UNIVERSIDAD AUTONOMA DE PUEBLA

Tonanzintla 2014

“Modelos in-silicio: desde los canales

iónicos a la terapia genética

Que sabemos……

………fatales……..

…..como lo sabemos…..

+

+

+

+

+

P

NH2 COOH

S4 S5 S3 S2 S1

OUT

IN - -

-

Canal de sodio

ß1 S6

Aminoquinolinas Efecto tóxico …

INa Ito Ik1 Ik

Primaquina

Cloroquina

Quinidina

4,7-dicloroquinolina

++ - - -

+ - ++ +

+ +++ - +

- ++ - +(Ikr)

Vm (mV)

-120 -80 -40 0 40

Im (pA)

-4000

-2000

0

2000

4000

[PQ]

1 10 100

Inhib

itio

n o

f I N

a (

%)

0

25

50

75

100

A B

Time (min)

Rela

tive I

Na

Curr

ent

0.0

0.5

1.0 3µM

10 µM

30 µM

12

8 16 24 32

5 ms

1 n

A

1

2

A B

1 n

A

P1P1 P1

P20

P20

,P20

C 1Hz 2 Hz

n

-20 mV

Vh

10 ms

Pulse Number

0 5 10 15 20

Norm

aliz

ed I N

a

0.0

0.5

1.0

Time (ms)

0 50 100 150

Norm

aliz

ed I

Na

0.0

0.5

1.0

200

A B

Sitio de unión Toxina o droga Dominio Efecto fisiológico

1 Tetrodotoxina (TTX)

Saxitoxina (STX)

µ-Conotoxina

IS2-S6,IIS2-S6,

IIS2-S6,IVS2-S6

Bloqueo del canal Inhibición del

transporte iónico

2 Veratridina

Batracotoxina (BTX)

Aconitina

Grayanotoxina (GTX)

IS6,IVS6 Activación persistente

3 -toxina de escorpiones de África

del Norte

Toxinas de anémona de mar

(ATX)

-atracotoxinas

IS5-IS6,IVS3-S4,

IVS5-S6

Inactivación lenta; incremento de la

activación persistente

4 -toxinas de escorpiones

americanos

IIS1-S2,IIS3-S4 Actividad repetitiva transitoria y

bloqueo corrimiento de la

activación dependiente de voltaje a

potenciales más negativos

5 Brevetoxinas (PbTx)

Ciguatoxinas (CTX)

IS6, IVS5 Actividad repetitiva; activación

persistente corrimiento de la

activación dependiente de voltaje a

potenciales más negativos

6? Piretroides

DDT

No establecido Actividad repetitiva y/o bloqueo;

retardo de la activación, Inactivación y

desactivación

Sitio no

identificado

DPI 201-106 No establecido Prolongación del potencial de acción

Sitio receptor a

anestésicos

locales

Anestésicos locales,

antiarrítmicos*, antiepilépticos

IS6,IIIS6,IVS6 Bloqueo del canal

Fármaco Sistema Biológico

Actividad biológica

Toxicidad

Sistemas Biológicos

Receptores

Células

Órganos

Organismos

Poblaciones

Absorción

Distribución

Metabolismo

Excreción

Farmacodinamia (Que le hace el fármaco al sistema)

Farmacocinética (Que le hacen los sistemas biológicos al fármaco)

Estructura

cristalina

del blanco

es

conocida?

Acercamiento basado en

estructura

Creación de un

farmacóforo del lugar de

unión

Acercamiento con base en

el ligando

Usar bases de datos para

comprender la biología del

ligando

Examinar ligandos de

blancos similares

Búsqueda en base de

datos

Búsqueda rápida

experimental

Docking del ligando

Modelo homologo

comparativo

La estructura

cristalina de

un blanco

similar es

conocida?

La

estructura

del

ligando es

conocida?

Identificación de nuevos

ligandos

SI

NO

SI

SI

NO

NO

Expresión del canal de sodio

•El DNAc del canal de sodio, fue microinyectado en los ovocitos

del Xenopus laevis.

• Ambas subuniades y fueron microinyectadas en una

proporción de 1:5 para asegurar una cinética normal del canal.

Inyección del DNA

Inyección

nuclear de

50nL de DNA

en le polo

animal.

Exploración

de la corriente

producida por

los ovocitos

(1-6 mA)

Examinación por

fluorescencia de la

intensidad de la

expresión de los

canales por medio de

microscopia confocal.

13

14 15

Expresión de canales de Sodio en ovocitos de la rana

Xenopus laevis

Mutantes del poro con cisteina:

Dominio I Y401C

Dominio I D400C

Dominio II E758C

Dominio III K1237C

Dominio IV F1579A

Dominio IV A1529C

Topología del canal de sodio

IFM

N

I II III IV

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

C

Mutantes del poro con cisteina:

Dominio I W402C

Dominio II W756C

Dominio III W1239C

Dominio IV W1531C

Vista superior del canal de sodio. La bola gris representa un ión de sodio.

Vista lateral del canal de sodio. Se representan los dominios I (Magenta), II (verde), III (amarillo), y IV (naranja). Las bolas y bastones pequeños (al centro) representan el motivo DEKA. Las bolas medianas (azul , gris y celeste),representan a la primaquina en su docking con el canal.

Acercamiento de la vista anterior.

Simplificación del docking de la primaquina y su posible interacción con el sodio (pelota gris)

in

out

DEKA

PQ

Nav W756C - 1

Em (mV)

-100 -80 -60 -40 -20 0 20 40

I Na

norm

alizad

a

-1,0

-0,8

-0,6

-0,4

-0,2

0,0

W756C Control n=6

W756C PQ 10 M n=6

Nav 1.4 - 1

Em (mV)

-100 -80 -60 -40 -20 0 20 40

I Na n

orm

alizad

a

-1,0

-0,8

-0,6

-0,4

-0,2

0,0

Nav 1.4 Control n=5

Nav 1.4 PQ10 M n=5

-100 mV

+50 mV30 ms10 ms

1

A

10 ms

1

A

Nav 1.4 - 1

Em (mV)

-100 -80 -60 -40 -20 0 20 40

I Na

no

rma

liza

da

-1,0

-0,8

-0,6

-0,4

-0,2

0,0

Control n=3

Post inyecc PQ60 M n=3

10 ms

2

A

0 20 40 60 80 100

% de Bloqueo por PQ 10 M

Nav 1.4

F1579C

Y401C

D400C

E758C

K1237C

A1529C

W756C

W1239C

W1531C

Biología Molecular Lourdes Millan PérezPeña Alfredo Sánchez Solano Modelos In-Silico Thomas F. Scior Angel A. Islas

Laboratorio de Biofísica Cardíaca

Electrofisiología Evelyn Martínez Morales Claudia Mancilla Simbro Erwin J. Pérez Cortez