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Evaluación de un medio de cultivo para el aislamiento selectivo
de campylobacters termotolerantes
Evaluation of a culture medium for the selective isolation of
thermotolerant
campylobacters
Álvaro Tresierra-Ayala, Juan Huanaquiri, Ramsés Perea,
María Bendayán.
Laboratorio de Microbiología. Centro de Investigación de
Recursos Naturales, Universidad Nacional de la
Amazonía Peruana. Psje. Los Paujiles S/N, San Lorenzo,
distrito de San Juan Bautista, Iquitos-Perú.
Resumen
Se evaluó la capacidad de aislamiento selectivo de un medio de
cultivo para campylobacters termotolerantes,el cual fue
suplementado con sangre de porcino y agentes restrictivos (sales
biliares, tioglicolato de sodio,fucsina básica), en lugar de la
sangre de ovino o equino y diversos antibióticos que suelen ser
componentesde los medios comúnmente empleados. Se logró aislar e
identificar 20 cepas (13 de Campylobacter jejuni y 7de
Campylobacter coli ) de un total de 70 muestras,
determinándose que no había diferencia
estadísticamentesignificativa respecto a la capacidad de
aislamiento entre el medio de cultivo evaluado y el medio
Skirrowmodificado. Para el análisis comparativo de la
cuantificación del crecimiento de las cepas en ambos medios,
se empleó la técnica de Miles y Misra modificada [1] y se
observó que las cepas no mostraban diferenciaestadísticamente
significativa en cuanto a su crecimiento en los medios ensayados,
obteniéndose recuentospromedios de 23,4 x106 y 21,7x106 UFC/ml,
para la especie de C. coli en el medio de cultivo
evaluado y elmedio Skirrow modificado y de 44,6 x106 y 40,1 x106
UFC/ml para la especie C. jejuni en ambos medios
decultivo, respectivamente. El medio de cultivo evaluado permite la
misma capacidad de aislamiento selectivopara campylobacters
termotolerantes que el medio Skirrow modificado; además, estos
agentes microbianoscrecen cuantitativamente de modo similar en
ambos medios de cultivo.
Descriptores: Campylobacter, medio de cultivo, sangre
de porcino, sales y colorantes.
Abstract
The ability of selective isolation of a culture medium for
thermotolerant campylobacters, supplemented with pigblood and
restrictive agents (bile salts, sodium thioglycollate, basic
fuchsin), instead of the blood of sheep orhorses and various
antibiotics which are often components of the means commonly
employed was evaluated.Twenty strains (13 C. coli y 7 C.
jejuni ) were isolated and identified from a total of 70
samples There was notsignificant difference with respect to the
isolation ability between the culture medium evaluated and
themodified Skirrow medium. For the comparative analysis about
quantification of the growth of strains in bothmedia, Miles and
Misra technique, modified [1], was employed. So, it was determined
that the strains showedno significant difference with respect to
their growth on both media studied. Average growth of 23,4 x 10 6
and21,7 x 106 CFU/ml for C. coli in culture medium
evaluated and the modified Skirrow medium, and 44,6 x 106 and
40,1 x 106 CFU/ml for C. jejuni in both culture
media, respectively, were detected. Culture mediumevaluated allows
the same ability selective isolation of thermotolerant
campylobacter than modified Skirrow
medium; moreover, these microbial agents grow similarly
quantitatively in both culture
media.Keywords: Campylobacter, culture medium, blood pig,
salts and dyes.
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1. Introducción
Las bacterias termotolerantes del géneroCampylobacter , se
caracterizan por ser baciloscurvos Gram negativos, de crecimiento
lento,
microaerófílos, cuya temperatura óptima decrecimiento es de 42°C
(termotolerantes) y se lesconsidera microorganismos
nutricionalmenteexigentes [2].
Entre estos seres microscópicos, C. jejuni y C.
coli se han mostrado como unos de los más
importantesagentes etiológicos de enteritis y en ocasiones
deinfección generalizada u otras patologías [3]. Algunos
investigadores responsabilizaron a estosagentes como la causa del
23% de cuadrosdiarreicos producidos a niños de la ciudad de
Iquitos[4]. Sin embargo, los laboratorios de análisis clínicosde la
región amazónica no incluyen en elcoprocultivo rutinario la
búsqueda de estos agentes;lo cual podría deberse, entre muchas
razones, alelevado costo del análisis y a la dificultad
depreparación de los medios de cultivo empleadospara el aislamiento
de los campylobacters.
En esta región, resulta dificultoso agenciarse desangre de ovino
o equino (componente de lamayoría de medios de cultivo para estos
agentes),
ya que su crianza es escasa y tomando como baselos estudios
realizados por algunos investigadores[5, 6[, se plantea la
posibilidad de utilizar otrasfuentes abundantes de sangre, en vez
de la de ovinoo equino, que son difíciles de conseguir.
El empleo de sales y colorantes, en reemplazo de lamezcla de
antibióticos empleada en todos losmedios para campylobacters,
facilitaría su procesode preparación, Este hecho disminuiría el
precio deestos medios de aislamiento y de este modo,
loslaboratorios de análisis clínicos podrían incluir la
búsqueda de estos enteropatógenos al realizar loscoprocultivos
rutinarios.Es así que el objetivo delpresente estudio fue evaluar
la capacidad deaislamiento selectivo de un medio de cultivo
paracampylobacters termotolerantes, el cual fuesuplementado con
sangre de porcino y agentesrestrictivos (sales y colorante).
2. Materiales y Métodos
Setenta muestras del contenido intestinal de aves de
corral (55 pollos y 15 patos), de la ciudad de Iquitos,obtenidas
mediante la técnica del hisopado cloacal,fueron depositadas en
tubos con medio de
transporte y enriquecimiento selectivo
paraCampylobacter [7], para su análisis
respectivo.Posteriormente, estas fueron sembradas tanto enplacas
con agar Skirrow modificado como con elmedio de cultivo evaluado (3
mg/L de sales biliares,
5 mg/L de tioglicolato de sodio y 2 mg/L de fucsinabásica), e
incubadas bajo condiciones demicroaerofilia a 42 °C durante 48 h. A
las coloniascon características sospechosas de pertenecer algénero
Campylobacter, se les realizó pruebas parala identificación
presuntiva (características de lacolonia, morfología celular,
prueba de la catalasa yoxidasa), y `posteriormente, pruebas para
laidentificación confirmativa (hidrólisis del hipurato
ysensibilidad al ácido nalidíxico) [8].
Las cepas identificadas como campylobacterstermotolerantes,
fueron sembradas, por duplicado,en el medio Skirrow modificado y
medio de cultivoevaluado, mediante la técnica de microrrecuento
deMiles y Misra modificada [1], para determinar lacapacidad de
crecimiento de las cepas
deCampylobacter termotolerantes
3. Resultados
De las 70 muestras procesadas, 20 (28,6%)resultaron positivas
para especies de Campylobacter
termotolerantes (Tabla N°1). Además, se observóque el porcentaje
de aislamiento más alto se obtuvoen las muestras procedentes de
pollos (29,1%),mientras que las muestras obtenidas de
patosmostraron un 26,7% de positividad. También sepudo apreciar que
la especie más frecuentementeaislada fue C.
jejuni (18,6%); mientras que C. coli seaisló
en menor frecuencia (10,0 %). En pollos ypatos, la especie más
frecuentemente aislada fue C. jejuni (18,2% y
20.0%, respectivamente), mientrasque la de menor frecuencia fue C.
coli (10,9% y6.7%, respectivamente).
De las 20 muestras positivas detectadas en el agarSkirrow
modificado, sólo 16 fueron consideradascomo tales en el medio
propuesto (Tabla N° 2),diferencia que no fue estadísticamente
significativa(p≥0.05). Cabe señalar, que ambos mediospermitieron
aislar la totalidad de cepas de C. coli ; sinembargo, el medio
de cultivo evaluado, a diferenciadel Skirrow modificado en el que
se aisló la totalidadde cepas, sólo permitió aislar el 69,2% de
cepas deC. jejuni . De acuerdo al análisis
estadísticorealizado, esta diferencia no fue significativa
(p≥0,05).
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La tabla N° 3 muestra los promedios de las dosrepeticiones que
se obtuvieron del recuento deUFC/ml, al comparar la capacidad de
crecimiento delas 20 cepas de Campylobacter ,
previamenteaisladas, en el medio de cultivo propuesto y el
medioSkirrow modificado. Se puede observar que las 20
cepas crecieron en ambos medios, con una ligeradiferencia entre
ellos, la cual resultó no serestadísticamente significativa
(p≥0.05). De igualmodo, sucedió con el crecimiento a nivel
deespecies.
4. Discusión
Las 20 cepas de Campylobacter fueron aisladas deaves de corral,
para lo cual fue necesario muestreara 70 especímenes, esto equivale
a una tasa deaislamiento de 28,6%, valor que es menor alregistrado
por Bernuy & Pereyra [9], quienesreportaron una tasa de
aislamiento de 39,0% enaves de corral de la ciudad de Iquitos.
Estasbacterias fueron aisladas del 29,1% de pollos,porcentaje que
resultó ser notoriamente menor conrespecto al 54,0% registrado en
1994 [9]; sinembargo, los porcentajes de aislamiento a partir
depatos, tanto en este estudio como en el anterior,fueron muy
similares.
En cuanto al análisis comparativo de la capacidad de
aislamiento de Campylobacter termotolerantes entreel
medio de cultivo evaluado y el medio Skirrowmodificado, se observó
que ambos permitían elaislamiento selectivo de estas bacterias,
puesto quede las 70 muestras analizadas, el medio de
Skirrowmodificado permitió aislar 20 cepas
deCampylobacter termotolerantes mientras que elmedio de
cultivo evaluado permitió aislar sólo a 16
de estas; sin embargo, dicha diferencia resultó noser
estadísticamente significativa. (p≥0.05).
Cabe destacar la acción restrictiva producida por losagentes
antimicrobianos empleados en lacomposición del medio de cultivo
propuesto (sales
biliares, tioglicolato de sodio y fucsina básica), sinembargo,
sus concentraciones no eran suficientespara restringir el
crecimiento de todos los agentesbacterianos presentes en el
contenido intestinal delas aves muestreadas. Teniendo en
consideraciónque estos agentes son compuestos químicos que
seutilizan con fines de aislamiento selectivo,mayormente para
bacterias Gram negativas, comolas enterobacterias y otras de
importanciamicrobiológica, es aceptable pensar que
estosmicroorganismos se encuentren en el contenidointestinal de las
aves y por consiguiente, crezcan enmedios de cultivo que tienen
este tipo de agentes.Se podría pensar, que aumentando los valores
delas concentraciones de los agentes restrictivosutilizados en el
medio propuesto se podría lograrmejorar la capacidad de aislamiento
de dicho medio;pero el incrementar 10 veces la concentración de
loscolorantes del trifenilmetano podría inhibir elcrecimiento de la
propia bacteria que se desea aislary por tanto, esta no se aislaría
[10]. Este hechotambién lo observaron Adrianzén & Alava [3],
puestoque determinaron que concentraciones de sales
biliares, fucsina básica y tioglicolato de sodio,superiores a
las empleadas en el presente estudio,inhibían el crecimiento tanto
de C. jejuni como de C.coli . Por otro lado, es una
regla general el hecho quelos microorganismos Gram positivos son
mássusceptibles a estos compuestos que los Gramnegativos [10].
Tabla 1: Aislamiento y distribución de las especies
termotolerantes de Campylobacters en aves de corral
AVES DE CORRAL Nº
ESPECIETOTAL
C. jejuni C. coliNº % Nº % Nº %
POLLOSPATOS
5515
103
18.220.0
61
10.96.7
164
29.126.7
TOTAL 70 13 18.6 7 10.0 20 28.6
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Tabla 2: Capacidad de aislamiento de las cepas de
Campylobacter termotolerantes en el medio de cultivoSkirrow
modificado y el medio de cultivo evaluado.
p ≥ 0.05
Tabla 3: Número de UFC/ml de las cepas de Campylobacter
termotolerantes de acuerdo al medio decultivo empleado
Nº de Cepa EspecieMedios de Cultivo
Skirrow Modificado Medio Evaluado1 C. coli 36x10 27x10
2 C. coli 14x10 17x10
3 C. coli 20x10 20x10
4 C. coli 20x10
20x10
5 C. coli 30x10 20x10
6 C. coli 22x10 30x10
7 C. coli 10x106 30x106
8 C. jejuni 80x10 90x10
9 C. jejuni 70x10 100x10
10 C. jejuni 90x106 90x106
11 C. jejuni 10x10 20x10
12 C. jejuni 30x10 30x10
13 C. jejuni 29x106 33x106
14 C. jejuni 30x10 20x10
15 C. jejuni 60x10
100x10
16 C. jejuni 40x106 40x106
17 C. jejuni 16x106 16x106
18 C. jejuni 11x10 6x10
19 C. jejuni 5x106 5x106
20 C. jejuni 50x106 30x106
p ≥ 0.05
Algunos investigadores [1,11.12]; han sugerido quelas
cepas de C. coli suelen ser más resistentes
aantimicrobianos y a condiciones ambientales
adversas que las de C. jejuni . Este hecho tambiénfue
observado en el presente estudio, toda vez queel medio propuesto
permitió aislar a todas las
cepas de C. coli estudiadas, mas no a las de
C. jejuni , cuyo aislamiento se vio
dificultadoprobablemente debido a un escaso crecimiento de
las mismas o tal vez a un enmascaramiento delcrecimiento de las
colonias de C. jejuni por lapresencia de otros
contaminantes (Tabla Nº 2).
Nº de Cepa EspecieAislamiento en
Skirrow
Modificado
Medio
Evaluado
1,2,3,4,5,6,7 C. coli + +
8,9,10,12,13,15,17,18,20 C. jejuni + +
11,14,16,19 C. jejuni + -
Nº / % de cepas aisladas de 20 muestras positivas 20 / 100 16 /
80
N° / % de cepas de C. coli aisladas de 7 muestras
positivas 7 / 100 7 / 100
N° / % de cepas de C. jejuni aisladas de 13
muestraspositivas
13 / 100 9 / 69.2
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En cuanto al análisis comparativo de la capacidadde crecimiento
de las 20 cepas de Campylobacter termotolerantes entre
el medio de cultivo propuestoy el medio de Skirrow modificado
(Tabla Nº 3), seobservó que no existe diferencia significativa
(p≥0.05) respecto a la capacidad de crecimientocuantitativo de
las cepas en ambos medios, apesar que 4 de las cepas de C. jejuni
(N° 11,14,16 y 19), no fueron aisladas en el medio propuesto(Tabla
Nº 2), lo cual indica que esto se debíaprobablemente a la
dificultad de aislamiento dedichas cepas causada por el
enmascaramiento porparte de colonias contaminantes, posiblemente
deGram negativos y no, por la incapacidad decrecimiento de dichas
cepas. Para evitar esto,sería conveniente ensayar otros agentes
quetengan efecto restrictivo sobre estas bacteriascontaminantes
Gram negativas, capaces de creceren el medio propuesto, pero que a
su vez, noafecten el normal crecimiento de las
especiestermotolerantes de Campylobacter .
5. Conclusiones
El medio de cultivo propuesto permite la mismacapacidad de
aislamiento selectivo deCampylobacter termotolerantes
que el medio deSkirrow modificado.
Las cepas de Campylobacter termotolerantescrecen
cuantitativamente, de modo similar, en elmedio de cultivo propuesto
y en el medio de cultivoSkirrow modificado.
6. Referencias
[1] A. Tresierra-Ayala, R. Ruiz, M. Bendayán.H. Fernández.
Survival times ofCampylobacter coli in
sterilized buffalo milk.
J. Vet. Med. B. (1999), 46: 141-144.[2] F. Hernández. Cultivo de
bacteriasmicroaerofílicas: Campylobacter . Rev. Col.de MQC de
Costa Rica. (2002), 8: 48-54.
[3] P. Adrianzén, F. Alava. Efecto de algunassales y colorantes
sobre el crecimiento deCampylobacter coli y
Campylobacter jejuni subsp. jejuni. Tesis para
optar el TítuloProfesional de Biólogo. UniversidadNacional de la
Amazonia Peruana. Iquitos.54.
[4] O. Grados, N. Bravo,N. BLACK, et al. 1988.
Paediatric Campylobacter diarrhoea fromhousehold exposure to
live chickens in Lima,Peru. Boll. WHO. (1988), 66:
369-374.
[5] C. Anand, G. Rhonda,S. Helene, K.Fonseca, M. Olsen. Pig and
goat blood assubstitutes for sheep blood in
blood –supplemented agar media. J Clin Microbiol,(2000), 38:
591-594.
[6] J. Flores, M. Navas. Uso de la sangre de
vacuno y porcino para el crecimiento deCampylobacter
termotolerantes e influenciade pH del medio sobre su
capacidadhemolitica. Tesis para optar el TituloProfesional de
Biólogo. UniversidadNacional de la Amazonia Peruana. (2008):43.
[7] A. Tresierra-Ayala, M. Bendayán, A. Bernuy,G. Pereyra and H.
Fernández. Chicken aspotential contamination source ofCampylobacter
lari in Iquitos,Peru.Rev.Inst.Med.Trop.Sao Paolo,
(1994),36: 497 – 499.
[8] H. Lior. New extended biotyping scheme forCampylobacter
jejuni , Campylobacter coli and Campylobacter
laridis.J.Clin.Microbiol.(1984), 20: 636-640.
[9] A. Bernuy, G. Pereyra. Campylobactertermotolerantes en aves
de corral de laciudad de Iquitos. Tesis para optar el
TituloProfesional de Biólogo. UniversidadNacional de la Amazonía
Peruana. (1994).52.
[10] G. Pelczar et al. Microbiología. Segundaedición. Editorial
Mc GRAW HILL. México.(1982): 826.
[11] G. Prats, B. Mirelis, T. LLovet, C. Muñoz, E.Miró, F.
Navarro. Antibiotic resistance trendsin enteropathogenic bacteria
isolated in1985-87 and 1995-98 in Barcelona. Antimicrobial
Agents and Chemotherapy(2000), 44: 1144-1145.
[12] M. Aquino, A. Filgueiras, M. Ferreyra, S.Oliveira, M.
Bastos, A. Tibana, Antimicrobialresistance and plasmid profiles
of
Campylobacter jejuni and Campylobactercoli from human and animal
sources. Lettersin Applied Microbiology (2002), 34: 149-153.
