El desarrollo de la genética molecularen los últimos años, ha permitido laidentificación de genes y/o regiones

del cromosoma que contienen genes queafectan a caracteres de importancia eco-nómica. El tamaño de camada en conejo,es considerado un carácter económica-mente importante, y a pesar de que se haobtenido respuesta a la selección con losmétodos clásicos de selección (índices deselección o BLUP), esta respuesta es me-nor a la esperada, al igual que ocurre enotras especies prolíficas como el porcino.Estos métodos se basan en la predicciónde los valores aditivos de los animales uti-lizando sus datos fenotípicos así como lainformación genealógica. Sin embargo, encaso de caracteres de baja heredabilidad,en caracteres difíciles de medir, en carac-teres que se expresan en una etapa tardíadel animal, o caracteres en los que solo seexpresan en un sexo, el uso de la genéticamolecular puede ayudar a incrementar larespuesta genética (Peiró et al., 2006).

Los componentes biológicos que determi-nan el tamaño de camada al nacimientoson la tasa de ovulación, la tasa de fecun-dación y la mortalidad prenatal. A pesar deque la tasa de ovulación es el factor limi-tante del tamaño de camada, el carácterde mayor interés biológico es la mortalidadprenatal, tanto en las especies prolíficas,

como el conejo o el porcino, como en laespecie humana. En conejo, la mortalidadprenatal es de aproximadamente el 30%,y se puede dividir en mortalidad embrio-naria o preimplantacional (supone un15%) y mortalidad fetal o postimplanta-cional (supone un 20%) (Adams 1960;Santacreu, 1992; Santacreu et al. 2000).

El estudio de los factores que conducen alas alteraciones en el desarrollo embriona-rio y/o fetal es complejo pues existen ungran número de factores que están relacio-nados tales como factores de crecimiento,proteínas, receptores, ect. Una poblaciónF2 procedente de un cruce de animalesseleccionados de forma divergente para elmismo carácter es una población adecua-da para realizar este tipo de estudios, puesen principio solo se deberían haber modi-ficado el gen/los genes relacionados condicho carácter. En nuestro caso, medianteel cruce de las líneas divergentes seleccio-nadas por capacidad uterina (Argente etal., 1997) se ha constituido una poblaciónF2 adecuada para estudiar genes relacio-nados con la supervivencia embrionaria y/ofetal.

En conejo se ha realizado el primer trabajoexperimental en el que se utiliza la infor-mación genética molecular mediante untrabajo experimental llevado a cabo con laA

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ASPECTOS DE LA GENÉTICA MOLECULARCUNICOLA. CASO PRÁCTICO (2ª parte)Peiró R.1, García M.L.2, Agea I. 2, Argente M.J. 2

1Unidad de Mejora Genética, Departamento de Ciencia Animal. Universidad Politécnica

de Valencia (UPV), P.O. Box 22012, 46071 Valencia, España.2División de Producción Animal, Departamento de Tecnología Agroalimentaria.

Universidad Miguel Hernández de Elche (UMH), 03312 Orihuela, España

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colaboración de tres universidades: la Uni-versidad Politécnica de Valencia, Universi-dad Miguel Hernández y Universidad Au-tónoma de Barcelona.

1. EXPERIMENTO DE CAPACIDAD UTERINA

Debido a que la selección por tamaño decamada ha presentado una respuesta me-nor de la esperada se han propuesto dife-rentes métodos de selección indirecta: unode ellos ha sido la capacidad uterina. La ca-pacidad uterina fue definida por Christen-son et al. (1987) como el número de fetosque una hembra puede gestar sin que la ta-sa de ovulación sea un factor limitante.

Debido a que la coneja tiene dos cuernosuterinos independientes y por tanto no haytrasmigración uterina, la ovariectomía uni-lateral ha sido utilizada para estimar la ca-pacidad uterina. La ovariectomía unilateralconsiste en la extirpación de un ovario, pro-duciéndose una compensación ovárica enel ovario remanente, de manera que en pro-medio se duplica la tasa de ovulación y por

tanto el cuerno uterino funcional sea ates-tado con el doble de embriones que encondiciones normales (figura 4).

En el Departamento de Ciencia Animal dela Universidad Politécnica de Valencia seha llevado a cabo un experimento de se-lección por capacidad uterina medida co-mo el tamaño de camada en hembras uni-lateralmente ovarectomizadas (Argente etal., 1997). Después de 10 generacionesde selección divergente la línea seleccio-nada para incrementar la capacidad uteri-na (H) presentaba un mayor número deembriones implantados (1.9) y un mayortamaño de camada (2.3 gazapos) que lalínea seleccionada para disminuir la ca-pacidad uterina (Santacreu et al., 2005)aunque ambas líneas presentaban una ta-sa de ovulación similar (Mocé et al.,2002; Santacreu et al., 2005). Al estimarla respuesta entre ambas líneas (H y L)con una población control, se observó quela diferencia obtenida se debe a un des-censo de la supervivencia embrionaria yfetal de la línea L (Santacreu et al.,2005).

Figura 4: Tracto reproductivo a los 18 días de gestación de una hembra unila-

teralmente ovariectomizada.

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Debido a que parte de las diferencias entrelas líneas H y L se produjeron en las dos pri-meras generaciones de selección (Blasco etal., 2005) se supone la existencia de ungen mayor relacionado con la supervivenciaprenatal. Además, resultados de un análisisde segregación sugieren la existencia de unQTL segregando en la población base parala capacidad uterina y el número de embrio-nes implantados (Argente et al., 2003).

Debido a que no se disponían de suficien-tes marcadores moleculares distribuidos alo largo de todo el genoma en conejo pararealizar un análisis de ligamiento, se deci-dió realizar la búsqueda de QTL por laaproximación del gen candidato (se realizaen función de la fisiología del carácter) porlo que era importante conocer si las dife-rencias en supervivencia (o mortalidad) seproducían durante el proceso de implanta-ción o anteriormente.

Mocé et al. (2002) obtuvieron una super-vivencia embrionaria mayor en la línea Hque en la línea L en el sexto día de gesta-ción (antes de la implantación). Esta dife-rencia fue similar a la obtenida despuésde la implantación (Figura 5), por lo queel momento de la implantación no parecíaser el periodo crítico en el que se producí-an las diferencias en las perdidas embrio-narias. Al evaluar la supervivencia embrio-naria a las 72-75 horas de gestación la lí-nea H presentaba un mayor número de

embriones y un mayor desarrollo embrio-nario que la línea L (Mocé et al., 2004).

Estas diferencias encontradas en el númerode embriones empiezan a ser relevantes alas 62 horas de gestación, no encontrándo-se diferencias ni a las 25 ni a las 48 horasde gestación. En cuanto al desarrollo em-brionario, las líneas presentan un desarrollosimilar a las 25 horas de gestación, perotanto a las 48 como a las 62 horas de ges-tación la los embriones de la línea H pre-sentan un desarrollo embrionario superiorque los embriones de la línea L (Peiró et al.,2004).

2. GENES CANDIDATOS.

Una vez conocido en que momentos seproducían las diferencias en la superviven-cia y el desarrollo embrionario, se estudia-ron genes relacionados con proteínas queestuvieran presentes en el oviducto y úteroen las primeras etapas de la gestación ycuya actividad está relacionada con el des-arrollo y supervivencia del embrión:

• La uteroglobina es el principal compo-nente proteico (40-60%) de la secreciónuterina durante la implantación y está re-lacionado con la protección del blastocis-to, observándose en los embriones a partirdel día cuarto de gestación (Gutierrez-Sa-gal et al., 1993; Beier, 2000;). Además,su expresión esta regulada por la acción

Figura 5. Cronología de las diferencias observadas entre la línea de alta (H) y baja

(L) capacidad uterina durante la gestación.

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de las hormonas esteroideas en los tejidosreproductivos (progesterona y estradiol).• El receptor de la progesterona codifica auna proteína, la progesterona, que está re-lacionada con la liberación del ovocito ma-duro, la implantación del embrión, el man-tenimiento de la gestación y el crecimien-to uterino (Gutierrez-Sagal et al., 1993).En ausencia de la hormona, el receptor es

transcripcionalmente inactivo, de maneraque solo cuando la progesterona se uneproduce un cambio conformacional en elgen que produce que sea activo.• La oviductina es una proteína que se ex-presa en el oviducto y que está relaciona-da con la fecundación y el desarrollo em-brionario temprano (Hendrick et al., 2001;Buhi, 2002).

PARENTALES2 _ H 12 _ L

2 BB 2 AA2BB3Bb7bb

2AA1Aa9aa

PARENTALES2 _ L 5_ H

1Bb1bb

2 Aa4 BB1Bb

3 AA2 Aa

10 _ 70 _

2 BB8 Bb

2 AA8 Aa

19 BB47 Bb4 bb

21 AA44 Aa5 aa

496 _172 BB260 Bb64 bb

171 AA247 Aa78 aa

F2

F1

Figura 6: Esquema del cruce F2

AA: animal homocigoto con los dos alelos designados como favorable para el receptor de progesterona; Aa: animal here-

rocigotos para el receptor de progesterona; aa: animal homocigoto con los dos alelos designados como desfavorable

para el receptor de progesterona; BB: animal homocigoto con los dos alelos designados como favorable para la oviduc-

tina; Bb: animal hererocigotos para la oviductina; bb: animal homocigoto con los dos alelos designados como desfavo-

rable para la oviductina; H: animal perteneciente a la linea seleccionada para aumentar la capacidad uterina; L: animal

perteneciente a la linea seleccionada para disminuir la capacidad uterina; F1: animal procedente del cruce de un animal

procedente de la linea H y L; F2: animal procedente del cruce de animales F1.

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• La IGF-I, factor de crecimiento similar ala insulina-I, es una hormona que está re-lacionada con el mantenimiento de la fun-ción normal de las células, promueve eldesarrollo embrionario preimplantacionaly previene la degeneración de los embrio-nes (Herrler et al., 1998).• El TIMP-I es una proteína que se expresaen el tracto reproductivo de la coneja, yque está relacionada tanto con el desarro-llo embrionario como con la implantación(Brew et al., 2000).

Al secuenciar los genes candidatos en losanimales de las líneas H y L se observaronvarias cambios nucleotidicos en la zonadel promotor y en la parte de los exonesque codifica a la proteína (cambio no si-lencioso), y en estos casos, se analizó siexistía una asociación entre estos cambiosnucleotiditos y las líneas, es decir, si lafrecuencia de un nucleótido en una líneaera superior a la frecuencia de ese mismo

nucleótido en la otra línea. Aunque se en-contraron cambios nucleótidos que produ-cían cambios en algún aminoácido para elgen de la uteroglobina, del TIMP-I y de laIGF-I, estos cambios no estaban asocia-dos a las líneas, por lo que en principio nopodían explicar las diferencias (o parte deéstas) encontradas entre ambas líneas.Sin embargo, si que se encontraron cam-bios nucleótidicos asociados a las líneasen el gen del receptor de la progesterona yel de la oviductina (Merchán et al., 2004).En el gen del receptor de la progesteronase han encontrado 4 cambios de aminoá-cidos: uno de ellos esta en la zona del pro-motor del gen y tres en la región del exón1 que no codifica a proteína. De todos es-tos cambios, sólo el cambio que se produ-ce en la zona del promotor podría explicarparte de las diferencias en la superviven-cia embrionaria modificando la expresióndel gen. En el gen de la oviductina, a pe-sar de que se han encontrado 10 cambiosnucleótidos en la región codificante de laproteína, solo tres de estos cambios pro-ducen un cambio de dos aminoácidos, porlo que en este caso las diferencias entreambas líneas se deberían a una alteraciónde la funcionalidad de la proteína.

3. POBLACIÓN ANIMAL.

Para conocer la existencia de un gen ma-yor se está realizando actualmente un ex-perimento F2 a partir del cruce de las lí-

El tamaño decamada en conejo es

considerado uncarácter económica-mente importante,

pero se ha obtenidorespuesta a la selec-ción con los métodosclásicos de selecciónmenor a la esperada.

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neas H y L (Figura 6), pues como ya se hajustificado anteriormente, una poblaciónF2 obtenida a partir de dos líneas parenta-les que han sido seleccionadas divergente-mente es la población más adecuada paraconocer el efecto de los polimorfismos en-contrados para los genes de la oviductina yel receptor de la progesterona sobre la su-pervivencia embrionaria Para ello se cruza-ron 3 machos de la línea H (uno de ellossin genotipar) con 12 hembras de la líneaL, y 3 machos de la línea L (uno de ellossin genotipar) con 5 hembras de la línea H.De la descendencia de estos cruces, 10machos y 70 hembras F1 se cruzaron paraproducir un total de más de 500 hembrasF2. Según la distribución de genotipos quese presentan en la figura 6, el 50% de losanimales F2 son heterocigotos para el gende la oviductina y el receptor de la proges-terona, aproximadamente el 35% son ho-mocigotos dominantes y el 15% homocigo-tos recesivos. Esta distribución de los ge-notipos no es exactamente la esperada enla teoría (1/2, 1/4 y 1/4 respectivamente)debido a que no todos los animales de lapoblación F1 son homocigotos.

Para conocer si el receptor de la progeste-rona y/o la oviductina son los genes res-ponsables de al menos parte de las dife-rencias obtenidas entre ambas líneas, esnecesario realizar un análisis de asocia-

ción, es decir, ver si las hembras F2 quetienen el genotipo mas habitual en los ani-males de la línea H (AA y BB en la figura5) tienen una mayor supervivencia embrio-naria y un mayor tamaño de camada quelas hembras que tienen en genotipado mashabitual en la línea L (aa y bb en la figura5), pues en este caso son los caracteres deinterés. Para ello, es necesario obtener 4partos de unas 500 hembras, así como re-alizar una laparoscopia a los 12 días de lasegunda gestación.

La genética

molecular puede ayu-

dar a las produccio-

nes en casos de

caracteres de baja

heredabilidad, de

caracteres difíciles

de medir, de caracte-

res que se expresan

en una etapa tardía

del animal, o de

caracteres en los que

solo se expresan en

un sexo.

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Los primeros resultados indican que el re-ceptor de la progesterona explica parte delas diferencias entre ambas líneas, ya quemientras no existen diferencias en la tasade ovulación entre los diferentes genoti-pos, los animales que presentan el genoti-po más frecuente en la línea H (BB) tie-nen un mayor número de embriones im-plantados y de nacidos vivos que el genoti-po más frecuente en la línea L (bb) (0.62y 0.76, respectivamente; Peiró et al.,2006). Sin embargo, los primeros resulta-dos obtenidos para el gen de la oviductinano son concluyentes, por lo que se necesi-ta tener más información para poder cono-cer si la oviductina puede explicar partede las diferencias entre las líneas (Mer-chán et al., 2006).

Una vez conocido que el gen del receptorde progesterona explica al menos parte delas diferencias encontradas tanto en el nú-mero de embriones implantados como enel tamaño de camada, el siguiente pasosería conocer si existen diferencias de ex-presión proteica de la progesterona en losestadios tempranos de la gestación en fun-ción de los diferentes genotipos de los ani-males, experiencia que se está realizandoen la actualidad.

Como conclusión y posibles implicacionesdel primer experimento realizado en cuni-cultura en el que se usan técnicas mole-culares, se podría indicar que el receptorde la progesterona es un gen candidatoque puede explicar parte de las diferen-cias encontradas en dos líneas selecciona-das por capacidad uterina de forma diver-gente en el número de embriones implan-tados y en el tamaño de camada. Si estosresultados se confirmasen, se podrían ge-notipar las líneas actualmente selecciona-das, y que comúnmente utilizan los cuni-cultores a través del cruce a tres vías, conel fin de conocer el genotipo de los anima-les e intentar integrar esta informaciónmolecular en el ámbito de la genéticacuantitativa clásica, de manera que se op-timizara la respuesta genética del carác-ter tamaño de camada.

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