Apo 9. Replicación Viral

2009Virología General

Microbiologia I

EVENTOS TEMPRANOS DE LA REPLICACION VIRAL

generalidades: REPLICACION

VIRAL

generalidades: REPLICACION

VIRAL

ADN

ARN

Proteínas Estructurales

Enzimas y proteínas de unión a ac. nucleicos

Nucleoproteina

Nucleoproteina

Virus Desnudos

Glicoproteinas y membrana

Virus Envueltos

REPLICACION VIRAL : Eventos Tempranos

1. Adhesion: el virus usa proteínas especificas para adherirse a moleculas en la superficie de la celula (“receptores”). Es una interaccion ionica. No es una reaccion enzimatica. Ocurre en un amplio rango de temperaturas. El numero y la naturaleza de los receptores en las celulas varía ampliamente

Adhesion viral: EJEMPLO DE RECEPTORESVIRUS PROTEINA CELULA RECEPTOR

VIRAL BLANCO CELULAR

EBV gp/350/220 B cell. Epitelio CD21 (C’ receptor)

Rinovirus VP1, 3 epitelio Nasal ICAM-1

Poliovirus VP1 GI epitelio Superfamilia de Ig

Hu Coronavirus gp180 epitelio TRS GI aminopeptidasa N

Influenzavirus HA epitelio TRS sialic-glycoprotein

Parainfluenzavirus HN URT epitelio gangliosido GD1a

Rotavirus VP4/VP7 GI epitelio sialic glycoprotein

HIV-1 gp120 T cell, Mϕ, CNS CD4 + correceptor*

* -cepas HIV-1 con tropismo a celulas T usan el receptor alfa chemokine como co-receptor; mientras, cepas HIV-1 con tropismo a macrofagos usan el receptor beta chemokine como co-receptor. Todas las cepas usan el CD4 como receptor principal al cual los peplomeros de gp120 se adhieren.

Adhesion viral: EJEMPLO DE RECEPTORES. Virus de Influenza tiene diferente afinidad por receptores dependiendo del huesped


2. Penetración: el virus entra a la celula via viropexis o fusion (solo en algunos virus envueltos). Usa energia; temperatura dependiente. Viropexis es un proceso similar a la endocitosos mediada por receptor; la membrana celular forma vesiculas que transportan al virion dentro de la celula y se fusiona con endosomas o lisosomas (fusion interna) para liberar al genoma. En algunos virus envueltos, la fusion es mediada por peplomeros fusogenicos. El envelope se funde con la membrana celular

Penetracion por Viropexis

El virion adherido es introducido en una vesicula de la membrana celular que entra a la celula & donde se genera una fusion interna con endosomas o lisosomas a bajo pH.

Micrografia Electronica de un virion de Togavirus entrando a la celula via Viropexis.

Entrada del virus por ENDOCITOSIS

PENETRACION POR FUSION: un virion de Herpes simplex tipo 1 comienza su fusion (flecha) con la membrana plasmatica. La fusion es mediada por peplomeros virales especificos (glicoproteinas) que tienen un dominio fusogenico. La Fusion es temperatura dependiente.


3. Desnudamiento: el envelope y, en algunos casos, la capside es eliminada para que el genoma pueda ser expresado. Virus con capside helical sufren un desnudamiento parcial. Mientras el genoma es expresado, esa parte de la capside es temporariamente desplazada. Si el virion entra via viropexis, el paso de fusion interna con el endosoma o lisosoma produce el desnudamiento.


Desnudamiento en virus de Influenza. Rol de M2 dependiente de pH

Desnudamiento: una particula de Adenovirus (V) penetra y es desnudada. Ocurre una perdida de fibras del penton (VU1). En elcitoplasma se libera la capside y se expone el core (VU2). En VU4 el core entra al nucleo; alternativamente, en VU3 el ADN viral entra al nucleo por via de un poro.

Core

Replicacion de los virus ADN. Vision idealizada. La transcripcion del genoma a ARNm viral ocurre en el nucleo (excepto para Poxviridae). La fase temprana de transcripcion es dividida usualmente en inmediata temprana y temprana. Los primeros ARNms codifican proteinas virales regulatorias. Los ARNms tardios codifican para proteinas estructurales.

Traduccion: ocurre en el citoplasma.

Ensamble: ocurre en el nucleo y el virus egresa.

Adhesión

Penetración

Desnudamiento

Transcripcion del mRNA temprano

Trascripción de proteínas tempranas

Trascripción del mRNA tardío

Trascripción de proteínas tardías

Replicación del DNA viral

Ensamble de los viriones

Liberación

Generalidades de REPLICACION de VIRUS ADNFAMILIA REPLICACION REPLICACION del ADN

Parvoviridae Nucleo Usa una ADN polimerasa celular

Papovaviridae Nucleo Usa una ADN polimerasa celular

Adenoviridae Nucleo Usa ADN polimerasa Viral

Herpesviridae Nucleo Usa ADN polimerasa Viral

Poxviridae Citoplasma Muchas enzimas codificadas por el virus; el virus codifica transcriptasa y ADN polimerasas.

Hepadnaviridae Nucleo REPLICACION UNICA. El ADN es replicado via un intermediario de RNA y por una Transcriptasa reversa codificada por el virus que lo transforma en ADN.

Sintesis de los pasos de REPLICACION de VIRUS ADN

i) ADN ---> mRNA temprano ---> PROTEÍNAS tempranas ii) ADN ---> ADN iii) ADN ---> ARNm tardío ---> PROTEÍNAS tardías

GENERALIDADES SOBRE LA REPLICACION DE LOS VIRUS ARN

Hay cuatro estrategias principales1.Virus cuyo RNA es de una sola cadena y su polaridad positiva.Este RNA sirve como RNA mensajero, dirigiendo la síntesis deproteínas virales in vitro (por ej, el virus de la poliomielitis). En este caso, actúa como RNA mensajero policistrónico. Cuando se traduce, se sintetiza un sólo polipéptido precursor, que rápidamente se rompe dando lugar a proteínas estructurales y no-estructurales. Estas últimas son las encargadas de replicar al RNA viral, de inhibir la síntesis de componentes celulares, etc. Como las células vivas no son capaces de realizar el proceso de síntesis de RNA a partir de RNA la enzima que cataliza la replicación del RNA viral es una RNA Polimerasa RNA-dependiente, codificada x el virus. El RNA genomico es infeccioso.

i) RNA + ---> PROTEÍNAS ii) RNA + ---> RNA - ---> RNA +

GENERALIDADES SOBRE LA REPLICACION DE LOS

VIRUS ARN2. Virus RNA de cadena simple, pudiendo estar o no fragmentado y de

polaridad negativa. El RNA viral no actúa como RNA mensajero, dado que tiene polaridad negativa (ej: virus influenza). La síntesis de ácido nucleico y proteínas virales se resuelve con la síntesis de un RNA de polaridad positiva que sirve como molde para la síntesis de nuevas moléculas de RNA con polaridad negativa, las cuales constituyen el RNA genómico y además actúan como RNA mensajero en la síntesis de proteínas virales. Para sintetizar el RNA de polaridad positiva, complementario al genómico, utiliza una RNA polimerasa RNA-dependiente, que forma parte del virión y que posteriormente es sintetizada como una proteína viral, puesto que la información genética para esta proteína está contenida en el RNA viral. Estos procesos se resumen del modo siguiente: i) RNA - ---> RNA + ii) RNA + ---> PROTEÍNAS iii) RNA + ---> RNA –Genomico no infeccioso


VIRUS ARN3. Virus cuyo RNA es doble hebra, fragmentado. Estos traen consigo una RNA polimerasa RNA-dependiente que transcribe una cadena del RNA viral, sintetizando RNAm del mismo tamaño y complementarios al RNA parental, que dirigen la síntesis de proteínas virales. El virus genera además otras copias de RNA polimerasa RNA-dependiente que es la encargada de sintetizar RNA viral de doble cadena, que constituye el material genético de los viriones; para esto utiliza como molde las hebras de RNA sintetizadas por la enzima estructural del virión. Ejemplo, reovirus.


VIRUS ARN4. Retrovirus. Los retrovirus poseen dos copias de un RNA de cadena simple. La información genética contenida en estos RNA genómicos es copiada en reverso para generar una copia de DNA viral de doble cadena, que se integra al genoma celular, comportándose como otros genes celulares, dando origen a un mRNA y proteínas virales. Para realizar el proceso de síntesis de este DNA viral o transcripción inversa- es decir, síntesis de DNA a partir de RNA-, estos retrovirus poseen una enzima DNA polimerasa RNA dependiente, llamada comúnmente transcriptasa reversa. La transferencia de información genética ocurre de acuerdo a: i) RNA + ---> DNA - ---> DNA +-ii) DNA +- ---> mRNA ---> PROTEÍNAS iii) DNA +- ---> RNA V

ENCAPSIDACION: Las proteinas de la capside se autoensamblan. En algunos virus con capside icosaedrica, primero se forma una capside vacia y luego se inserta el genoma.Para virus con capside(s) helical, las proteinas de la capside se asocian con el nuevo RNA genomico a medida que es sintetizado. Algunos virus como Reoviridae, Poxviridae, etc. tienen un proceso de ensamble bastante complicado. Poxviridae se ensambla en el citoplasma.

ENVOLTURA: La envoltura de todos los virus es derivada de la membrana celular por un proceso de brotacion. Para viriones conuna proteina de Matriz (M), la proteina se asocia con el dominiocitoplasmico de los peplomeros insertados en la membrana celulary entonces la capside interactua con la proteina M para desencadenar la brotacion. Para viriones que no tienen proteinaM, la capside interactua con el dominio citoplasmico de los peplomeros insertados en la membrana celular para desencadenar la brotacion. Herpesviridae obtienen su envoltura a partir de la membrana nuclear interna en la cual el tegumento interactua con la misma. Herpesviridae pueden desenvolverse y adquirir una envoltura en el RE. Poxviridae tienen varias capas de envoltura

SLN simples contienen una prolina seguido por una corta cadena de residuos basicos. SLN bipartidos, como en polimerasa de adenovirus, tiene dos tramos de aminoacidos básicos separados por una secuencia espaciadora variable Estas SLN son reconocidas por moleculas de importacion como la importina-a. Proteinas que van y vienen al nucleo como Rev, poseen un segundo motivo, la señal de exportacion nuclear (SEN) caracterizada por un patron de residuos de leucina.

Señales de localización nuclear(SLN)

La translocacion del complejo de proteina dentro del nucleo requiere de Ran una proteina de union a nucleosidos de guanina en la forma de Ran–guanosina difosfato (GDP). Ran se une especificamente a ciertas nucleoporinas y media la transferenciadel complejo desde la cara citoplasmica del poro nuclear a la cara nuclear. En el nucleo, una proteina especifica de intercambio de nucleotidos (Rcc) convierte Ran- GDP en Ran–GTP y el complejo se disocia terminando el delivery de la carga de proteinas en el nucleo.

Importacion al Nucleo. La SLN es reconocida y ligada a la importina -a. Luego, la importina –b se une a este complejo y lo lleva hasta el poro nuclear donde se une a nucleoporinas en los filamentos citoplasmicos

Las proteinas a ser exportadas fuera del nucleo se unen a la exportina-1 a traves de su SEN. Este complejo, junto a Ran-GTP, se une a nucleoporinas localizadas en el complejo del poro e inician la translocacion al citoplasma. Una vez alli, Ran-GTP se convierte en Ran-GDP por una proteina de activacion de la Ran-GTPase (RanGAP-1), causando que el complejo carga-exportina-1-Ran se disocie, por lo tanto completa el delivery de la carga al citoplasma. Copyright © 2001 by Lippincott Williams & Wilkins

Ensamble de Poliovirus. La proteina precursora P1 es clivada dos veces en una reaccion autocatalitica por la proteasa 3CD- produciendo VP1, VP3, y VP0. Este clivaje es escencial para el ensamble de monomeros 5S en los pentameros 14S. Doce de esos pentameros se asocian directamente con el RNA genomico naciente para ensamblar un provirion inmaduro 150S. El clivaje de maduracion de la VP0 para producir las VP2 y VP4 resulta en la conversion del provirion inmaduro en el virion maduro de 160S.

Coronavirus localiza 3 proteinas de membrana (E, M, y S) en un compartimiento del RE, en el cual ocurre la brotacion viral. En contraste, la nucleocapside del virus vaccinia aparece envuelta en una doble memb. derivada de este compartimiento pero permanece libre el el citoplasma por lo que puede entonces ser envuelta por memb. derivadas del Golgi. Las glicoproteinas G1 y G2 de Bunyavirus se localizan en el compartimiento trans-Golgi para hacer brotar directamente las nucleocapsides desde alli.

Ensamble viral en la memb. celular. Herpesvirus, dos vias 1.brota en el lumen de la mem. nuclear y entonces es transportado a la sup. celular por la via secretoria; 2, virus tambien brota en el lumen de la mem. nuclear , pero se fusiona con la mem. Externa de la mem. nuclear para liberar la capside, que obtiene su envoltura del Golgi.

Rotavirus usa la memb del RE como plataforma de ensamble de las proteinas de la capside la cual es envuelta solo temporalmente, y las particulas no envueltas se acumulan en el lumen del RE

ENVOLTURA DE HERPESVIRIDAE : Una nucleocapside de Herpesvirus con su tegumento asociado obtiene inicialmente una envoltura de la membrana nuclear interna por brotacion desde el nucleo

Citoplasma

NUCLEO

Envoltura de Herpesvirus: Proceso en dos pasos

ENVOLTURA de HERPESVIRUS: Dos vías, A y B

SITIO DE ENVOLTURA DE PRINCIPALES FAMILIAS DE VIRUS

Familia Genoma Obtencion de envoltura Replica en de la mem. celular en

Herpesviridae Nucleo Nucleo

Poxviridae Citoplasma Golgi

Hepadnaviridae Nucleo R.E.

Flaviviridae Citoplasma mem. plasmatica

Coronaviridae Citoplasma Golgi

Bunyaviridae Citoplasma Golgi

Arenaviridae Citoplasma mem. plasmatica

Retroviridae Nucleo mem. plasmaticaOrthomyxoviridae Nucleo mem. plasmaticaRhabdoviridae Citoplasma mem. plasmaticaParamyxoviridae Citoplasma mem. plasmatica

Envoltura viral por brotacion desde la membrana plasmatica.

Arriba: peplomeros virales se insertan en la mem. plasmatica y empiezan a desplazar a proteinas celulares.

Centro: Capside con el genoma interactua con el dominio citoplasmico de los peplomeros dentro de la membrana plasmatica y empiezan a brotar.

Abajo: el virion se ha formado y obtuvo su envoltura por brotacion de una porcion modificada de la mem. plasmatica. La envoltura es bi-lipidica y tiene peplomeros de transmembrana compuestos de glicoproteinas virales.

Fuera de la celula

Maduracion de un virion de Paramixovirus: capsidehelicoidal acarreando genoma RNA que interactua con la proteina M que se ha unido a los peplomeros insertados en la membrana plasmatica. La brotacion desde la mem. Plasmatica forma el envelope.

A

Maduracion de Influenza HA & NA transportado al lipid raft. El complejo M1-vRNAP se exporta fuera del nucleo y puede unirse a HA/NA para ser transportado a este sitio rico en lipidos y brotar. El complejo M1-RNP tiene vRNA, NP, NEP, 3P, y M1.

Lipid Raft: Dominio rico en colesterol y glicoesfingolipidos; plataforma de ensamble viral.

Tetramero de M2 insertado en la memb. celular y en el virion tiene un canal. Importante en desnudamiento de los Tipo A. Blanco de drogas.

Curva ideal de crecimiento: El tiempo que requiere un virus para replicar y las cantidades relativas de virus liberado versus el que esta asociado a celulas varia entre los mismos.

Proteinas del virionLa lista sumariza las proteinas en los virus

1. CAPSIDE: Comprende la capside per se, sea icosaedrica, helicoidal, de simetria compleja. Capside helicoidal tiene una sola proteina.

2. MATRIZ: Algunos (no todos) virus envueltos tienen proteina M3. PEPLOMERO: estructura glicoproteica en todos los viriones

envueltos4. CORE: proteinas internas asociadas al genoma (ej. polio VP4 )5. ENZIMAS: Algunos viruses tienen enzimas en el virion: Todos los

Virus RNA Negativos; Retroviridae; Poxviridae, Hepadnaviridae6. FIBRAS de Adenovirus; la fibra esta en cada vertice; NO es un

peplomero7. Proteina M2 (Canal) : Presente en Orthomyxoviridae Tipo A8. TEGUMENTO: capa entre la capside y el envelope en Herpesviridae.

Aloja algunas proteinas regulatorias.9. RIBOSOMAS: atrapados en los Arenaviridae; No tienen ninguna

funcion.

Funcion de las proteinas virales No estructurales

1. REPLICACION: RNA Pol; DNA Pol; Timidine Kinasa; Helicasa; etc.

2. TRANSCRIPCION: RNA Pol; Poly-A Pol; DNA-binding; Metilasa; etc.

3. INHIBEN al HUESPED: Destruye mRNA; Bloquean sintesis proteica; Roban el cap del mRNA celular; Daña la mem. cel; Inhibe el transporte de mRNA; Altera citoesqueleto; muchos otros efectos celulares

4. INHIBE RESPUESTA INMUNE : Bloqueo de MHC; del procesamiento de Ag; Destruye moleculas CD4; mata macrofagos, etc.

5. TRANSFORMACION: Varios mecanismos para transformar la celula Muchos Retroviridae codifican cONC

HTLV I y II usan gen TAX Oncoproteinas de virus tumoral DNA bloquean supresores de tumor Hepatitis C and Hepatitis B: Mecanismo no bien entendido

Se basa en el contenido genetico y en la estrategia de replicacion de los virus. El material genetico de todo tipo de celulas es ADN de doble cadena, pero algunos virus usan RNA o DNA de cadena simple para codificar su informacion.

De acuerdo con la clasificacion de Baltimore, los virus se dividen en las sig. siete clases:

virus ADN dcvirus ADN csvirus ARN dcvirus ARN cs sentido(+)-virus ARN cs sentido(-) -virus ARN transcripcion reversavirus ADN transcripcion reversaDonde “dc" representa "doble cadena" y “cs" representa “cadena

simple".

La Clasificacion de Baltimore

El ARNm es definido como cadena positiva(+) porque contiene informacion que puede ser traducida inmediatamente.

Una cadena de ADN de polaridad equivalente tambien es designada (+) pues, si fuera mRNa podria ser traducido a proteina.

La cadena de ARN y ADN complementaria a la (+) es la cadena (-).

Esta no puede ser traducida en las correspondientes proteinas; debe ser primero copiada para obtener su cadena (+)

Necesario convenir quegenomas ARN cadena simple

(sentido) Positivo

(anti-sentido) Negativo

AUG GCA CGA

UAC CGU GCU

met ala arg

• genomas ARN (sentido) +vo y (anti-sentido) -vo

Tabla 1-E-1. Ej de virus comunes.ss = cadena simple; ds = cadena doble. RNA (+) es el unico que puede funcionar como mRNA para la sintesis de proteinas. RNA(-) no

funciona como mRNA. Reovirus e influenza virus tienen genomas RNA segmentados;

Clase I: ADN de doble cadena (Adenovirus; Herpesvirus; Poxvirus; Papovavirus):Pueden ser subdivididos en dos grupos:

a) Replicación es exclusivamente nuclear (ej. Adenovirus, Papovavirus, Herpesvirus).La trascripción del genoma ocurre en ciclos sucesivos:Inmediato-Temprano } Dependiente de lo codificado por el virus. Temprano} factores de trans-activación.Tardio

b) Replicación ocurre en el citoplasma (ej. Poxvirus). Estos virus han desarrollado todos los factores necesarios para la trascripción/replicación y por lo tanto son independientes de la maquinaria celular.

Clase II: ADN de cadena simple, de sentido (+) (Parvovirus):La replicación ocurre en el núcleo, involucra la formación de 1 cadena de sentido (-) que sirve como molde para la síntesis de cadenas (+).

Clase III: ARN de cadena doble (Reovirus):Estos virus tienen genoma segmentado. Cada segmento genómico es traducido separadamente para producir mRNAsmonocistronicos.

Clase IV: ARN de cadena simple de sentido (+) (Picornavirus; Calicivirus; Togavirus; Flavivirus; Coronavirus):

Pueden ser sub divididos en dos grupos:

a) ARNm Policistronico ej. Picornavirus; Hepatitis A. Genoma ARN = ARNm. La traducción resulta en la formación de una poli proteína, la cual es subsecuentemente clivada para dar origen a las proteínas maduras.

b) Trascripción Compleja e.g. Togavirus. Son necesarios dos o más ciclos de traducción para producir ARN genomico.

Clase V: ARN de cadena simple de sentido (-) (Orthomyxovirus; Paramyxovirus; Rhabdovirus; Filovirus;Bunyavirus):

Pueden ser:

a) Segmentados. Ej. Orthomyxovirus. El primer paso en la replicación es la trascripción del genoma ARN de sentido (-) por la RNA-polimerasa del virion, dependiente de ARN para producir mRNAs monocistronicos, el que sirve también como molde para la replicación del genoma.

b) No-segmentados. Ej. Rhabdovirus. Replicación ocurre como en el anterior y se producen ARNmsmonocistronicos.

Clase VI: ARN de cadena simple de sentido (+) con intermediario de ADN (Retrovirus):

El genoma es de sentido (+) pero lo original entre los virus es que es DIPLOIDE, y no sirve como ARNm sino como molde para la trascripción reversa.

Clase VII: ADN de cadena doble con intermediario de ARN (Hepadnavirus):

Este grupo de virus también se basa en la trascripción reversa pero a diferencia de los Retrovirus esto ocurre dentro de la partícula en maduración. Cuando infecta una nueva célula, lo primero que ocurre es la reparación del genoma viral seguido por la trascripción.

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Apo 9. Replicación Viral