perdidos 0 1 0 0 0

Media ,0189 ,0246 ,0475 ,0287 ,0806

Desv. Típ. ,05308 ,06235 ,16476 ,05653 ,17983

Mínimo ,00 ,00 ,00 ,00 ,00

Máximo ,38 ,43 1,35 ,26 1,04

Percentiles 25 ,0000 ,0000 ,0000 ,0000 ,0000

50 ,0000 ,0000 ,0000 ,0028 ,0137

75 ,0120 ,0253 ,0350 ,0382 ,0543

Casos N Válidos 105 105 105 105 106

Perdidos 2 2 2 2 1

Media ,1864 ,1820 ,1233 ,0377 ,2510

Desv. Típ. 1,01918 1,15902 ,97542 ,12064 ,70258

Mínimo ,00 ,00 ,00 ,00 ,00

Máximo 2,00 2,00 2,00 1,19 2,00

Percentiles 25 ,0000 ,0000 ,0000 ,0000 ,0000

50 ,0114 ,0000 ,0001 ,0131 ,0620

75 ,0572 ,0321 ,0291 ,0365 ,1615

Patología

Benigna

N Válidos 36 36 36 36 36

Perdidos 0 0 0 0 0

Media ,0236 ,0469 ,0236 ,0479 ,2472

Desv. Típ. ,03120 ,09332 ,05934 ,14520 ,51427

Mínimo ,00 ,00 ,00 ,00 ,00

Máximo ,13 ,46 ,33 ,87 2,00

Percentiles 25 ,0000 ,0000 ,0000 ,0000 ,0080

50 ,0023 ,0000 ,0000 ,0067 ,0696

75 ,0473 ,0720 ,0232 ,0439 ,2803


- 134 -

4.3. ESTUDIO DE LA RELACIÓN ENTRE LAS VARIABLES EPIGENÉTICAS

Una de las condiciones esenciales, cuando se estudia una serie de potenciales

biomarcadores de enfermedad, es que las variables cuantificadas para cada uno

de ellos sean independientes de los valores que resulten al medir los otros. Para

estudiar las correlaciones entre las variables, dentro de cada grupo, se ha

empleando el coeficiente de correlación de Spearman. La tabla 42 resume estos

resultados. Observando las correlaciones en los diferentes grupos se ve que los

biomarcadores APC y 14-3-3-sigma son los que más se correlacionan con los otros

marcadores.

Tabla 42. Correlación entre los biomarcadores ensayados y los grupos de casos y controles

Correlaciones de Spearman por grupo

Grupo RE E-Cadher. RAR-beta APC 14-3-3s.

Control

RE r 1,000 0,128 0,169 0,270 0,385

P - 0,280 0,149 0,020 0,0007

N 74 73 74 74 74

E-Cadh. r 0,128 1,000 0,121 0,177 0,128

P 0,280 - 0,309 0,133 0,282

N 73 73 73 73 73

RAR-beta r 0,169 0,121 1,000 0,329 0,286

P 0,149 0,309 - 0,004 0,013

N 74 73 74 74 74

APC r 0,270 0,177 0,329 1,000 0,527

P 0,020 0,133 0,004 - 0,000

N 74 73 74 74 74

14-3-3 s. r 0,385 0,128 0,286 0,527 1,000

P 0,000 0,282 0,013 0,000 -

N 74 73 74 74 74

Casos

RE r 1,000 0,160 0,183 0,184 0,153

P - 0,103 0,061 0,060 0,119

N 107 107 107 107 107

E-Cadh. r 0,160 1,000 0,102 0,156 0,279

P 0,103 - 0,299 0,111 0,003


- 135 -

Correlaciones de Spearman por grupo

Grupo RE E-Cadher. RAR-beta APC 14-3-3s.

N 107 107 107 107 107

RAR-beta r 0,183 0,102 1,000 0,413 0,140

P 0,061 0,299 - 0,000 0,153

N 107 107 107 107 107

APC r 0,184 0,156 0,413 1,000 0,315

P 0,060 0,111 0,000 - 0,001

N 107 107 107 107 107

14-3-3 s. r 0,153 0,279 0,140 0,315 1,000

P 0,119 0,003 0,153 0,001 -

N 107 107 107 107 107

Control

Patología

Tumoral

Benigna

RE

r

1,000

0,263

0,194

0,307

0,111

P - 0,120 0,257 0,068 0,519

N 36 36 36 36 36

E-Cadh. r 0,263 1,000 0,089 0,353 0,168

P 0,120 - 0,604 0,034 0,326

N 36 36 36 36 36

RAR-beta r 0,194 0,089 1,000 0,461 0,132

P 0,257 0,604 - 0,004 0,443

N 36 36 36 36 36

APC r 0,307 0,353 0,461 1,000 0,338

P 0,068 0,034 0,0046 - 0,043

N 36 36 36 36 36

14-3-3 s. r 0,111 0,168 0,132 0,338 1,000

P 0,519 0,326 0,443 0,043 -

N 36 36 36 36 36

En la tabla anterior hemos sombreados los cruces en los que, tras el estudio de

correlación, hemos encontrado la existencia de significación estadística para la

relación entre las dos variables investigadas.


- 136 -

Del análisis de esa tabla se deduce que los valores de concentración del

promotor del gen RE no muestran correlación con ninguno de los otros

biomarcadores, ni en el grupo de pacientes afectas de cáncer de mama (casos), ni

en el grupo de mujeres con patología tumoral benigna. También es notoria la

diferencia entre el número de veces (10 veces) que encontramos correlación

entre los resultados obtenidos para las variables cuantificadas en la serie de

mujeres sin evidencia alguna de enfermedad tumoral mamaria (Grupo Control)

frente las veces en la que esta correlación se encuentra al estudiar los resultados

de la serie de mujeres afectas de cáncer (Grupo casos: 6 veces) y la serie de

pacientes afectas de patología tumoral benigna (6 veces).

Los biomarcadores que muestran mayor tendencia a correlacionar con otros

son APC y 14-3-3-sigma. Una explicación sencilla a este hallazgo es el elevado

número de veces que el resultado cuantitativo del ensayo, para esos dos

biomarcadores epigenéticos, corresponde con el valor cero. Esto tiene como

resultado que la coincidencia, en uno y otro biomarcador, del valor 0 cuando se

estudia la relación entre dos biomarcadores, produzca un resultado estadístico

significativo aun cuando tal correlación probablemente carece de significado

biológico alguno. Por el contrario, nos parece biológicamente relevante, y

significativo, el hecho de que entre el Receptor de Estrógenos y el 14-3-3-sigma no

se encuentren indicios de relación de uno con el otro en ninguno de los tres

grupos estudiados (Tabla 41). Y siendo estos los dos biomarcadores los únicos

que el estudio estadístico elemental parecen distinguir entre pacientes con

cáncer y personas sin enfermedad, podemos sugerir que tanto el RE como el 14-3-

3-sigma pueden ser considerados como biomarcadores independientes del

cáncer de mama.

4.3.1. Contraste de la hipótesis

Nuestra hipótesis es que los niveles de un biomarcador cuantificado en el

suero de una paciente con cáncer de mama debe ser mayor que el que los que se

miden en personas con enfermedad benigna de la mama y mayor que los que

aparecen en el suero de una mujer sin evidencia alguna de enfermedad mamaria.


- 137 -

Con objeto de determinar las diferencias entre los tres grupos de personas que

hemos establecido en este trabajo se llevó a cabo el test de Kruskal-Wallis, en su

versión exacta y cuando fue significativo se llevaron a cabo las comparaciones

por parejas siguiendo la penalización de Bonferroni. Realizado el test exacto de

Kruskal-Wallis para cada uno de los biomarcadores, en la tabla 43 se han

recogido los datos correspondientes a la comparación entre casos y controles.

Tabla 43. Comparación de las diferencias entre los grupos de pacientes con cáncer y de mujeres sin enfermedad

Niveles de Significación exactos del test de Kruskal-Wallis

RE E- Cadher. RAR beta APC 14-3-3 sig.

Significación 0,0007 0,3686 0,7238 0,4044 0,0064

Como se ve en la tabla 43, los únicos dos marcadores que muestran diferencias

significativas cuando se comparan los resultados obtenidos para el Grupo Casos

con los encontrados en el Grupo Control, son el RE y el 14-3-3-sigma. Esto

confirma al análisis preliminar que anteriormente exponíamos.

Por otra parte, al realizar las comparaciones por parejas se obtiene que las

significaciones que se encuentra provienen de la comparación controles-casos, no

llegándose a obtener significaciones en ninguna de las dos comparaciones cuando

en el proceso de cálculo figura el grupo de mujeres afectas de patología tumoral

benigna de la mama.

Para buscar las diferencias individuales entre el grupo de enfermas y el grupo

de controles se llevó a cabo un análisis mediante el test de Mann-Whitney. Como

ya se había dicho anteriormente, hemos encontrado diferencias significativas

entre casos y controles, pero sólo en el caso de los biomarcadores RE y del 14-3-3-

sigma. De estos resultados (tabla 44) se puede sugerir que las pacientes con

cáncer de mama tienden a tener niveles de metilación patológica de RE

superiores a los que muestran las personas sin evidencia alguna de enfermedad

(Grupo Control). Lo mismo podemos decir del biomarcador 14-3-3-sigma.


- 138 -

Tabla 44. Comparación de medias. Aplicación Test U de Mann-Whitney en casos/ control

CASOS/ CONTROLES NORMALES CASOS/ CONTROLES

CON Patología Benigna

GENES U Mann-Whitney

P Significación

IC 95% U Mann-Whitney

P Significación

IC 95%

APC

3360,000

0.07

ns

1710,000

0.305

ns

E-Cad. 3589,000 0.315 ns 1850,000 0.741 ns

14-3-3 s. 3269,000 0.046 s 1014,500 < 0.001 s

Rar-βeta 3819,000 0.743 ns 1831,000 0.690 ns

RE 2734,500 < 0.001 s 1656,500 0.223 ns

A partir los resultados obtenidos (tabla 44) podemos decir que del conjunto de

genes analizados en nuestras series de casos y controles, dos de ellos (RE y 14-3-

3 Sigma) alcanzaron suficiente potencia estadística para discriminar entre grupo

casos y controles normales.

Las diferencias entre los grupos de pacientes con cáncer (Grupo Casos) y de

personas sin patología tumoral alguna (Grupo Normal) fueron apreciadas

también cuando se compararon los valores correspondientes a APC entre grupo

casos y controles normales pero su magnitud no alcanzó la significación

estadística (P=0.07). Tampoco se encontraron diferencias estadísticamente

significativas en los promotores de los genes Rar-βeta y E- Cadherina.

4.3.2. Análisis multivariante

Para estudiar la posible asociación entre diferentes biomarcadores y la

presencia de enfermedad e intentar fabricar una regla clasificatoria que

combinara varios de los marcadores empleados, se empleó la regresión logística

multivariante incluyendo en los modelos los diferentes marcadores. Para llevar a

cabo este análisis los resultados obtenidos se ajustaron a un modelo de regresión

logística en el que la variable dependiente era el grupo (controles/casos) y las

variables independientes eran los cinco biomarcadores.

Ajustado el modelo de regresión logística de este análisis resulta claro que tres

biomarcadores estaban muy lejos de la significación, E-Cadh., RAR-β y APC. Con


- 139 -

objeto de ver si esas tres variables aportaban algo de información sobre la

variable dependiente los datos de nuestro estudio se ajustaron a un modelo

utilizando sólo las variables significativas y se calculó la diferencia entre los

logaritmos de las verosimilitudes de ambos modelos (el resultante del

tratamiento de las cinco variables y el que se obtiene tras el ajuste de sólo las dos

significativas). El estudio de estas verosimilitudes nos proporciona un valor de

χ2exp=4.22, 3g.l., P=0.2385, lo que nos permite afirmar que las tres variables

categorizadas como carentes de significación no aportan información alguna

sobre la variable dependiente, y que su inclusión en el modelo tampoco añade

valor a la capacidad discriminante de los dos biomarcadores significativamente

asociados (RE y 14-3-3-sigma) y con capacidad para distinguir entre casos y

controles sin enfermedad alguna.

Desde un punto de vista teórico el modelo global resultó significativo,

P<0.001, aunque las variables consideradas individualmente (debido a su

relación) no alcanzan la significación al 5%. No obstante ambas variables resultan

informativas sobre la presencia/ausencia de enfermedad por lo que con ellas se

puede construir un discriminador lineal basándonos en las estimaciones de los

coeficientes del modelo, según propone P. Margaret [381].


- 140 -

4.3.3. Validación de la capacidad discriminatoria del test

Es claro que la distribución de los valores de los biomarcadores estudiados en

los grupos de casos y de control (véanse las figuras 8 y 9) han resultado, en parte,

estar solapadas. Como consecuencia el número de de predicciones correctas

sobre la presencia o la ausencia de cáncer de mama –verdaderos positivos y

verdaderos negativos- identificados utilizando uno u otro marcador son

dependientes del umbral de decisión elegido. Para hacer fácil de entender lo que

sigue hemos dibujado el esquema idealizado que se incluye en la figura 10. Si

utilizando los datos de esa figura se adopta un nivel de corte muy bajo (umbral 1)

la fracción de

diagnósticos

positivos (puntos

rojos en la

columna

correspondiente al

grupo casos, que se

sitúan sobre la

línea marcada

como Umbral 1

será muy alta, pero

también habrá un

elevado número de resultados falsos positivos (puntos verdes que se sitúan por

encima de la misma línea en la columna que corresponde al Grupo Control). Si,

por el contrario, adoptamos como nivel de decisión un valor alto los resultados

serán muy diferentes con pocos diagnósticos falsos positivos (puntos verdes

situados sobre la línea que marca el umbral 2) pero también con un descenso

muy fuerte en la fracción de diagnósticos verdaderos positivos (puntos rojos que

quedan por encima de la misma línea). Así pues, cuando las distribuciones de los

valores del biomarcador de enfermedad se solapan en los grupos de casos y

controles. La elección de un umbral de decisión que consiga la máxima eficacia

diagnóstica: Máxima probabilidad de acierto (Fracciones Verdadera Positiva y

Casos Control

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30

0.35

Umbral 1

Umbral 2

Figura 10. Influencia del umbral de decisión sobrelos porcentajes de aciertos VP y VN y fallos FP y FN

Unid

ades R

ela

tivas


- 141 -

Verdadera Negativa máximas) unido a la Mínima probabilidad de error es un

problema clínico frecuente que se resuelve mediante la obtención de sucesivos

pares de valores verdaderos positivos (Especificidad del test) y falsos positivos (1

– Sensibilidad del test), que se representa en un eje de coordenadas cartesianas

dando lugar a un curva que se denomina Curva ROC atendiendo a las siglas que

resultan de su denominación inglesa (Reciver Operator Characteristic Curve, ROC

curve).

Este método lo hemos empleado con las variables que en este trabajo han

resultado significativas (RE y 14-3-3-sigma) y con la combinación lineal de las

mismas tomadas conjuntamente a partir de la ecuación que surge de los

coeficientes de regresión logística encontrados (tabla 43). Una vez construidas las

tres curvas ROC posibles se calculó, por la regla del trapecio, el área bajo la curva

ROC para cada uno de los biomarcadores y para el discriminador lineal resultante

de la combinación de los mismos. Con este análisis se concluyó en la calidad

discriminante de los diferentes marcadores y de una combinación de ellos.

La ecuación lineal que resulta de la combinación de ambas variables es:

21 ·5.1·5.5 XXY

Donde Y es la variable dependiente; X1 la concentración del biomarcador

basado en la determinación cuantitativa de promotor del gen del Receptor de

estrógenos aberrantemente metilado y X2 la concentración del biomarcador

basado en la determinación cuantitativa de promotor del gen de 14-3-3-sigma

aberrantemente metilado. Así cada muestra (tanto de casos como de controles)

tendrá además de los valores de cada uno de los biomarcadores un valor

resultante de su combinación. La comparación de los resultados de casos y

controles y el cálculo de los índices de sensibilidad y especificidad que resultan

para sucesivos umbrales de decisión nos ha permitido para cada una de las

variables por separado, y para el discriminante de su combinación, medir la

calidad diagnóstica final empleando el área bajo la curva ROC. Los resultados de

ese cálculo figuran en la tabla 45.


- 142 -

Tabla 45. Área bajo la curva ROC para los dos biomarcadores y para su combinación línea

Variables contraste

Área

Error típico a)

Significación asintótica(b)

Intervalo de confianza asintótico al 95%

Límite inferior

Límite superior

RE

,655

,041

,000

,574

,735

14- 3- 3 sigma ,618 ,042 ,007 ,535 ,700

Combinación ,692 ,040 ,000 ,614 ,770

Las tres estimaciones del área bajo la curva ROC son significativamente

distintas de 0,5 (área de una curva ROC correspondiente a una variable que no

discrimina). Los valores de las áreas estimadas no son muy altos pero, aunque no

haya diferencias significativas, parece ligeramente más discriminante la que

corresponde a la variable RE que la que se obtienen utilizando la variable 14-3-3-

sigma y, desde luego, el área bajo la curva correspondiente a la combinación

lineal de ambas variables es mayor que las de las variables por separado.

Obsérvese que aún así el área bajo la curva ROC que resulta, es inferior al valor de

0,75 que se considera como el nivel mínimo necesario para que un test

diagnóstico sea calificado como bueno y por ello útil en clínica. Es así que el test

que en este trabajo hemos desarrollado para discriminar entre presencia y

ausencia de cáncer de mama en una mujer en particular, debe ser calificado como

pobre o de valor escaso. Sin duda que ampliar nuestro trabajo y encontrar otro

biomarcador que añadiera información a la ecuación combinatoria resultante

podría resolver mejor el problema de la discriminación y ayudarnos a conseguir

un mejor diagnóstico del cáncer de mama.

Los resultados obtenidos para las curvas ROC generadas se han incluido en la

figura 11. En ella se puede comprobar cómo la curva obtenida tras el cálculo del

discriminante combinado se sitúa por encima de las otras dos.


- 143 -

4.3.4. Sensibilidad y especificidad del test diagnóstico

Una vez demostrado que existen diferencias en los valores cuantitativos de los

biomarcadores: RE y 14-3-3-sigma, que están determinadas por la presencia, o la

ausencia, de enfermedad tumoral maligna, nos queda cuantificar cual es la valía

clínica del test diagnóstico que en este trabajo hemos aplicado sobre una amplia

serie de mujeres con cáncer de mama y de mujeres elegidas como control.

En efecto, los datos de concentración sérica de los biomarcadores estudiados

en este trabajo nos permiten calcular la especificidad y la sensibilidad del test. Y

la sensibilidad (S) y la especificidad (E) son los parámetros clínicamente

relevantes. Pero en este cálculo, la elección del umbral de decisión, para definir

como positivo o negativo el resultado, adquiere una importancia fundamental

puesto que a cada umbral de decisión se asocian valores de S y E. Por ello la

elección del mejor umbral debe hacerse atendiendo a criterios científicos. Para

Figura 11. Curva ROC.


- 144 -

ello es también posible acudir al análisis de las curvas ROC. Con este análisis se

determinó para los genes RE y 14-3-3-sigma el punto de corte que optimizaba los

valores de E y S atendiendo al parámetro de Likelihood Ratio.

Los datos de nuestro trabajo nos han permitido concluir que el valor de corte y

los índices de S y E, para el biomarcador RE, son:

Umbral de decisión = 0.02 Unidades Relativas (ng/ml de ADN patrón)

S = 82,4, 95% IC (71.8% - 90.3%)

E = 41,9, (95% IC 32.4% - 51.9%; likelihood ratio = 1,4

(las cifras se han redondeado a un decimal);

Para el biomarcador 14-3-3-sigma los mejores valores fueron:

Umbral de decisión = 0.05 Unidades Relativas (ng/ml de ADN patrón)

S = 75.7 (95% IC 64.3% - 84.9%)

E = 54.7 (95% IC 44.7% - 64.4%; likelihood ratio = 1.6

El objetivo ideal de este trabajo era conseguir un procedimiento diagnóstico

que permitiese identificar con certeza a las mujeres afectas de cáncer de mama y

que, al mismo tiempo, informase de la ausencia de enfermedad en las mujeres en

las que clínicamente la situación de salud era un hecho objetivo. De nuestros

resultados se desprende que los valores de Sensibilidad y Especificidad obtenidos

no responden a las exigencias que debe respetar un test diagnóstico aplicado a la

oncología clínica. En efecto, aun cuando tolerable la cifra correspondiente a la

fracción de diagnósticos en los que en presencia de la enfermedad, el test informa

positivamente este hecho (sensibilidad), el método de cuantificar la metilación

aberrante en los promotores de los genes RE y 14-3-3-sigma fracasa en identificar

como libres de enfermedad a una importante proporción de las personas que

hemos incluidos el grupo como controles (especificidad). Podemos por ello

ambos biomarcadores pueden definirse como aceptablemente sensibles pero, al

ser altamente inespecíficos, su utilidad en clínica es limitada.

Otra forma de abordar el problema es considerar que el diagnóstico de

presencia de enfermedad debe hacerse cuando uno, otro, o los dos


- 145 -

biomarcadores se encuentren elevados, mientras que la ausencia de enfermedad

debe considerarse cuando ambos biomarcadores se den resultados que

cuantitativamente se encuentren por debajo del punto de corte elegido.

Procediendo así hemos construido la tabla 46 en la que se resumen los datos

relevantes de este cálculo.

Tabla 46. Valores de Sensibilidad y Especificidad del test para el diagnóstico de cáncer de mama

usando RE y 14-3-3-sigma como biomarcadores

RE ó 14-3-3 Sigma

Cáncer mama

Controles Sanos

RE ó 14-3-3 Sigma

Cáncer mama

Controles Sanos

Enfermedad (+) +/- -/+ +/+

87a

33a

Enfermedad (+) +/+

39b

9b

Enfermedad (-) -/-

20a

41a

Enfermedad (-) +/- -/+ -/-

67b

65b

P < 0.0001

P = 0.0003

Sensibilidad = 81% (95% IC: 72-88) Sensibilidad = 37% (95% IC: 73-47)

Especificidad = 55% (95% IC: 40-67) Likelihood ratio = 1.82

Especificidad = 88% (95% IC: 78-94) Likelihood ratio = 3.03

De acuerdo con lo anterior hemos supuesto dos situaciones:

Situación 1: (zona izquierda de la tabla 46): El diagnóstico de enfermedad

tumoral presente (+) se hará cuando uno de los marcadores, u otro, o los dos

resultasen superiores a los umbrales elegidos (+/-, -/+, +/+) mientras que el

diagnóstico de enfermedad ausente se haría sólo cuando ambos biomarcadores

estuviesen por debajo del valor umbral (-/-). Del recuento de casos y controles

resulta la tabla de contingencia cuyos números están marcados por el subíndice

“a” y que hace máximo el valor de Sensibilidad diagnóstica. Esto es casi todos los

casos con enfermedad maligna de la mama serán correctamente diagnosticados

(S=88%) aun cuando una importante proporción de mujeres sin enfermedad

serán incorrectamente clasificadas como portadoras de cáncer de mama

(porcentaje de resultados falsos positivos FP = 100 – E = 45%).


- 146 -

Situación 2 (zona derecha de la tabla 46): Se hará el diagnóstico de

enfermedad tumoral presente sólo cuando ambos biomarcadores sean positivos

(+/+). Por el contrario se asignará el diagnóstico de ausencia de enfermedad

cuando uno, u otro o ambos biomarcadores sean negativos (+/-, -/+, -/-).

Procediendo así los números que definen la nueva tabla de contingencia están

incluidos en las cuadrículas del lado derecho de la Tabla 45 y han sido destacados

con el subíndice “b”. Esta nueva decisión diagnóstica permite llevar la

Especificidad a un nivel aceptable E= 88%. Esto equivale a decir que casi todas

las mujeres sin enfermedad serán correctamente diagnosticadas pero ese

incremento se produce a costa de fallar en el diagnóstico en un porcentaje muy

elevado de casos de cáncer (porcentaje de diagnósticos falsos negativos FN = 100

– Sensibilidad = 73%).

Añadamos al análisis anterior una condición importante que resulta de la

simple observación clínica: Para que un test de diagnóstico en cáncer sea eficaz,

el valor del biomarcador en el grupo de personas afectas de cáncer debe ser

superior al que se cuantifica en personas sin enfermedad y, además, en el caso de

que existan enfermedades tumorales benignas que afecten al mismo órgano, un

marcador tumoral ideal, debe distinguir también entre la presencia y la ausencia

de éstas, y los niveles que se cuantifiquen cuando existen tumores benignos

deberían permitir la diferenciación entre esta enfermedad tumoral y el cáncer. La

condición anterior es especialmente importante en la mama por cuanto que,

además de enfermedades tumorales malignas, la mama es asiento de frecuentes

patologías de carácter benigno. Para estudiar esta posibilidad hemos incluido en

nuestro trabajo un grupo de 36 mujeres afectas de tumoraciones mamarias de

carácter benigno en el que se han cuantificado los mismos biomarcadores que en

el grupo casos y en el grupo control. Los datos referentes a la posibilidad de

distinguir entre personas con enfermedades benignas y personas sin evidencia de

enfermedad tumoral mamaria alguna se han resumido en la tabla 47 y su lectura

e interpretación añade más dudas a la aplicabilidad de estos biomarcadores para

el diagnóstico del cáncer de mama.


- 147 -

Tabla 47. Valores de Sensibilidad y Especificidad del test cuando se compara el Grupo casos con

enfermedad tumoral benigna de la mama con el Grupo control

RE ó 14-3-3 Sigma

Patología Benigna mama

Controles Sanos

RE ó 14-3-3 Sigma


Controles Sanos

Enfermedad (+) +/- -/+ +/+

24

33

Enfermedad (+) +/+

9

9

Enfermedad (-) -/-

10

41

Enfermedad (-) +/- -/+ -/-

25

65

P < 0.0136 P = 0.09

Sensibilidad = 70% (95% CI: 53–85) No significación estadística

Especificidad = 55% (95% CI: 43–67)

4.4. CORRELACIÓN DEL PERFIL METILACIÓN DE ESR1 EN SUERO CON EL

SILENCIAMIENTO EXPRESIÓN DE RE EN TUMOR

De acuerdo a lo ya comentado en capítulos anteriores, la metilación

epigenética de la región promotora de un determinado gen, da lugar a la ausencia

transcripcional de este y por tanto a la falta de expresión proteica derivado de

ello o lo que es lo mismo su silenciamiento génico. Este hecho que podemos

conocer a través del análisis por PCR del ADN extraído a partir de muestras de

los pacientes, tiene una repercusión directa en la pieza tumoral. Es decir,

aquellas pacientes que tuviesen metilado el gen RE y por lo tanto este no se

expresara es decir estuviese silenciado, esto debería correlacionarse con la

ausencia de expresión de receptores estrogénicos en tumor lo que desde el punto

de vista terapéutico es importante conocer para aproximarnos desde una prueba

analítica a un futuro tratamiento hormonal en caso de estar presente en tumor

así como factor predictivo de respuesta.

Para conocer si en nuestra serie de casos se cumplen o no las hipótesis

anteriormente expuestas, se realizaron las siguientes pruebas estadísticas

mediante el test no paramétrico para dos muestras relacionadas de Wilconxon:


- 148 -

1. Se estudió la correlación de RE no metilado en suero con RE (+) en tumor

obteniendo el correspondiente valor para el estadístico de Z del test Wilconxon

junto con grado de significación P. De los resultados obtenidos para el estadístico

Z (-5.891) y valor P < 0.001, se puede deducir que existe correlación en la

hipótesis planteada y que esta es significativa. Por lo tanto en nuestra serie de

casos el tener el promotor de RE no metilado en suero se correlacionaba con la

presencia de RE positivo en tumor. No se obtuvo correlación entre RE no

metilado en suero y RE (+) en tumor como era de esperar de acuerdo a lo ya

explicado anteriormente (tabla 48).

2. Igualmente se analizó si existía correlación entre RE metilado en suero y

RE (-) en tumor de nuestra serie de casos. Tras aplicar el test de Wilconxon para

muestras apareadas se obtuvieron los valores de P < 0.03 y Z -3.873 que

apoyaban esta relación de forma significativa. Tampoco en este caso se observó

correlación entre RE metilado en suero y RE (-) en tumor como igualmente era de

esperar (tabla 48).

Tabla 48. Frecuencia de casos RE

Receptor Estrógenos

Metilado Suero

No Metilado Suero

RE (-) Tumor 15 12

RE (+) Tumor 37 33

RE No Metilado Suero

Nº

Casos Z P

RE (+) Tumor

33 -5.891 < 0.001

RE Metilado Suero

Nº

Casos Z P

RE(-) Tumor

15 -3.873 < 0.003

RE Metilado Suero

Nº

Casos Z P

RE (+) Tumor

37 0 1

RE No Metilado Suero

Nº

Casos Z P

RE (-) Tumor

12 0 1


- 149 -

Así mismo en este trabajo de investigación y partiendo del mecanismo de

silenciamiento de la expresión génica mediante metilación del promotor de ESR1,

quisimos correlacionar su silenciamiento epigenético de acuerdo al fenotipo

luminal y a partir de ella poder extraer conclusiones de la implicación y papel

predominante que tiene la metilación en dicho silenciamiento génico en el tumor.

Para ello aplicamos el test no paramétrico para dos muestras relacionadas de

Wilconxon.

De los resultados obtenidos, observamos un mayor porcentaje de metilación

del promotor de RE en aquellos fenotipos de peor pronóstico concretamente el

80% de las pacientes triple negativas y 60% de las pacientes HER2 frente al 28%

y al 5.9% de las pacientes con fenotipos de mejor pronóstico como Luminal A y

Luminal B respectivamente con p < 0.05 (tabla 49).

Tabla 49. Porcentaje de metilación RE de acuerdo con el fenotipo luminal

RE LUMINAL

A LUMINAL

B TRIPLE

NEGATIVO HER2(+) P

NO METILADO 28

(71%)

14

(64%)

3

(20%)

4

(40%)

<< 00..0055

METILADO 11

(28%)

8

(36%)

12

(80%)

6

(60%)

<< 00..0055

A partir de estos datos analizamos si dentro de cada fenotipo luminal podrían

existir subgrupos de pacientes de acuerdo con el perfil de metilación que pudiera

explicar en parte por qué en algunos casos a pesar de pertenecer a un fenotipo de

buen pronóstico acaban desarrollando metástasis a distancia. Observamos que

dentro de cada subgrupo de acuerdo al estado de metilación de RE en suero,

existía una tendencia a presentar menor supervivencia a 4.5 años de seguimiento

en cada fenotipo cuando RE estaba metilado frente a cuando estaba no metilado,

aunque estas diferencias no fueron significativas (tabla 50).


- 150 -

Tabla 50. Diferencias de presentación de metilación aberrante RE por subgrupos dentro del fenotipo luminal

FENOTIPO Nº SG 4.5 años P

RE NO

METILADO luminal A 28 93% >0.05

luminal B 14 92% >0.05

Triple Negativo 3 80% >0.05

Her2 4 75% >0.05

RE

METILADO luminal A 11 81,8% >0.05

luminal B 8 86% >0.05

Triple Negativo 12 75% >0.05

Her2 6 66,7% >0.05

A la vista de estos resultados en nuestra serie de casos probablemente la

metilación deba ser considerada como un factor pronóstico más que considerar

en la práctica clínica diaria si bien son necesarios más estudios prospectivos para

validar esta hipótesis.

4.5. VARIACIÓN DEL PERFIL DE METILACIÓN PRE Y POST-TRATAMIENTO

En este apartado del trabajo de investigación realizado, analizamos si existían

diferencias entre los resultados analíticos obtenidos por PCR cuantitativa de los 5

genes estudiados antes y después del tratamiento. Con este cálculo se pretendía

responder a la hipótesis de si conforme la paciente se fuese sometiendo a

distintos tratamientos oncológicos, esto repercutiría en una menor cuantificación

proteica derivada de cada uno de los genes por PCR cuantitativa como signo de la

menor presencia de ADN procedente de células tumorales y por lo tanto

indirectamente relacionarse con una evolución favorable o viceversa. Para ello

aplicamos el test no paramétrico para pruebas apareadas de Wilconxon con el

que no se observaron diferencias estadísticamente significativas.


- 151 -

No obstante al calcular el estudio descriptivo para comparar las distintas

medianas de cada gen antes y después de administrados los diferentes

tratamientos así como el percentil 75 mediante el empleo de un diagrama de

cajas y vigotes, se observó en todos los genes una menor cuantificación proteica

al analizar las muestras post-tratamiento respecto a las muestras pre-tratamiento

aunque de escasa magnitud. Probablemente una tendencia más marcada del

descenso de estos biomarcadores en muestras sanguíneas podría haberse

obtenido si dicha determinación hubiese sido realizada transcurridos varios

meses de finalizado el tratamiento (tabla 50 y representación gráfica figura 12).

Tabla 50. Perfil de metilación Pre y Pos-tratamiento

Pre-tratamiento

M S ẋ P 75% IC 95%

APC 0,012 0,040 0,026 0,036 0,03-0.01

E-Cad 0,000 0,045 0,024 0,030 0,03-0,01

14-3-3 0,047 0,108 0,082 0,119 0,10-0,05

Rar-β 0,0001 0,051 0,023 0,027 0,03-0,01

R. E. 0,009 0,049 0,031 0,044 0,02-0,04

Post-tratamiento

M S ẋ P 75% IC 95%

APC 0,001 0,082 0,025 0,020 0.04-0.003

E-Cad 0.000 0,048 0,019 0,015 0,03-0.006

14-3-3 0,038 0,096 0,075 0,125 0.10-0.048

Rar-β 0.000 0,038 0,017 0,023 0.02-0.007

R. E. 0,003 0,062 0,031 0,027 0,04-0,014

ẋ*: media. M: mediana


- 152 -

Figura 12. Representación niveles de metilación de los genes pre y postratamiento.


- 153 -

4.6. ESTUDIO DE LA CORRELACIÓN DE LAS VARIABLES CLÍNICO-

PATOLÓGICAS CON EL PERFIL DE METILACIÓN DE LOS GENES RE, 14-3-3

SIGMA, E-CADHERINA, APC Y RAR- BETA

En este apartado hemos realizado un análisis descriptivo de las variables

clínico-patológicas del tumor con el perfil epigenético de los promotores de los 5

genes analizados para conocer sus frecuencias de presentación y estudiar si

existe o no relación estadísticamente significativa entre ellas. Para ello se realizó

aplicó el test estadístico de Chi-cuadrado con la corrección de Yates.

De los resultados obtenidos se observó que se obtuvieron niveles más

elevados de metilación aberrante para el gen 14-3-3 sigma en aquellas pacientes

que tenían mayor afectación ganglionar y mayor tamaño del tumor con resultado

estadísticamente significativo. Para el resto de variables clínico-patológicas no se

observó relación estadísticamente significativa (tabla 51).

Tabla 51. PROMOTORES GENES METILADOS

RE APC E-Cad. RAR-β 14-3-3 SIGMA

Factores Clínico Patol.

+ - + - + - + - + -

Edad Diagnóstico

≤ 35 años > 35 años

P

54 2

49 2 0.67

3

56

1 47 0.76

3 43

1 60 0.42

1 40

3 63 0.97

2 62

2 41 0.911

Edad Menarquia

< 12 años ≥13 años

P

29 26

24 27 0.69

33 26

20 27 0.27

24 21

29 32 0.69

22 19

31 34 0.69

33 30

20 23 0.629

Edad Menopausia

< 45 años ≥ 45 años

P

35 1

37 2 0.94

36 1

36 2 0.98

30 3

42 0 0.16

26 1

46 2 0.60

39 2

33 1 0.868

Estado Menopáusico

Premenop. Postmenop.

P

21 35

12 39 0.17

23 36

10 38 0.07

14 32

19 42 0.89

15 26

18 48 0.42

24 40

9 34 0.108

Grado diferenciación

GI GII- III

P

11 40

10 34 0.91

11 42

10 32 0.91

10 31

11 43 0.82

9 26

12 48 0.69

13 43

8 31 0.951

Continúa en página siguiente


- 154 -

PROMOTORES GENES METILADOS

RE APC E- Cadher. RAR-β 14-3-3 SIGMA

Factores Clínicopat. + - + - + - + - + -

Estadio Tumor

T1 T2

T3-4 P

30 22 4

32 16 3 0.63

37 20 2

25 18 5 0.27

24 19 3

38 19 4 0.36

27 12 2

35 26 5 0.42

26 7 2

36 31 5 <0.05

Estadio Ganglionar

N0 N1 N2 P

36 17 3

32 15 4 0.87

40 16 3

28 16 4 0.56

32 12 2

36 20 5 0.49

28 10 3

40 22 4 0.61

47 14 4

21 18 3 <0.05

Metástasis M0 M1 P

51 5

43 8 0.43

52 7

42 6 0.84

38 8

56 5 0.25

37 4

57 9 0.76

56 8

38 5 0.867

Cerb2 + - P

12 41

7 37 0.56

11 43

8 35 0.96

7 36

12 42 0.63

10 26

9 52 0.19

13 43

6 34 0.461

P53 + - P

23 28

21 23 0.96

23 29

21 22 0.80

21 21

23 30 0.66

15 18

29 33 0.92

29 25

15 26 0.147

QT Si No P

40 16

28 23 0.11

41 18

27 21 0.22

32 14

36 25 0.09

26 15

42 24 0.85

41 23

27 16 0.943

RT Si No P

47 9

49 2 0.08

54 5

42 6 0.71

41 5

55 6 0.88

37 4

59 7 0.85

56 8

40 3 0.550

HT Si No P

45 10

38 12 0.62

46 13

37 9 0.94

35 11

48 11 0.67

32 8

51 14 0.95

48 16

35 6 0.304


- 155 -

4.7. ANÁLISIS DE SUPERVIVENCIA

4.7.1. Análisis univariante de los factores pronósticos clínico-patológicos

relacionados con la supervivencia libre de enfermedad

Los datos a 6 años resultantes de la estimación de supervivencia libre de

enfermedad (SLE), en relación con los distintos factores pronósticos en el cáncer

de mama conocidos hasta hoy día tales como; edad <35 años, estado de

menopausia, tamaño tumoral, afectación ganglionar, grado de diferenciación

histológica, receptores hormonales, p53, estado del Cerb2 y triple negativas se

presentan a continuación.

En todos los casos se ha aplicado el procedimiento de cálculo de supervivencia

actuarial mediante el método de Kaplan-Meier así como el test de log-rank para

valorar si las diferencias encontradas entre las curvas de supervivencia poseen o

carecen de significación estadística.

Edad: La SLE a 6 años fue del 50% en el grupo de pacientes menores a 35

años y del 87.80% para las mayores de 35 años. Estas diferencias observadas

fueron significativas. (p= 0.03). Figura 13.


- 156 -

Supervivencia libre de enfermedad

SLE meses

8070

6050

4030

2010

0

Supe

rviv

enci

a ac

umul

ada

1,1

1,0

,9

,8

,7

,6

,5

,4

EDAD MENOR 35 AÑOS

edad < 35 años

edad < 35 años -censurado

edad > 35 años

edad > 35 años

-censurado

Edad de la menarquía: La SLE a 6 años fue del 89.20% en el grupo de

pacientes con edad de la menarquía mayor o igual a 12 años y del 82.63% para

las pacientes con edad de la menarquía menor a 12 años. Estas diferencias

observadas no fueron significativas (p= 0.3504).

Estado de la menopausia: La SLE a 6 años en las pacientes

premenopáusicas fue del 83.78% y del 87.18% en las pacientes

postmenopáusicas. Estos resultados fueron estadísticamente no significativos (p=

0.6877).

Tipo histológico: Con resultados de supervivencia a 6 años se encontró

que la SLE para los carcinoma ductales infiltrantes fue del 84.69%, para los

lobulillares infiltrantes del 88.89% y del 88.21% para el resto de histologías. Las

diferencias observadas no fueron significativas (p= 0.7468).

Figura 13. SLE en función de la edad.


- 157 -

Grado de diferenciación histológica: La SLE a los 6 años en las pacientes

con buen grado de diferenciación histológico fue del 94.74 y 83.50 para aquellas

con grado de diferenciación moderado o mal diferenciado. Los tumores en los que

no se determinó el grado histológico se analizaron como una categoría

independiente obteniendo una SLE del 75%. Las diferencias observadas no

fueron estadísticamente significativas (p=0.4137).

Tamaño tumoral: La SLE a 6 años para las pacientes con tumores ≤ 2 cm

(T1) fue del 89.16%, para tumores entre 2 y 4 cm (T2) del 81.86% y para

tumores ≥ 5 cm (T3) o con infiltración en dermis (T4) fue del 80%. Las

diferencias encontradas no fueron estadísticamente significativas (p= 0.6751).

Afectación ganglionar: Respecto al número de ganglios afectos, los

resultados de SLE a los 6 años fueron del 92.50% en el grupo sin afectación

ganglionar, del 79.34% en el grupo de pacientes que presentaron de 1-3 ganglios

afectos y del 50% para las pacientes que tenían 4 o más ganglios afectos. Dichas

diferencias fueron estadísticamente significativas (p= 0.0008). Figura 11.

Supervivencia libre de enfermedad

SLE meses

80706050403020100

Supe

rvive

ncia

acum

ulada

1,2

1,0

,8

,6

,4

,2

Estadio ganglionar

N2

N2-censurado

N1

N1-censurado

N0/Nx

N0/Nx-censurado

Figura 14. SLE en función de afectación ganglionar.


- 158 -

Estado del receptor hormonal: La SLE a 6 años para pacientes que

expresaban receptores hormonales (RH) en el tumor fue del 88.75%, mientras

que aquellas que presentaban receptores hormonales negativos fue del 77.01%.

El grupo de pacientes con RH desconocidos fue analizado de forma independiente

obteniéndose una SLE del 85.71%. Dichas diferencias no fueron estadísticamente

significativas (p=0.2777).

Estado del Cerb2: Las pacientes Cerb2 negativo tuvieron un ILE a 6 años

del 86.88% mientras que en aquellas pacientes con Cerb2 positivo fue del 89.47%

sin alcanzar significación estadística (p= 0.8565).

Estado del p53: La SLE a 6 años para pacientes con P53 positivo en el

tumor fue del 73.99%, mientras que aquellas que presentaban P53 negativo fue

del 95.61%. El grupo de pacientes con P53 desconocido fue analizado de forma

independiente obteniéndose una SLE del 88.89%. Las diferencias encontradas

fueron estadísticamente significativas (p=0.0145). Figura 15.

Supervivencia Libre Enfermedad

SLE meses

8070

6050

4030

2010

0

Supe

rvive

ncia

acum

ulada

1,1

1,0

,9

,8

,7

P53 POSITIVO/NEGATIV

NO INDICADO

NO INDICADO-censurad

o

P53 POSITIVO

P53 POSITIVO

-censurado

P53 NEGATIVO

P53 NEGATIVO

-censurado

Figura 15.SLE en función de expresión de p53.


- 159 -

Triple negativo: La SLE a 6 años para pacientes no triple negativas fue del

89.74%, mientras que aquellas que no fueron triple negativas fue del 65%. Las

diferencias fueron estadísticamente significativas p= 0.0009 (figura 13).

Supervivencia Libre de Enfermedad

SLE meses

80706050403020100

Supe

rvive

ncia

acum

ulada

1,1

1,0

,9

,8

,7

,6

TRIPLE NEGATIVAS

si

si-censurado

no

no-censurado

QT Adyuvante: Respecto a la SLE a 6 años para las pacientes que

recibieron QT fue del 80.17% frente al 96.55% para aquellas pacientes que no

recibieron QT. Estas diferencias fueron estadísticamente significativas p= 0.029.

Este resultado casa con ser mujeres con factores de mal pronóstico las que

reciben QT y no aquellas con factores de buen pronóstico (figura 14).

Figura 13.SLE en función de fenotipo luminal


- 160 -


SLE meses

80706050403020100

Supe

rvive

ncia

acum

ulada

1,1

1,0

,9

,8

,7

QT

SI

SI-censurado

NO

NO-censurado

RT Adyuvante: En cuanto a SLE a 6 años y haber o no recibido RT, fue de

un 90.91% para aquellas pacientes que realizaron RT y de un 85.55 para las que

no recibieron RT. Las diferencias no fueron significativas p= 0.8425.

HT Adyuvante: Respecto a la SLE a 6 años para las pacientes que

recibieron HT fue del 90.13% frente al 71.08% para aquellas pacientes que no

recibieron HT. Estas diferencias fueron estadísticamente significativas p= 0.020

(figura 15).

Figura 14. SLE en función de administración de QT.


- 161 -


SLE meses

8070605040302010

Supe

rvive

ncia

acum

ulada

1,1

1,0

,9

,8

,7

HORMONOTERAPIA

SI

SI-censurado

NO

NO-censurado

De los resultados obtenidos en nuestra serie, podemos decir que con una SLE

media de 51 meses, el grupo de pacientes que presentó menor intervalo de

tiempo a la recaída fueron aquellas pacientes con edad de presentación del tumor

menor a 35 años, edad de la menarquia menor a 12 años, con tumores con

estadio T3-T4 con grado de diferenciación histológica GII-III e

inmunohistoquímica triple negativas, con afectación ganglionar y P53 positivo.

De todos estos factores clínico patológicos se alcanzó la significación estadística

en el caso de edad menor a 35 años, afectación ganglionar, triple negativas y P53

positivas.

4.7.2. Análisis univariante de los niveles de metilación de los genes RE y

14-3-3-sigma en relación con la supervivencia libre de enfermedad

Del estudio estadístico respecto a la SLE y al perfil de metilación aberrante

para los promotores de los genes RE y 14-3-3 Sigma, no se observaron diferencias

estadísticamente significativas respecto a la supervivencia libre de enfermedad

Figura 15.SLE en función de administración de HT.


- 162 -

aunque sí una leve tendencia a menor SLE en aquellos donde estaban metilados

sin alcanzar significación estadística.

Receptor Estrogénico metilado positivo/ negativo: La SLE a 6 años

para pacientes con Receptor de estrógenos (RE) metilado positivo en suero de las

pacientes fue del 86%, mientras que aquellas que presentaban RE no metilado fue

del 87%. Las diferencias encontradas no fueron estadísticamente significativas

(p=0.9565).

14-3-3 Sigma metilado positivo/ negativo: Respecto a la SLE a 6 años

para 14-3-3 Sigma metilado positivo en suero fue del 89.80% y para aquellas con

14-3-3 Sigma metilado negativo fue de un 83.71%. Las diferencias tampoco

fueron significativas p= 0.4371.

4.7.3. Análisis univariante de los factores pronósticos clínico-patológicos

relacionados con la supervivencia global de cáncer de mama

Al igual que se realizó el estudio de supervivencia libre de enfermedad de

acuerdo con los distintos factores clínico-patológicos del cáncer de mama

utilizados en clínica, también se analizaron los datos a 6 años resultantes de la

estimación de supervivencia global (SG). Los resultados se presentan a

continuación.

En todos los casos se ha aplicado el procedimiento de cálculo de supervivencia

actuarial mediante el método de Kaplan-Meier así como el test de log-rank para

valorar si las diferencias encontradas entre las curvas de supervivencia poseen o

carecen de significación estadística.

Edad: La SG a 5 años fue del 86.76% en el grupo de pacientes mayores a

35 años y del 75% para las pacientes menores de 35 años. Estas diferencias



- 163 -

Edad de la menarquía: La SG a 5 años fue del 91.30% en el grupo de

pacientes con edad de la menarquía mayor o igual a 12 años y del 83% para las

pacientes con edad de la menarquía menor a 12 años. Estas diferencias


Estado de la menopausia: La SG a 6 años en las pacientes

premenopaúsicas fue del 93.74% y del 82.90% en las pacientes

postmenopáusicas. Estos resultados fueron estadísticamente no significativos (p=

0.1836).

Tipo histológico: Con resultados de supervivencia a 6 años se encontró

que la SG para los carcinoma ductales infiltrantes fue del 86.91%, para los

lobulillares infiltrantes del 77.78% y del 87.69% para el resto de histologías. Las

diferencias observadas no fueron significativas (p=0.6700).

Grado de diferenciación histológica: La SG a los 6 años en las pacientes

con grado de diferenciación histológico bueno fue del 100% y del 83.12% para

aquellas con grado de diferenciación moderado o mal diferenciado. Los tumores

en los que no se determinó el grado histológico se analizaron como una categoría

independiente obteniendo una SG del 83.33%. Las diferencias observadas no


Tamaño tumoral: La SG a 6 años para las pacientes con tumores ≤ 2 cm

(T1) fue del 91.71%, para tumores entre 2 y 4 cm (T2) del 86.51% y para

tumores ≥ 5 cm (T3) o con infiltración en dermis (T4) fue del 42.86%. Las

diferencias encontradas fueron estadísticamente significativas (p= 0.0002).

Figura 16.


- 164 -

Supervivencia Global

SG MESES

80706050403020100

Supe

rvive

ncia

acu

mul

ada

1,1

1,0

,9

,8

,7

,6

,5

,4

Estadio T

T3-T4

T3-T4-censurado

T2

T2-censurado

Tx-T1

Tx-T1-censurado

Afectación ganglionar: Respecto al número de ganglios afectos, los

resultados de SG a los 6 años fueron del 95.57% en el grupo sin afectación

ganglionar, del 83.25% en el grupo de pacientes que presentaron de 1-3 ganglios

afectos y del 19% para las pacientes que tenían 4 ó más ganglios afectos. Dichas

diferencias fueron estadísticamente significativas (p=0.001). Figura 17.

Figura 16. SG en función de estadio T.


- 165 -


SG MESES

80706050403020100

Supe

rvive

ncia

acu

mul

ada

1,2

1,0

,8

,6

,4

,2

0,0

Estadio Ganglionar

N2

N2-censurado

N1

N1-censurado

N0/Nx

N0/Nx-censurado

Estado del receptor hormonal: La SG a 6 años para pacientes que

expresaban receptores hormonales (RH) en el tumor fue del 87.27%, mientras

que aquellas que presentaban receptores hormonales negativos fue del 81.06%.

El grupo de pacientes con RH desconocidos fue analizado de forma independiente

obteniéndose una SG del 90%. Dichas diferencias no fueron estadísticamente

significativas (p=0.7284).

Estado del Cerb2: Las pacientes Cerb2 negativo tuvieron un SG a 6 años

del 85.23% mientras que en aquellas pacientes con Cerb2 positivo fue del 89.47%

sin alcanzar significación estadística (p= 0.8565).

Estado del p53: La SG a 6 años para pacientes con P53 positivo en el

tumor fue del 76.30%, mientras que aquellas que presentaban P53 negativo fue

del 93.37%. El grupo de pacientes con P53 desconocido fue analizado de forma

Figura 17.SG en función del estadio N.


- 166 -

independiente obteniéndose una SG del 91.67%. Las diferencias encontradas no


Triple negativo: La SG a 6 años para pacientes con triple negativas fue del

76.15%, mientras que aquellas que no fueron triple negativas fue del 87.58%. Las

diferencias no fueron estadísticamente significativas p= 0.1979.

De los resultados obtenidos en nuestra serie, podemos decir que con una SG

media de 52.6 meses, el grupo de pacientes que presentó mayor supervivencia

global fue aquellas pacientes con edad de presentación del tumor mayor a 35

años, edad de la menarquia mayor a 12 años, con tumores con estadio T1, bien

diferenciados sin afectación ganglionar, con RH positivos y P53 negativo. De

todos estos factores clínico patológicos sólo se alcanzó la significación estadística

en el caso de la afectación ganglionar y tamaño tumoral.

Presencia de metástasis: Respecto a la SG a 6 años para las pacientes que

recayeron fue del 93.19% frente al 32.05% para aquellas pacientes que

presentaron metástasis a lo largo del seguimiento. Estas diferencias fueron

estadísticamente significativas p= 0.001 (figura 18).


- 167 -


SG MESES

80706050403020100

Supe

rviv

enci

a ac

umul

ada

1,1

1,0

,9

,8

,7

,6

,5

,4

,3

METASTASIS

si

si-censurado

no

no-censurado

QT Adyuvante: La SG a 6 años respecto a aquellas paciente que recibieron

QT fue del 83.17% frente a aquellas que no recibieron QT con un 92.31%. Las

diferencias fueron no significativas p= 0.3417.

RT Adyuvante: En cuanto a SG a 6 años y haber recibido RT, fue de un

89.22% para aquellas pacientes que realizaron RT y de un 62.34 para las que no

recibieron RT. Las diferencias fueron significativas p= 0.0114. Este resultado se

explica porque la mayoría de las pacientes que no recibieron RT fue por

habérseles practicado mastectomía por tratarse de tumores con T elevado (figura

19).

Figura 18. SG en función del estadio M.


- 168 -


SG MESES

80706050403020100

Supe

rviv

enci

a ac

umul

ada

1,1

1,0

,9

,8

,7

,6

RT

SI

SI-censurado

NO

NO-censurado

HT Adyuvante: Respecto a la SG a 6 años para las pacientes que

recibieron HT fue del 89.85% frente al 80.74% para aquellas pacientes que no

recibieron HT. Estas diferencias no fueron estadísticamente significativas p=

0.2295.

Figura 19.SG en función de administración de RT.


- 169 -

Tabla resumen resultados SLE y SG:

SLE a 6 años SG a 6 años

Factores Clínico-patl.

% IC 95% P % IC 95% P

Edad diagnóstico ≤ 35 años > 35 años

50 87.80

(81-94.6) (45-55)

0.033

86.76 75

(70.8-79.2) (79.65-93.96)

0.512

Edad menarquia < 12 años ≥13 años

82.63 89.20

(71.43-93.83) (80-98.4)

0.3504

83 91.30

(72.07-94.07) (82.9-99.7)

0.237

Estado menopáusico Premenopausia Postmenopausia

83.78 87.18

(70.34-97.22) (78.58-95.78)

0.6877

93.74 82.90

(85.34-102.1) (73.28-92.5)

0.183

Grado de diferenciación No indicado GI GII- III

75 94.74 83.50

(84.54-100) (74.5-92.5)

0.4137

83.33 100 83.12

(63.33-103.3) (73.72-92.52)

0.156

Estadio Tumor (T) T1 T2 T3-4

89.16 81.86 80

(80.76-97.57) (68.46-95.26) (40-100)

0.6751

91.97 86.51 42.86

(83.51-99.91) (75.31-97.71) (39.26-46.46)

0.002

Estadio Ganglionar (G) N0 N1 N2

92.50 79.34 50

(85.3-99.7) (64.34-94.34) (46-54)

< 0.001

95.57 83.25 19

(90.57-100.57) (69.68-96.85) (15.85-22.25)

0.001

RH Suero No Indicados + -

85.71 88.75 77.01

(83.11-88.31) (80.75-96.75) (59.01-05.01)

0.2777

90 94.65 81.06

(15.85-108.8) (90.57-100.57) (69.68-96.64)

0.728

Cerb2 + -

89.47 86.98

(75.47-103.7) (79.14-94.62)

0.8565

89.47 85.23

(75.47-103.47) (76.43-94.03)

0.856

P53 No indicados + -

88.89 73.99 05.61

(68.89-100) (59.59-88.39) (89.61-100)

0.0145

91.67 76.30 93.37

(75.87-107.4) (85.97-100.7) (62.1-90.5)

0.08

Triple (-) + -

60.58 89.64

(34.58-86.58) (82.96-96.96)

0.0009

76.15 87.55

(52.15-100) (80.18-94.98)

0.197

HT + -

90.13 71.08

(83.13-97.13) (51.08-91.08)

0.020

89.85 80.74

(82.45-97.25) (63.34-98.14)

0.229


- 170 -

4.7.4. Análisis univariante de los niveles de metilación de los genes RE y 14-

3-3-sigma en relación con la supervivencia global de cáncer de mama

Con respecto al estudio estadístico respecto a la SG y al perfil de metilación

aberrante para los promotores de los genes RE y 14-3-3 Sigma, no se observaron

diferencias estadísticamente significativas respecto a la supervivencia global al

aplicar el método de libre de enfermedad aunque sí una leve tendencia a menor

SG en aquellos casos donde se encontraron niveles más elevados de metilación

aberrante sin alcanzar significación estadística.

Receptor Estrogénico metilado positivo/ negativo: La SG a 6

años para pacientes con Receptor de estrógenos (RE) metilado positivo

en suero de las pacientes fue del 86.77%, mientras que aquellas que

presentaban RE no metilado fue del 85.63%. Las diferencias

encontradas no fueron estadísticamente significativas (p=0.9341).

14-3-3 Sigma metilado positivo/ negativo: Respecto a la SG a 6

años para 14-3-3 Sigma metilado positivo en suero fue del 88.33% y

para aquellas con 14-3-3 Sigma metilado negativo fue de un 82.66%.

Las diferencias tampoco fueron significativas p=0.4183.

4.7.5. Modelo de regresión multivariante de COX

En cuanto al riesgo de muerte en nuestra serie de casos se asoció de forma

estadísticamente significativa con la edad al diagnóstico menor a 35 años.

Aquellas pacientes con edad al diagnóstico menor a 35 años tienen 34 veces más

riesgo de muerte por cáncer que aquellas pacientes con edad al diagnóstico

mayor a 35 años, p= 0.039.

El estado menopáusico se relacionó de forma significativa con el riesgo de

muerte con un riesgo relativo 20 veces superior para aquellas pacientes que

fuesen pre-menopáusicas en el momento del diagnóstico frente a aquellas que

fuesen post-menopáusicas, p= 0.023.


- 171 -

El tamaño tumoral fue otro de los factores pronóstico con el que se relacionó el

riesgo de muerte, siendo éste 15 veces superior al observado en el grupo de

pacientes con T3-T4 frente a T1 con valor p=0.007. No se encontraron diferencias

estadísticamente significativas entre T2 y T1.

El grado de afectación ganglionar también influyó de forma significativa en

nuestra serie en el riesgo relativo de muerte siendo 14 veces superior en el

subgrupo de pacientes con afectación ganglionar N2 frente a N0, p=0.016. No se

observaron diferencias significativas cuando el número de ganglios afectos era de

1 a 3 frente a ningún ganglio afecto.

El resto de variables analizadas; estado Cerb2, P53, Receptores Hormonales,

Grado Histológico y niveles de metilación aberrante de RE y 14-3-3 Sigma no se

asociaron de forma estadísticamente significativas con el riesgo de muerte (tabla

52).


- 172 -

Tabla 52. Resultado del análisis multivariante para el riesgo de muerte

P RR Error Estándar

Edad diagnóstico ≤ 35 años > 35 años

0.039 34.17 1.71

Estado menopáusico Pre-menopáusica Post-menopáusica

0.023 20.9 1.33

Estadio Tamaño Tumoral T1 T2 T3

0.364 0.007

2.4 15

0.966 1.012

Estadio Ganglionar N1 N2 N3

0.959 0.016

1.04 14

0.912 1.100

Grado Histológico GI GII/III

0.244

0.262

1.150 Estado de RH (-) (+)

0.995 0 0.010

Estado Cerb2 (+) (- )

0.291 7.264 1.876

P53 tumor (+) (- )

0.967 12.9 11.7

RE Metilado (+) (-)

0.842 1.189 0.870

14-3-3 Sigma Metilado (+) (-)

0.168 0.317 0.833

DISCUSIÓN

Joaquina Martínez-Galán Discusión

- 175 -

5. DISCUSIÓN

5.1. DIAGNÓTICO PRECOZ EN EL CÁNCER DE MAMA. JUSTIFICACIÓN

5.1.1. Despistaje del cáncer de mama mediante las técnicas actuales. Sus

ventajas, limitaciones, costes y riesgos

El cáncer de mama continúa siendo el tipo de cáncer que con más frecuencia se

diagnóstica entre las mujeres de todo el mundo. En efecto, en este sector de

población la causa más frecuente de muerte específica por cáncer. Cada año se

diagnostican más de 1-2 millones de casos nuevos de cáncer de mama lo que

representa que el cáncer de mama lo padecerá aproximadamente un 10-12% de la

población femenina mundial. Si a estos datos añadimos que la cifra global de

muertes que se producen por cáncer de mama es aproximadamente de 500.000

muertes al año y que se está observando un aumento de la incidencia de nuevos

casos en edades comprendidas entre los 35 a 39 años, la perspectiva de que nos

encontremos ante un importante problema de salud pública a nivel mundial hace

necesario que se busquen métodos de cribado poblacional que hagan posible que

el diagnóstico precoz permita alcanzar mayores tasas de supervivencia y un mejor

pronóstico de la enfermedad [5].

Actualmente se dispone de un importante despliegue de medios y técnicas de

imagen que puestas al servicio de las campañas de detección precoz del cáncer de

mama a nivel poblacional asisten como población de riesgo incluso al estudio de

determinadas mujeres que puedan presentar una mayor probabilidad de

desarrollar cáncer de mama ligado a la herencia familiar. Todo ello ha permitido

divulgar y concienciar a la población global para participar en las campañas de

“screening” con la consiguiente repercusión en alcanzar un diagnóstico más

temprano y en definitiva una mejora en el pronóstico de la enfermedad. Se estima

que gracias al cribado poblacional del cáncer de mama la mortalidad derivada de

su diagnóstico se ha reducido en aproximadamente un 20-15% de los casos. Sin

embargo y a pesar de ello los programas de “screening” tienen importantes

limitaciones como es el hecho de que actualmente alrededor de un 32% de los


- 176 -

casos de cáncer de mama se siguen diagnosticando en estadios localmente

avanzados y un 6% en estadio metastásico donde la enfermedad no es curable

[382].

Entre las técnicas que habitualmente se emplean en el diagnóstico precoz del

cáncer de mama se incluyen fundamentalmente la autoexploración y exploración

de la mama por el clínico y la mamografía como una de las técnicas que han

supuesto una mayor aportación en los programas de cribado poblacional. Hoy

sabemos que el diagnóstico del cáncer de mama en etapas tempranas de la

enfermedad por medio de técnicas de imagen como la mamografía con una

sensibilidad global para el diagnóstico de la enfermedad situada en torno al 75%

de los casos, ha demostrado en diferentes estudios aleatorizados realizados en

población sana, un impacto positivo en la reducción del número de muertes por

cáncer de mama especialmente en mujeres con edades comprendidas entre los 50-

69 años siendo algo menor su beneficio en mujeres con edades entre los 40-49 ó

mujeres mayores a 70 años de edad. Sin embargo aunque la mamografía es una

prueba de imagen razonablemente sensible para el diagnóstico precoz en mujeres

postmenopáusicas, en el caso de mujeres más jóvenes su sensibilidad desciende de

forma significativa al igual que sucede en aquellas mujeres que tienen una

predisposición genética al desarrollo del cáncer de mama en las que la enfermedad

suele presentarse en edades más tempranas y con mayor índice de proliferación

celular que en la población general. Este hecho que parece estar relacionado con la

mayor densidad del parénquima mamario que presenta la glándula mamaria de las

mujeres premenopáusicas, puede ocultar los signos y matices radiológicos

característicos que permiten el diagnóstico de un tumor dificultando así su

visualización en los momentos iniciales de la enfermedad. En particular en el

cáncer de mama asociado con mutaciones del gen BRCA (concretamente BRCA1) es

frecuente la presentación de una imagen mamográfica con un aspecto radiológico

ambiguo y que en ocasiones puede confundirse con el de una patología benigna de

la mama. Esto, que ha dado lugar a falsos negativos, es una fuente de error

conocida que debe ser considerada para examinar cuidadosamente estas

imágenes.


- 177 -

Unida a esta limitación, la mamografía tampoco está exenta de un porcentaje

nada desdeñable de falsos positivos que aunque en términos generales son

resultados que pueden ser esperados y que son asumidos por la población de

mujeres que aceptan participar en los programas de “screening”, no deja de

generar un cierto estado de ansiedad y preocupación así como ocasionar que se

pongan en marcha otras técnicas diagnósticas para intentar confirmar –o

descartar- el diagnóstico. No se puede dejar de tomar en consideración que

cualquier inseguridad en el diagnóstico que obliga a la realización de nuevas

pruebas lo que ocasiona gastos que se deberían evitar en la medida de lo posible.

La cifra de falsos positivos que según los datos estadísticos publicados podría

variar ampliamente entre un 0.7% a un 17% de los casos (6.5% como promedio),

probablemente esté en relación con la existencia de diferencias en las políticas de

actuación de los programas de cribado poblacional en los que la mamografía puede

estar, o no, asociada a otros medios diagnósticos complementarios con lo que se

disminuye el porcentaje de error al definir de forma más precisa si el hallazgo

radiológico es compatible con malignidad o por el contrario si el diagnóstico más

probable es el de lesión benigna [383]. Incluso se ha descrito que en aquellas

mujeres en las que se emite un diagnóstico falso positivo como resultado de un

primer “screening” en posteriores controles mamográficos se ha observado en

algunos casos un efecto deletéreo por ser atendidas por segunda vez con menos

frecuencia de la debida. Esto explica el hecho de que los tumores que se

diagnostican en este grupo de personas sean de mayor tamaño que los que se

objetivan en las mujeres que son seguidas con arreglo al protocolo y la frecuencia

establecida. Por ello se han de analizar los factores que predisponen a la obtención

de falsos-positivos y animar a las mujeres en las que este error se produce a seguir

el programa en la forma prevista [384].

A parte de lo comentado anteriormente el “screening” con mamografía puede

ocasionar un sobre diagnóstico de casos de cáncer de mama y también que algunas

personas resulten sobre tratadas. En efecto, de acuerdo con los datos publicados

en la base de datos Cochrane se estima que aunque el cribado poblacional con

mamografía para el cáncer de mama reduzca su mortalidad, realmente la magnitud


- 178 -

de este efecto es impreciso ya que también dará lugar a que se diagnostiquen y se

traten de cáncer de mama a algunas mujeres cuya lesión se comportaría de forma

indolente sin que su presencia se le pueda atribuir el fallecimiento por causa de

cáncer. A pesar de lo anterior tenemos que aceptar que, actualmente, a partir de las

pruebas de “screening” no es posible determinar cuáles ni cuantas son las mujeres

sobre tratadas y en quién el tumor se comportará de forma más agresiva. Esta

incertidumbre determina que se realicen en algunos casos, tratamientos

quirúrgicos y se apliquen tratamientos con radioterapia de forma innecesaria

[385].

Estudios recientes han sugerido que, además de presentar las limitaciones

anteriormente subrayadas, la utilización de la mamografía también puede

conllevar algunos riesgos. La dosis media de radiación que recibe la mama durante

la realización de una mamografía bilateral es aproximadamente de 4 a 5 mGy

aumentando ésta en relación directa a la densidad de la mama. Por otro lado la

dosis media acumulativa que recibe una mujer sana incluida en el programa de

“screening” durante 10 años es de 60 mGy. Hoy sabemos que el riesgo de

desarrollar cáncer de mama radioinducido sigue una tendencia lineal que aumenta

conforme lo hace la dosis recibida (P=0.0001) describiéndose un aumento de la

incidencia tras la realización de mamografías seriadas, realizadas por causa del

control evolutivo de la patología benigna de la mama fundamentalmente en

mujeres que presentan alteraciones en uno de los alelos de genes encargados de

reconocer y reparar el daño ocasionado al ADN aún a dosis bajas de radiación

[386].

En este sentido la Resonancia Magnética (RM) es otra de las pruebas de imagen

que aunque actualmente no se realiza de forma sistemática en las campañas de

“screening poblacional”, cada vez son más los estudios que coinciden en la mejora

de la sensibilidad diagnóstica (alcanzándose porcentajes en torno al 90%) cuando,

en determinados subgrupos de población, se asocia al estudio mamográfico la RM.

Concretamente se ha descrito que la Resonancia Magnética parece tener una

mayor sensibilidad que la mamografía en la detección precoz del cáncer de mama

especialmente en mujeres de edades más jóvenes donde por tener mayor densidad


- 179 -

el parénquima mamario la mamografía pierde en resolución pudiendo la RM

detectar lesiones que son ocultas para la mamografía. Sin embargo la RM no está

exenta de desventajas como es su moderada especificidad a la hora de discriminar

entre patología benigna y patología maligna. Esto conduce a que la indicación de

biopsias se realice con mayor frecuencia con la finalidad de asegurar mejor el

diagnóstico y reducir el porcentaje de falsos positivos. Sin embargo no disponemos

aun de datos que demuestren de forma concluyente los posibles beneficios que se

derivarían a la asociación de la RM a la mamografía en las campañas de cribado

poblacional.

En resumen todavía, y a pesar de las mejoras en las técnicas de imagen que

actualmente se utilizan en el diagnóstico precoz del cáncer de mama, siguen

existiendo ciertas limitaciones que dificultan en algunos casos el poder alcanzar un

diagnóstico lo más precoz posible. Considerando estas limitaciones creemos que

del estudio de nuevos biomarcadores pueden surgir datos que ayuden a predecir el

comportamiento biológico del cáncer de mama y a partir de él, conseguir una

aproximación al conocimiento de la capacidad de diseminación de un determinado

tumor, para a partir de él poder predecir el riesgo de progresión de lesiones

benignas a malignas, de carcinoma intraductal a carcinoma infiltrante, así como a

diferenciar el perfil molecular de los tumores que potencialmente tiene el mayor

riesgo de recidivar o producir metástasis a distancia para indicar el tratamiento

que mejor se adapte a sus características moleculares evitando que, en los casos

más favorables, se realicen tratamientos loco-regionales o sistémicos innecesarios.

5.1.2. Papel de los Marcadores Tumorales empleados actualmente en la

clínica, sus ventajas y limitaciones

El principal papel que tiene actualmente los marcadores tumorales que

habitualmente se determinan en muestras de sangre periférica de los pacientes

diagnosticados de cáncer de mama, se centra fundamentalmente en su aplicación

para evaluar la respuesta clínica al tratamiento oncológico aplicado, así como en la

detección temprana del desarrollo de metástasis. En líneas generales aunque han

sido propuestos un amplio número de marcadores tumorales son el CA 15.3, CA


- 180 -

27.29, el CEA (Antígeno Carcinógeno Embrionario) y las citoqueratinas (por ej.

TPA, TPS o Cyfra 21.1) los que más comúnmente se indican determinar siendo de

todos ellos el CA 15.3 el marcador tumoral que más frecuentemente se utiliza en la

práctica clínica asistencial.

Sin embargo y a pesar de su utilidad en la práctica clínica diaria, ninguno de los

marcadores tumorales actualmente determinados en sangre periférica ha

demostrado ser lo suficientemente útil para poder aplicarlo en los programas de

diagnóstico precoz del cáncer en general, y del cáncer de mama en particular,

debido a las limitaciones que presentan tanto por la baja sensibilidad como por la

falta de especificidad que su determinación analítica ha demostrado tener cuando

se aplican a los propósitos del diagnóstico precoz. El factor limitante de la

sensibilidad es la cantidad de proteína producida por el tumor así como por la

transferencia de esta proteína desde el proceso neoplásico hasta el torrente

circulatorio donde va a ser analizada. Ambos procesos biológicos, junto con las

limitaciones analíticas de la técnica, determinan cuál es el límite de concentración

que es detectable en la muestra sanguínea. Concretamente para el CA 15.3, uno de

los marcadores tumorales más empleados en la actualidad en cáncer de mama, se

ha publicado que su utilidad en el diagnóstico inicial de la enfermedad es muy baja

como se demuestra por los valores de sensibilidad que presenta su determinación

en el diagnóstico inicial del cáncer de mama. En efecto, de acuerdo con el estadio

de la enfermedad en el momento del diagnóstico la sensibilidad oscila entre un 10-

15 % en estadio I, el 20-25 % en estadios II y el 30-45 % en estadios III de la

enfermedad [387] .

Por otro lado asociado a esta baja sensibilidad se añade la falta de especificidad

que también caracteriza la utilización de los marcadores tumorales en la clínica.

Esta falta de especificidad está relacionada, entre otras causas, con la producción

del marcador por células normales pertenecientes a los tejidos donde asienta el

tumor primario o, incluso a otros tejidos del mismo organismo. Ambas

posibilidades encuentran una explicación lógica en el hecho de que los marcadores

tumorales hasta ahora conocidos son sustancias más órgano-específicas que

tumor-específicas. Por ello es frecuente la observación de niveles elevados de


- 181 -

marcadores tumorales en personas sin enfermedad así como en personas afectas

de algún otro tipo de patología no tumoral. Así se ha demostrado que el CA 15.3 se

encuentra frecuentemente elevado en la patología benigna de la mama, en las

alteraciones crónicas del metabolismo hepático y en enfermedades del sistema

inmune [387]. Por tanto estos problemas de especificidad que afectan a los

marcadores tumorales clásicamente utilizados como el CA 15.3 limitan sus

aplicaciones en el “screening” del cáncer de mama.

De igual forma los marcadores tumorales en cáncer de mama actuales también

presentan determinadas limitaciones cuando se les utiliza como factores

indicativos del pronóstico de la enfermedad. En relación con esta cuestión se ha

descrito que el nivel de CA 15.3 cuantificado en las pacientes con cáncer de mama

antes de la cirugía es un factor pronóstico tanto para la supervivencia libre de

enfermedad (SLE) como para supervivencia global (SG), ya que niveles iniciales

elevados se correlacionan con una menor SLE y SG. Sin embargo estudios más

detallados no han podido demostrar que el CA 15.3 sea un marcador que

independientemente de los clásicos marcadores de pronóstico (tamaño tumoral,

estado de los linfáticos, etc.) permita precisar la evolución clínica de la paciente

afecta por el tumor. Por ello la utilidad de esta proteína como factor pronóstico ha

sido muy cuestionada. No obstante en algunos estudios se ha descrito que el nivel

de CA 15.3 en el momento del diagnóstico de la enfermedad se relaciona con el

riesgo de recidiva y de mortalidad que puede presentar la paciente, tanto en

estadios iniciales como cuando la enfermedad alcanza una extensión metastásica.

En este contexto su determinación no de forma aislada en el tiempo sino de forma

sucesiva a lo largo del seguimiento de la paciente, ha mostrado tener un papel

importante en el diagnóstico de la enfermedad metastásica. De hecho se ha

descrito en diferentes estudios que la sensibilidad del CA 15.3 para detectar a

partir de su elevación progresiva la recidiva de la enfermedad y el desarrollo de

metástasis oscila entre el 50 % al 90 % en función del sitio anatómico en donde

aparezca el nuevo foco de enfermedad, siendo más alta cuando asienta en el hígado

seguida de la localización ósea y pulmonar así como del número de localizaciones y

el tamaño de los focos metastásicos [388]. Aún menos resultados existen a favor de


- 182 -

la utilidad del CEA para predecir el pronóstico de las pacientes con cáncer de

mama obteniéndose resultados que están en desacuerdo unos de otros por lo que

su determinación es de una utilidad muy limitada.

Todo lo anterior refleja que la utilidad de los marcadores tumorales en la clínica

está limitada por el hecho de que no son lo suficientemente sensibles para que a

través de su elevación se pueda asegurar la existencia de un proceso tumoral

incipiente, y por ello potencialmente curable, o de descubrir la enfermedad

metastásica cuando ésta se encuentra en un momento en el que por su menor

carga tumoral sea posible conseguir mejoras en la calidad de vida y en las

expectativas de supervivencia de las pacientes.

5.2. NECESIDAD DE BUSCAR NUEVOS BIOMARCADORES EN EL CÁNCER DE

MAMA

En la actualidad y debido a las limitaciones derivadas de la falta de sensibilidad

y especificidad que presenta la determinación de los habituales marcadores

tumorales aplicados a la búsqueda del diagnóstico precoz en cáncer, han surgido

múltiples iniciativas de investigación que pretenden identificar nuevos

biomarcadores y factores moleculares a partir de los cuales establecer vías de

investigación y desarrollo que, basadas en técnicas de biología molecular,

genómica y proteómica, mejoren los actuales resultados. Los datos publicados

hasta ahora resultan prometedores y se confía en que nuevas moléculas permitirán

alcanzar el objetivo de conseguir el diagnóstico del cáncer de mama en su estadio

más inicial. También los nuevos biomarcadores tumorales deberían ser útiles en la

identificación de los individuos con mayor riesgo de padecer cáncer de mama, y su

utilidad se reforzaría si aportasen datos válidos para precisar el pronóstico de la

enfermedad o predecir la respuesta al tratamiento efectuado, incluyendo el

despistaje de la recidiva tumoral o el desarrollo de enfermedad metastásica del

paciente.

Se sabe desde la década de los 70 que en el suero de los pacientes con cáncer es

posible demostrar la presencia de niveles elevados de ADN. Años más tarde se


- 183 -

demostró que parte de ese ADN corresponde a ácidos nucleicos liberados por el

propio tumor. Esto ha supuesto un importante avance en la aplicación y estudio de

los ácidos nucleicos en la sangre de pacientes con cáncer buscando su utilidad en la

patología oncológica y más concretamente en el cáncer de mama [389, 390].

Actualmente conocemos que el defecto primario en el cáncer reside en el ADN

genómico en el que, distintas alteraciones moleculares como son las mutaciones,

amplificaciones, translocaciones, pérdida de heterocigosidad, inestabilidad de

microsatélites así como cambios epigenéticos entre ellos la alteración del perfil de

metilación, conducen a la puesta en marcha de cascadas de transducción de

señales intracelulares anómalas que, finalmente, pueden dar lugar al desarrollo de

una enfermedad tumoral por fracaso de los mecanismos de reparación del ADN y

de regulación del ciclo celular normal. Por tanto poder aislar el ADN que se

encuentra en el torrente circulatorio y analizar la existencia de deleciones o

translocaciones de nucleótidos o de metilación de regiones promotoras de genes

con función supresor de tumores podría ayudar a alcanzar el diagnóstico en etapas

en donde el tumor aún no se ha manifestado clínica ni radiológicamente o incluso

no se ha desarrollado y sólo existen cambios moleculares en el ADN circulante.

En los últimos años han sido muchos los intentos de desarrollar técnicas no

invasivas persiguiendo lograr el diagnóstico precoz del cáncer de mama. Muchas

de ellas han estado basadas en el análisis de ADN extracelular libre que se

encuentra circulando en la sangre. En efecto en el plasma se ha demostrado la

existencia de niveles elevados de ADN libre circulante lo que, por sí solo, se ha

vinculado como un indicador del desarrollo tumoral. Sin embargo, esta

determinación carece de especificidad al observarse que en otras patologías como

en los pacientes afectos de lupus eritematoso sistémico, artritis reumatoidea,

glomerulonefritis, pancreatitis, hepatitis, etc. también se describe este aumento en

la concentración de ADN libre circulante [391]. No obstante numerosos estudios

han demostrado que existen diferencias entre el patrón de metilación hallado en la

región promotora de numerosos genes, cuando se estudia el ADN circulante en el

plasma de pacientes diagnosticados de cáncer mientras que estos cambios en el

patrón de metilación no son tan frecuentes al estudiar el ADN circulante extraído


- 184 -

de la sangre de personas sanas [314]. Hoy es posible afirmar que los cambios del

estado de metilación de ADN representan una de las alteraciones moleculares más

comunes en el cáncer [346], [346], incluyendo el cáncer de mama [238]. Por lo

tanto, el análisis de la metilación en los promotores de diversos genes en el suero

de la población en general podría ser de gran importancia para la detección

temprana de la enfermedad.

Además el empleo del ADN en suero de los pacientes con cáncer como marcador

tumoral tiene una serie de ventajas respecto a otras moléculas como ARNm,

ARNmi y ciertas proteínas. En primer lugar, la molécula de ADN es muy estable. En

contraste con lo que le sucede al ARNm y muchas proteínas, el ADN puede

sobrevivir incluso en condiciones hostiles durante largos períodos de tiempo

permitiéndonos su almacenaje para su posterior análisis. Por otro lado el ADN

relativamente intacto se puede aislar y fijar en parafina así como y a diferencia de

las proteínas, puede ser amplificado por PCR de manera que partiendo de

pequeñas cantidades de material genético, es posible obtener importantes

cantidades del mismo. Este proceso de multiplicación del ADN facilita su estudio y

análisis [392].

Se ha demostrado que las anomalías de metilación en el ADN circulante, en

pacientes con cáncer, ofrece los mejores porcentajes de especificidad en el

diagnóstico de las enfermedades neoplásicas [393] y de ello se supone que estas

moléculas pueden ser potenciales biomarcadores de la enfermedad tumoral

mínima. Sin embargo el hallazgo de resultados falsos positivos es relativamente

frecuente y conduce al seguimiento de la persona y a la aplicación de nuevas

técnicas analíticas buscando la confirmación diagnóstica lo cual no siempre es real.

Por ello, en este asunto hay que tener muy en consideración los costos que el

procedimiento global de despistaje de la enfermedad puede acarrear y el

sufrimiento provocado en el paciente a causa del estrés y la inseguridad producida

por la ausencia de un pronunciamiento diagnóstico claro. Estos hechos han

llevado a recomendar que en el despistaje de la enfermedad se asocien los

biomarcadores que más específicos hayan resultado en cada caso. Por ejemplo

biomarcadores de ADN metilado en combinación con el antígeno PSA en cáncer de


- 185 -

próstata y en combinación con CA 125 para el “screening” del cáncer de ovario o

asociados a la mamografía en el “screening“ del cáncer de mama: es decir, el panel

de las pruebas de mayor especificidad y sensibilidad asociadas debe superar la

fiabilidad diagnóstica de un simple test aislado [394].

La metilación de citosinas que sucede en el carbono situado en la posición 5´

tiene un papel importante tanto durante el desarrollo celular normal como en el

proceso de la carcinogénesis. Este evento que ocurre casi exclusivamente en los

dinucleótidos CpG que se encuentran agrupados en pequeñas secuencias (islas

CpG) de 0.5 a 5kb repartidas por el genoma humano, se localizan preferentemente

-en más del 70% de los genes- en la región promotora del gen y concretamente en

el primer exón aunque en ocasiones se encuentran localizadas en el extremo final

3´ [237].

En las células de los tejidos sanos las regiones CpG en condiciones fisiológicas,

se encuentran en estado no metilado reflejando un estado transcripcional activo

del gen capaz de formar proteínas que, por tanto, ejercen la acción para la que se

ha transcrito. Sin embargo, en situaciones de transformación neoplásica acontecen

eventos epigenéticos entre ellos, la metilación de citosinas en las regiones CpG de

la región promotora del gen; esta alteración que parece ocurrir en etapas

tempranas de la carcinogénesis ocasiona el silenciamiento del gen y la ausencia de

su expresión proteica lo que, cuando ocurre en genes supresores de tumores,

conduce a la pérdida de su función y en consecuencia a la alteración de los

procesos de regulación normal del ciclo celular, proliferación, apoptosis y

supervivencia celular [13, 263, 393].

Por tanto la detección del estado de metilación del ADN por técnicas

cuantitativas como es mediante PCR en tiempo real y basándonos en un

tratamiento del ADN genómico mediante la técnica de modificación bisulfítica, que

convierte sólo citosinas no metiladas en uracilos dejando inalteradas las citosinas

metiladas, nos podrá permitir inspeccionar y poner de manifiesto este estado

metilado de la región promotora del gen a estudiar. A partir de aquí y sabiendo que

este proceso ocurre en fases iniciales de la tumorogénesis podría utilizarse su


- 186 -

cuantificación como potencial marcador para identificar a individuos con un mayor

riesgo para desarrollar un proceso cancerígeno o para ayudar al diagnóstico de la

enfermedad en un estadio temprano, mientras que aquellos genes que sufren este

proceso de metilación durante la progresión de la enfermedad podrían ser

utilizados como potenciales marcadores pronóstico así como para conocer la

resistencia o sensibilidad al tratamiento y por tanto poder ser un factor predictivo

de respuesta.

Por otra parte una cuestión importante a tratar es la especificidad de órgano

que es una de las características que debería reunir un marcador tumoral ideal.

Actualmente sabemos que los únicos marcadores específicos de órgano son la

Tiroglobulina para el cáncer diferenciado de tiroides [395] y el marcador PSA

(antígeno prostático específico), que si bien es específico de la próstata, su

elevación no siempre es debida a un proceso cancerígeno es decir carece de

especificidad tumoral. Sin embargo y aunque tampoco existe especificidad en

cuanto al perfil de metilación y su correlación con un tumor maligno, algunos

genes sí que poseen una significativa especificidad de tejido en su patrón de

metilación del promotor. Así, el gene hMLH1 se encuentra frecuentemente

metilado en el cáncer colo-rectal y el cáncer gástrico mientras que es raro

encontrarlo metilado en el cáncer esofágico y en el hepatocarcinoma; el gen BRCA1

está frecuentemente metilado en el cáncer de mama y ovario y no en otros tipos de

tumores y la metilación de p73 y p15INK4B parece estar presente de manera casi

exclusiva en procesos tumorales hematológicos [396]. Por lo tanto probablemente

sean necesarios más estudios prospectivos que analicen el patrón de metilación

del ADN y su correlación un determinado tipo histológico que quizás incluso

podría ser una herramienta de ayuda en la identificación de los tumores

metastásicos de origen desconocido.

5.3. JUSTIFICACIÓN DEL ADN METILADO COMO BIOMARCADOR EN EL

CÁNCER DE MAMA

En la actualidad y después de décadas de investigación en las que se han

estudiado los patrones de expresión de determinados genes y las anomalías que en


- 187 -

ellos es frecuente encontrar, creemos que el cáncer es en gran parte debido al

acúmulo de alteraciones genéticas y epigenéticas que, actuando sinérgicamente

sobre la cinética celular promueven la ausencia de control del ciclo celular y

cascadas de transducción de señales que dan lugar a una pérdida de control y

regulación del crecimiento y proliferación celular que conduce en la puesta en

marcha del proceso de carcinogénesis. Recientemente Hanahan y Weinberg [397]

han descrito las alteraciones moleculares y las cualidades que adquire la célula

tumoral hasta conseguir capacidad de crecimiento y proliferación celular

independiente de la regulación celular fisiológica que define el crecimiento celular

tumoral. Estas características son; i) el potencial ilimitado de las células para

replicarse, ii) su autonomía para generar señales autocrinas estimulantes del

crecimiento celular, iii) ser insensibles a las señales inhibitorias de proliferación

celular, iv) la evasión a los mecanismos de señalización que inducen a las células en

condiciones fisiológicas a entrar en apoptosis, v) la secreción de sustancias

proangiogénicas a partir de las cuales se estimula la formación de vasos por los

que el tumor consigue nutrientes y vi) la capacidad de invadir otros tejidos y dar

lugar al desarrollo de metástasis.

Entre los eventos que pueden favorecer que la célula adquiera estas

capacidades se encuentran las alteraciones que ocurren en la estructura de la

cromatina como consecuencia del proceso de desacetilación y metilación de las

histonas así como la metilación de las citosinas situadas en el promotor del gen;

todo ello afecta a la estructura de la cromatina alterando la expresión génica y

ocasionando un cambio en la función proteica derivada de la falta de transcripción

de determinados genes. De hecho actualmente se piensa que los procesos

epigenéticos que alteran la conformación de la cromatina juegan un papel

importante tanto en la iniciación como en la progresión tumoral de numerosos

procesos oncológicos. Es así que se considera que los cambios epigenéticos pueden

ser tan importantes como las mutaciones genéticas en el desarrollo y proliferación

del cáncer [398]. La organización de la cromatina y el estado de metilación de la

misma que son responsables de la homeostasis de la expresión proteica en

condiciones fisiológicas, en el cáncer esta regulación de la expresión se altera hasta


- 188 -

hacer que las células tumorales sean reconocibles por sus cambios morfológicos al

tiempo en que son independientes de la maquinaria de regulación normal de las

células normales. Así el genoma de la célula tumoral adquiere una distribución

atípica de los grupos metilos respecto a la célula sana exhibiendo un estado de

metilación en la región promotora de determinados genes que contrasta con la

ausencia de metilación en las regiones CpG reguladoras de la expresión génica de

esos mismos genes en la célula normal en condiciones fisiológicas. Consecuencia

de esos cambios puede ser la activación de secuencias parasitarias endógenas del

ADN, la inestabilidad cromosómica, la pérdida de la actividad génica heredable

(imprinting) y cambios en el genoma que conlleven aneuploidía, mutaciones, etc.,

que responden a algunos de los interrogantes que empezando por ¿cómo ocurre?

se formulan en relación al fenómeno de la carcinogénesis.

Este patrón aberrante de metilación del ADN puede afectar a diferentes genes

implicados cada uno de ellos en distintas etapas del proceso de proliferación,

crecimiento o muerte celular. Hoy disponemos de técnicas extraordinariamente

sensibles y mínimamente invasivas para el paciente a través de las cuales podemos

determinar y cuantificar el ADN metilado correspondiente a la región promotora

del gen que deseemos cuantificar en cualquier sujeto diagnosticado de cáncer.

Además estas determinaciones son posible en muestras de fluidos naturales como

son el suero, orina o esputo tal que cuando se realizan utilizando la técnica de PCR

en tiempo real específica para la metilación, podemos conocer la concentración de

ADN metilado en la muestra. La utilidad de ADN metilado como un potencial

biomarcador para el estudio de los pacientes con cáncer de mama ha sido descrita

por diversos autores [278, 280]. Si los hallazgos publicados se confirman en series

de pacientes más extensas, la determinación de ADN procedente del tumor a partir

de muestras de fluidos biológicos podría convertirse en una herramienta válida

para el despistaje y diagnóstico precoz del cáncer de mama.

Basándonos en resultados previos y en la propia experiencia de nuestro grupo

de investigación [268] hemos realizado este trabajo de investigación para analizar

si existen diferencias en el patrón de metilación entre un grupo de pacientes

diagnosticadas de cáncer de mama frente a dos grupos control, el primero de ellos


- 189 -

constituido por mujeres sanas y el segundo formado por mujeres con patología

benigna de mama. Nuestro objetivos se centraban en evaluar la relevancia clínica

de esto biomarcadores en el diagnóstico del cáncer de mama, incluyendo la

posibilidad de avanzar hacia un diagnóstico precoz de la enfermedad, y analizar la

relación de los biomarcadores elegidos con las variables clínico-patológicas

actualmente utilizadas en la práctica clínica diaria, su papel como posible factor

pronóstico y su quizás implicación en la no expresión de receptores hormonales de

estrógenos como mecanismo de silenciamiento génico mediante metilación.

Para ello se seleccionaron 5 genes implicados en diferentes rutas metabólicas

importantes en la dinámica y las funciones celulares y que, en estudios previos,

habían sido identificados como genes cuya expresión resultaba modificada, por

metilación de su promotor, en el espécimen tumoral de mujeres afectas de cáncer

de mama [280, 363]. Los biomarcadores así seleccionados fueron: 14-3-3 Sigma,

RAR-Beta, RE, APC y E-Cadherina.

El gen 14-3-3 Sigma es un gen tumor supresor implicado en la regulación de

múltiples procesos biológicos fundamentales para la célula como son los

mecanismos de apoptosis, migración, progresión del ciclo celular y mantenimiento

de la integridad del citoesqueleto. Se ha descrito que la ausencia de expresión de la

proteína a la que codifica causada por metilación de las citosinas incluidas en las

islas CpG del promotor correlaciona con la presencia del tumor. Esto es así porque

en condiciones fisiológicas cuando se produce un daño en el ADN y no es reparado,

p53 induce la expresión de 14-3-3 Sigma que a través de p21 detiene la progresión

del ciclo celular en fase G2 y, en asociación con CDK2 y CDK4, parece que también

pueda regular la progresión en fase G1/S haciendo que la célula que contiene un

daño en su ADN entre en apoptosis protegiéndose así el tejido de que en él se

alberguen células con alteraciones en el material genético importantes puedan dar

lugar a la iniciación del proceso carcinogénico. Sin embargo cuando este

mecanismo de protección fisiológico que la célula utiliza para hacer frente al daño

producido en el ADN celular es bloqueado por distintos eventos como el

silenciamiento génico mediante metilación, la célula no entra en apoptosis y

continúa el proceso de diferenciación y proliferación celular transmitiendo a


- 190 -

futuras células hijas información errónea y aberrante que puede iniciar y, más

adelante, promover el proceso carcionogenético [399, 400].

Otro de los genes incluidos en este trabajo de investigación ha sido RAR-Beta

(RAR-B). La proteína que este gen codifica es importante por su implicación como

gen tumor supresor en los mecanismos de control crecimiento y diferenciación

celular, estableciendo un equilibrio entre procesos de proliferación y apoptosis. El

gen RAR-Beta actúa como factor de transcripción dependiente de ligando que

uniéndose a la región promotora de numerosos genes diana, dan lugar a su

expresión o represión transcripcional. Es un importante gen tumor supresor que

se ha observado que se encuentra metilado y por tanto no se expresa favoreciendo

consecuentemente el crecimiento celular ininterrumpido, en diversos tumores

sólidos como son el cáncer de pulmón, cáncer de cabeza y cuello y cáncer de mama

[356]. Se cree que el silenciamiento del gen RAR-Beta favorece el crecimiento

celular ininterrumpido. Concretamente, en muestras tisulares de cáncer de mama

el promotor del gen se encuentra metilado hasta en un 43% de los tumores

infiltrantes [352] relacionándose su estado de metilación con la mayor frecuencia

de metástasis óseas, cerebrales y pulmonares [359]. Esto es, la metilación del gen

podría, además, corresponderse con pacientes que presentan enfermedad tumoral

diseminada. Por tanto determinar el estado de metilación en suero de este gen y

derivado de ello, la consiguiente pérdida de expresión proteica derivada de la

ausencia de su transducción proteica, podría servir como biomarcador predictivo

del riesgo de metástasis en el cáncer de mama. Además, en diversos trabajos se ha

observado que es posible la reactivación endógena de RAR-B al inducir la re-

acetilación de histonas en la secuencia promotora RAR-B P2 en líneas celulares de

cáncer de mama sugiriendo también que RAR-B podría ser un objetivo importante

para la terapia contra el cáncer [361].

Por otro lado la importancia pronóstica y predictiva de respuesta a la

hormonoterapia que, con seguridad científica, se atribuye a la expresión

intracelular de la proteína receptora de estrógenos nos hizo considerar el interés

de analizar el perfil de metilación del promotor del gen RE en mujeres afectas de

cáncer de mama. Es clásica la división del cáncer de mama en tumores, unos que


- 191 -

son hormonosensibles y aquellos otros que son hormono-independientes. El

primer grupo lo constituyen aquellos tumores que expresan receptores

hormonales y por lo tanto son subsidiarios de recibir tratamiento con

hormonoterapia, tienen mejor pronóstico. En cambio aquellos que son hormono-

resistentes por carecer de la expresión de estos receptores hormonales y que como

consecuencia de la ausencia de esta proteína no se benefician del tratamiento

hormonal, circunstancia además, les confiere un peor pronóstico.

Otro de los genes que decidimos estudiar fue E-Cadherina por su implicación en

el desarrollo de metástasis, al estar directamente relacionada con el

mantenimiento de la correcta adhesión y polaridad existente de célula a célula, e

implicada a su vez en los procesos de diferenciación celular, así como en el

mantenimiento de la correcta homeostasis tisular. La proteína E-Cadherina es una

glicoproteína transmembrana de 120kDa que interviene en la adhesión celular

mediada por calcio indispensable para mantener la adhesividad e integridad de las

células normales de los ductos mamarios. El papel de E-Cadherina es ligar las

células epiteliales entre sí y mantener la integridad del epitelio estratificado y se ha

descrito que su ausencia o su débil expresión contribuye a la pérdida o a la

reducción de la adhesión celular favoreciendo la diseminación de las células del

tumor y así la progresión tumoral, la invasión tisular y el desarrollo de metástasis

en el cáncer a partir de estudios que se remontan a 1990 [401, 402]. En líneas

generales se sabe que los tumores epiteliales pierden a menudo la expresión de E-

Cadherina parcial o completamente y que esta pérdida se acompaña de la

progresión hacia un proceso neoplásico invasivo debido a que los cambios en rutas

de señalización y la pérdida de inhibición del contacto celular, actúan estimulando

la migración celular así como interacciones estromales aberrantes que son

responsables del desarrollo de metástasis a distancia [403]. El gen CDH1 que

codifica para E-Cadherina, es un gen supresor de tumores asociado a las

características de multicentricidad, invasividad, metástasis y mal pronóstico del

carcinoma de mama principalmente en el cáncer lobulillar. Los mecanismos

moleculares implicados en la disminución o pérdida de la expresión de E-

Cadherina, pueden ser variables, mutaciones, pérdida de uno de los alelos con


- 192 -

pérdida de heterocigosis y procesos de metilación en el promotor del gen CDH1. Se

ha descrito en al menos 8 tipos de tumores entre ellos el cáncer de mama, que el

promotor de E-Cadherina se encuentra aberrantemente metilado

correlacionándose este evento con la ausencia de su expresión proteica y

consecuentemente con un mayor riesgo de desarrollo de metástasis [404, 405].

Finalmente también se incluyó en este trabajo la cuantificación de APC. La

mayor parte de las veces las deficiencias en la función de APC son debidas a

mutaciones dentro de la secuencia codificante del gen, y esto conduce a la falta de

degradación, y a la acumulación nuclear de b-catenina que actúa como un

activador transcripcional causando la pérdida del control del crecimiento celular

[406]. Además las funciones de APC se centran en las rutas metabólicas que

contrarrestan la diseminación metastásica a través de la mediación de esta

proteína en la adhesión celular y la estabilización del cito esqueleto [407]. La

pérdida de la expresión de APC y la regulación incrementada de b-catenina han

sido descritas en líneas celulares de cáncer de mama humano y en células de los

tumores mamarios [408]. Las mutaciones somáticas de APC han sido encontradas

en una minoría de los casos de cáncer de mama[409], a pesar de la alta frecuencia

con la que ocurre la pérdida de un alelo en el locus cromosómico 5q21. Sin

embargo la inactivación epigenética de APC debida a la metilación del AND

correspondiente a su región promotora es un hecho que ocurre con alta frecuencia

tanto en las líneas celulares derivadas de cáncer de mama humano como en el

tejido tumoral mamario. En la mayor parte de células de cáncer de mama que se

han conseguido cultivar existe una complete concordancia entre la metilación de

promotor de APC y el silenciamiento de su transcrito [410]. Lo anterior nos indujo

a seleccionar este fragmento de ADN como posible biomarcador del cáncer de

mama y a incluirlo en este estudio.

5.3.1. Discriminación entre casos - controles y entre controles sanos -

controles con patología benigna

En el caso del cáncer de mama, recientemente se ha propuesto que las

alteraciones en el perfil de metilación del ADN aislado a partir de muestras de


- 193 -

pacientes con cáncer de mama pueden ser utilizadas como posibles marcadores

del aumento del riesgo de desarrollar cáncer de mama en mujeres sanas. En este

sentido se han descrito recientemente dos alteraciones en el perfil de metilación

del ADN presentes en pacientes con cáncer y que podrían indicar que existe un

patrón de metilación distinto en estos sujetos predispuestos. En una de estas

observaciones se describe que la activación del REα que a su vez se encuentra

relacionado con el riesgo aumentado de desarrollar cáncer de mama, se

correlaciona con un bajo nivel de metilación del gen que codifica para RE (ERT) y

por otro lado como un conjunto de genes (polycomb group target genes PCGT) que

se encuentran relacionados con la biología de las células madre, se encuentran

metilados con mayor frecuencia que otros genes en pacientes afectas de cáncer de

mama. A partir de estos hallazgos se ha sugerido [411] que el análisis del estado de

metilación de RE y PCGT podrían en un futuro contribuir a predecir el riesgo de

desarrollar cáncer de mama.

De igual forma también se ha descrito en estudios moleculares realizados una

posible relación entre el estado de metilación de los genes RASSF1A y RAR-B en

relación con un aumento del riesgo de desarrollar cáncer de mama incluso con

independencia de una historia familiar de lesiones benignas y malignas de mama

[412]. Incluso se ha publicado por autores como Lewis y col. que en mujeres que

presentan lesiones benignas de mama en las que al aplicar el modelo predictivo de

riesgo de Gail se obtienen cifras de ≥ 2, es decir en mujeres que presentan un

riesgo elevado para desarrollar cáncer de mama, el porcentaje de metilación de los

genes tumor supresor RASSF1A y APC se sitúa en torno a un 70% para RASSF1A y

un 56% para APC frente al 29% y 20% encontrado en aquellas otras mujeres no

afectas de cáncer de mama, en las que el modelo de Gail ofrece un resultado bajo o

intermedio para el riesgo de padecer cáncer. De igual forma la ausencia de

expresión transcripcional por silenciamiento de otros genes como RAR-B

fundamentalmente correlacionado con la presencia de una historia familiar de

cáncer de mama, se ha asociado con la presencia de cambios histológicos en el

epitelio benigno de mama previo al desarrollo de un proceso tumoral. Estos


- 194 -

hallazgos podrían ser utilizados para la estratificación del riesgo de cáncer de

mama de forma individualizada [352, 392].

Otros trabajos que han encontrado diferencias significativas en el perfil de

metilación del ADN al comparar los resultados extraídos del estudio de mujeres

sanas y compararlos con los procedentes de muestras tomadas en mujeres con

cáncer de mama y que podrían contribuir al diagnóstico precoz han sido los

realizados por Krassensteiny col. [302], Dulaimi y col. [272] y Hoque y col. [413]. En

efecto de estos estudios se sabe que tras analizar un panel de genes, entre ellos

p16INK4A, p14ARF, RASSF1 y DAP kinasa, en pacientes afectas de cáncer de mama,

al menos uno de ellos se encuentra metilado en una proporción que oscila entre el

100 y el 94% de las pacientes con cáncer de mama mientras que no está metilado

en las mujeres sanas. Paralelamente se han correlacionado los niveles de

metilación obtenidos en muestras tomadas de la sangre periférica y en muestras

procedentes del lavado de los conductos galactóforos en pacientes diagnosticadas

de cáncer de mama, obteniéndose una correlación del 82%, sin observarse

diferencias significativas entre las muestras apareadas.

Estos datos preliminares sobre el análisis del perfil de metilación en suero

sugieren que el estudio de la metilación del ADN puede ser superior al CA 15-3

como marcador para el desarrollo de un cáncer de mama. Si se confirman estos

resultados en nuevos estudios prospectivos, la metilación de determinados genes

podría ser utilizada conjuntamente con la mamografía en el cribado poblacional

del cáncer de mama. Así, en las mujeres en las que, por factores epidemiológicos, se

pensase que tienen un mayor riesgo de desarrollar cáncer de mama y en las que, al

hacerles el estudio mamográfico éste fuese negativo, se podría realizar el análisis

de un determinado panel de genes tal que si se encontrara ADN metilado para esos

genes específicos se podría indicar el estudio de la mama mediante técnicas como

la RNM y recomendar el seguimiento estrecho de la paciente para tratar de

alcanzar un diagnóstico más precoz [392].

Por tanto, en nuestra opinión, deberían realizarse más estudios que comparasen

el perfil de metilación del ADN en fluídos biológicos de sujetos sanos y en pacientes


- 195 -

con cáncer para así poder conocer, a través de su análisis, si es posible establecer

un diagnóstico precoz del cáncer de mama y poder aplicarlo en la clínica.

Este trabajo de investigación se ha realizado con el objetivo de evaluar la

frecuencia y relevancia clínica que tiene la metilación de la región promotora de 5

genes implicados en distintas rutas de transcripción y que se han descrito como

frecuentemente alterados en cáncer de mama así como analizar si este patrón de

metilación aberrante puede ser utilizado como biomarcador plasmático de la

presencia de enfermedad. Todo lo anteriormente expuesto parte del conocimiento

de que el ADN derivado del tumor puede detectarse en el suero sanguíneo de los

pacientes con cáncer, en nuestro caso cáncer de mama y que es posible aislar y

cuantificar este ADN por medio de técnicas caracterizadas por su alta sensibilidad

como es el caso de la PCR específica de metilación en tiempo real [414, 415].

Los resultados que hemos obtenido en este trabajo demuestran que existen

diferencias en el patrón de metilación encontrado en las muestras extraídas de las

personas incluidas en el grupo de pacientes con cáncer de mama y en las muestras

de sangre extraídas a las personas que formaron parte del grupo control.

Concretamente se ha observado que los niveles medios de los promotores de ESR1

y de 14-3-3-sigma que se detectan en las muestras de suero son estadísticamente

diferentes cuando se comparan los valores correspondientes a las pacientes con

cáncer de mama y los valores que pertenecen a las personas constituyentes del

grupo de controles sanos (p= 0.0112 para ESR1 y p= 0.0047 para 14-3-3-sigma); no

hemos encontrado diferencias estadísticamente significativas al comparar los

niveles medios de metilación encontrados en el subgrupo de controles sanos y en

el subgrupo de controles sanos con patología benigna; en este último subgrupo es

frecuente encontrar valores relativamente altos para algunos de los promotores de

los genes estudiados, y esto es especialmente frecuente en el caso del promotor de

14-3-3-sigma.

No obstante es importante comentar que aunque las diferencias cuantitativas de

metilación entre los genes analizados en el grupo control sano y con patología

benigna en nuestro trabajo no han resultado ser estadísticamente significativas, en


- 196 -

otras series de pacientes en las que se han se han analizado patologías pre-

malignas como hiperplasia DIN3 o CDIS estos niveles han sido estadísticamente

diferentes respecto a los obtenidos en sujetos sanos. Este resultado sugiere que el

proceso de metilación y su alteración juega un papel importante y temprano en el

proceso de carcinogénesis de la mama y que es posible detectar pequeñas

diferencias, y anomalías en este perfil de metilación, en etapas pre-invasivas de la

enfermedad lo que confiere a estos procedimientos el potencial suficiente para ser

utilizados en el diagnóstico precoz de la enfermedad [416]. En nuestra serie de

controles sanos con patología benigna de mama este resultado no ha podido ser

confirmado creemos que debido al bajo número de muestras recogidas y

posiblemente también al hecho de haber incluido dentro del grupo a personas con

lesiones benignas de la mama consideradas como no pre-invasivas.

Nuestros resultados están en consonancia con recientes publicaciones en las

que también se ha observado la existencia de diferencias entre el patrón de

metilación en pacientes con cáncer de mama respecto al patrón de metilación

encontrado estudiado en población sana. Esta concordancia sugiere que este tipo

de ensayos podrían ser de aplicación para el “screening” del cáncer de mama [416,

417].

Sabemos que no existe ningún biomarcador que, con independencia del

resultado anatomo-patológico correspondiente al estudio del tumor, pueda

aportar información fidedigna que ayude a distinguir entre lesiones premalignas

como el CDIS y lesiones benignas de la mama en etapas previas a hacerse invasivas.

Es así que no podemos identificar aquellas lesiones premalignas que tiene mayor

potencial para evolucionar y dar origen a un proceso tumoral maligno. Quizás el

estudio del perfil de metilación pueda ayudar en un futuro a reconocer estas

lesiones identificando las que tienen mayor potencial para hacerse infiltrantes. Si

esto se consiguiese se avanzaría hacia una detección más temprana de la

enfermedad, diagnosticando las lesiones pre-malignas antes de que se conviertan

en procesos tumorales malignos propiamente dichos.


- 197 -

Los resultados obtenidos demuestran la existencia de diferencias significativas

en los valores de concentración sérica de metilación en el promotor de los genes

ESR1 y 14-3-3-sigma entre las pacientes con cáncer de mama y el grupo de

pacientes sanas. De los resultados obtenidos en nuestro trabajo es posible calcular

la sensibilidad y la especificidad diagnóstica que tendría un hipotético test basado

en la determinación cuantitativa de ESR1 y 14-3-3-sigma al aplicado al estudio de la

población en general para el diagnóstico de personas con cáncer de mama. El

primer paso fue elegir el punto de corte a partir del cual se considera que una

concentración de promotor metilado excede del valor normal. Para ello hicimos

uso del método de análisis estadístico basado en las curvas ROC (figura 8) y

utilizando el programa GraphPad Prism, seleccionamos como punto de corte, tanto

para ESR1 como para 14-3-3-sigma, aquel valor de concentración de promotor que

ofreciese los índice de Sensibilidad (S) y Especificidad (E) de manera que la razón

de probabilidades fuera máxima (likelihood ratio). Estos valores han resultado ser

de 0.02 para ESR1 y 0.05 para 14-3-3 sigma. Para estos valores los resultados para

14-3-3-sigma fueron Sensibilidad (S)= 75 % (IC del 95 %: 64-85) y Especificidad

(E) = 53 % (IC del 95 %: 45-65) y de S = 65 % (IC del 95 %: 53-76) y E = 62 % (IC

del 95 %: 52-71) para ESR1 respectivamente.

Como quiera que los valores de S y de E difieren claramente de los óptimos (S =

1; E = 1) nuestros resultados no son los suficientemente consistentes como para

que el test pueda ser aplicado al diagnóstico del cáncer. No obstante al ser ESR1 y

14-3-3 sigma factores independientes (p=0.9721), es posible analizar los valores de

sensibilidad y especificidad que se obtienen cuando se combina el resultado de la

determinación del nivel de metilación de ambos promotores, ESR1 y 14-3-3 sigma,

aplicando para ello el test exacto de Fisher. Con esta nueva aproximación se

observa que mejoraba sustancialmente tanto la sensibilidad como la especificidad.

Así si definimos la presencia de enfermedad en un sujeto elegido al azar cuando

uno de los dos genes (+/-, -/+) o ambos (+/+) estuviesen metilados y la ausencia de

ésta cuando ninguno de los dos estuviesen metilados (-/-), la sensibilidad del test

sería del 81% (95% IC: 72-88) y la especificidad del 55% (95% IC: 40-67) con

p<0.001. Es decir mejoramos el índice de sensibilidad a cambio de una


- 198 -

relativamente baja especificidad. En cambio si consideramos como enfermedad

sólo aquellos casos en los que ambos genes se encuentran metilados (+/+) y

ausencia de enfermedad en el resto de los casos (+/-, -/+, -/-), alcanzaríamos una

baja sensibilidad 37% (95% IC: 73-47) a consta de una alta especificidad 88%

(95% IC: 78-94) p=0.0003. Tabla 53.

Tabla 53. Valores de Sensibilidad y Especificidad del test para el diagnóstico de cáncer de mama

usando RE y 14-3-3-sigma como biomarcadores

RE ó 14-3-3 Sigma

Cáncer mama

Controles

Sanos

RE ó 14-3-3 Sigma

Cáncer mama

Controles

Sanos

Enfermedad (+) +/- -/+ +/+

87

33

Enfermedad (+) +/+

39

9

Enfermedad (-) -/-

20

41

Enfermedad (-) +/- -/+ -/-

67

65

P < 0.0001

P = 0.0003

Sensibilidad = 81% (95% IC: 72-88) Sensibilidad = 37% (95% IC: 73-47)

Especificidad = 55% (95% IC: 40-67) PPV = 72% (95% CI: 63–80)

Especificidad = 88% (95% IC: 78-94)

El análisis de estos resultados es un ejemplo de un clásico dilema que nos

encontramos habitualmente en la decisión diagnóstica. Es decir si el objetivo es

diagnosticar el mayor número de casos de cáncer de mama, el teórico caso es

descrito como un “caso potencial” cuando los valores de ESR1 y/o los valores de

14-3-3 sigma están por encima de los valores definidos como normales, por lo

tanto necesitaríamos un test con una alta sensibilidad. Sin embargo, si el objetivo

es identificar el mayor número de individuos sin cáncer, el sujeto caso es

considerado sin enfermedad cuando los valores de ambos marcadores biológicos

son inferiores a los puntos de corte identificados y por lo tanto necesitaríamos un

test con una alta especificidad.

De igual forma si analizamos lo que ocurriría al aplicar este hipotético test en

población sana incluyendo dentro de esta población a las mujeres afectas con

patología mamaria benigna, es fácil entender que si consideramos como

completamente sanas aquellas mujeres en las que los niveles de metilación en


- 199 -

ambos genes están por debajo del rango de la normalidad (-/-), existe una mayor

proporción de sujetos con niveles bajos de ambos biomarcadores en el grupo de

mujeres incluidas dentro del grupo control sin enfermedad alguna que en el grupo

de mujeres afectas de patología benigna con p <0.0136. Este hecho sugiere que un

test de este tipo también podría ayudar a diferencias entre ambos grupos de

mujeres (tabla 54).

Tabla 54. Valores de Sensibilidad y Especificidad del test cuando se compara el Grupo casos con

enfermedad tumoral benigna de la mama con el Grupo control.

RE ó 14-3-3 Sigma


Controles Sanos

RE ó 14-3-3 Sigma


Controles Sanos

Enfermedad (+) +/- -/+ +/+

24

33

Enfermedad (+) +/+

9

9

Enfermedad (-) -/-

10

41

Enfermedad (-) +/- -/+ -/-

25

65

P < 0.0136

P = 0.09

Sensibilidad = 70% (95% CI: 53–85) No significación estadística

Especificidad = 55% (95% CI: 43–67)

Incluso si analizamos lo que sucedería al encontrarse metilado alguno o ambos

genes los resultados serían estadísticamente no significativos. Esto podría ayudar

en el diagnóstico de patologías benignas que en ocasiones puede ser una potencial

fuente de confusión para el diagnóstico de lesiones malignas. Así, el empleo de

biomarcadores unidos a los estudios mediante la imagen que habitualmente se

realizan ante la presencia de una lesión mamaria sospechosa de malignidad, quizás

pueda ser en un futuro un complemento importante para mejorar la exactitud

diagnóstica “no cruenta” preoperatoria. No obstante, estas son sólo observaciones

iniciales que requieren más investigaciones y estudios que permitan esclarecer la

importancia de los biomarcadores en clínica así como encontrar las combinaciones

óptimas de promotores génicos metilados a estudiar en cada caso.


- 200 -

5.3.2. Monitorización y respuesta biológica de los biomarcadores en sangre

periférica tras tratamiento

Uno de los actuales desafíos en la práctica clínica oncológica es el poder evaluar

la respuesta al tratamiento durante la administración del mismo para poder

anticiparnos a una posible resistencia, a la recurrencia o a la progresión de la

enfermedad durante el tratamiento. Hasta el momento, ningún método de imagen,

tampoco ningún test analítico, ha resultado ser lo suficientemente sensible ni

específico para, supervisando la eficacia de los tratamientos administrados, pueda

servir para alertar sobre la resistencia terapéutica, la reaparición de la enfermedad

o la presencia de metástasis a distancia. Actualmente uno de los métodos que hoy

día se emplean con este fin, se basan en la monitorización de la respuesta al

tratamiento mediante la determinación en sangre de marcadores tumorales

durante el tratamiento y, posteriormente, a lo largo del tiempo en el que el

paciente está sometido a revisiones periódicas. De esta forma intentamos

identificar aquellas pacientes que son resistentes al tratamiento, progresan

durante éste o presentan una recurrencia de la enfermedad. Sin embargo sabemos

que estas determinaciones bioquímicas están sujetas a múltiples limitaciones y que

en ocasiones fracasan en el intento de alertarnos sobre la mala evolución de la

enfermedad sometida a tratamiento.

En este sentido la determinación cuantitativa de nuevos biomarcadores como el

estudio del estado de metilación de determinados genes quizás podría ser una

herramienta válida potencialmente más sensible para la predicción y

monitorización de la respuesta al tratamiento a partir de la cuantificación de

fragmentos de ADN tumoral metilado obtenidos de muestras del suero de las

pacientes. En nuestro trabajo de investigación hemos observado que existen

diferencias entre los valores de concentración sérica de los biomarcadores 14-3-3-

sigma y ESR1 cuando se comparan los grupos constituidos por pacientes con

cáncer de mama y por sujetos sanos. Partiendo de este resultado y del supuesto de

que una vez resecado el tumor y tratado con RT y/o QT adyuvante, por lo tanto

quedara eliminada la fuente de ADN metilado procedente del tumor, hemos


- 201 -

querido analizar los cambios que se producen en los niveles séricos de metilación

correspondientes a los 5 genes estudiados. Esta parte de nuestro trabajo tenía

como objetivo investigar si alguno de los biomarcadores ensayados puede ser

utilizado como indicador capaz de predecir el riesgo de desarrollar metástasis o de

recidiva de la enfermedad con anterioridad a que la enfermedad recurrente o la

metástasis fuesen clínicamente manifiestas. Para ello cuantificamos los niveles

séricos de metilación de los promotores de E-Cadherina, RAR-β, 14-3-3 sigma, RE y

APC antes y después de realizado el tratamiento indicado en cada caso.

Los resultados obtenidos en este trabajo nos permiten describir que al término

del tratamiento se observa un descenso en el nivel de metilación con respecto al

nivel de metilación que se encontró en las mismas enfermas antes de iniciar el

tratamiento. En la comparación estadística de los resultados obtenidos no pudimos

encontrar diferencias significativas los que puede atribuirse al bajo intervalo de

tiempo transcurrido, aproximadamente 2 semanas, entre el fin del tratamiento y la

extracción sanguínea final. Probablemente hubiese sido necesario medir estos

biomarcadores después períodos de tiempo más largos para clarificar su

importancia y comportamiento al final del tratamiento.

Sin embargo lo que sí hemos podido demostrar es que, en el subgrupo de

pacientes que desarrollaron metástasis a distancia en nuestra serie (12 pacientes)

y de las que dispusimos de muestras (7 pacientes), de ESR1 y 14-3-3-sigma

metilado a partir de las muestras extraídas inmediatamente tras finalizar el

tratamiento fue inferior que en el resto de las pacientes que no desarrollaron

metástasis a distancia y que incluso en una tercera toma sanguínea que pudo

conseguirse en el momento de la aparición de la metástasis en 5 de las pacientes

con metástasis se observó un aumento de los valores de ESR1 y 14-3-3-sigma

metilado lo que podría indicarnos que, la escasa disminución inicial, y el

subsiguiente ascenso de los niveles de biomarcadores presentes en el suero de las

enfermas, correspondiese con la existencia de masa tumoral residual y con su

crecimiento posterior.


- 202 -

En cualquier caso nos parece claro que la metilación aberrante de las regiones

promotoras en determinados genes es un acontecimiento clave en el desarrollo y

progresión del cáncer, y que estos cambios epigenéticos ocurren en etapas

tempranas del desarrollo tumoral, manifestándose como alteraciones específicas

de los tumores. Por todo ello pensamos que la determinación cuantitativa del nivel

de metilación de las regiones del promotor de determinados genes puede

contribuir de forma significativa a la detección temprana del cáncer, ayudar a

determinar de forma más precisa el pronóstico de la enfermedad así como

contribuir a la predicción de la respuesta al tratamiento indicado. Una revisión de

la literatura científica en relación con este tema nos permite saber que la

determinación del estado de metilación de GSTP1 puede ayudar al diagnóstico

precoz del cáncer de próstata, la metilación de MGMT a la predicción de respuesta

a la terapéutica con agentes alquilantes en pacientes diagnosticados de

Glioblastoma Multiforme y que la determinación del estado de metilación de PITX2

ayuda a predecir la supervivencia en pacientes afectas de cáncer de mama sin

afectación ganglionar, aun cuando la validación de estos resultados exige su

confirmación mediante estudios prospectivos en los que se incluyan un mayor

tamaño muestral [418, 419]

5.3.3. Correlación de los Biomarcadores hipermetilados y las variables

clínico patológicas

La afectación ganglionar, la sobreexpresión de Her2-neu, así como el tamaño

tumoral y la expresión de receptores hormonales son algunos de los factores

pronóstico más importantes conocidos en el cáncer de mama [420]. Otros factores

han sido investigados para analizar su potencial para predecir el pronóstico de la

enfermedad en los pacientes diagnosticados de cáncer de mama aun cuando los

resultados obtenidos carecen de significación. Así, se ha sido investigado el papel

de las proteínas reguladoras del ciclo celular [421], y la presencia de células

tumorales en médula ósea de las pacientes, en donde si bien los resultados

obtenidos sugieren cierta validez indican, también, que estos hallazgos precisan de

una evaluación aun más rigurosa [422].


- 203 -

Sin embargo hasta ahora, hemos encontrado muy pocos trabajos en los que se

haya estudiado el valor pronóstico de las alteraciones epigenéticas encontradas en

el ADN extraído de muestras de sangre de las pacientes afectas de cáncer de mama,

o que se haya estudiado la correlación de estos parámetros con los aspectos clínico

patológicos que caracterizan el tumor o con la expresión de los receptores

hormonales.

En este trabajo de investigación hemos evaluado el potencial pronóstico de ADN

metilado cuantificado en el suero de las pacientes diagnosticadas de cáncer de

mama y, específicamente hemos centrado nuestro trabajo en la cuantificación de

RE, E-Cadherina, 14-3-3-sigma, RAR-Beta y APC para conocer si los niveles

plasmáticos de estos fragmentos de ADN añaden información de utilidad para

estimar de forma más precisa el pronóstico de las pacientes con cáncer de mama y

que pudiese ser complementaria a la que nos proporcionan los parámetros que

actualmente utilizamos en la clínica diaria. Para avanzar en este supuesto hemos

estudiado las posibles correlaciones entre los distintos genes analizados y las

variables pronósticas tanto demográficas como aquellas dependientes del tumor.

De acuerdo con nuestros resultados parece que la metilación aberrante de 14-3-3-

sigma se correlaciona con factores pronósticos adversos como son la afectación

ganglionar y el tamaño tumoral; así, las pacientes con afectación ganglionar

presentan niveles de metilación de 14-3-3-sigma superiores a los que se

encuentran pacientes sin afectación ganglionar y estas diferencias son

estadísticamente significativas (p<0.05). De igual forma se observó que cuanto

mayor es el “T” mayores son los niveles de metilación de 14-3-3 sigma siendo las

diferencias encontradas estadísticamente significativas. La explicación que

podríamos dar a este hecho está relacionada con la implicación que tiene 14-3-3

sigma en los procesos que conducen a la proliferación y a las ventajas que las

células tumorales tienen para prolongar su supervivencia.

Sin embargo hasta ahora, pocos estudios han analizado el valor pronóstico de

las alteraciones epigenéticas a partir de muestras sanguíneas de las pacientes así

como su correlación e influencia en el tumor de la expresión de marcadores

moleculares como la expresión de los receptores hormonales.


- 204 -

En este trabajo de investigación evaluamos el potencial pronóstico de ADN

metilado en el suero de las pacientes diagnosticadas de cáncer de mama a partir de

la cuantificación de RE, E-Cadherina, 14-3-3- sigma, RAR-Beta y APC para conocer si

podía aportar algún dato más que nos aproximara a estimar de forma más precisa

el pronóstico de las pacientes con cáncer de mama y que pudiese ser

complementaria a la información pronóstica que actualmente utilizamos en la

clínica diaria. Para ello correlacionamos los distintos genes analizados con las

variables pronósticas tanto demográficas como aquellas dependientes del tumor.

De acuerdo con ello observamos que la metilación aberrante de 14-3-3-sigma se

correlacionaba con factores pronósticos adversos como son la afectación

ganglionar y el tamaño tumoral, tal que se observó que las pacientes con afectación

ganglionar presentaban niveles de metilación de 14-3-3-sigma superiores de forma

estadísticamente significativas respecto a las pacientes sin afectación ganglionar

(p<0.05). De igual forma se observó que cuanto mayor es el “T” mayores niveles de

metilación de 14-3-3 sigma se obtuvieron de forma estadísticamente significativa.

La explicación que podríamos dar a este hecho está relacionada con la implicación

que tiene 14-3-3 sigma en la proliferación y supervivencia celular tumoral [423].

Actualmente ssabemos que 14-3-3 sigma, es un gen tumor supresor que actúa

regulando negativamente el ciclo celular promoviendo la parada de las células en

fase G2-M. Su incremento de expresión, cuando se estudian líneas celulares de

cáncer de mama, parece ser antagonista de la promoción del crecimiento celular

impulsada por oncogenes y de la transformación de las células hacia elementos con

mayores características malignas [399]; mientras que por otra parte su

silenciamiento permite a los queratinocitos humanos primarios crecer

indefinidamente alcanzando características de inmortalización evadiendo la

senescencia [424].

Nuestros resultados no nos han permitido encontrar ninguna otra relación

entre variables clínicas tales como la edad de la menarquía, la menopausia o la

paridad y las variables moleculares introducidas en este trabajo.

Estos resultados están en consonancia con recientes estudios realizados donde

se ha observado como el encontrarse metilado de forma aberrante los genes APC y


- 205 -

RASSF1A en mujeres afectas de cáncer de mama antes de cualquier tratamiento

oncológico es factor pronóstico independiente para la supervivencia global,

asociándose a una peor supervivencia que aquellas otras pacientes en las que estos

mismos genes se encontraban metilados [425]. Otros estudios como los realizados

por Feng Jing [426] obtuvieron resultados similares al analizar la repercusión de

presentar metilados los genes p16 y BRCA1 en mujeres con cáncer de mama

concluyendo que se asociaba junto a la afectación ganglionar a un peor pronóstico

y a un mayor riesgo relativo (RR) de muerte por cáncer de 6.4 y 5.5

respectivamente.

En este sentido se ha sugerido que la presencia de anomalías epigenéticas en el

ADN extraído de muestras del ganglio centinela afectas por metástasis de cáncer

de mama podría aumentar la sensibilidad para la predicción de una recidiva

ganglionar y alertar sobre el peor pronóstico de la paciente afecta si bien son

necesarios más estudios, incluyendo un mayor seguimiento de las pacientes para

extraer conclusiones fidedignas [281].

5.4. CORRELACIÓN DE FENOTIPOS LUMINALES EN CÁNCER DE MAMA Y

METILACIÓN

El cáncer de mama es una patología compleja en la que múltiples factores

histológicos, anatomo-patológicos, moleculares y clínicos se interrelacionan. De su

análisis pormenorizado es posible extraer datos que, aproximándonos al

pronóstico de la enfermedad, nos permiten ofrecer las opciones terapéuticas más

adecuadas a cada caso. Recientemente y gracias a los avances producidos en el

campo de la Biología Molecular, la Proteómica y la Genómica, se ha conseguido

avanzar en el conocimiento molecular del cáncer y, través del análisis de rutas de

transcripción de señales y de la funcionalidad de los receptores de membrana,

avanzar hacia tratamientos determinados por el perfil molecular que expresan las

células del tumor. Todo esto ha permitido el avance del conocimiento molecular en

el cáncer de mama y la descripción de distintos subtipos fenotípicos

principalmente atendiendo a su perfil de expresión. Esta clasificación es

importante porque contiene elementos que facilitan el pronóstico y permiten la


- 206 -

predicción de la respuesta al tratamiento oncológico. Es bien sabido que la

expresión de receptores de estrógenos (RE) en el espécimen tumoral representa

uno de los principales factores pronóstico de supervivencia a largo plazo y es

predictivo de la respuesta de la enfermedad al tratamiento hormonal. También se

sabe que esta proteína juega un importante papel en la iniciación y progresión del

cáncer del cáncer de mama. Así aquellas pacientes con tumores que expresan RE-

positivos se asocian a un pronóstico más favorable y, en su tratamiento se debe

incluir la terapia hormonal con Tamoxifeno y/o Inhibidores de la Aromatasa; sin

embargo en aquellas pacientes que presentaban tumores con RE-negativos el

tratamiento hormonal carece de utilidad terapéutica aunque sí es un elemento que

incide sobre el pronóstico de la enfermedad al asociarse más frecuentemente con

los casos en los que el curso de la enfermedad es más adverso. Sabemos que

alrededor del 25 % de los cánceres de mama no expresan RE en el momento del

diagnóstico siendo por lo tanto resistentes al tratamiento hormonal [372].Incluso

en algunos casos la expresión de RE inicial puede negativizarse a lo largo del curso

de la enfermedad perdiendo la sensibilidad a dicho tratamiento hormonal [427].

Explicar este hecho y encontrar la causa por la que el cambio de fenotipo sucede es

complejo sin que actualmente se haya podido describir una causa genética como

deleciones, translocaciones, reagrupamientos o inserciones que puedan ser

responsables del cambio en el perfil de expresión de RE [428].

En nuestra revisión de la literatura relacionada con este tema no hemos podido

encontrar que se hayan realizado estudios que correlacionen el perfil epigenético

de metilación y su relación con el estado de expresión de RE o con otros factores

pronósticos como la amplificación de HER2-neu. Distintos autores han descrito que

la expresión de RE en el tumor correlaciona con la metilación de diferentes genes y

a su vez con un mejor o peor pronóstico, pero aún no se ha analizado la metilación

del promotor del gen RE con la ausencia de expresión de RE en tumor. Así autores

como Widschwendter y col.[337] han descrito la existencia de relación entre el

estado de metilación de APC y casos de cáncer de mama RE-positivo mientras que

otros trabajos como el de Li y col. [429] han sugerido que en pacientes RE-positivo

parecía existir hipermetilación de los promotores del gen Twist con mayor


- 207 -

frecuencia mientras que la metilación del promotor del gen CDH1 ocurría con

mayor frecuencia en pacientes con tumores RE-negativos.

En este trabajo de investigación y partiendo de los casos en los que hemos

encontrado hipermetilación del promotor de ESR1 en el suero de las pacientes con

cáncer de mama, hemos sometido a análisis esta señal de silenciamiento

epigenético del gen ESR1 con el fenotipo luminal encontrado al estudiar

histopatológicamente el tumor con la ausencia de expresión de la proteína RE en el

tumor. Para ello hemos analizado la correlación entre el estado de expresión de RE

en el tumor y el estado de metilación de la región promotora de ESR1 aislado en el

suero de las pacientes. De los resultados obtenidos se observó que el estado

metilado de ERS1 en el suero se correlacionaba de forma estadísticamente

significativa con la ausencia de expresión de RE en tumor y viceversa (p=0.0179).

Este resultado concuerda con los datos publicados por Lapidus y col. y Ottaviano y

col. [375, 430] en líneas celulares de cáncer de mama. En efecto, estos autores han

descrito que el promotor ubicado en el exón 1 del gen RE se encuentra altamente

metilado en las líneas celulares que no expresan RE y en cambio no está metilado

en el tejido mamario normal y en las líneas celulares de cáncer de mama que

expresan una proteína receptora de estrógenos funcionante.

Al analizar lo que sucede al correlacionar el fenotipo luminal con estado de

metilación de RE, observamos que en los casos con fenotipo de mejor pronóstico

(luminal A y luminal B) predomina la forma molecular no metilada del promotor

del gen ESR1, es decir, existe cierto nivel de correlación entre la expresión de RE y

mejor pronóstico, mientras que en los fenotipos con peor pronóstico (Her2-neu y

triple negativo) predomina la forma molecular metilada (p<0.05). Incluso al

analizar en cada fenotipo luminal el porcentaje de ESR1 metilado frente a ESR1 no

metilado, observamos como dentro de cada subgrupo aquellos que presentan ESR1

no metilado y por lo tanto expresan receptores de estrógenos tienen una tendencia

a mejor supervivencia que aquellos que son ESR1 metilados. Por lo tanto parece

que el la variante molecular del promotor del gen ESR1 –metilada, no-metilada,

aporta información pronóstica adicional a los factores pronósticos que

actualmente manejamos en oncología clínica del cáncer de mama.


- 208 -

Es decir a la vista de estos resultados podemos decir que el silenciamiento

génico por metilación de la región promotora del gen del receptor de estrógenos

ESR1 tiene un importante papel en la expresión de la proteína que dicho gen

codifica, que repercute sobre su presencia en el tumor primario, encontrándose

que la proteína está ausente en el tumor (RE-negativo) cuando en sangre periférica

el promotor del gen está metilado y viceversa. Estos datos demuestran que el ADN

del tumor llega a la circulación periférica donde puede identificarse y que de su

estudio pueden surgir elementos que faciliten el pronóstico o indiquen cual puede

ser la respuesta a determinado tipo de tratamiento. Por otra parte como la

metilación en cáncer es un evento reversible también es claro que su modulación

pueda en un futuro constituirse como una diana terapéutica sobre la que sea

posible actuar clínicamente.

CONCLUSIONES

Joaquina Martínez-Galán Conclusiones

211

6. CONCLUSIONES.

Los resultados obtenidos en este trabajo nos han permitido formular las siguientes

conclusiones:

6.1 Las alteraciones epigenéticas del genoma como la metilación de la región

promotora del ADN y remodelación de la cromatina que tienen un papel clave en la

iniciación y progresión del cáncer, pueden ser detectadas y cuantificadas a partir de

muestras procedentes del suero de pacientes mediante la técnica de detección del ADN

por la reacción cadena de la polimerasa específica de metilación.

6.2 La cuantificación en sangre periférica del perfil de metilación en población sana

a partir de los resultados obtenidos podría ser utilizada como prueba complementaria a las

conocidas en el momento actual en el diagnóstico precoz si bien aún son necesarios más

estudios prospectivos que validen esta técnica para dicho fin.

6.3 Así mismo la cuantificación en sangre periférica del perfil de metilación en

población afecta de cáncer de mama de los promotores 14-3-3 sigma y RE puede ser de

utilidad para monitorizar la respuesta al tratamiento así como para aportar información

pronóstica adicional sobre la evolución de las pacientes tratadas de cáncer de mama.

6.4 De la correlación entre ESR1 metilado en suero y la ausencia de expresión de RE

en el tumor, podemos deducir que la metilación representa un importante mecanismo de

silenciamiento génico en la carcinogénesis del cáncer de mama que explica en gran parte

la ausencia de expresión de receptores hormonales en el tumor y con ello la

hormonoresistencia al tratamiento hormonal.

6.5 La metilación del ADN puede diferenciar subgrupos pronósticos dentro del

fenotipo luminal que nos aproximan a un mejor conocimiento de los mecanismos de

silenciamiento implicados en la ausencia de transcripción de factores implicados la

correcta regulación del ciclo celular favoreciéndose la actividad de factores estimulantes

de proliferación y supervivencia celular incontrolado.

PUBLICACIONES Y COMUNICACIONES

Joaquina Martínez-Galán Publicaciones y Comunicaciones

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MÉDICA (SEOM). Correlación del estado de metilación en tumor y suero del

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Joaquina Martínez-Galán Abreviaturas

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8. ABREVIATURAS.

ADN: Ácido desoxirribonucleico.

CDIS: Carcinoma ductal in situ.

CK: Citoqueratinas.

EGFR: Receptor del factor de crecimiento epidérmico.

FISH: Hibridación in situ.

IC: Intervalo de confianza.

IGF: Insulin Growth Factor.

IHQ: Inmunohistoquímica.

IMC: Índice de masa corporal.

MFQ: Mastopatía Fibroquística.

Mv: Mega-electrón voltios.

NIH: National Institutes of Health.

Pb: Pares de base.

PCR: Reacción de polimerasa en cadena.

Seg: Segundos.

SG: Supervivencia global.

SLE: Supervivencia libre de enfermedad.

RE: Receptores de estrógenos.

RH: Receptores hormonales.

RM: Resonancia Magnética.

RNA m: Ácido Ribonucleico mensajero.

RNA mi: Micro RNA.

RP: Receptores de progesterona.

RR: Riesgo relativo.

TSH: Terapia hormonal sustitutiva.

UTDL: Unidad terminal ducto-lobulillar.

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