Bioq. Aliano AnalíaBioq. Fanessi Viviana

Experiencia en el Hospital Posadas

Introducción: Anemias hemolíticas

Las anemias hemolíticas (AH) resultan de una menor sobrevida eritrocitaria.

Características:Acumulación productos degradación de HbAumento actividad médula ósea

anemias regenerativas

Clasificación de las Anemias Hemolíticas 1. Por defectos corpusculares Hereditarios

Anormalidades de membrana: Esferocitosis Hereditaria,

Eliptocitosis, etc

Anormalidades de la hemoglobina

Estructurales : Hb S, Hb C, etc

Velocidad de síntesis: Talasemias

Anormalidades del metabolismo: deficit de G6PDH, PK, etc. Adquiridos

Hemoglobinuria Paroxística Nocturna

2. Por defectos extra corpusculares (adquiridos) Por anticuerpos

An Hem autoinmune Idiopáticas Secundarias: Infecciones, drogas, enf hematológicas, colagenopatías

An Hem alloinmune: postransfusional, Enf Hemolítica del recién nacido Por traumatismo mecánico

Anemia hemolítica microangiopática: SUH, PTT, CID, etc

Valvulopatías aórtica

Prótesis Valvulares Por tóxicos directos: Infecciones, toxinas, agentes físicos y qcos, venenos serpientes y

arañas Por estímulo externo: esfuerzo, quemaduras Por hepatopatía Por hiperesplenismo

Banda 3

Banda 3

Banda 3

Banda 3

Glicoforina A

Ankirina

p55

4.1

4.9

β Espectrina β

Tropomiosina

Tropomodulina

Actina

Adducina

Glicoforina C

Membrana del eritrocito

4.2

α Espectrina

Interacciones horizontales

Inte

racc

ion

es

vert

icale

s

Esferocitosis Hereditaria(SH)Síndrome caracterizado por: presencia

de esferocitos en sangre periférica, anemia, ictericia y esplenomegalia.

Expresión heterogénea si consideramos la severidad de la enfermedad, la alteración proteica involucrada y el modo de transmisión.

Antecedentes históricos

1871. Vanlair Masius.

1890. Wilson.

1907. . ChauffardChauffard

Aumento de fragilidad osmótica.Aumento de fragilidad osmótica.

””Enfermedad de Minkowsky Enfermedad de Minkowsky Chauffard”Chauffard”

1970. Alteraciones proteínas de membrana

1985. Alteraciones moleculares

Generalidades de la Esferocitosis hereditaria

Herencia: 75% Autosómica dominante (AD)

25% 50% Autosómica recesiva (AR) o AD con

penetrancia incompleta 50% mutaciones de novo

Epidemiología

AH congénita crónica más frecuente en los países occidentales.

Mayor incidencia: Norte de Europa y América del norte.

Frecuencia: 1/5000 - 1/2000.Argentina: no existen datos de

incidencia, pero se sabe que es la anemia hemolítica crónica más frecuente.

Fisiopatología

Mecanismosfisiopatológicos

Defecto intrínseco de la membrana

eritrocitaria

Bazo intacto remueve hematíes dañados.

Fisiopatología

Déficit espectrina, prot 4.2 o ankirina

Déficit de banda 3

↓ S/V ↓ deformabilidad celular

Secuestro esplénico

Eritrostasis

↓pH ↑contacto GR-Macrofago↓glu↑(oxidantes)

Hemólisis

Pérdida membranaCondicionamiento

esplénico

Esferocitos en frotis de sangre periféricaAdaptado de Narla Mohandas, Silverio Perrotta, Patrick G Gallagher. Hereditary spherocytosis. www.thelancet.com Vol 372 October 18,

2008

Causas de Esferocitosis Hereditaria

N. Mohandas, S. Perrotta, P.Gallagher. Hereditary spherocytosis. www.thelancet.com. 18/10/08

Clasificación de Esferocitosis hereditaria

Actualmente la clasificación se basa en los niveles de Hb:Severa: Hb<8 g/lModerada: 8-10 g/lMínima: 10<Hb<11.5 g/l en ♀

10<Hb<13.5 g/l en ♂

N. Mohandas, S. Perrotta, P.Gallagher. Hereditary spherocytosis. www.thelancet.com. 18/10/08

Complicaciones Crisis hemolíticas, muy frecuentes

durante las infecciones virales, rara vez son graves.

Crisis aplásticas por infección de parvovirus B19.

Crisis megaloblásticas resultan de la deficiencia de ácido fólico, en particular en las embarazadas.

ComplicacionesLitiasis vesicular, colelitiasis u

obstrucción biliar.

Poco frecuente:Ulceras recurrentes o dermatitis en

miembros inferiores, hemopoyesis extramedular, gota, retraso en crecimiento y desarrollo sexual.

Diagnóstico

CLINICA

LABORATO

RIO

ANTECEDENTES

FAMILIARES

Anemias HemolíticasAnemias Hemolíticas↓ ↓ Hb + ↑ ReticulocitosHb + ↑ Reticulocitos

Hemólisis Intravascular Hemólisis Intravascular Hemólisis extravascularHemólisis extravascular

↑ Hb plasmática, LDH ↑ Bilirrubina Total e Indirecta↓ Haptoglobina y hemopexina ↑ Estercobilinógeno fecalHemoglobinuria y hemosiderinuria ↑ Urobilina en orina

Prueba de Coombs DirectaNegativa Positiva

Historia familiar!!! Anemias hemolíticas

InmunesFROTIS (morfología GR)

Esferocitos Inespecífica Dianocitos, falciformesEliptocitos Hipocromía, microcitos

Investigar TODAS las Investigar Membranopatías DETERMINACIONES Hemoglobinopatías

LABORATORIO

General Específico

Parámetros de Anemia Hemólisis

Estudios descreening y confirmatorios

• Alteraciones indicativas de hemólisis Extravascular: Bilirrubina Indirecta, Urobilinógeno fecal, Urobilina Intravascular: Hemoglobinemia, LDH, disminución de Haptoglobina, Hemoglobinuria, Hemosiderinuria

• Prueba de Coombs directa: negativaAdultos: no descartar la posibilidad de una anemia hereditaria

• Reticulocitos: aumentados Tener en cuenta los valores de referencia adecuadosEdad gestacional: > %Retic a menor edad gestacionalDías de vida: valores elevados al nacimiento hasta el 3º día

• Hemograma: VCM, HCM, ADE, CHCM.

• FROTIS: MORFOLOGIA!!

Laboratorio General

•FROTIS: MORFOLOGÍA!!

Déficit banda 3 Déficit de β-espectrina

Esferocitos

Esferoacantocitos

Hongos

Sin alteraciones

LABORATORIO

Parámetros de Anemia Hemólisis

Estudios de screening y confirmatorios

General Específico

Estudios de Membrana

Hemólisis aumentada- Prueba de Autohemólisis- Test de glicerol acidificado- Pink testFragilidad osmótica

aumentada - Curvas de fragilidad

osmótica- Técnica de Dacie- Fragilímetro- Nefelometría- Criohemólisis hipertónica Deformabilidad celular

alterada- Ectacitometría- Reoscopía Otras Citometría de flujo

Determinación cuantitativa de las proteínas de membrana

- Electroforesis PAGE-SDS

- Electroforesis bidimensional

- Electroforesis capilar

Análisis genético

Screening Confirmatorios

Fundamento: Mide la capacidad de los hematíes para mantener su integridad in vitro después

de 48 hs de incubación a 37ºC en su a su propio

plasma.

Prueba de Autohemólisis

Límites de % hemólisis normales Sin glucosa añadida: 0.2-2 % Con glucosa añadida: 0-0.9%

Técnica : Se incuba 48 Hs

sangre heparinizada estéril con y sin agregado de glucosa a 37ºC

Se evalúa % hemólisis leyendo absorbancia a 540nm.

Prueba de Autohemólisis

Desventajas Volumen

relativamente grande de muestra

Posibilidad de contaminación duplicados de cada tubo.

Fundamento: Se suspenden los eritrocitos en soluciones de

hipotonía creciente de NaCl. (0 a 0.9% NaCl) El H2O penetra en el interior del GR para

equilibrar su presión osmótica con la del medio La célula se vuelve esférica y al alcanzar un

volumen crítico se rompe.

En la SH el Vc del esferocito <<<< Vc glóbulo rojo

Curva de fragilidad osmótica

Técnica Eritrocitos +

soluciones de hipotonía creciente de NaCl.

Incubación 20 min a TA se centrifugan los tubos y se cuantifica el grado de hemólisis.

CONTROL

PACIENTE

Curva de fragilidad osmótica

Coincidente con la normal

I

Población condicionadaCurva de fragilidad osmótica

Resistencia mínima VN: 0.48-0.51 gr% ClNa

Fragilidad corpuscular media VN: 0.43-0.475 gr ClNa

Resistencia máxima VN: 0.30-0.33 gr.% ClNa

Incremento de la sensibilidad, preincubación de las células 24hs en soluciones de distinta concentración salina estériles a 37ºC.

Se produce stress metabólico de los eritrocitos y maduración de reticulocitos que son osmoticamente más resistentes, acentuando las diferencias entre las poblaciones.

Hipocromía debido a una ferropénia latente puede enmascarar un descenso de la resistencia osmótica.

Curva de fragilidad osmótica diferida

Gráfico: % Hemólisis vs [ClNa]

Curva de fragilidad osmótica basal y diferida

Gráfico : Incremento del % Hemólisis vs [ClNa]

Fundamento: Evalúa el efecto de un cambio

brusco de temperatura en los eritrocitos suspendidos en un medio hipertónico.

No depende de la relación S/V, sino de la integridad de las proteínas de membrana.

Criohemólisis hipertónica

Criohemólisis hipertónica

Se suspenden los eritrocitos en solución hipertónica de sucrosa a 37ºC durante 10 minutos y luego igual tiempo a 0º C.

Se cuantifica el % hemólisis en el sobrenadante.

Valores de corte : Criohemólisis > 2,8 %

E: 95 % y S: 79 %

Ventajas:Arroja resultados normales en la AHAI

American Journal of Haematology 58.206-212 (1996)

Fundamento: evalúa la intensidad de la fluorescencia

que presentan los eritrocitos intactos luego de ser incubados con el colorante 5-eosina-maleimida (5-EMA) que se une covalentemente en un 80% al residuo Lys de la proteína banda 3, el 20% a glicoproteínas del grupo Rh.

Cada muestra de paciente se debe correr con 6 controles normales y se informa como disminución de la fluorescencia del histograma

Citometría de flujo

Histogramas de fluorescencia

Permiten diferenciar SH, EH y PPH

Esferocitosis (SH)

Reducción de fluorescencia Eliptocitosis (EH)

No presenta diferencias entre la población eritrociatria normal

Piropoiquilocitosis (PPH)

Doble pico de fluorescenciaBritish Journal of Haematology 2000,924-933

Citometría de flujo

Ventajas: Rapidez en la obtención de resultadosPequeño volumen de muestraPermite diferenciar los esferocitos

presentes en EH de los presentes en AHAI

Sensibilidad del 92.7% y una especificidad del 99.1% reportada por bibliografía.

Citometría de flujo

Electroforesis SDS-PAGE de membrana Método de referencia para identificación de

proteína deficiente. Tiene bajo porcentaje de recuperación. Permite diferenciar la presencia o no de

proteínas del citoesqueleto eritrocitario.

Permite confirmar el diagnóstico de EH en :

Aquellos casos en que no haya historia familiar positiva

Cuando las pruebas de screening no son concluyentes

Cuando la clínica que presenta el paciente no guarda relación con la que presenta el resto del grupo familiar. Clin. Lab, Haem.

25,373-376

Tratamiento Esplenectomía

Las HS deficientes en banda 3 no se beneficiarían

con la esplenectomía. Blood 2002; 100: 2208-

2215

Riesgos :

3 semanas antes de la cirugía, vacuna para Neumococo, Haemophilus,Meningococo , Influenza, Hepatitis A y B

Transfusión de paquete globular en crisis :

1) megaloblástica, 2) hemolítica 3) aplásica

Suplementar con ácido fólico

Membranopatía Hereditaria

• Cuadro clínico• Parámetros de laboratorio general

• Historia familiar positiva

No se requieren estudios adicionales

Bolton-Maggs PH, Br. J Haematol. 2004

Conclusiones El 75 % de las EH pueden ser diagnosticadas con:

Cuadro clínico Parámetros de laboratorio general Historia familiar positiva

De las restantes, el 66 % pueden diagnosticarse mediante estudios confirmatorios simples: Prueba de autohemólisis Curvas de Fragilidad eritrocitaria Criohemólisis hipertónica

Muy pocas veces se requieren estudios específicos para arribar al diagnóstico: Electroforesis de membrana (PAGE-SDS) ¿Valor pronóstico?

Análisis genético Documentar mutaciones “de novo”

Población estudiada

Resultados

Resultados

Resultados

Conclusiones del trabajo Recalcamos la utilidad de realizar varias pruebas, no

todas son simultáneamente positivas. EMA-FC y CH test fáciles de ejecutar, con mayor

sensibilidad que otros test para diagnóstico de HS. Incorporación nuevo parámetro para evaluar la

citometría, que es el % incremento del CV. Proteínas deficientes más frecuentes en la población

estudiada son espectrina y ankirina. Estudio extendido a los familiares del paciente

permiten establecer el diagnóstico de esferocitosis asintomáticas y detectar portadores sanos.

Bibliografía

Sara Streichman* and Yehudit Gescheidt . Cryohemolysis for the Detection of Hereditary Spherocytosis: Correlation Studies With Osmotic Fragility and Autohemolysis. American Journal of Hematology 58:206–212 (1998)

May-Jean King, Judith Behrens, Chris Rogers, Clare Flynn, David Greenwood and Keith Chambers. Rapid flow cytometric test for the diagnosis of membrane cytoskeleton-associated haemolytic anemia. British Journal of Haematology, 2000, 111, 924±933.

P. S. Kedar, R. B. Colah, S. Kulkarni, K. Ghosh, D. Mohanty. Experience with eosin-5¢-maleimide as a diagnostic tool for red cell membrane cytoskeleton disorders. Clin. Lab. Haem. 2003, 25, 373–376

Walter E. Rodríguez*, German F. Sáenz*, Jessie Orlich. Diagnostico de la esferocitosis hereditaria con pruebas de glicerolisis

María del Pilar Ricard Andrés. La esferocitosis hereditaria y su diagnóstico en la práctica clínica. Universidad complutense de Madrid facultad de medicina departamento de medicina. Madrid, 1993.

Bibliografía Narla Mohandas, Silverio Perrotta, Patrick G Gallagher. Hereditary

spherocytosis. www.thelancet.com Vol 372 October 18, 2008

P. H. B. Bolton-Maggs, R. F. Stevens2, N. J. Dodd3, G. Lamont4, P. Tittensor5and M.-J. King on behalf of the General Haematology Task Force of the British Committee for Standards in Haematology. Guidelines for the diagnosis and management of hereditary spherocytosis . 2004 Blackwell Publishing Ltd, British Journal of Haematology, 126, 455–474

Mariagabriella Mariani, Wilma Barcellini, Cristina Vercellati, Anna Paola Marcello,Elisa Fermo, Paola Pedotti, Carla Boschetti, and Alberto Zanella. Clinical and hematologic features of 300 patients affected by hereditary spherocytosis grouped according to the type of the membrane protein defect. Published Ahead of Print on July 18, 2008, as doi:10.3324/haematol.12546

Crisp R, Solari L, Chamorro M, Gammela D, Vota D, Garcia E, Venegas B, Miguez G, Schvartzman G, Caldarola S, Ricchieri C, Alfomso G, Nesse A, Donato H. Hereditary spherocytosis: relationship between clinical outcome, diagnostic test results and membrane protein deficiency. A prospedtive study from argentina. Poster presentedat EHA 15 on: 1012--P Renée Crisp 12th June 2010

Agradecimientos Dra. Renée Crisp del Servicio Médico de

Hematología del Hospital Profesionales del Sector de Citometría de

flujo del Laboratorio Central Dra. Sandra Cozzarín y demás

profesionales y técnicos del Sector de Hematología del Laboratorio Central

Profesionales y técnicos de Endocrinología y Bacteriología

Nuestros compañeros de Residencia

GRACIAS!!!!