Embed Size (px)
Citation preview
1
Unidad IIIDNA, Genomas y
Cromatina
1630 Genética y Biología Molecular/ Grupo 4
Purinas Pirimidinas
Base
Enlace N-glicosídico
Nucleósido
Nucleótido
Ribosa 2’-Desoxi-ribosa
Pentosa
RNA DNA
Las unidades monoméricas de los ácidos nucleicos son los nucleótidos trifosfato
Adenina GuaninaTimina Citosina Uracilo
Bases Purinas
Adenina Guanina
pKa (N1) 3.5 9.4
Timina Citosina Uracilo
Bases Pirimidinas
pKa (N3) 9.9 4.2 9.4
2
Ribosa 2’-Desoxi-ribosa
Pentosa
RNA DNA
Base
Enlace N-glicosídico
La unión entre una base y una pentosa forma un Nucleósido
Para purinas, es la unión entre el N9 con el C1’ de la pentosa.
Para pirmidinas, es la unión entre el N1 con el c1’ de la pentosa.
La unión entre una base y una pentosa forma un Nucleótido
El fosfato se une en la posición 5’ de la pentosa
Purinas Pirimidinas
Base
Enlace N-glicosídico
Nucleósido
Nucleótido
Ribosa 2’-Desoxi-ribosa
Pentosa
RNA DNA
Las unidades monoméricas de los ácidos nucleicos son los nucleótidos trifosfato
Adenina GuaninaTimina Citosina Uracilo
3
d-TMP, d-TDP, d-TTP
d-timidinaTimina
d-CMP, d-CDP, d-CTP
d-citidinaCitosina
d-GMP, d-GDP, d-GTP
d-guanosinaGuanina
d-AMP, d-ADP, d-ATP
d-AdenosinaAdenina
Nucleótido NucleósidoBase
Nomenclatura de nucleósidos y nucleótidos
2679,600482dTTP
25313,700507dGTP
2719,300467dCTP
25915,200491dATP
λ(nm)
C.E.M.P.M.Nucleótido
CEM => Coeficiente de extinción molar
Propiedades espectroscópicas de los nucleótidos trifosfato
Los nucleótidos se unen covalentemente por enlaces fosfodiéster
El enlace fosfodiéster se dan entre las posiciones 3’ y 5’ de la pentosa
Watson y Crick predijeron la estructura de la doble hélice de DNA a partir de datos de cristalografía de rayos X
Rosalind Franklin obtuvo los datos cristalográficos
4
La doble hélice de DNA es:
Antiparalela
Complementaria
Las dos cadenas de nucleótidos se estabilizan por puentes de hidrógeno que se forman entre una purina y una pirimidina
Una guanina se aparea con una citosina
Una adenina se aparea con una timina
Para el DNA de doble cadena,
[G] = [C] y [A] = [T]
El par G = C es estabilizado por 3 puentes de H
El hecho de que las bases se encuentren en el mismo plano, estabiliza los puentes de H
El par A = T es estabilizado por 2 puentes de H
DIMENSIONES DE LA DOBLE HÉLICE DNA-B
Surco menor
Surco mayor
Las dimensiones del diámetro de la doble hélice pueden variar según la orientación de la base con respecto a la ribosa, el grado de hidratación del DNA y la secuencia
5
Diámetro (A): 26 20 18
Las formas A y Z del DNA son poco comunes en la naturaleza.
DESNATURALIZACIÓN de ACIDOS NUCLEICOS:1) No se rompen enlaces covalentes.2) Se rompen puentes de hidrógeno (entre bases apareadas)3) Como consecuencia, se va abriendo la doble hélice.4) Cuando la doble hélice se abre, las bases nitrogenadas
quedan más expuestas y por tanto absorben más la luz ultravioleta (efecto hipercrómico)
TM
TMABS
260nm
ºC
Tm = TEMPERATURA DEFUSION
El DNA es la molécula que acarrea la información genética
Pneumococcus sp. Cepa Rugosa (R) (avirulenta)
Pneumococcus sp.Cepa Lisa (S) (virulenta)
Pneumococcus sp.Cepa Lisa (S) inactivada con calor
Cepa Lisa (S) inactivada con calor + Cepa R viva
Las bacterias de la cepa R son transformadas por un material termoestable de la cepa S
El tratamiento con calor mata a Pneumococcus (S)
El DNA es la molécula transformante.
Experimentos de Griffith (1928) y de Avery, McLeod y McCarty (1944)
Eliminación de lípidos y CHOs después de lisar a la bacteria inactivada por calor
Tratamiento de la solución con proteasas, RNAsas, o DNAsas
Mezclar estas muestras con bacterias R y observar cuál transforma para generar bacterias virulentas.
Experimentos de Avery, McLeod y McCarty (1944)
Solamente cuando se elimina el DNA, se pierde el principio transformante
6
Experimento de Hershey y Chase, 1952
Bacteriofago T-2
Infección de E. colicon el fago T2
Crecer E. coli en medio con:32P 35S
Lisis de las bacterias y obtención de los fagos marcados diferencialmente
Experimento de Hershey y Chase, 1952
Se usan los fagos
marcados para infectar E. coli
32P 35S
Desprendimiento de los fagos por
agitación
Replicación del bacteriofago
La progenie contiene DNA
marcado
ORGANIZACIÓN DE LOS GENOMASEl genoma es el conjunto de genes que contiene la informaciónnecesaria para que una célula pueda existir y reproducirse
Los genomas de eucariontes son muy grandes. Hay regiones intergénicas muy largas. Los genes están separados
por regiones de DNA muy largas.
Además, en la mayoría de los eucariontes los genes están segmentados:Estructura: Exón – Intrón
Exón: Segmento del DNA que está representado en el RNAm maduro.Intrón: Segmento del DNA que es transcrito a RNA pero que es eliminado
de éste. Corresponde a regiones no codificantes.
7
Tamaños relativos de los genomas haploides (pb) de distintos organismos
106 107 108 109 1010 1011 1012
pb en el genoma haploide
Sin embargo, el tamaño del genoma no es proporcional al número de genes cuando se
comparan procariontes y eucariontes
17,0001.22 x 108Drosophila melanogaster
28,2003.9 x 108Oryza sativa (arroz)
25,0003.3 x 109Homo sapiens
10,1003.8 x 107Neurospora crassa
115.4 x 103Bacteriófago φX174
5,3002.3 x 107Plasmodium falcifarum
5,6006.3 x 106Pseudomonas aeruginosa
4,4004.6 x 106Escherichia coli
# genesGenoma (pb)Organismo
La estructura del genoma varía mucho entre eucariontes y procariontes.
El genoma en procariontes es más compacto que el de los eucariontes.
Organización de genes en un cromosoma humano
Cromosoma humano
Sección (10%) del cromosoma (~40 genes)
Sección (1%) del cromosoma (~4 genes)
1 gen, formado por 9 exónes
8
¿DNA basura?
El 27.5% del genoma humano corresponde a genes y de éstas secuencias el solamente el 1.5% corresponde a regiones
codificantes
SINEs (short interspersed nuclear elements)
LINES (long interspersed nuclear elements)
LINES (long interspersed nuclear elements)
Genes
Regiones codificantes de proteínas
El genoma en bacterias está constituido por un solo cromosoma que forma un círculo cerrado
covalentemente
El cromosoma bacteriano está super compactado
DNA cromosomal Plásmidos
FORMAS TOPOLÓGICAS DEL DNA CIRCULAR CERRADO
9
El genoma en eucariontes está dividido en varios cromosomas. Los cromosomas son
lineales
20Zea maysMaíz22Phaseolus vulgarisFrijol24Oryza sativaArroz14Pisum sativumChícharo8Drosophila melanogasterMosca fruta64Eqqus caballusCaballo78Canis familiarisPerro60Bos taurusBovino38Felis catusGato46Homos sapiensHumano
# diploideEspecieOrganismo
El número de cromosomas de cada especie es característico de ésta
El DNA se encuentra “empacado” en los cromosomas eucariontes
Segmento de doble hélice El DNA extendido de una célula de mamífero mediría aproximadamente 1 mt delongitud
El DNA se encuentra “empacado” en los cromosomas eucariontesEl DNA extendido de una célula de mamífero mediría aproximadamente 1 mt delongitud
Segmento de doble hélice
DNA + Histonas = Nucleosomas
Octámero de Histonas:
H2A; H2B; H3;H4
10
CONTENIDO DE LYS Y ARG DE LAS HISTONAS
HISTONA %LYS %ARG
H1 24.8 2.6H2A 10.9 9.3H2B 16.0 6.4
H3 9.6 13.3H4 10.8 13.7
Esquema de una sección de la cromatina
INTERACCIONES ENTRE LAS HISTONAS Y EL DNA EN LOS EUCARIOTES
El octámero de histonas se asocia por int. hidrofóbicas
Un nucleosoma consiste en 147 pb de DNA enrrollados en el octámero de histonas.
Estructura de un nucleosoma
El DNA se encuentra “empacado” en los cromosomas eucariontesEl DNA extendido de una célula de mamífero mediría aproximadamente 1 mt delongitud
Segmento de doble hélice
DNA + Histonas = Nucleosomas
Empaquetamiento de nucleosomas. Cromatina de 30 nm
Octámero de Histonas:
H2A; H2B; H3;H4
11
El DNA se encuentra “empacado” en los cromosomas eucariontesEl DNA extendido de una célula de mamífero mediría aproximadamente 1 mt delongitud
Segmento de doble hélice
DNA + Histonas = Nucleosomas
Empaquetamiento de nucleosomas. Cromatina de 30 nm
Sección de cromosoma en forma extendida
Octámero de Histonas:
H2A; H2B; H3;H4
El DNA se encuentra “empacado” en los cromosomas eucariontesEl DNA extendido de una célula de mamífero mediría aproximadamente 1 mt delongitud
Segmento de doble hélice
DNA + Histonas = Nucleosomas
Empaquetamiento de nucleosomas. Cromatina de 30 nm
Sección de cromosoma en forma extendida
Sección de cromosoma en forma condensada
Octámero de Histonas:
H2A; H2B; H3;H4
El DNA se encuentra “empacado” en los cromosomas eucariontesEl DNA extendido de una célula de mamífero mediría aproximadamente 1 mt delongitud
Segmento de doble hélice
DNA + Histonas = Nucleosomas
Empaquetamiento de nucleosomas. Cromatina de 30 nm
Sección de cromosoma en forma extendida
Sección de cromosoma en forma condensada
Cromosoma en metafase
Octámero de Histonas:
H2A; H2B; H3;H4
12
Grado de compactación del DNA
Heterocromatina: Segmentos del cromosoma que se tiñen fuertemente y permanecen visibles, prácticamente, durante todo el ciclo celular. Regiones supercondensadas.
Secuencias repetitivas de DNA, regiones no transcribibles en el genoma.
Eucromatina: Segmentos del cromosoma que no son visibles durante la telofase e interfase. Regiones que se condensan y se descondensan.
Secuencias que contienen genes y que son transcripcionalmente activas.
Heterocromatina y Eucromatina
Centrómeros.
Son regiones repetitivas de DNA (150-171 pb)n
Constituyen el sitio de unión de las fibras del huso mitótico.
Componen del 1% al 3% de la secuencia de un genoma.
Su posición varía en los distintos cromosomas.
Telómeros
Se encuentran en los extremos de los cromosomas.
Se requieren para la replicación y estabilidad de los cromosomas.
Son secuencias repetidas de DNA, en humanos: -TTAGGG- que se repite entre 250 a 1,500 veces.
13
Los cromosomas ocupan compartimentos discretos en el núcleo.
Las regiones de los cromosomas que tienen pocos genes se encuentran en la periferia del núcleo.
Territorios cromosomales
¿Cómo podemos explicar el metabolismo del DNA
como replicación, reparación y recombinación, si éste
se encuentra estrechamente unido a las histonas
formando los nucleosomas?
Tipo de interacciones que estabilizan la unión DNA-
histona.
¿Cómo se pueden romper estas interacciones?
La acetilación de las lisina neutraliza su carga positiva; se desestabiliza la interacción DNA – proteína.
Es un proceso reversible, pues hay:
• Histonas acetil-transferasas
• Histonas desacetilasas
Estas modificaciones ocurren principalmente en las histonas H3 y H4
14
Cariotipo El set de cromosomas de una célula o individuo. Durante la metafase los cromosomas se puedenobservar ordenados e identificar por su tamaño desde la posición del centrómero.
Citogenética. 1956 Tijo y Levan desarrollan las técnicas para teñir y observar a los cromosomas durante la metafase.
Los cromosomas están duplicados y condensados pero el centrómero no se ha dividido.
Clasificación de cromosomas por su tamaño y la posición del centrómero:
• Metacéntricos: Los dos brazos del mismo tamaño aprox.
• Submetacéntricos: Se observa un brazo corto (p) y un brazo largo (q).
• Acrocéntricos: Muestran una fuerte tinción, llamada satélite, en el extremo del brazo corto.
Cariotipo humano. Cromosomas en metafase.
Cariotipo humano. Cromosomas en metafase.
Morfología de los cromosomas
15
La tinción “clásica” para el análisis del cariotipo es con el colorante Giemsa que tiñe diferencialmente algunas regiones de los cromosomas.
Se distinguen las bandas G, que se tiñen con Giemsa y las bandas R que no se tiñen.
Cada cromosoma tiene un patrón típico de bandas G y R, lo que permite su identificación.
Hay otras técnicas basadas en la hibridación de ácidos nucleicos que permiten identificar específicamente a cada uno de los cromosomas.
Se emplean fluoróforos por lo que la observación de las preparaciones se debe hacer en un microscopio de epifluorescencia.
El análisis de cariotipo tiene varias aplicaciones clínicas.
Amniocentesis: Edad de la madre, antecedentes por ultrasonido
Linfocitos. Diagnóstico de anormalidades congénitas.
Linfocitos circulantes en sangre
FitohemaglutininaLinfocitos estimulados. Alta división celular
colcimida
La mitosis se detiene en metafaseFijación, tinción y análisis de cariotipo
16
Patologías asociadas al cariotipo.
EUPLOIDÍAS.
Organismos que poseen múltiplos de la dotación cromosómica básica.
Triploidía.
3n = 69
Ocurre si:
• Espermatocito diploide
• Ovocito diploide
• Dispermia durante la fertilización (fecundación por dos espermatozoides)
Ocurre aborto en el 4to mes y el feto muestra severas malformaciones.
Patologías asociadas al cariotipo.
Aneuploidías. El número cromosómico difiere del silvestre en parte de la dotación cromosómica.
Trisómico (2n + 1)
Monosómico (2n –1)
Nulisómico (2n –2)
Trisomías (47; XY). De los 22 autosomas humanos, solamente 3 ocurren como trisomías en los productos que nacen. Otras trisomías son letales, y el producto muere durante la embriogénesis.
Trisomía 21: Incidencia de 1/800 nacimientos.
Trisomía 18: Incidencia de 1/10,000 nacimientos
Trisomía 13: Incidencia de 1/25,000 nacimientos
Las trisomías se deben a un defecto en la meiosis en la que no se separan los cromosomas. NO DISYUNCIÓN
Esto puede ocurrir durante la meiosis I o meiosis II.
Alineamiento de los cromosomas en el plano de la metafase
Uno de los pares de cromosomas nose separan
Meiosis Todos los gametos tienen un número anormal de cromosomas
En la trisomía 21, la edad de la madre en el momento de la concepción es un factor de riesgo importante.
Monosomías autosómicas.
Falta alguno de los pares de cromosomas autosómicos.
El genotipo es (45, XY). Todos son letales y llevan a la muerte del embrión durante los primeros días o semanas después de la concepción.
Cromosoma X adicional.
Genotipo (47; XXY).
Conduce a una sintomatología de:
• Estatura alta
• Ausencia de caracteres sexuales secundarios
• No hay espermatogénesis
Otros genotipos:
• 47; XYY => Varón, sin algún fenotipo característico.
• 47; XXX => Hembra, tampoco hay ningún fenotipo severo asociado.
17
Inactivación del cromosoma X.
En las células de mamíferos de hembras, solamente un cromosoma X está activo. El otro se inactiva y así permanece. Citológicamente, se observa como una masa de cromatina condensada empaquetada (Cuerpos de Barr).
La inactivación ocurre durante los primeros días de la vida embrionaria. Se puede inactivar el Xp o el Xm
Inactivación del cromosoma X. MOSAICOS.
Debido a que en algunas células se inactiva el cromosoma Xp y en otras el cromosoma Xm, el embrión y el organismo resultante se convierten en una mezcla de los dos tipos de células que expresan distintos alelos (mosaicos).
En organismos, como gatos y ratones, en que el gen que codifica para la pigmentación del pelaje está presente en el cromosoma X, se observan mosaicos de colores en las hembras. => Calico
