Biorremediación de suelos contaminados con hidrocarburos a

UNIVERSIDAD CENTRAL “MARTA ABREU” DE LAS VILLAS

FACULTAD DE QUÍMICA-FARMACIA DEPARTAMENTO DE INGENIERÍA QUÍMICA

Biorremediación de suelos contaminados con hidrocarburos a partir del

uso de un consorcio bacteriano alóctono en la zona costera de Punta Majagua. Cienfuegos, Cuba.

Tesis presentada para optar por el grado académico de Master en Ciencias Ténicas.

Mención Ingeniería en Saneamiento Ambiental.

Autor: Lic. Jelvys Bermúdez Acosta

Tutores:

Dr. Roberto Nuñez Moreira Dr. Remigio Cortés Rodríduez

Consultante:

Dra. Edudalys Ortíz Guilarte

Santa Clara Febrero de 2012

Exergo

I

EXERGO

«Llegará una época en la que una investigación diligente y prolongada sacará a la luz

cosas que hoy están ocultas. La vida de una sola persona, aunque estuviera toda ella

dedicada al cielo, sería insuficiente para investigar una materia tan vasta [...]. Por lo tanto

este conocimiento sólo se podrá desarrollar a lo largo de sucesivas edades. Llegará una

época en la que nuestros descendientes se asombrarán de que ignoramos cosas que para

ellos son tan claras... Muchos son los descubrimientos reservados para las épocas futuras,

cuando se haya borrado el recuerdo de nosotros. Nuestro universo sería una cosa muy

limitada si no ofreciera a cada época algo que investigar... La naturaleza no revela sus

misterios de una vez para siempre.»

Séneca. Cuestiones naturales, libro 7, siglo I.

Agradecimientos

II

AGRADECIMIENTOS

A mis tutores: Dr. Roberto Núñez Moreira y Dr. Remigio Cortés Rodríguez.

Por sus sabios consejos, y valiosos aportes en la realización de este trabajo.

A la Dra. Eudalys Ortiz Guilarte

Por sus siempre oportunas ideas y aportes en este encargo.

A mis Colegas: José R. Poma, Yoelvis Castro y David Castro.

Por su amistad y por siempre contribuir con sus ideas y críticas constructivas.

A Alejandro García

Por su dedicación y ayuda incondicional

A todos los profesores de la Maestría de Ingeniería en Saneamiento Ambiental

Por su profesionalidad y por transmitirnos sus experiencias y conocimientos

A todos

Gracias, de veras Gracias…

Dedicatoria

III

DEDICATORIA

No podría faltar tal espacio para dedicar este trabajo a quienes han sido la razón de ser en

mi empeño y esfuerzo. Lo dedico a mi hijo, Luca, quién no solo me inspira, sino que me da

fuerzas y esperanza para alcanzar todas las metas propuestas. Lo dedico a mi esposa,

Isany, quien no solo es mi soporte emocional y espiritual, sino mi amiga y confidente. Lo

dedico a mis padres; a Isady y Jimmy; amigos y familiares. Lo dedico a todos los que de

una forma u otra me han apoyado en la conclusión de trabajo.

Resumen

IV

RESUMEN

El propósito de esta investigación fue realizar el saneamiento ambiental de una zona

costera contaminada con hidrocarburos, localizada en la porción centro-norte de la Bahía

de Cienfuegos, Cuba. El tratamiento de los residuos petrolizados se realizó mediante la

técnica de bioaumentación con el uso del consorcio bacteriano BIOIL-FC, aplicándose un

diseño aleatorizado por bloques completos con un factor categórico. Se diseñó un área de

biorremediación de 115m X 75m donde posteriormente se dispusieron 479m3 de residual

mezclado con tierra fértil en proporción 1/3. Se aplicaron 76 640L de BIOIL-FC, producidos

en un biorreactor de 12 000L utilizando para su producción industrial un cultivo

semicontinuo con adiciones y extracciones de 7 000L cada 4h, hasta lograr el volumen final

de producción. Se monitorearon las variables microbiológicas, físico-químicas y

ecotoxicológicas antes del tratamiento y a los 45, 90 y 120 días posteriores a la aplicación

del bioproducto. Las poblaciones de bacterias degradadoras se incrementaron durante el

proceso de biorremediación (106cel·mL-1), llegando a predominar en el total de las

poblaciones de heterótrofas totales. Niveles que disminuyeron significativamente al final del

proceso (105cel·mL-1), relacionado con una reducción significativa de las concentraciones

de Hidrocarburos Totales del Petróleo (HTP). Del cual se obtuvieron remociones

superiores al 90% con una velocidad media de degradación de 245,0±35,7mg⋅(kg⋅h)-1. Para

las fracciones fundamentales del petróleo (SARA) se obtuvieron remociones superiores al

70%, con una velocidad media de degradación entre 107,8±11,8 y 233,7±86,6mg⋅(kg⋅h)-1.

Se obtuvieron niveles de HTP y SARA inferiores a los límites máximos permisibles

establecidos por la norma SEMARNAT, (2003). Los ensayos ecotoxicológicos de

germinación y crecimiento para frijol y maíz demostraron una recuperación de las

características del suelo a los 120 días de tratamiento. Del análisis costo-beneficio se

obtuvo un VAN=$37 674,61; una TIR=60% y un PRD=2,4meses. Indicadores que

demostraron la factibilidad económica de la investigación.

Índice

V

ÍNDICE

EXERGO ...................................................................................................................................... IAGRADECIMIENTOS .................................................................................................................. IIDEDICATORIA ........................................................................................................................... IIIRESUMEN ................................................................................................................................. IVÍNDICE ........................................................................................................................................ VINTRODUCCIÓN ......................................................................................................................... 11. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA ................................................................................................ 6

1.1. Generalidades sobre el petróleo y sus derivados ............................................................ 61.1.1. Origen del petróleo. Características generales .......................................................... 61.1.2. Composición química del petróleo ............................................................................ 61.1.2.1. Parafinas volátiles (n-alcanos e isoprenoides volátiles) .......................................... 61.1.2.2. Parafinas no volátiles (n-alcanos e isoprenoides) .................................................. 61.1.2.3. Naftenos (cicloalcanos) ........................................................................................ 71.1.2.4. Olefinas (alquenos) .............................................................................................. 71.1.2.5. Hidrocarburos aromáticos ..................................................................................... 71.1.2.5.1. Hidrocarburos monoaromáticos ......................................................................... 71.1.2.5.2. Hidrocarburos poliaromáticos ............................................................................ 71.1.2.6. Resinas y asfaltenos ............................................................................................ 81.1.3. Clasificación químico-física del petróleo ................................................................... 81.1.4. Generalidades sobre la refinación del petróleo. Derivados ........................................ 9

1.2. La contaminación de los suelos por petróleo y sus derivados ........................................ 101.2.1. Antecedentes de la contaminación por petróleo y sus derivados .............................. 101.2.2. Generalidades sobre las propiedades físico-químicas, estructurales y microbiológicas de los suelos ...................................................................................................................... 131.2.2.1. Estructura y composición del suelo ..................................................................... 141.2.2.2. Fracciones minerales ......................................................................................... 141.2.2.3. Materia orgánica ................................................................................................ 161.2.2.4. Gases en el suelo .............................................................................................. 161.2.2.5. Humedad en el suelo ......................................................................................... 171.2.2.6. Microflora autóctona del suelo ............................................................................ 181.2.3. Procesos naturales que ocurren durante los derrames de hidrocarburos en el suelo 191.2.4. Efectos de la contaminación por hidrocarburos sobre los suelos .............................. 21

1.3. Metodologías y técnicas más empleadas en la remediación de suelos contaminados con hidrocarburos ......................................................................................................................... 22

1.3.1. Tecnologías de remediación. Clasificación ............................................................. 221.3.1.1. Estratégia de remediación .................................................................................. 231.3.1.1.1. Destrucción o modificación de los contaminantes ............................................. 23

Índice

VI

1.3.1.1.2. Extracción o separación del contaminante ....................................................... 231.3.1.1.3. Aislamiento o inmovilización del contaminante ................................................. 231.3.1.2. Lugar de realización del proceso de remediación ................................................ 241.3.1.3. Tipo de tratamiento ............................................................................................ 24

1.4. La biorremediación como método de tratamiento de suelos contaminados por hidrocarburos ......................................................................................................................... 24

1.4.1. Generalidades ....................................................................................................... 241.4.2. Clasificación .......................................................................................................... 251.4.2.1. Bioestimulación .................................................................................................. 251.4.2.2. Bioaumentación ................................................................................................. 251.4.3. Fundamentos bioquímicos de la biorremediación .................................................... 261.4.4. Consorcios Bacterianos degradadores de hidrocarburos ......................................... 281.4.5. Factores que condicionan la biodegradación de los hidrocarburos ........................... 291.4.5.1. Temperatura ...................................................................................................... 291.4.5.2. pH ..................................................................................................................... 291.4.5.3. Oxígeno ............................................................................................................. 301.4.5.4. Nutrientes .......................................................................................................... 301.4.5.5. Humedad ........................................................................................................... 301.4.5.6. Estructura, composición y disponibilidad del contaminante .................................. 311.4.6. Polémica actual sobre el empleo de las técnicas de biorremediación ....................... 31

Conclusiones parciales ........................................................................................................... 322. MATERIALES Y MÉTODOS ............................................................................................... 34

2.1. Breve descripción de la zona de estudio ...................................................................... 342.2. Tratamiento de los residuos petrolizados ..................................................................... 34

2.2.1. Diseño y preparación del área de biorremediación .................................................. 342.2.2. Microorganismos empleados .................................................................................. 342.2.3. Medios de cultivo ................................................................................................... 342.2.4. Proceso de fermentación ....................................................................................... 35

2.3. Monitoreo y control del proceso de biorremediación ..................................................... 362.3.1. Muestreo ............................................................................................................... 362.3.2. Determinaciones analíticas .................................................................................... 372.3.2.1. Análisis microbiológico ....................................................................................... 372.3.2.1.1. Determinación de Microorganismos Heterótrofos Totales ................................. 372.3.2.1.2. Determinación de Microorganismos Degradadores de Petróleo ........................ 372.3.2.1.3. Absorbancia ................................................................................................... 372.3.2.1.4. Número total de células ................................................................................... 372.3.2.1.5. Velocidad específica de crecimiento ................................................................ 372.3.2.2. Análisis físico-químico ........................................................................................ 37

Índice

VII

2.3.2.2.1. Determinación de Hidrocarburos Totales del Petróleo ...................................... 372.3.2.2.2. Determinación de Saturados, Aromáticos, Resinas y Asfaltenos ....................... 382.3.2.2.3. Velocidad de degradación de hidrocarburos ..................................................... 382.3.2.3. Determinación del porciento de remoción de hidrocarburos ................................. 382.3.2.4. Análisis Ecotoxicológicos .................................................................................... 382.3.2.4.1. Ensayos de fitotoxicidad sobre la germinación en plantas terrestres. ................ 382.3.2.4.2. Ensayos de fitotoxicidad sobre el crecimiento en plantas terrestres. ................. 38

2.4. Tratamiento estadístico de los resultados ..................................................................... 382.5. Análisis costo-beneficio ............................................................................................... 39

3. RESULTADOS Y DISCUCIÓN ........................................................................................... 413.1. Diseño del área de manejo .......................................................................................... 413.2. Obtención industrial de BIOIL-FC ................................................................................. 42

3.2.1. Fermentación a escala industrial ............................................................................ 423.2.2. Aplicación del BIOIL-FC ......................................................................................... 44

3.3. Análisis microbiológico ................................................................................................ 453.4. Análisis físico-químico ................................................................................................. 47

3.4.1. Análisis de la concentración de Hidrocarburos Totales del Petróleo ......................... 473.4.2. Análisis de la concentración de las fracciones saturadas, aromáticas, resinas y asfalténicas ........................................................................................................................ 51

3.5. Análisis ecotoxicológico ............................................................................................... 543.5.1. Determinación de la fitotoxicidad sobre la germinación de semillas en frijol y maíz .. 543.5.2. Ensayos de fitotoxicidad del suelo sobre el crecimiento en plantas terrestres ........... 553.5.2.1. Determinación de la fitotoxicidad del suelo sobre el crecimiento de frijol ............... 553.5.2.2. Determinación de la fitotoxicidad del suelo sobre el crecimiento de maíz. ............. 57

3.6. Análisis costo-beneficio ............................................................................................... 58CONCLUSIONES ...................................................................................................................... 62RECOMENDACIONES .............................................................................................................. 64BIBLIOGRAFÍA ......................................................................................................................... 65ANEXOS ................................................................................................................................... 74

Introducción

1

INTRODUCCIÓN

Una de las problemáticas ambientales en la industria petrolera está relacionada con el

tratamiento y disposición de los residuos generados en los procesos de extracción y

refinación del petróleo, que comprenden la disposición de lodos y aguas no reutilizados en

los procesos de perforación/extracción y lodos acumulados en los depósitos de

combustible. Desechos que contienen aguas oleosas, lodos petrolizados, altas

concentraciones sales (NaCl y Na2CO3

Por su parte, los derrames de crudo y sus derivados son otra fuente de contaminación con

resultados nefastos para el medio ambiente en general, siendo los efectos biológicos de

dichos productos petrolíferos, aunque de difícil predicción muy graves, al actuar a todos los

niveles de organización biológica, desde los componentes subcelulares hasta los niveles

superiores del ecosistema (

) agregadas como densificantes y contaminantes

peligrosos como metales pesados e hidrocarburos poli aromáticos de carácter carcinógeno

siendo un residual peligroso con características especiales de manejo.

Alexander, 1994).

Muchos trabajos publicados (Luque et al., 1998; Ercoli, 1999; Martínez and López, 2001;

Mendoza et al., 2001) demuestran que la presencia de hidrocarburos en el suelo modifica

sus características. Sus propiedades físicas se afectan al aglutinarse las partículas del

suelo, generando estructuras más gruesas que cubren la superficie y el espacio poroso

afectando la aireación. Como la película que cubre las partículas es hidrófoba también

disminuye la retención de agua, generando alteraciones del sustrato original y modificando

sus propiedades químicas y biológicas, que a su vez impiden o dificultan la implantación de

las especies vegetales, dejando suelos inutilizables durante años (Ayelén, 2008).

Teniendo en cuenta la magnitud de la contaminación por hidrocarburos y los efectos

nocivos que ocasiona, se hace necesario el establecimiento de un equilibrio entre el

desarrollo productivo y la protección del medio ambiente. Lo que conlleva al desarrollo de

tecnologías eficientes para el tratamiento de estos desechos, debiendo incluir la

recuperación del valor energético de estos residuales y su reintroducción en los procesos

productivos; proponiendo a su vez metodologías y procedimientos que logren la total

degradación de los contaminantes presentes, y garanticen su disposición en espacios

ambientales sin representar riesgo alguno para los ecosistemas o cuerpos receptores.

Introducción

2

Son disimiles las tecnologías de tratamiento usadas en la actualidad. Dependiendo de su

uso en particular, además de los factores específicos del sitio y de las propiedades

fisicoquímicas del contaminante, de su disponibilidad, fiabilidad demostrada o proyectada,

de su estado de desarrollo (laboratorio, escala piloto o gran escala) y de su costo (Sellers,

1999).

Dichas tecnologías pueden clasificarse sobre la base de tres criterios fundamentales:

primero, en función de la estrategia de remediación, las cuales incluyen la destrucción o

modificación del contaminante, la extracción o separación y el aislamiento o inmovilización;

segundo, en función del lugar en que se realiza el proceso de remediación, clasificándose

en tecnologías “ex-situ” e “in-situ”; tercero, de acuerdo al tipo de tratamiento, en métodos

biológicos, fisicoquímicos y térmicos.

Dentro de las principales ventajas de los métodos biológicos está su efectividad en cuanto

a costos, son más benéficos para el medio ambiente y generalmente son destruidos la

totalidad de los contaminantes requiriendo un mínimo de tratamiento posterior; sin

embargo requieren de mayores tiempos de tratamiento y generalmente es necesario

verificar la toxicidad de intermediarios y productos. Por su parte, los métodos

fisicoquímicos también son factibles en cuanto a costos, pueden ejecutarse en períodos

relativamente cortos y el equipamiento necesario es accesible, no requiriendo de mucha

energía ni ingeniería; por el contrario los residuos generados por esta técnica deben

tratarse o disponerse, deviniendo en un incremento de los costos y necesidades de

permisologías, a su vez los fluidos de extracción pueden aumentar la movilidad de los

contaminantes, necesitándose sistemas de recuperación. Finalmente los métodos de

tratamiento térmico poseen tiempos cortos de limpieza pero tienen un incremento

considerable de sus costos en función de su alto consumo de energía, equipamiento y

mano de obra.

Las investigaciones relacionadas con la biorremediación surgen como una alternativa

eficiente para la recuperación de los ecosistemas impactados. Esta técnica aprovecha la

capacidad que tienen los microorganismos de crecer a partir de sustancias nocivas al

medio ambiente, de manera que la degradan hasta dióxido de carbono y agua, además,

permite tratar grandes volúmenes de contaminantes con un impacto ambiental mínimo, a

diferencia de otros procedimientos de descontaminación (Núñez, 2003).Entre las técnicas

más utilizadas en la biorremediación se encuentra el uso de los dispersantes (primera

Introducción

3

generación, en los años ’60 del pasado siglo), la segunda generación llamada

bioestimulación y a partir de los años ’80 la denominada bioaumentación basada en el uso

de microorganismos exógenos para acelerar el proceso de descontaminación(Núñez,

2003).

A partir de la década del ’70 comenzó el desarrollo de técnicas de biorremediación con

productos para estimular la biodegradación natural. Estos se basaban en la utilización de

tensoactivos emulgentes que facilitaran la oxidación de los compuestos del petróleo, pero

lejos de obtener resultados alentadores se incrementaba la contaminación del entorno con

estos productos (Bergueiro and Domínguez, 1996). Teniendo en cuenta las bajas

concentraciones de nitrógeno y fósforo en el ambiente marino y la baja frecuencia de

aparición de microorganismos degradadores de petróleo (10-6

Bartha, 1986

bacterias

hidrocarbonoclastas/ml) ( ), una nueva generación de productos se desarrolló

desde mediados de los años ’80, mediante la técnica de bioestimulación llamados

biofertilizantes (Atlas, 1995; Lee and Tremblay, 1995), permitiendo enriquecer en nutrientes

la zona afectada por el derrame. Los productos de esta generación presentan una gran

variedad de composición y fueron ampliamente comercializados (Head, 1998). Estos

productos se utilizaron con resultados no satisfactorios durante la limpieza del derrame

ocasionado por el Supertanquero “Exxon Valdez” en Alaska (Arrejuría, 1994).

En la actualidad se han desarrollado otros productos que se basan en la técnica de

bioaumentación, o sea, en el aislamiento y selección de microorganismos marinos

hidrocarbonoclastas, que son liofilizados con nutrientes y añadidos en la zona afectada

después de la recogida mecánica del crudo. Los productos de esta generación también se

comercializan actualmente y entre ellos se encuentran los productos rusos “Putidoil” y

“Biotemposkreem” (Núñez, 2003).

La experiencias en el campo de la biorremediación en nuestro país, han estado basadas

fundamentalmente en el empleo de métodos de bioestimulación a escala de laboratorio,

reportándose en la literatura solo algunos casos aislados de experiencias a nivel de

campo con resultados discretos. Por su parte, el empleo de técnicas de bioaumentación,

ha tenido mayor uso con resultados alentadores tanto a escala de laboratorio como en

campo. El uso del BIOIL-FC (Cultivo mixto de cinco bacterias hidrocarbonoclastas

degradadoras de hidrocarburos y productoras de sustancias tensoactivas, aisladas de la

bahía de Cárdenas) obtenido por el Centro de Bioproductos Marinos (CEBIMAR) ha sido

Introducción

4

utilizado en el tratamiento satisfactorio de varios derrames de hidrocarburos en Bahías y

Playas de Cuba (Fonseca et al., 1994; Núñez, 2003). Técnica que asumimos como soporte

de nuestra investigación a partir de las ventajas antes expuestas que el método

proporciona en sí, además de la disponibilidad de uso del producto patentado BIOIL-FC.

La industria petrolera contribuye de manera importante al desarrollo económico de Cuba,

razón por la cual, las actividades de exploración, extracción, refinación, transporte y

consumo de productos derivados del petróleo se incrementan cada día. Así, el manejo

inadecuado y los accidentes durante la transportación de crudo y sus derivados, han

generado un incremento de la contaminación por hidrocarburos a lo largo del territorio

nacional tanto en ecosistemas marinos como terrestres. De manera particular, en la

provincia de Cienfuegos, con una amplia proyección de desarrollo del polo petroquímico

desde el 2007 con la reapertura de la refinería “Camilo Cienfuegos”, se ha incrementado el

riesgo de contaminación de las aguas y zonas terrestres contiguas a su Bahía.

Uno de estos escenarios lo constituye la zona costera de “Punta Majagua”, península

localizada en la porción centro-norte de la Bahía, perteneciente al consejo popular Reina;

la cual además de haber constituido uno de los pilares del desarrollo industrial en

Cienfuegos, constituye el asentamiento de una de las comunidades pesqueras de mayor

tradición en la provincia, que ocupa un área de 0,89km2 con un fondo poblacional de 1 719

habitantes y posee una población con una tendencia al envejecimiento, y una metrópoli

residente bastante estable con pocos movimientos migratorios, consecuencia de un fuerte

arraigo a la cultura del lugar.

La severa contaminación ambiental en “Punta Majagua”, tuvo su origen en la presencia de

479m3 de fueloil y lodos de deposición de alta viscosidad con altos contenidos de

sedimento y agua; acumulados en los restos de cuatro tanques de almacenamiento y

derramados en la zona tras el abandono de las instalaciones de la Unidad Distribuidora de

Combustibles de Cienfuegos en 1998. Su presencia representaba un peligro potencial para

los habitantes de la zona, y de contaminación de las aguas de la bahía y el suelo,

causando la pérdida de la biodiversidad en dicha franja costera. Las características físico -

químicas del residual y la limitada capacidad de autodepuración natural entre otras causas,

propició la persistencia de dichas condiciones ambientales por más de 12 años.

Introducción

5

Teniendo en cuenta lo anteriormente expuesto se plantea el siguiente problema de

investigación: La biodegradación natural de residuos petrolizados en procesos de autodepuración de

zonas contaminadas con hidrocarburos, está limitada por la baja capacidad degradativa de

los microorganismos autóctonos sobre los compuestos orgánicos del petróleo.

Hipótesis del trabajo El uso del potencial metabólico del consorcio bacteriano BIOIL-FC, pudiera ser efectivo en

la degradación de residuos petrolizados sometidos a años de intemperismo, los cuales son

cuantificables por técnicas analíticas y factibles de evaluar su potencial ecotóxico.

Objetivo general Realizar el saneamiento ambiental de la zona costera de “Punta Majagua” mediante la

técnica de biorremediación con el uso del consorcio bacteriano BIOIL-FC.

Objetivos específicos

1. Diseñar el área de manejo de residuos petrolizados y aplicar el consorcio bacteriano

BIOIL-FC.

2. Evaluar la eficiencia del proceso de biorremediación mediante variables

microbiológicas, físico-químicas y ecotoxicológicas del suelo antes, durante y después

del tratamiento.

3. Realizar el análisis costo-beneficio del saneamiento de la zona contaminada.

Capítulo I. Revisión Bibliográfica

6

1. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA

1.1. Generalidades sobre el petróleo y sus derivados 1.1.1. Origen del petróleo. Características generales

El petróleo es esencialmente una mezcla compleja de hidrocarburos, y elementos no

hidrocarbonados tales como oxígeno, azufre, nitrógeno, vanadio, níquel y cromo,

generalmente presentes como componentes de moléculas complejas. Se origina a partir de

la materia orgánica depositada con los sedimentos, la cual es convertida por procesos

bacterianos y químicos durante el soterramiento en un polímero complejo o kerógeno, el

que contiene pequeñas cantidades de nitrógeno y oxígeno. Este proceso es acompañado

por remoción del agua y compactación de los sedimentos. El kerógeno a su vez, es

convertido en hidrocarburos por crackeamiento térmico a mayores profundidades y

temperaturas relativamente elevadas ( Welte, 1965; citado en Quiroga and Rodrigo,

1990).La composición elemental de un crudo está condicionada por la predominancia de

los compuestos tipo hidrocarburo: 84-87% de C, 11-14% de H, de 0-8% de S, y de 0-4% de

O, N y metales como el níquel y el vanadio (Clark and Brown, 1997).

1.1.2. Composición química del petróleo 1.1.2.1. Parafinas volátiles (n-alcanos e isoprenoides volátiles)

Representan hasta un 30% del crudo de petróleo. Son n-alcanos e isoprenoides (alcanos

ramificados) de un tamaño C1-C10 (de 1 a 10 átomos de carbono). Es la fracción más

volátil del crudo y por lo tanto la más susceptible de pérdidas abióticas por volatilización. La

fracción gas natural contiene, principalmente C1-C5. Los isoprenoides volátiles, están

representados principalmente por el isobutano e isopentano. Los homólogos de mayor

peso molecular disminuyen su presencia en el crudo con el incremento del peso molecular.

Los isoprenoides volátiles también pueden llegar hasta C10 Howe-

Grant, 1996

(2,6 dimetil octano) (

) .

1.1.2.2. Parafinas no volátiles (n-alcanos e isoprenoides)

Se definen como aquellos n-alcanos y aquellos isoprenoides entre C11-C40. Los

componentes entre C11-C15 son de volatilidad intermedia. Los n-alcanos oscilan entre C11-

C40, aunque se han descrito cadenas más largas y pueden constituir entre el 15-20% de

crudos no degradados. Los isoprenoides varían de C12-C22 y constituyen entre 1-2% del

crudo, llegando a 15% en crudos degradados.


7

El pristano y fitano se han utilizado como marcadores internos del grado de biodegradación

de un crudo, La bibliografía especializada sobre los rangos de los índices de Pr/nC17 y

Fi/nC18

Lee and Levy, 1989

cita que se consideran valores umbrales de biodegradación relaciones de 0,5 y 0,3

respectivamente ( ; Wang et al., 1998; Ortíz, 2004)

1.1.2.3. Naftenos (cicloalcanos)

Esta familia está compuesta por las cicloparafinas o cicloalcanos. Los compuestos más

abundantes de esta familia son los ciclopentanos alquilados (fundamentalmente

metilados), que pueden llegar a representar un 31% del crudo. Los compuestos mono y

dicíclicos corresponden al 50-55% de esta fracción, los tricíclicos al 20% y los tetracíclicos

al 25%. Esta familia engloba a los hopanos, antes mencionados.

1.1.2.4. Olefinas (alquenos)

Los alquenos están poco presentes en el crudo de petróleo, encontrándose en

concentraciones traza. Adquieren importancia en los productos resultantes del refinado, ya

que se generan durante el proceso de cracking, existiendo hasta un 30% en gasolinas y un

1% en fueles.

1.1.2.5. Hidrocarburos aromáticos

El crudo de petróleo contiene una mezcla muy compleja de hidrocarburos aromáticos.

Compuestos por moléculas que contienen uno o varios anillos bencénicos en su estructura.

Así encontramos hidrocarburos monoaromáticos (un anillo bencénico), diaromáticos (dos

anillos bencénicos) y poliaromáticos (HAPs, con más de dos anillos bencénicos).

1.1.2.5.1. Hidrocarburos monoaromáticos

Conformado por el benceno y sus alquilados (monoalquilados como el tolueno y

dialquilados como los xilenos), formando la familia de los BTEX (benceno, tolueno,

etilbenceno y xileno) de gran importancia ambiental debido a su volatilidad y toxicidad

(Torres and Zuluaga, 2009).

1.1.2.5.2. Hidrocarburos poliaromáticos

Entre los hidrocarburos diaromáticos, encontramos el naftaleno y sus alquilados (mono, di,

tri y tetrametilnaftalenos). Constituyen la familia mayoritaria de hidrocarburos aromáticos

presentes en un crudo. Entre los hidrocarburos poliaromáticos de tres anillos, encontramos

el fenantreno, antraceno, fluoreno, y sus derivados alquilados. El fenantreno y los

metilfenantrenos, representan los componentes mayoritarios de los triaromáticos. Entre los

hidrocarburos poliaromáticos de más de tres anillos, encontramos el fluorantreno (tres


8

anillos bencénicos y uno no bencénico), pireno y criseno (cuatro anillos aromáticos), pireno

y benzo(a) pireno (cinco anillos aromáticos).

1.1.2.6. Resinas y asfaltenos

Se trata de mezclas complejas, integradas por núcleos policíclicos o naftenoaromáticos.

Contienen cadenas hidrocarbonadas con heteroátomos de oxígeno, nitrógeno y azufre

(componentes NOS del petróleo) y a veces están asociadas con pequeñas

concentraciones de metales como el vanadio y el níquel. Constituyen entre un 10% en

crudos poco degradados o ligeros, hasta un 60% en crudos muy degradados. Es la

fracción que presenta una mayor recalcitrancia de un crudo de petróleo. Se trata de

agregados de piridinas, quinolinas, carbazoles, tiofenos, sulfóxidos, amidas, HAP, sulfuros,

ácidos nafténicos, ácidos grasos, metaloporfirinas y fenoles polihidratados. (Howe-Grant,

1996).

1.1.3. Clasificación químico-física del petróleo

Una de las clasificaciones más utilizadas se basa fundamentalmente en la concentración

de los cuatro componentes funcionales del petróleo citados anteriormente: Saturados,

Aromáticos, Resinas y Asfaltenos, (tabla 1).

Tabla 1. Clasificación química del petróleo según su composición, (Mello et al., 1984; citado en Quiroga and Rodrigo, 1990: p. 352).

COMPOSICIÓN (%) CLASES Pa

rafin

as

Naf

teno

s

Aro

mát

icos

Res

inas

Asf

alte

nos

Parafínica 75%(+) --

Nafténica -- 70%(+) --

Aromática -- 50%(+) -- Asfáltica -- 60% (+)

Parafínico-Nafténica 60-70% 20% (-) -- Parafínico-Nafténico-Aromática Aproximadamente igual % --

Nafténico-Aromática -- 35%(+) 35%(+) -- Nafténico-Aromático-Asfáltica -- 25%(+) 25%(+) -- 25%(+)

Aromático-Asfáltica -- -- 35%(+) -- 35%(+)


9

Otro de los criterios de clasificación usados en la industria petrolera, está en función de su

densidad API. Básicamente creada para clasificar líquidos menos densos que el agua en

una escala relacionada con la gravedad específica, y se calcula de acuerdo a la expresión:

La tabla 2 muestra los tipos de hidrocarburos de acuerdo a dicha clasificación:

Tabla 2. Clasificación del petróleo según su densidad, (API, 2008; citado en Melaine, 2009: p.23)

Petróleo Crudo Densidad (g/cm3 Densidad. Grados API ) Extra Pesado >1 <10

Pesado 1-0,92 10-22,3 Mediano 0,92-0,87 22,3-31,1 Ligero 0,87-0,83 31,1-39

Súper Ligero <0,83 >39

1.1.4. Generalidades sobre la refinación del petróleo. Derivados El conocimiento de las características de los derivados del petróleo y las generalidades de

su obtención en los procesos de refinación del crudo, es importante para comprender la

naturaleza química de sus derivados que potencialmente pueden contaminar el medio

ambiente. En la refinación de un crudo la destilación tiene como finalidad eliminar el color

y olor, así como también, los compuestos del azufre. Se destila a temperaturas crecientes

obteniendo cuatro fracciones principales: gasolina, queroseno, destilados medios

(querosenos, gasoil, aceites lubricantes) y un residuo. Este residuo se destila al vacío

obteniéndose otros aceites lubricantes (más pesados), ceras, parafinas y bitumes

asfálticos (alquitranes).

Durante el proceso de refinado, se eliminan componentes de la fracción asfalténica

(altamente recalcitrante) lo que implica que los refinados intermedios (gasoil, fueles,

querosenos y también las gasolinas) sean productos relativamente más biodegradables

que los coques o alquitranes residuales (Viñaz, 2005).

Así pues, la composición química de la gasolina es diferente a la del gasoil debido a que se

han obtenido como productos de destilación del petróleo a partir de diferentes intervalos de


10

temperatura (tabla 3). La obtención de gasolina es menos directa que la de los fueles y

gasóleos, ya que en una primera fase se obtiene por destilación del crudo entre 20-180ºC.

Esto implica una composición de n-alcanos más ligera (C6-C11) que los fueles y gasóleos

(C10-C25

% de Salida

). En la gasolina encontramos como componentes más abundantes: n-butano,

isopentano, pentano, mono y dimetilpentanos, hexano, BTEX, mono y dimetilhexanos,

trimetilbencenos, metiletilbencenos, y en menor cantidad los naftalenos, sus mono y

dimetilados y heptano (de menor índice de octanaje).

Tabla 3. Fracciones obtenidas durante la destilación de un crudo de petróleo.

Rango de ebullición (ºC) Átomos de Carbono Productos

2 <30 1-5 Hidrocarburos Ligeros

15-20 30-200 5-12 Gasolinas, Naftas 5-20 200-300 12-15 Queroseno 10-40 300-400 15-25 Gas-oíl

Residuos 400 (+) 25(+) Lubricantes, Alquitrán

Los fueles ligeros y el gasoil forman parte de la fracción intermedia de destilación en el

proceso de refinado, lo que implica un rango de puntos de ebullición entre 185-345ºC,

encontrando compuestos de 10 a 25 átomos de carbono, siendo los más abundantes los

C15-C17

Viñaz, 2005

. Su composición es de un 30% en parafinas (n-alcanos e isoprenoides), 45% de

naftenos (cicloalcanos) y un 25% de aromáticos. En concreto a nivel de compuestos

aromáticos encontramos alquibencenos, y más abundantemente, el naftaleno y sus

alquilados. También se ha encontrado, en cantidades menores, el fenantreno y el fluoreno.

No contienen pireno ni fluoranteno (compuestos de 4 anillos aromáticos), cuyos puntos de

ebullición son más elevados que el intervalo utilizado en la destilación de fracciones

intermedias ( ).

1.2. La contaminación de los suelos por petróleo y sus derivados

1.2.1. Antecedentes de la contaminación por petróleo y sus derivados El problema de la contaminación por petróleo y sus derivados en ambientes terrestres y

marinos, ha recibido gran atención en los últimos años y sobre todo en los aspectos del

destino y los efectos tóxicos del petróleo derramado. Los accidentes de contaminación

tanto en tierra como en cuerpos de agua resultan inevitables en la industria petrolera,


11

debido a los grandes volúmenes de hidrocarburos que se manejan. Siendo así, los

derrames pueden provenir de dos fuentes fundamentales: terrestres (ruptura de ductos y

depósitos de almacenamiento, transportación ferroviaria y por carreteras, manejo

inadecuado de lodos de acumulación y cortes de perforación entre otras causas), y

marítimas (operaciones de limpieza, carga, descarga, y colisiones de buques tanqueros y

supertanqueros así como la ruptura de ductos submarinos y malas operaciones en

plataformas de extracción mar adentro entre otras fuentes).

La mayoría de los grandes desastres o accidentes petroleros que han ocasionado

derrames de impacto global, han sido ampliamente reportados y analizados en medios

internacionales, asimismo, algunos de los derrames de mayor connotación fueron los del

Torrey Canyon que vertió entre 586 000 y 872 000 barriles (80 000-119 000t) de petróleo

frente a las costas de Cornualles, Inglaterra, en 1967 y el Exxon Valdez, que vertió 240 000

barriles (30 000t) en Prince William Sound, Alaska, en marzo de 1989, produciendo en el

plazo de una semana, una marea negra de 6 700km2

La zona marino-costera mexicana del Golfo de México es una de las mayores cuencas de

hidrocarburos con una producción superior a las 400 000t/d. Sujeta a un intenso tráfico de

buques petroleros que movilizan más de 5 000 000 de barriles diarios y donde se vierte al

mar cerca de 7 000 0000 de barriles al año por el lavado de sus tanques que ejerce una

presión ambiental en los principales ríos, lagunas costeras y estuarios de la zona (Botello

et al., 1997). Dentro de los accidentes reportados de mayor impacto ambiental en el área

está la producida por el pozo petrolífero Ixtoc I de Pemex en 1979, entre 3 328 000 y 3 518

000 barriles de crudo (454 000-480 000t ), (

, que puso en peligro la vida silvestre

y las pesquerías de toda el área. Por su parte entre las mayores mareas negras

registradas hasta el momento estuvo la del petrolero Amoco Cádiz frente a las costas

francesas en 1978 con 1 635 000 barriles de crudo (223 000t); otro derrame de gran escala

fue el producido en el campo de Nowruz, Golfo Pérsico, en 1983 con 1 906 000 barriles

(260 000t) de crudo.

Núñez, 2003) y 32 años más tarde el 22 de

abril de 2010 el derrame producido por la explosión de la plataforma Deepwater Horizon,

de la empresa British Petroleum (BP), donde fueron vertidos al mar más de 4 900 000

barriles de petróleo crudo (Dávalos, 2010), considerado hoy como el mayor desastre

petrolero la historia


12

La región del Caribe por su parte, sufre un daño considerable debido a vertimientos

sistemáticos de hidrocarburos, según datos estimados, el 90% de las cargas

contaminantes por petróleo que ingresan en las aguas costeras de la región están

relacionadas con fuentes industriales, señalándose las refinerías y las plantas

petroquímicas, pequeños derrames y especialmente la descarga de aguas de lavado de

tanques en los supertanqueros que son transportados por las corrientes oceánicas, para

terminar como agregados de alquitrán en playas y arrecifes coralinos. Uno de los

vertimientos mayor escala global totalizó unos 872 000 barriles (119 000t) debido a la

colisión de dos petroleros, el Aegean Captain y el Atlantic Empress, cerca de Trinidad y

Tobago en 1979 (Núñez, 2003).

Los anales de la industria del petróleo en Cuba por su parte, registran ejemplos

fehacientes de la contaminación por petróleo y sus derivados. Por citar algunos ejemplos

en 1992 se reportó el vertimiento accidental de 100t de petróleo crudo en la Bahía de

Cienfuegos, tras la varadura de la nave inglesa B/T Aida ; en 1998 en la Bahía de

Matanzas se derramaron más de 500t de petróleo Varadero (11 API ), provocado por la

colisión de los buques Bravo y Sharadar ; en el mismo año el desmantelamiento de las

instalaciones de la base de combustibles de la Unidad Distribuidora de Cienfuegos, produjo

la acumulación de 479 m3 de lodos petrolizados, los que contaminaron 70 000 m2 de suelo

y parte del litoral costero. El recalo de 120t de diesel marino en playa Jibacóa, al norte de

la provincia La Habana, se produjo por la limpieza de sentinas de un barco desconocido en

el 2000, provocando la contaminación de 500m de costas y la acumulación de diesel en

300m de la playa antes mencionada. En el 2002 por su parte, producto de la avería de un

tramo del oleoducto Felton-Nicaro en la provincia de Holguín, se contaminaron con más de

300t de crudo cubano (11 API), 6km de costa, de las cuales 1km fue de costa rocosa,

1,5km de playa y el resto de mangle costero e interior. Uno de los derrames de mayor

envergadura en el territorio nacional ocurrió en septiembre de 2008 producto de la avería

de un sector del oleoducto Puerto Escondido-Supertanqueros en las cercanías del rio

Bacunayagua, localizado en los límites de la Provincia de La Habana y Matanzas, en el

cual fueron vertidos al medio más de 800 t de petróleo crudo que contaminó 172 700m2

Núñez et al., 2008

de

estuario y ensenada del rio Bacunayagua, y 3,610 km de distancia, comprendidos entre

afluente, río, playa y franja costera ( ). A su vez el 24 de Marzo de 2010

en Arroyo la Bomba, provincia de Cienfuegos, tras el descarrilamiento de tres carros


13

cisternas en el tramo refinería Camilo Cienfuegos-Planta Fertilizantes, se derramaron

121m3 de fueloil y 46m3 de diesel, contaminando más de 20 000m2

Bermúdez et al.,

2011

de suelo, y lagunas

naturales, además de 5km de río hasta su desembocadura en la bahía (

).

Los derrames accidentales no son la única fuente de peligro de contaminación sino que la

acumulación de pasivos ambientales constituye también un problema ambiental latente en

la industria cubana del petróleo, asimismo, la refinería Camilo Cienfuegos de Cienfuegos

acumula más de 30 000m3 de lodos petrolizados en confinamiento temporal; por su parte

en la base de Supertanqueros de Matanzas se confinan hoy, sin alternativas de tratamiento

más de 5000m3 Castro and

Bermúdez, 2011

de lodos petrolizados producto de la limpieza de tanques (

), otras empresas como la refinería Ñico López en La Habana, Cabaiguan

en Santi Spíritus, la Empresa Puerto Moa en Holguín, la Empresa Comercializadora de

Combustibles de Villa Clara entre otras, reportan hoy volúmenes considerables de residuos

petrolizados confinados potencialmente contaminantes del medio ambiente.

1.2.2. Generalidades sobre las propiedades físico-químicas, estructurales y

microbiológicas de los suelos El suelo se define como la parte superior de la corteza terrestre, y se trata de un sistema

formado por componentes minerales (meteorización de las rocas), componentes orgánicos

(humus y derivados, biomasa viva y muerta), gas (aire en el espacio existente en los

poros), y agua envolviendo partículas y el espacio capilar. Constituye la Interfaz entre la

tierra, el aire y el agua, lo que le confiere la capacidad de desempeñar tanto funciones

naturales como de uso antropogénico (Viñaz, 2005). Así, Los suelos proporcionan soporte

físico y nutrientes para el crecimiento de las plantas y los microorganismos. Existe una

gran variedad de microorganismos (bacterias, actinomicetos, hongos, algas y protozoos)

que casi siempre están presentes en ellos, aunque las densidades de población de las

mismas varían ampliamente. La superficie de los suelos constituye el lugar donde se

producen la mayoría de las reacciones bioquímicas pertenecientes al ciclo de la materia

orgánica, el nitrógeno y otros minerales, a la meteorización de las rocas y a la toma de

nutrientes por parte de las plantas (Alexander, 1991; citado en Viña, 2005).

Las propiedades físico-químicas de los suelos influyen en gran manera sobre la aireación,

la disponibilidad de nutrientes, la retención de agua y por lo tanto, sobre la actividad

biológica. Las propiedades más importantes de las que engloban estos grupos son el


14

tamaño de partícula, la textura, la porosidad, la humedad, estado de aireación,

composición química, fracción de arcilla, capacidad de intercambio de cationes y fracción

orgánica. El tamaño de partícula afecta a la química de la superficie de los suelos y al

tamaño de los poros. La cantidad de poros depende de la textura, estructura y contenido

de materia orgánica del suelo.

1.2.2.1. Estructura y composición del suelo

Según las proporciones de arenas, limos, arcillas y materia orgánica, principalmente

humus y derivados, existe una gran variedad de tipos diferentes de suelos. Los

componentes minerales y la materia orgánica se distribuyen en el espacio generando una

estructura porosa. Los poros pueden contener agua o aire, de manera que existen tres

fases: sólida, líquida y gaseosa. El agua contenida en los poros del suelo contiene sales

minerales y nutrientes y es el medio en el cual se puede desarrollar la actividad metabólica

de los microorganismos que lo colonizan. El contenido en agua de un suelo puede oscilar

enormemente, afectando dicha actividad.

Básicamente, la matriz de un suelo está compuesta por cinco componentes principales:

Minerales (50% del volumen total), aire y agua (del 25 al 50% del volumen), organismos

vivos (1% de volumen) y materia orgánica (de 3 a 6% del volumen).

1.2.2.2. Fracciones minerales

El mineral predominante en un suelo es el dióxido de silicio (SiO2

Los suelos se clasifican según el tamaño de sus partículas, teniendo en cuenta tres

componentes principales: Arcilla (Pasa por un tamiz de 0,002mm), Limo (Queda retenido

en el tamiz de 0,002mm pero pasa a través del tamiz de 0,05mm) y Arena (Queda retenida

en el tamiz de 0,05mm aunque pasa a través del de 2mm), (

). Igualmente se

encuentran en abundancia el aluminio y el hierro, mientras que el calcio, magnesio,

potasio, titanio, manganeso, nitrógeno, azufre, sodio y fósforo están presentes en menor

cuantía (Alexander, 1991). La composición química varía de un suelo a otro y, en un

mismo suelo, a diferentes profundidades. Los microorganismos obtienen parte de los

nutrientes que necesitan de la fracción mineral del suelo, siendo dichos nutrientes

nitrógeno, fósforo, potasio, magnesio, azufre, hierro, calcio, manganeso, zinc, cobre y

molibdeno. Sin embargo los microorganismos pueden disponer con facilidad únicamente

de una pequeña parte de estos minerales, convirtiéndolos más en una provisión de lento

empleo, que en una fuente de rápido uso.

Torres and Zuluaga, 2009).


15

El área específica (área/volumen) de los diferentes tipos de partículas afecta directamente

las propiedades físicas, químicas y biológicas del suelo (tabla 4). La arcilla constituye el

tipo de partícula que mayor efecto produce sobre las propiedades de un suelo,

principalmente debido a la alta actividad superficial que la caracteriza. La mayor parte de

sus partículas son de naturaleza coloidal, tienen una carga superficial negativa y de forma

plana; además, son buenos absorbentes de agua, iones y gases. Las partículas de mayor

tamaño, como la arena, no tienen el mismo nivel de actividad superficial. Los principales

efectos asociados a las partículas de arena están relacionados con el tamaño del poro del

suelo y, por tanto, con el movimiento del aire y el agua a través del mismo (las arenas no

afectan en gran medida a las propiedades químicas y biológicas del suelo).

La presencia en un suelo de superficies que absorban con gran intensidad determinadas

clases de compuestos puede reducir la disponibilidad de compuestos orgánicos para la

biodegradabilidad. También afecta la disponibilidad de nutrientes, la capacidad de

intercambio de cationes en el suelo de los minerales arcillosos (NH4+, K+, Na+, Ca 2+, Mg2+

Tabla 4. Clasificación de las partículas de un suelo (

)

y los compuestos orgánicos que constan de zonas con carga eléctrica superficial negativa.

El amonio, por ejemplo, que tiene carga positiva, pasa a estar disponible en menor grado

para su uso directo por plantas y microorganismos y queda retenido en el suelo más

tiempo que los nitratos, oxidándose y pasando a tener carga negativa.

Millar et al., 1958; citado en Torres and

Zuluaga, 2009: p. 9)

Tipo de partícula Diámetro (mm) Área específica (m2/kg) Arena -- --

Gravilla 1,0-2,0 1,1 Arena gruesa 0,5-1,0 2,3 Arena media 0,25-0,5 4,5 Arena fina 0,1-0,25 9,1

Arena muy fina 0,05-0,1 22,7 Limo 0,002-0,05 45,4 Arcilla 0,002 1130,0


16

1.2.2.3. Materia orgánica

La fracción orgánica del suelo está compuesta por residuos de plantas y animales, células

microbianas y productos resultantes del metabolismo microbiano, comúnmente llamado

humus. El humus es materia orgánica que ha sufrido varias degradaciones y

transformaciones. Está compuesto en su mayor parte por sustancias polimerizadas:

compuestos aromáticos, polisacáridos aminoácidos, polímeros del ácido urónico y

compuestos que contienen fósforo (Alexander, 1991; citado en Viña, 2005). Mucha de la

materia orgánica de un suelo, en particular el humus, es ligeramente soluble únicamente

en agua y de alguna forma resistente a la biodegradación. El material húmico tiene

propiedades coloidales y una carga neta negativa; por lo tanto, la importancia que tiene en

el proceso de formación de complejos organometálicos es considerable.

1.2.2.4. Gases en el suelo

Existe una relación directa entre las cantidades de agua y aire contenidas en un volumen

de suelo, ya que el espacio de poros que no ocupe el gas lo ocupa el agua. Los principales

gases que conforman un suelo son, en esencia, los mismos que se encuentran en la

atmósfera terrestre. El aire de la atmósfera está compuesto, aproximadamente, por un

78,08% de nitrógeno, un 20,94% de oxígeno, un 0,035% de dióxido de carbono y un 0,93%

de gases inertes como el argón y el neón. Sin embargo, las concentraciones relativas de

dichos gases en el suelo, específicamente del O2 y del CO2, dependen de la aireación del

mismo y de la actividad microbiana en todo el perfil. En un suelo con buena aireación la

concentración de O2 puede oscilar entre el 18% y 20% y la concentración del CO2 puede

alcanzar valores tan altos como del 1% al 2%. En suelos con menor aireación (como los

suelos arcillosos con un alto contenido en agua y una actividad microbiana considerable) el

CO2 Torres and Zuluaga, 2009 puede llegar a presentarse en una concentración del 10% ( ).

En cuanto a la actividad microbiana, el nivel de aireación de un suelo no es tan importante

como las condiciones en el interior de los agregados. Aquellos suelos que en general están

bien aireados pueden tener zonas microscópicas anaerobias en el interior de las

formaciones de agregados, las cuales constituyen una explicación relativa a la presencia

de bacterias anaerobias, tales como los clostridium, en las capas superiores de un suelo

(Eweis et al., 1999).Las bacterias aerobias al mismo tiempo que colonizan zonas

microscópicas, consumen todo el oxígeno allí almacenado, dando lugar a las condiciones

que las bacterias anaerobias necesitan para desarrollarse y sobrevivir. Se calcula que la


17

transición de condiciones aerobias a anaerobias tiene lugar para valores de la

concentración de oxígeno inferiores al 1%; al mismo tiempo se cree que manteniendo una

aireación adecuada del suelo, el porcentaje del espacio de los poros ocupado por aire no

disminuiría por debajo de un 10% (Paul and Clark, 1989; citado en Torres and Zuluaga,

2009).

1.2.2.5. Humedad en el suelo

Para darse una idea general de la importancia que tiene el agua para el suelo es necesario

resaltar que junto con sus sales disueltas, forma la llamada solución del suelo; ésta es

esencial para abastecer de nutrimentos a las plantas que en él se desarrollan. La humedad

del suelo influye significativamente en la actividad biológica, puesto que un suministro

adecuado de agua es esencial para el crecimiento y la estabilidad microbiana. Un suelo

con una humedad demasiado baja da lugar a zonas secas y a una disminución en la

actividad microbiana; sin embargo, demasiada humedad inhibe el intercambio de gases y

el movimiento de oxígeno a través del suelo y deriva en la aparición de zonas anaerobias,

lo cual daría lugar a la eliminación de las bacterias aerobias y el aumento de la presencia

de anaerobios o anaerobios facultativos (Torres and Zuluaga, 2009). El agua que se

encuentra en un suelo se clasifica en tres tipos:

Gravitacional: Es el agua que está disponible para los microorganismos y las raíces de las

plantas. Ésta juega un papel importante en el transporte de contaminantes y otras

materias.

Capilar: Es el agua que está contenida en los poros, también está disponible para los

microorganismos del suelo.

Osmótica: Es el agua que está retenida por las partículas de arcilla y el humus y, opuesto a

los otros dos tipos de agua, no es de fácil alcance para los microorganismos y las raíces de

las plantas.

El contenido de agua en un suelo, en peso o volumen, es función de la presión de succión

o, como también se le conoce, el potencial de la matriz. Como concepto, el potencial de la

matriz constituye una medida de la tenacidad con la que es retenida el agua en los poros o

en la matriz de un suelo. Principalmente el agua es retenida en los poros por efecto capilar

y por adsorción. En la práctica, el potencial de la matriz es una medida de la succión

necesaria para que un determinado volumen de suelo contenga una cierta cantidad de

agua. La relación entre el potencial de la matriz y la humedad del suelo se representa


18

gráficamente mediante la curva característica de la humedad de un suelo, la cual es única

para cada tipo de suelo. Según los diferentes tipos de suelo, cuanto mayor sea el

contenido de arcilla de un suelo, mayor será su capacidad de retener agua y la variación

de la pendiente de la curva característica suelo-agua será más gradual (Eweis et al., 1999).

En la bibliografía la presión de succión puede expresarse en bares (bar) y algunas veces

en atmósferas (atm) o en mega pascales (MPa), pero en el laboratorio normalmente se

expresa en centímetros de succión de agua. La altura de la columna de agua se traduce

como medida de presión mediante la ecuación:

Donde:

: Presión (kg/ms2

Densidad del agua (kg/m

) 3

Constante gravitacional (9,81m/s

) 2

Altura de la columna de agua (m)

h)

Los tres tipos de agua anteriormente mencionados, pueden ser eliminados de la matriz de

un suelo si se aumenta la presión de succión. Se estima (tabla 5), que la actividad

microbiana óptima se obtiene para las humedades correspondientes a 0,5bar de presión

de succión (Paul and Clark, 1989; citado en Torres and Zuluaga, 2009). A presiones de

succión menores el suelo tiene demasiada humedad y puede encharcarse, mientras que

en presiones mayores el suelo está demasiado seco.

Tabla 5. Presión de succión necesaria para eliminar agua en el suelo (Torres and Zuluaga,

2009: p. 15).

Tipo de agua Presión de suelo necesaria para eliminar toda el agua

(m) (bar) Gravitacional 0-3 0-0,3

Capilar 3-150 0,3-15 Osmótica 150-1 500 15-150

1.2.2.6. Microflora autóctona del suelo

La red de poros formada como resultado de la asociación de las partículas minerales

(arenas, limos y arcillas) y la materia orgánica, provee una gran variedad de tamaños y

espacios, lo que condiciona el tipo y la diversidad de las poblaciones microbianas

existentes (Sessitsch et al., 2001; citado en Viñas, 2005). En términos generales se


19

encuentran en el orden de 106-109

Alexander,

1997

bacterias cultivables por gramo de suelo, mientras que

los hongos se encuentran en dos órdenes de magnitud menos como unidades formadoras

de colonias, pero representan una parte importante de la biomasa del suelo (

; Atlas and Bartha, 1997). Sin embargo, la estructura de la población microbiana en

los microhábitats (poros) del suelo, aún sigue siendo poco conocida (Sessitsch et al., 2001;

citado en Viñas, 2005), y además se estima que tan solo entre 0,1-1% de los

microorganismos son cultivables. La organización estructural de las partículas del suelo,

confiere una heterogeneidad espacial para los microorganismos, que se caracteriza por la

presencia de diferentes sustratos, nutrientes, concentraciones de oxígeno, contenido de

agua líquida, así como de un pH variable (Ladd et al., 1996; citado en Viñas, 2005). Este

hecho implica que en un suelo se puedan encontrar una gran variedad de poblaciones

microbianas con capacidades metabólicas distintas, condicionadas también por la

biodisponibilidad de las distintas fuentes de carbono y energía, que a su vez está

condicionada por las características físico-químicas propias de cada suelo (Kästner, 2000).

1.2.3. Procesos naturales que ocurren durante los derrames de hidrocarburos en el

suelo Luego de producirse un derrame de petróleo se producen una serie de cambios

progresivos de las propiedades físico-químicas del hidrocarburo en cuestión, atribuibles al

proceso de intemperización, el cual incluye parámetros tales como: evaporación,

fotooxidación, y biodegradación. La intemperización es la pérdida de ciertos componentes

del petróleo a través de una serie de procesos naturales que comienzan una vez que

ocurre el derrame y continúan indefinidamente.

La existencia de tres fases en el suelo, así como la gran diversidad de materiales que

pueden constituirlo, lo convierten en un compartimiento ambiental muy complejo. La

distribución de los contaminantes orgánicos se encuentra condicionada por estas

características, pudiéndose encontrar adsorbidos sobre el particulado o materia orgánica

(mayoritariamente aquellos compuestos de elevada hidrofobicidad como los HAPs y los

aceites minerales), en disolución, o en fase de vapor (Mackay and Betts, 1991; Means et

al., 1980; Weissenfels et al., 1992). Los contaminantes orgánicos que se encuentran en la

superficie de suelo pueden sufrir evaporación, disolución, dispersión, fotooxidación y

emulsificación. De este modo en el conjunto del suelo, los contaminantes orgánicos

pueden ser transformados fisicoquímicamente o sufrir biodegradación (Bossert and Bartha,


20

1984). Además los productos de oxidación parcial procedentes de los compuestos

orgánicos (como los HAPs y otros hidrocarburos) pueden ser movilizados en la fase

acuosa (son más polares), pudiendo ser transportados hasta otros suelos o ambientes

acuosos (Bossert and Bartha, 1984).

Las características que determinan el comportamiento de los hidrocarburos en el ambiente

son la densidad, presión de vapor, coeficiente de partición agua/suelo, polaridad (McBride,

1994), electronegatividad, hidrofobicidad (característica química que condiciona otros

parámetros específicos como la movilidad y estabilidad química, acumulación,

bioacumulación y sorción química), y solubilidad en agua. La alta solubilidad de un

compuesto químico promueve su mayor movilidad, teniendo menor probabilidad de ser

acumulativo, bioacumulativo, volátil y persistente. Como compuesto químico altamente

soluble es propenso a ser biodegradado y metabolizado por los microorganismos, el

contenido de materia orgánica del suelo es importante en la adsorción de los

contaminantes orgánicos (Ney, 1990; citado en Ortínez et al., 2003).

De acuerdo a su solubilidad, los compuestos químicos se pueden clasificar en los

siguientes rangos: baja solubilidad (< 10ppm); solubilidad media (entre 10 y 1 000ppm) y

alta solubilidad (> 1 000ppm).

El coeficiente de distribución agua/suelo de contaminantes no polares es fuertemente

dependiente del contenido de materia orgánica del suelo o alternativamente del contenido

de carbón orgánico del suelo (Chiou et al., 1998; citado en Ortínez et al., 2003), expresado

por la siguiente relación: .

Donde:

Koc: Coeficiente de partición en suelo.

Kd: Coeficiente de distribución agua/suelo.

foc: Contenido de carbón orgánico del suelo.

La tabla 6, representa el destino de los contaminantes orgánicos en el ambiente en función

de su coeficiente de distribución en suelo y solubilidad en el agua:


21

Tabla 6. Relación de compuestos orgánicos y su destino en el ambiente (Ney, 1990; citado

en Ortínez et al., 2003: p. 38).

Suelo Koc>10 000 S<10ppm

Koc: 1 000-10 000 S: 10-1000ppm

Koc<1 000 S> 1 000ppm

Adsorción Sí Otra vía N Movilidad N Otra vía Sí

Acumulación Sí Otra vía N Bioacumulación Sí Otra vía N

Contaminación a la cadena alimenticia Sí Otra vía N

Solubilidad N Otra vía Sí Persistencia Sí Otra vía N Disipación Sí Otra vía Sí

N: Insignificante.

El comportamiento de los hidrocarburos (en función de las características fisicoquímicas

antes mencionadas) depende además de las características del medio como son la unidad

del suelo, permeabilidad, estructura, tamaño de las partículas, contenido de humedad y de

materia orgánica, así como la profundidad del manto freático; factores climatológicos como

la temperatura y la precipitación pluvial. Todas las variables en su conjunto definen el

tamaño y la distribución tridimensional del frente de contaminación en una zona específica.

1.2.4. Efectos de la contaminación por hidrocarburos sobre los suelos De manera general, la contaminación por hidrocarburos en el suelo tiene un efecto

importante sobre sus propiedades físico-químicas, pudiendo retardar o impedir el

crecimiento de la flora microbiana y la vegetación existente sobre el área contaminada.

Cuando los hidrocarburos cubren la superficie del suelo, interrumpen la interacción

electrostática entre la superficie de las partículas del suelo y el agua, reduciendo su

capacidad de retención de agua. Durante los periodos de sequía, la cantidad de humedad

retenida en el suelo puede no ser suficiente para satisfacer la demanda de la vegetación,

produciendo resequedad y muerte de la vegetación (Adams et al., 2006; Zavala et al.,

2005) y la flora microbiana, la cual requiere condiciones mínimas de humedad (20%) para

su crecimiento y desarrollo. Relacionado a este problema está la repelencia al agua, en

ciertos suelos sobre todo arenosos que han sufrido algún periodo largo de sequía o

quema, se desarrolla una lámina delgada de hidrocarburos meteorizados que reduce la


22

capacidad del suelo a humectarse después de un periodo de estiaje (Roy and McGill,

2000). Por su parte dicha película de hidrocarburos reduce la transferencia de oxígeno

suelo-atmósfera, así, el rápido consumo de oxigeno por los microorganismos en la

oxidación de la materia orgánica y las propias fracciones de hidrocarburo, provocan la

aparición de condiciones de anaerobiosis, eliminando consecuentemente las poblaciones

de microorganismos aerobios en el suelo.

Por otra parte, muchos nutrientes de importancia para las plantas y microorganismos son

catiónicos, tales como el NH4+, K+, y Ca2+. Estos nutrientes catiónicos

Porta et al., 1999

son retenidos en el

suelo, aún en áreas con precipitaciones altas, debido a la interacción electrostática de las

partículas de suelo con carga negativa ( ). Cuando los hidrocarburos, poco

polares y sin carga, cubren esta superficie, se interrumpe la interacción entre las partículas

del suelo y los cationes, reduciéndose la capacidad del suelo para retenerlos.

Otra propiedad importante que se ve afectada por la presencia de hidrocarburos es la

compactación, al ocurrir un derrame de petróleo en un suelo mineral inmediatamente

disminuye su densidad aparente debido al incremento de carbono orgánico (Zavala et al.,

2005). Después de algunos meses los hidrocarburos residuales, sobre todo los muy

meteorizados, reducen la capacidad del suelo de volver a su situación natural luego de una

compresión temporal, asociada al carácter parcialmente oxidado de los hidrocarburos

residuales, y a que su estructura química presenta "terminales pegajosas", que

incrementan su viscosidad y adherencia. Martínez and López (2001) reportaron una

reducción del 87% de la porosidad en un suelo agrícola, correspondiente al cambio

inducido por la contaminación con aceites.

Finalmente, la presencia de aguas de producción o formaciones geológicas (domos

salinos), pueden alterar la conductividad eléctrica, la relación de adsorción de Na y a veces

el pH

1.3. Metodologías y técnicas más empleadas en la remediación de suelos contaminados con hidrocarburos

del suelo debido a las altas concentraciones de sales disueltas.

1.3.1. Tecnologías de remediación. Clasificación El término “tecnología de tratamiento” implica cualquier operación unitaria o serie de

operaciones unitarias que altere la composición de una sustancia peligrosa o contaminante

a través de acciones químicas, físicas o biológicas de manera que reduzcan la toxicidad,

movilidad o volumen del material contaminado (EPA, 2001).


23

Las tecnologías de remediación pueden clasificarse de diferentes maneras, en base a los

siguientes principios: estrategia de remediación; lugar en que se realiza el proceso de

remediación y tipo de tratamiento. Es importante mencionar que cada una de estas

clasificaciones proporciona información diferente acerca de las tecnologías de

remediación. A continuación se describen con más detalle las clasificaciones anteriores

(Deuren et al., 2000; Seller, 1999).

1.3.1.1. Estratégia de remediación

Son tres estrategias básicas que pueden usarse separadas o en conjunto,para remediar la

mayoría de los sitios contaminados:

1.3.1.1.1. Destrucción o modificación de los contaminantes

Alteración de la estructura química del contaminante. Dentro de ellos se pueden citar el

empleo de la incineración, en la cual se somete el suelo o matriz contaminada a

temperaturas cercanas a los 10000

1.3.1.1.2. Extracción o separación del contaminante

C lográndose la destrucción total de contaminante; y la

biorremediación en la cual se logra la destrucción parcial o total de los contaminantes

mediante un conjunto de técnicas o prácticas basadas en el uso de organismos vivos,

dentro del mismo se destacan el uso de plantas (Fitorremediación) y el empleo de

bacterias, hongos y otros microorganismos (Biopilas, Bioestimulación, Bioaumentación,

Land Farming, entre otros).

Aprovecha las propiedades físico-químicas del contaminante, tales como volatilidad,

solubilidad y carga eléctrica. Dentro de ellos destacan la desorción térmica, en la cual se

somete el suelo o matriz contaminada a temperaturas más bajas (250-5500

1.3.1.1.3. Aislamiento o inmovilización del contaminante

C) para

conseguir la desorción en vez de la destrucción del contaminante; el lavado químico donde

se aprovecha la solubilidad de los componentes del contaminante, tanto en solventes

orgánicos, como en agua; la aireación o arrastre gaseoso, el cual consiste en hacer pasar

una corriente de aire o vapor a través del suelo o matriz contaminada, favoreciendo la

volatilización de los componentes de bajo peso molecular; y la separación mecánica a

partir del uso de la fuerza centrífuga para separar la matriz del contaminante, entre otros.

Los contaminantes son estabilizados, solidificados o contenidos con el uso de métodos

físico-químicos. Dentro de esta estrategia se agrupan técnicas tales como la vitrificación,

que consiste en someter el suelo o la matriz a altas temperaturas (1 600-2 300°C)


24

consiguiendo su vitrificación, con lo que se llegan a fundir los materiales del suelo,

produciéndose una masa vítrea similar a la obsidiana; y el confinamiento o aislamiento del

suelo o matriz contaminada del ambiente natural de origen (sellado y encapsulado).

La selección de cada una de las estrategias explicitadas en el punto anterior o su

combinación, dependen básicamente del lugar donde se ejecute el tratamiento en sí, o sea

de la capacidad de aplicación de la misma en el área contaminada o en áreas confinadas y

preparadas para tales fines.

1.3.1.2. Lugar de realización del proceso de remediación

En general se distinguen dos tipos de tecnologías:

“in-situ”: Son las aplicaciones en las que el suelo contaminado es tratado, o bien, los

contaminantes son removidos del suelo contaminado sin necesidad de excavar el sitio. Es

decir, se realizan en el mismo sito donde se encuentra la contaminación.

“ex-situ”. Requiere de excavación, dragado o cualquier otro proceso para remover el suelo

contaminado antes de su tratamiento, puede realizarse en el mismo sitio (on site) o fuera

de él (off site).

1.3.1.3. Tipo de tratamiento

Esta clasificación se basa en el principio de la tecnología de remediación y se divide en

tres tipos de tratamiento: tratamiento biológico o biorremediación (uso del potencial

metabólico de ciertos organismos (plantas, hongos, bacterias) para degradar, transformar o

remover los contaminantes a productos metabólicos); tratamiento físico-químico (uso de

las propiedades físicas y/o químicas del contaminante o del medio para destruir, separar o

contener la contaminación); y tratamiento térmico (uso de calor para incrementar la

volatilización (separación), quemar, descomponer y/o fundir (inmovilización) los

contaminantes en un suelo).

1.4. La biorremediación como método de tratamiento de suelos contaminados por

hidrocarburos 1.4.1. Generalidades

La capacidad metabólica de las poblaciones microbianas, frente a los contaminantes

presentes en un suelo, es el fundamento sobre el que se sustenta la tecnología de

biorremediación (Alexander, 1999). Generalmente, en un suelo con contaminación

recurrente o con episodios previos de contaminación, las poblaciones microbianas

autóctonas se habrán seleccionado en favor de la metabolización del contaminante, el cual


25

puede ser transformado con mayor rapidez que la materia orgánica húmica del suelo

(Kästner, 2000). Numerosos microorganismos poseen la capacidad de utilizar

hidrocarburos como única fuente de carbono y se encuentran ampliamente distribuidos en

la naturaleza. Estos se encuentran sin embargo en bajas concentraciones en áreas no

contaminadas y se incrementan en ambientes sometidos a impactos crónicos de petróleo

(Núñez, 2003). Por este motivo, en emplazamientos previamente contaminados, la

bioestimulación de la población microbiana auctóctona, puede acelerar el proceso de

biodegradación de los contaminantes, siempre y cuando los compuestos no sean de gran

recalcitrancia (Alexander, 1999). Únicamente en aquellos casos de contaminación puntual

o de compuestos de gran recalcitrancia, puede ser necesaria la inoculación de poblaciones

alóctonas, procedentes de cultivos de laboratorio con capacidades degradativas

especializadas para posibilitar la degradación de los contaminantes existentes. Sin

embargo, a menudo la falta de adaptación de las poblaciones exógenas, puede poner en

peligro su supervivencia (Dejonghe et al., 2001; Kästner, 2000). Por lo tanto, antes de

iniciar cualquier estudio de biorremediación, es esencial conocer si la población microbiana

existente en el suelo es potencialmente degradadora de los contaminantes presentes y es

suficiente para llevar a cabo el proceso de biodegradación en un tiempo razonable (Wrenn

and Venosa, 1996).

1.4.2. Clasificación La biorremediación puede ser aplicada “in-situ” o “ex-situ” , siendolos métodos más usados

son la bioestimulación y la bioaumentación.

1.4.2.1. Bioestimulación

Consiste en la adición de nutrientes, sustratos o tensoactivos que estimulen el crecimiento

y la actividad metabólica de los microorganismos degradadores presentes en la zona

impactada (Baheri and Meysami, 2002). Generalmente se emplean fertilizantes,

suplementos y/o factores de crecimiento. También pequeñas cantidades de contaminantes

pueden actuar como estimulante natural, pues activan los operones que regulan la síntesis

de las enzimas que intervienen en el proceso de biorremediación (Andersson et al., 1998;

Razak et al., 1999; Mathew et al., 1999).

1.4.2.2. Bioaumentación

Comprende el uso de enzimas o cultivos de microorganismos con alta capacidad de

oxidación con el propósito de eliminar sustancias indeseables, donde se asegura que estén


26

presentes los microorganismos específicos capaces de degradar el compuesto

contaminante no deseado hasta sus moléculas básicas (Shmaefsky, 1999) siendo las

bacterias los microorganismos más comúnmente utilizados para este proceso. En

condiciones controladas ésta es una técnica práctica y económicamente efectiva para

eliminar la contaminación por hidrocarburos. Los microorganismos deben estar presentes

en suficiente cantidad y diversidad. También deben tener asegurados sus requerimientos

esenciales para lo cual se controlan rigurosamente parámetros como: nivel de oxígeno,

nutrientes inorgánicos, acceso al sustrato, agua y otras condiciones como pH, temperatura,

salinidad, propiedades del contaminante, etc. (Biotechnology, 2001).

1.4.3. Fundamentos bioquímicos de la biorremediación El fundamento bioquímico de la biorremediación se basa principalmente en la serie de

reacciones de oxidación-reducción (cuyo fin es la obtención de energía) que se producen

en la cadena respiratoria, o transportadora de electrones de las células. La cadena la inicia

un sustrato orgánico (compuestos hidrocarburados) que es externo a la célula y que actúa

como dador de electrones, de modo que la actividad metabólica de la célula acaba

degradando y consumiendo dicha sustancia (Maroto and Rogel, 2009).

Los aceptores más comúnmente utilizados por los microorganismos son el oxígeno, los

nitratos, el hierro (III), los sulfatos y el dióxido de carbono. Cuando el oxígeno es utilizado

como aceptor de electrones la respiración microbiana se produce en condiciones aerobias,

y los procesos de biodegradación serán de tipo aerobio; sin embargo, si utiliza los sulfatos

o el dióxido de carbono se produce en condiciones reductoras o anaerobias, y los procesos

de biodegradación serán de tipo anaerobio (figura 1).

Figura 1. Esquema de las reacciones (Maroto and Rogel, 2009: p. 298)

La biodegradación microbiana es un proceso complejo que consiste en la transformación

de los hidrocarburos en otros compuestos más solubles e inestables, llevada a cabo por


27

acción de monooxigenasas y dioxigenasas, enzimas que oxidan a los hidrocarburos con

incorporación directa de oxígeno molecular (Swannell et al., 1995; Venosa et al., 2000).

La misma está acompañada de importantes modificaciones cuantitativas de las diferentes

fracciones del petróleo, observándose un relativo incremento en los compuestos polares y

una disminución en la fracción asfalténica (Joseph et al., 1994; Wang et al., 1998).

Las n-parafinas son degradadas más rápidamente seguido por los aromáticos, isoalcanos,

cicloparafinas, y policíclicos aromáticos de cadenas largas (Prince, 1993). Cuando se trata

de petróleos pesados se mantiene esta secuencia de degradación incluidas las resinas y

los asfaltenos, compuestos de alto peso molecular que se acumulan como resultado de la

biodegradación y persisten en el medio ambiente por décadas, pero que sin embargo y

afortunadamente, no son tóxicos a la biota (Haines et al., 1996).

Los alcanos pueden ser degradados con gran facilidad por la acción de numerosas

bacterias ya que son simples cadenas carbonadas. Los de C12-C18 son los atacados más

fuerte y rápidamente. Los menores de C12 son evaporados o eliminados, son tóxicos para

los microorganismos y, por tanto, menos utilizados. Por encima de C18 tienen una

consistencia sólida, son insolubles y difícilmente emulsionables. Los superiores a C27

Aggaewal et al., 1997

son

poco biodegradables; aunque, desde el metano hasta compuestos con más de 40 átomos

de carbono, son susceptibles a una oxidación microbiana en condiciones favorables

( ).

La degradación de este tipo de hidrocarburo comienza normalmente por la oxidación del

grupo metilo terminal mediante oxígeno para dar alcohol, aldehído y un ácido carboxílico.

Una vez formado este último, ocurre la β-oxidación con pérdida de dos átomos de carbono

en cada caso hasta dar el acetil CoA que se degrada por el ciclo de Krebs (o el propionil

CoA, sí el número de átomos de carbono es par).

En cuanto al proceso de biodegradación de los cicloalcanos, sólo se conoce que como

resultado final en la biodegradación se obtienen ácidos, pero no se ha descrito un

mecanismo de bioxidación típico de estos compuestos en la literatura (Atlas, 1993).

Algunos autores plantean que el mecanismo de bioxidación de los cicloalcanos debe ser

similar al de los isoalcanos como un proceso de cometabolismo (Martinkova et al., 1985;

Murakami et al., 1985).

Los isoalcanos son metabolizados mediante un proceso de cometabolismo o cooxidación,

el cual consiste en que un sustrato puede ser oxidado por la acción enzimática de


28

microorganismos sin ser fuente de energía de los mismos, sino que para obtenerla, y como

base para su crecimiento, usan a los n-alcanos (Atlas and Bronner, 1881; Rontani, 1986).

Estos hidrocarburos son usados como única fuente de carbono y energía por muy pocas

especies microbianas como Pseudomonas fluorecens y Mycobacterium vaccas (Núñez,

2003).

En el caso de los hidrocarburos aromáticos, que comprende al benceno (C6H6

Liu et al., 1995

) y sus

homólogos superiores, es más complejo el mecanismo de biodegradación. Los átomos de

carbono están asociados en anillos, pero solamente una valencia de cada dos, es

saturada. Al producirse la oxidación del anillo, éste se abre por un doble enlace y se

obtienen compuestos oxigenados lineales, cuya degradación es más fácil. Así, en

dependencia del microorganismo y del hidrocarburo en cuestión, se obtienen diferentes

productos intermedios. Por otra parte, la práctica ha demostrado que los hidrocarburos

heterocíclicos, que tienen otro átomo distinto al carbono en cada uno de sus anillos,

también pueden ser degradados ( ; Herbert et al., 1996; Daly et al., 1997).

Además de los mecanismos antes señalados se conocen los de α y ω-oxidación, los cuales

se presentan fundamentalmente en los procesos de biodegradación de petróleos

asfalténicos o cuando ocurre una inhibición por altas concentraciones de sustrato posterior

a la metil-oxidación, estos mecanismos son tan efectivos en la oxidación de los

hidrocarburos como los de β-oxidación, sólo que la velocidad de degradación es más lenta

lo que trae consigo un mayor tiempo de interacción entre el microorganismo y el petróleo.

1.4.4. Consorcios Bacterianos degradadores de hidrocarburos La capacidad de degradación microbiana de hidrocarburos es un hecho conocido desde

finales del siglo XIX, a partir de las observaciones de Miyoshi (1895) sobre la especie

Botrytis cinerea. (Rahn (1906) expuso la habilidad de diversas especies de hongos, de

usar parafina como única fuente de energía. Más tarde en Fush and Ponsford (1912)

elaboraron una amplia lista de bacterias capaces de degradar diferentes tipos de

hidrocarburos (Santiago et al., 1978).

En la actualidad, la literatura especializada refiere una gran variedad de microorganismos

hidrocarbonoclastas:

Proteobacteria, Mycobacterium y Sphingobacterium (Kanaly et al., 2000).

Planococcus spp (Engelhardt et al., 2001). Pseudomonas spp (Lim and Halos, 1997; Al-Gounaim and Diab, 1998).


29

Bacillus, Brevibacterium (Lim and Halos, 1997)

Corynebacterium spp (Lim and Halos, 1997; Al-Gounaim and Diab, 1998).

Arthrobacter spp., Acinetobacter spp., y Flavobacterium spp (Razak et al., 1999).

Acinetobacter calcoaceticus y otras especies de los géneros (Lim and Halos, 1997).

Marinobacter y Alcanivorax (Shutsubo, 2001).

Nocardioforms (Lim and Halos, 1997; Radwan et al., 1995).

Rhodobacter sphaeroides y Rhodovulum sp (Sasaki et al., 2000).

Bacillus alcalophilus, Bacillus licheniformis, Bacillus macerans, Corynebacterium sp,

Micrococcus varians (Morales, 2006).

Algunas especies de Candida y Rhodotorula son los más representativos entre las

levaduras (Prabhakaran and Sivadas, 1995); (Fonseca, 1998).

Cladosporium, Penicillium y Aspergillus son los más frecuentes entre los hongos

filamentosos (Fonseca, 1998).

La concentración y composición de la comunidad microbiana así como las tasas de

transformación de los hidrocarburos está influenciada por diversos factores, tales como la

temperatura, el pH, oxígeno, humedad, disponibilidad de nutrientes, estructura,

composición y disponibilidad del contaminante.

1.4.5. Factores que condicionan la biodegradación de los hidrocarburos 1.4.5.1. Temperatura

Es uno de los factores ambientales más importantes que afecta la actividad metabólica de

los microorganismos y la tasa de biodegradación. Generalmente, las especies bacterianas

crecen a intervalos de temperatura bastante reducidos, entre 15 y 45ºC (condiciones

mesófilas), decreciendo la biodegradación por desnaturalización de las enzimas a

temperaturas superiores a 40ºC e inhibiéndose a inferiores a 0ºC (Maroto and Rogel,

2009).

1.4.5.2. pH

Afecta significativamente la actividad microbiana. En consecuencia, cuanto mayor sea la

diversidad de microorganismos existentes, potencialmente mayor será el rango de

tolerancia. No existen condiciones preestablecidas que sean óptimas en todos los casos,

pero en términos generales el crecimiento de la mayor parte de los microorganismos es

máximo dentro de un intervalo de pH situado entre 6 y 8. En general, el pH óptimo para las

bacterias heterótrofas es neutro (pH 6-8), mientras que es más ácido para los hongos (pH


30

4-5). El pH óptimo establecido para procesos de biodegradación es neutro (pH 7,4-7,8)

(Dibble and Bartha, 1979). Así mismo el pH también afecta directamente la solubilidad del

fósforo y el transporte de metales pesados en el suelo.

1.4.5.3. Oxígeno

Es el aceptor final de electrones generalmente empleado en procesos biológicos y también

es necesario en determinados tipos de reacciones de oxidación-reducción catalizadas por

enzimas. Los microorganismos oxidan compuestos orgánicos o inorgánicos obteniendo así

la energía necesaria para su crecimiento. El proceso de oxidación da lugar a electrones

que intervienen en una cadena de reacciones en el interior de la célula, y al final deben ser

vertidos en el entorno. El aceptor final de electrones es el receptor de los mismos y en el

caso de un metabolismo aerobio, O2 es el aceptor y H2

La mayor parte de los hidrocarburos presentes en los productos petrolíferos son

degradados con mayor extensión y rapidez de forma aerobia (O

O es el producto.

2 como aceptor final de

electrones), ya que en ausencia de O2, y en presencia de aceptores de electrones

alternativos (NO3-, SO42-, CO2, Mn4+ y Fe3+

Holliger and Cender,

1996

) los hidrocarburos pueden ser degradados,

pero con tasas de biodegradación muy inferiores a las aerobias (

; Grishchenkov et al., 2000; Massias et al., 2003).

1.4.5.4. Nutrientes

El metabolismo microbiano está orientado a la reproducción de las células y requieren que

los constituyentes químicos se encuentren disponibles para su asimilación y sintetización.

Los nutrientes principalmente requeridos son el fósforo y el nitrógeno, por tanto, las

concentraciones asimilables de dichos elementos presentes en el suelo suelen ser

limitantes para un incremento y activación de la población microbiana, mientras que otros

nutrientes esenciales como el Ca2+, Na+, Fe2+ y SO42-

Menn et al., 2000

ya están presentes en cantidades

suficientes ( ).

Aunque en general la adición de fuentes inorgánicas de N y P al suelo es beneficiosa para

los procesos de biodegradación, de igual manera el uso excesivo de nutrientes inorgánicos

también puede inhibir los procesos de biodegradación (Zhou and Crawford, 1995; margesin

and Schinner, 1997; Genouw et al., 1994).

1.4.5.5. Humedad

Los microorganismos requieren condiciones mínimas de humedad (20%) para su

crecimiento. El agua forma parte del protoplasma bacteriano y sirve como medio de


31

transporte a través del cual los compuestos orgánicos y nutrientes son movilizados hasta el

interior de las células. Un exceso de humedad inhibirá el crecimiento bacteriano al reducir

la concentración de oxígeno en el suelo (Maroto and Rogel, 2009).

Por lo anterior, la humedad del suelo puede limitar de forma severa la biodegradación,

fundamentalmente en suelos superficiales afectados por oscilaciones importantes en el

contenido de agua. No obstante el nivel óptimo de humedad depende de las propiedades

de cada suelo, el tipo de contaminación y si la biodegradación es aerobia o anaerobia.

1.4.5.6. Estructura, composición y disponibilidad del contaminante

La inherente biodegradabilidad de un hidrocarburo depende, en gran medida, de su

estructura molecular. Siendo los parámetros que más van a afectar la halogenación, la

existencia de ramificaciones, la baja solubilidad en el agua y la diferente carga atómica.

Por su parte la tasa de degradación depende tanto de la capacidad de transporte y del

metabolismo microbiano, como de la transferencia de masas del compuesto.

La relación entre estos factores se conoce como biodisponibilidad. En los suelos uno de los

factores limitantes para la biodegradación es la transferencia de masas, ya que los

microorganismos de los suelos contaminados, suelen tener amplias capacidades

biodegradativas al estar expuestos a una gran variedad de compuestos orgánicos

diferentes.

Por lo tanto la adsorción, la absorción, desadsorción, disolución y la difusión son

fenómenos, propios de la transferencia de masas, que condicionan la biodisponibilidad de

los contaminantes (Stucki and Alexander, 1987; Tabak et al., 1995; Harms and Bosma,

1996; Bosma et al., 1997). Un fenómeno que afecta de forma negativa a la

biodisponibilidad de los contaminantes es el envejecimiento de los hidrocarburos,

producidos por fenómenos como adsorción con la materia particulada del suelo; absorción

a la materia orgánica del suelo (ácidos húmicos, fúlvicos y humina); baja difusividad de los

compuestos (principalmente desde los micro poros); la disolución en fases líquidas no

acuosas (FLNAs) y la formación de uniones covalentes con la materia orgánica e

inorgánica del suelo.

1.4.6. Polémica actual sobre el empleo de las técnicas de biorremediación

Aquellos que proponen la bioestimulación plantean que la amplia distribución de los

microorganismos en los más variados ecosistemas, permite que los autóctonos de la zona

contaminada sean capaces de biorremediar; siendo necesaria únicamente la adición de


32

fertilizantes y nutrientes para estimular el crecimiento de las poblaciones de especies

biodegradadoras (Biotechnology, 2001). Quienes proponen la bioaumentación insisten en

el hecho de que la mejor forma de eliminar la sustancia no deseada es añadir al sitio

cultivos microbianos capaces de degradar los contaminantes específicos de cada situación

(Aldrett et al., 1997; Biotechnology, 2001).

La bioaumentación reduce el tiempo de respuesta ante un derrame y no afecta el medio

ambiente sino que elimina los materiales contaminantes liberados al medio antes y durante

las labores de contingencia. El uso de la bioestimulación como técnica de biorremediación

es cuestionable. Los microorganismos autóctonos capaces de producir enzimas para la

degradación de hidrocarburos se encuentran en la naturaleza en porcentaje bajo y

requieren un período de tiempo relativamente largo para su adaptación. Por otra parte los

fertilizantes añadidos al medio pueden ser utilizados de forma competitiva por otros

microorganismos, limitando así el crecimiento de las especies hidrocarbonoclastas (Núñez,

2003). Cuando se aplica de forma adecuada la bioaumentación resulta más eficiente,

rápida y menos costosa que la bioestimulación (Venosa et al., 1996).

Conclusiones parciales 1. La mezcla compleja de hidrocarburos y elementos no carbonados que componen al

petróleo le confiere propiedades particulares, las cuales dependen del origen y

composición del mismo. Así, es muy resistente a la degradación natural especialmente

a los procesos de degradación biológica, afectados fundamentalmente por la presencia

de fracciones deletéreas (HPAs, BTEX, etc.), y recalcitrantes (Asfaltenos, Resinas,

etc.).

2. El suelo constituye la Interfaz entre la tierra, el aire y el agua, en el cual se producen la

mayoría de las reacciones bioquímicas pertenecientes al ciclo de la materia orgánica,

el nitrógeno y otros minerales, su complejos compartimentos ambientales y

propiedades físico-químicas y biológicas, condicionan el comportamiento y la

distribución de los hidrocarburos en el mismo (evaporación, disolución, adsorción,

lixiviación, biodegradación, etc.).

3. Los estudios realizados sobre la contaminación con hidrocarburos, demuestran que en

el área del Caribe y en especial en nuestro país, existe contaminación por

hidrocarburos tanto en ecosistemas acuáticos como terrestres, observándose una


33

tendencia al incremento de los derrames producidos por accidentes y la acumulación

de pasivos ambientales sin alternativas de solución en los últimos años.

4. La revisión bibliográfica nos permitió identificar los diversos métodos físico- químicos y

biológicos de tratamiento de residuos petrolizados y de descontaminación de espacios

naturales contaminados; siendo de ellos los métodos de biorremediación los de mayor

aplicabilidad teniendo en cuenta su efectividad en cuanto a costos, y que generalmente

son destruidos la totalidad de los contaminantes requiriendo un mínimo de tratamiento

posterior.

Capítulo II. Materiales y Métodos

34

2. MATERIALES Y MÉTODOS

2.1. Breve descripción de la zona de estudio La zona de estudio se localiza en la península de “Punta Majagua”, ubicada en la porción

centro-norte de la Bahía de Cienfuegos, Cuba. Con una extensión promedio de 100 000m2

constituye una barrera de protección natural de la ciudad ante penetraciones del mar y

otros eventos meteorológicos. La presencia en el área de los restos de cuatro tanques

cuyas características se describen en el anexo 1 con aproximadamente 371m3 de fueloil y

lodos de deposición de alta viscosidad, así como 108m3 de residual derramado, tras el

abandono de las instalaciones de la Unidad Distribuidora de Combustibles de Cienfuegos,

provocaron la contaminación de aproximadamente 70 000m2

2.2. Tratamiento de los residuos petrolizados de la zona objeto de análisis.

El esquema de biorremediación de residuos petrolizados propuesto, se basó en el uso de

la técnica de bioaumentación, a partir del uso del bioproducto BIOIL-FC, tal y como se

describe en el diagrama del anexo 2.

2.2.1. Diseño y preparación del área de biorremediación

Fue diseñada un área de biorremediación (anexo 3), para lo cual se tuvieron en cuenta los

criterios básicos de diseño de áreas de manejo para el tratamiento “ex-situ” de residuos

petrolizados, tales como requerimientos de aislamiento o impermeabilización,

homogeneidad, humedad, temperatura, oxigenación, nutrientes, entre otros, descritos por

Bermúdez (2011).

2.2.2. Microorganismos empleados

Fue utilizado un cultivo mixto de bacterias aislado de los sedimentos de la bahía de

Cárdenas, Matanzas (Joseph et al., 1994) formado por las cepas CBM-225 (Bacillus

alcalophilus), CBM-60 (Bacillus licheniformis), CBM-226 (Bacillus macerans), CBM-232

(Corynebacterium sp.) y CBM-234 (Micrococcus varians) pertenecientes a la Colección de

Bacterias Marinas (CBM) del Centro de Bioproductos Marinos, CITMA (Morales, 2006). Este

cultivo se incluye en la formulación del producto BIOIL-FC patentado por el Centro de

Bioproductos Marinos (CEBIMAR) diseñado para combatir la contaminación de petróleo en

diferentes ecosistemas (Núñez, 2003).

2.2.3. Medios de cultivo Medio basal salino agarizado para el conteo de microorganismos degradadores de hidrocarburos (Finnerty, 1994)


35

KH2PO 6,00 g 4 CaCl2·2H2 0,01 g O Na2HPO 4,00 g 4 EDTA 0,10 g Ext. de Levadura 1,00 g FeSO4·7H2 0,01 g O NH4 5,30 g Cl Agar 20,00 g MgSO4·7H2 0,20 g O H2 1,00 L O dest. (c.s.p.) pH= 7

Luego de esterilizado el medio de cultivo se añadió asépticamente una emulsión de

petróleo en agua al 1% de concentración final de la fuente de carbono.

Medio basal salino para la obtención de biomasa a nivel de laboratorio (MF) (Ortíz, 2004)

Sacarosa 20,00 g MgSO4·7H2 0,20 g O Na2HPO 2,60 g 4 NH4 5,30 g Cl Ext. de Levadura 1,00 g EDTA 0,10 g CaCl2·2H2 0,01 g O FeSO4·7H2 0,01 g O pH = 7 H2 1,00 L O dest. (c.s.p.)

Medio de Producción (MP) para la obtención de biomasa a nivel industrial (Núñez, 2003)

Azúcar 30,0 g (NH4)2HPO 5,0 g 4 Levadura Torula 1,0 g MgSO4·7H2 0,2 g O pH = 7 0,2 g H2 1,0 L O corriente.

(c.s.p.)

Los medios de cultivo fueron esterilizados a 121o

2.2.4. Proceso de fermentación

C por 15min, excepto para la escala de

20L que el tiempo fue de 45min, bajo similares condiciones.

Todos los experimentos desarrollados a escala de zaranda fueron realizados a partir de

cultivos de 24h en cuñas de agar nutriente. Los preinóculos de cada una de las cepas

integrantes del BIOIL-FC fueron cultivados en 100mL de medio de fermentación (MF)

(Ortíz, 2004) durante 24h. Posteriormente los cultivos fueron inoculados al 5% (v/v) en

500mL de este medio en Erlenmeyers de 2L de capacidad. Todas las fermentaciones

hasta esta escala fueron realizadas en zaranda orbital Infors a 125r·min-1 y 30 ±2oC.

El inoculo fue escalado a un nivel de fermentación en botellones de 18L de volumen

efectivo de medio de fermentación (MF) con una concentración inicial de 106cel·mL-1, el

mismo fue cultivado durante 24h, determinándose DO como control de calidad en el

momento que se alcanzó una concentración de 109cel·mL-1, utilizado como criterio para

comenzar la producción industrial.


36

La producción industrial fue realizada a partir del medio de cultivo MP en tres escalas de

producción correspondiente a 800, 3 000 y 10 000L. En las dos primeras etapas fue

utilizado un cultivo en lote (batch) con un tiempo de duración entre 10 y 12h.

Para la obtención de los volúmenes finales de bioproducto a aplicar fue utilizada una

tecnología de cultivo semicontinuo con adiciones y extracciones de 7 000L cada 4h

aproximadamente hasta lograr el volumen final de producción de 76 640L.

El control microbiológico del proceso productivo fue realizado por conteo celular en cámara

de Neubauer y la homogeneidad del cultivo por tinción de Gram, cuando la concentración

celular alcanzó un valor de 108cel·mL-1,

2.3. Monitoreo y control del proceso de biorremediación

se procedió a la aplicación del producto

suministrando lotes de 7 000L por aspersión mediante un camión cisterna con una bomba

impulsora hasta alcanzar el volumen total a aplicar en el área impactada.

2.3.1. Muestreo Fue aplicado un muestreo estratificado antes del tratamiento, 45, 90 y 120 días después de

aplicado el BIOIL-FC. Fueron identificados cuatro estratos geográficos o parcelas cuyos

criterios de homogeneidad fueron las propiedades y el volumen de los hidrocarburos

dispuestos. Para la elección de los puntos de muestreo fue seleccionado un patrón de

recorrido por estrato. En los estratos 1 y 4 se establecieron 12 y 21 puntos de muestreo

respectivamente siguiendo un patrón en cuadrículas; en el estrato 2 se tomaron16 puntos

con un patrón en zigzag; mientras que en el 3 se fijaron 9 puntos de muestreo asumiendo

un patrón en diagonal, de acuerdo con los criterios establecidos en INTA, (1984) (anexo 3).

El número de submuestras fue seleccionado teniendo en cuenta los criterios establecidos

por Brady and Weil (2008) e ICA (1992). Las cuales fueron colectadas en la columna de

suelo hasta 30cm, tamizadas y homogenizadas mediante el método de cuarteo descrito

por Bubuda (2004).

Para los ensayos microbiológicos fueron colectadas siete muestras integradas en frascos

de vidrio estériles de 250mL de capacidad. Procesadas durante las primeras horas de la

colecta según la metodología descrita por Harrigan and Mc Cance (1968) y Miravet et al.,

(2009)

De manera análoga para los análisis físico-químicos fueron tomadas siete muestras

integradas en cada muestreo; conservadas añadiendo 1mL de HCl (conc) , refrigeradas a 40C


37

y transportadas al laboratorio en un término no mayor de 24h de acuerdo a los

requerimientos establecidos en CEAC (2008)

2.3.2. Determinaciones analíticas

2.3.2.1. Análisis microbiológico

2.3.2.1.1. Determinación de Microorganismos Heterótrofos Totales

La concentración de bacterias heterótrofas aerobias presentes en el suelo fue determinada

según la metodología descrita por la norma (ISO4833, 1991). Las siembras fueron

incubadas a 37oC durante 48h, posteriormente fue realizado el conteo directo de las

unidades formadoras de colonias expresadas como UFC·g-1

2.3.2.1.2. Determinación de Microorganismos Degradadores de Petróleo

suelo.

La concentración de bacterias hidrocarbonoclastas fue determinada en medio (Finnerty,

1994) agarizado con petróleo ligero (Merey) al 1% como única fuente de carbono y

energía. Las siembras fueron incubadas a 30oC y luego de 10 días fue realizado el conteo

directo de las unidades formadoras de colonias, expresadas como UFC·g-1

2.3.2.1.3. Absorbancia

suelo.

Las determinaciones fueron realizadas en un espectrofotocolorímetro Spekol 11, en

cubetas de 1mL, a una longitud de onda (λ) de 650nm y fueron expresadas como unidades

de DO.

2.3.2.1.4. Número total de células

Fue utilizado el método de conteo directo en cámara de Neubauer según la metodología

descrita por Madigan et al., (2003).

2.3.2.1.5. Velocidad específica de crecimiento

La velocidad específica de crecimiento (µ) fue determinada en la fase exponencial del

crecimiento, mediante el modelo de crecimiento no restringido (López and Gódia, 1998).

2.3.2.2. Análisis físico-químico

Previo a las determinaciones analíticas cada muestra fue sometida a un pretratamiento,

que consintió en secar entre 8 y 15g de suelo en una estufa con temperatura controlada a

45ºC durante 16h. Posteriormente fue macerada en un mortero hasta obtener partículas

inferiores a 250μm (CEAC, 2010a).

2.3.2.2.1. Determinación de Hidrocarburos Totales del Petróleo


38

La concentración de Hidrocarburos Totales del Petróleo (HTP) se determinó por el método

gravimétrico (EPA, 1998) y (Fernández et al., 2007) utilizando como solvente de extracción

hexano/acetona (CEAC, 2010a). Todos los solventes empleados pertenecen a la marca

BDH.

2.3.2.2.2. Determinación de Saturados, Aromáticos, Resinas y Asfaltenos

La concentración de las fracciones saturadas, aromáticas, resinas, y asfalténicas (SARA),

fue determinada por el método gravimétrico (EPA, 1996) y (Fernández et al., 2007), como

solvente de extracción fue utilizado el diclorometano/acetona y hexano (CEAC, 2010b).

2.3.2.2.3. Velocidad de degradación de hidrocarburos

La velocidad de degradación de hidrocarburos fue determinada mediante ajustes

polinomiales en función de la cinética de cada una de las fracciones del petróleo.

2.3.2.3. Determinación del porciento de remoción de hidrocarburos

El porciento de remoción de hidrocarburos fue calculado de acuerdo a la metodología

descrita por (Rosa, 1998) mediante la expresión:

2.3.2.4. Análisis Ecotoxicológicos

2.3.2.4.1. Ensayos de fitotoxicidad sobre la germinación en plantas terrestres.

Para la evaluación de la fitotoxicidad fue realizada la prueba de germinación de semillas en

frijol (Faciola Vulgaris) y maíz (Zea Maíz), de acuerdo con los criterios de referencia

establecidos en EPA (1996).

2.3.2.4.2. Ensayos de fitotoxicidad sobre el crecimiento en plantas terrestres.

Para la evaluación de la fitotoxicidad de compuestos tóxicos fue aplicada la prueba de

crecimiento en plantas terrestres para frijol (Faciola Vulgaris) y maíz (Zea Maíz). Esta

prueba fue realizada con la combinación de los métodos EPA (1984) y EPA (1996).

2.4. Tratamiento estadístico de los resultados

Fue aplicado un diseño aleatorizado por bloques completos con un factor categórico

(Montgomery, 2004). Como factor de efecto fijo fue tomado el tiempo de tratamiento para

0, 45, 90 y 120 días.


39

Los estratos o parcelas fueron considerados como bloques fijos para minimizar el efecto de

la heterogeneidad de residuos petrolizados sobre las variables de respuesta descritas en el

epígrafe 2.3.2.

Para verificar el cumplimiento de los supuestos de idoneidad del modelo fue realizado el

análisis de residuos, posteriormente fue aplicado una transformación Box-Cox con

λ1

Para realizar el análisis de similitud de medias de cada variable de respuesta por

tratamiento fue realizado un análisis de varianza de clasificación simple y una prueba de

múltiple rangos LSD de Fisher. La prueba de hipótesis para las variables físico-químicas

fue aplicada con el fin de contrastar con el valor de concentración establecido por la norma

de vertimiento de hidrocarburos (

=0,296 a los datos obtenidos de cada variable para excluir el incumplimiento del

supuesto de homogeneidad de varianza de los residuos para la prueba f. La idoneidad del

nuevo modelo obtenido fue verificado a partir del análisis del cumplimiento de los

supuestos de ų=0, normalidad, homogeneidad de varianza e independencia de los

residuos.

SEMARNAT, 2003) en cada tratamiento con α=0,05. El

análisis de la potencia de la dócima fue realizado para el tratamiento a los120 días.

Tanto para el análisis de comparación de medias de la concentración de microorganismos

heterótrofos totales y degradadores de hidrocarburos como para los resultados obtenidos

en las pruebas ecotoxicológicas, fue utilizado el método no paramétrico de Kruskal-Walis.

Todos los datos fueron procesados con el paquete estadístico Statgraphics Centurión XVII.

2.5. Análisis costo-beneficio

Para el análisis costo-beneficio fueron determinados los indicadores dinámicos de

rentabilidad del proyecto (VAN, TIR y PRD) tomando como referencia la metodología ABC.

Los mismos fueron calculados con una variabilidad de ±30% de los ingresos planificados

en una hoja de cálculo en Microsoft Excel. Además fue realizado un análisis de sensibilidad

a los ingresos del proyecto (±30%) para detectar posibles fluctuaciones de la inversión

durante su ejecución (anexo 4).

Para la determinación de los costos del proyecto fueron considerados los costos de

inversión (adquisición de equipos y accesorios) y de producción (fuerza de trabajo,

materias primas y materiales, subcontrataciones a terceros, entre otros). Para la

determinación de los ingresos fueron consideradas las ventas totales por concepto de


40

cobros periódicos al cliente, los ingresos por ahorro de agua, materias primas y materiales,

los gastos evitados por tratamiento, y los ingresos por externalidades (anexo 5).

Los criterios tomados para la determinación de los ingresos por externalidades fueron:

ahorros por daños y perjuicios de la contaminación al suelo, las aguas de la bahía, la flora

y la fauna; ahorro por impago de multas ambientales y ahorros por daños a la salud de los

pobladores de la zona.

Capítulo III. Resultados y Discusión

41

3. RESULTADOS Y DISCUCIÓN

3.1. Diseño del área de manejo Para el tratamiento “ex-situ” de los residuos oleosos se diseñó una parcela de 115m x 75m,

limitada por muros de contención de 1,70m de alto x 2,00 m de ancho, la cual fue

seccionada en cuatro parcelas cuyas dimensiones se describen en la siguiente tabla.

Tabla 7. Dimensiones de las parcelas del área de biorremediación de residuos petrolizados.

Parcelas Largo (m)

Ancho (m)

Área (m2)

1 23,82 21,74 517,85

2 60,00 30,00 1800,00 3 * * 754,39 4 107,66 53,58 5014,03

*Parcela circular de diámetro 31m.

Los muros de contención permitieron minimizar los riesgos de contaminación del resto de

la zona terrestre y las aguas de la bahía, debido a posibles penetraciones del mar y

escorrentías pluviales al estar el área ubicada a menos de 30m del mar, en una zona baja

con reportes históricos de inundaciones costeras.

Las dimensiones de las parcelas se calcularon teniendo en cuenta el volumen total de

mezcla a tratar (1 916m3) y una altura mínima de la columna (30cm) en la cual se logró una

actividad metabólica óptima de los microorganismos hidrocarbonoclastas aerobios,

corroborada posteriormente con los ensayos microbiológicos realizados durante el proceso

de biorremediación.

Por su parte el seccionamiento del área en cuatro estratos, permitió realizar la aplicación

homogénea del BIOIL-FC en la totalidad del área a tratar; además permitió realizar de

manera eficiente el mezclado y la humectación periódica de las parcelas y aplicar un

muestreo representativo de cada uno de los estratos geográficos.

La impermeabilización del área de manejo se logró a partir de la compactación de la arcilla

de relleno presente en la zona objeto de análisis, como muestra el perfil de suelo tomado

por la Empresa Nacional de Investigaciones Aplicadas (ENIA) (anexo 6).


42

Los residuos confinados en cada tanque y derramados en la zona fueron mezclados y

homogenizados con tierra fértil (1 437m3

Procedencia de los residuos

) en una proporción 1:3 (v/v), dispuestos en el área

de manejo de acuerdo a la distribución descrita en la tabla 8.

Tabla 8. Volumen de hidrocarburos, tierra fértil y mezcla total, dispuesta en cada parcela del área de biorremediación.

Residual (m3

Tierra fértil (m) 3

Total (m) 3 Parcelas )

TK-1 51,59 154,77 206,36 3 TK-2 197,64 592,92 790,56 4

TK-3 4,11 12,33 16,44 1 TK-4 117,96 353,88 471,84 2

Derramados 107,7 323,1 430,8 4

3.2. Obtención industrial de BIOIL-FC 3.2.1. Fermentación a escala industrial

Debido a la magnitud de la contaminación de las áreas a tratar fue necesaria la producción

de BIOIL-FC en biorreactores de capacidad industrial para lograr un proceso fermentativo

eficiente. En los fermentadores industriales generalmente sólo se permite la

implementación de agitación pneumática, aún cuando no se logra homogeneidad en el

sistema por los patrones de flujo que se crean. El costo de construcción y operación de

estos sistemas disminuye la potencia utilizada para el mezclado de los componentes

mediante la agitación mecánica.

Para el biorreactor de inóculo de volumen total de 1 000L se trabajó con un volumen

efectivo de 800L y para el de producción (volumen total de 12 000L) se trabajó solo a 10

000L, con el fin de evitar el derrame de espuma que se crea en todo proceso fermentativo,

la cual se incrementa con la presencia de metabolitos con actividad superficial

(biotensioactivos) producido por una de las cepas que conforman el producto BIOIL-FC,

necesario para favorecer los procesos de biodegradación de hidrocarburos (Ortíz, 2004).

El proceso de obtención de BIOIL-FC en el fermentador de 800L de volumen efectivo

muestra que el incremento de biomasa en el tiempo se corresponde con una curva típica

de crecimiento (Aiba et al., 1973) (figura 2). En estas condiciones se alcanzó una velocidad

específica de crecimiento promedio de 0,3472 ±0,004h-1, similar a la obtenida en la escala


43

de laboratorio. Así mismo los niveles de biomasa alcanzados garantizaron el desarrollo

efectivo del proceso industrial de obtención de BIOIL-FC.

Figura 2. Perfil de fermentación promedio para la obtención de 800L de BIOIL-FC, que se

corresponde con el inóculo para el proceso a escala industrial.

La figura 3 muestra el perfil de fermentación del sistema semicontinuo a nivel industrial,

que permitió obtener las cantidades necesarias de bioproducto a aplicar en cada área. En

esta figura se aprecia una rápida recuperación del cultivo después de cada extracción y

adición de medio de cultivo, lográndose altas concentraciones de biomasa. La velocidad

específica de crecimiento promedio del proceso fue de 0,415 ±0,050h-1

Figura 3. Perfil de fermentación del sistema semicontinuo en la obtención de los 76 000L

de BIOIL-FC aplicados en el área de biorremediación.

similar a las

obtenidas en las escalas anteriores.

0

2

4

6

8

0 2 4 6 8

Con

c. m

icr.

x108

(cel

·mL

-1)

t (h)

0

2

4

6

8

10

12

14

16

0 15 30 45

Con

c. m

icr.x

108

(cel

·mL

-1)

t(h)


44

Es necesario señalar que la µ de un cultivo es dependiente de diferentes factores

ambientales como el pH, temperatura, concentración y tipo de sustrato, oxígeno disuelto,

etc. El desarrollo de un proceso productivo en equipamientos que no posibilitaron el control

de la temperatura en cada etapa, en particular en el horario de madrugada donde se

alcanzaron temperatura por debajo de 25o

3.2.2. Aplicación del BIOIL-FC

C, afectaron las reacciones del metabolismo

microbiano y por tanto la velocidad especifica de crecimiento.

Por otra parte, la utilización de nutrientes de calidad fertilizante con elevadas

concentraciones de impurezas y sólidos en suspensión utilizados en la escala industrial

interfiere en el crecimiento celular y en las determinaciones analíticas.

Bajo estas condiciones no se lograron perfiles de fermentación del cultivo similares a nivel

de laboratorio y a escala industrial. No obstante, durante el proceso industrial se demostró

la efectividad del sistema de fermentación utilizado para las capacidades instaladas, ya

que se produjo el incremento de la biomasa bacteriana en el tiempo, permitiendo obtener

los volúmenes de bioproducto necesarios para la aplicación.

En la tabla 9 se describen los volúmenes de BIOIL-FC aplicados en el área de manejo.

Tabla 9. Volúmenes de BIOIL-FC aplicados para cada una de las parcelas de trabajo en el

área de biorremediación.

Parcelas Volumen (L)

1 657,60

2 18 873,10

3 8 254,40 4 48 854,40

La aplicación en las áreas correspondientes al área de manejo ascendió a un total de 76

640L de BIOIL-FC.

Estos resultados demuestran que la relación de aplicación de BIOIL–FC en área

contaminada fue aproximadamente a 40L/m3

Núñez et al., 2009

; relación que ha sido utilizada

satisfactoriamente en otros tratamientos con este bioproducto en diferentes ecosistemas.

Bajo esas condiciones en los tratamientos realizados en los Lácteos de Pinar del Rio

( ) se alcanzaron porcentajes de remoción superiores al 90%.


45

3.3. Análisis microbiológico

Los resultados obtenidos de los ensayos microbiológicos realizados para cada una de las

observaciones se describen en el anexo 7.

Las concentraciones de microorganismos heterótrofos y degradadores de hidrocarburos

variaron en el tiempo en las áreas tratadas (figuras 4 y 5), antes y después del tratamiento

(Kruskal-Walis; p<0,5).

Los microorganismos degradadores se identificaron por la reducción del compuesto debido

a la actividad microbiana en la cadena de trasporte de electrones y por el cambio de las

características físicas del petróleo (desmenuzamiento y emulsificación) (Swannell et al.,

1995).

El análisis de los resultados arrojó que antes del tratamiento microbiano en las parcelas de

biorremediación existían concentraciones de bacterias heterótrofas en el orden entre 105 y

106 cel·mL-1

1 2 3 4 5 6 70

1x106

2x106

3x106

4x106

5x106

6x106

7x106

8x106

9x106

bb

bab

bb

b

aa

aa

a

aaa

a

a

a

aaa

aa

a

a

a

a

bb bbbb

a

Observaciones

Conc

entra

ción

(UFC

·g-1)

0 días 45 días 90 días120 días165 días

, probablemente relacionado con la carga microbiana procedente de la capa

vegetal con la cual se mezclaron los residuos petrolizados.

Figura 4. Concentración de microorganismos heterótrofos totales antes y durante el

tratamiento de las parcelas con BIOIL-FC (Kruskal-Walis; p<0,5).


46

1 2 3 4 5 6 70.0

5.0x1051.0x1061.5x1062.0x1062.5x1063.0x1063.5x1064.0x1064.5x1065.0x1065.5x1066.0x1066.5x1067.0x1067.5x1068.0x1068.5x1069.0x106

bb

bbbbb

b

bb

bbbb

aaa

a

ab

ab

ab aaa

aaaa

ccccccc

Observaciones

0 días 45 días 90 días120 días165 días

Conc

entra

ción

(UFC

·g-1)

Figura 5. Concentración de microorganismos degradadores de hidrocarburos antes y

durante el tratamiento de las parcelas con BIOIL-FC (Kruskal-Walis; p<0,5).

La concentración de bacterias degradadores de hidrocarburos antes del tratamiento con

BIOIL-FC se encontraban en el orden desde 104 cel·mL-1

En estas condiciones los niveles de degradadores de petróleo (10

en cada una de las parcelas.

Venosa et al., (2000) refirieron que aunque los microorganismos degradadores

comprenden el 1 % de la población heterótrofa total en ambientes no contaminados, éstos

se incrementan hasta un 10 % por un derrame de petróleo. Bajo estas condiciones debió

incrementarse la concentración de microorganismos degradadores, sin embargo los

niveles determinados en estas áreas se encontraban disminuidos luego de largos períodos

de tiempo con la presencia de altas concentraciones de la contaminación petrogénica. De

acuerdo a estas observaciones se infiere que las áreas no presentaban una alta capacidad

de autodepuración debido a la magnitud del impacto de la contaminación y el tipo de

petróleo contaminante. 4 cel·mL-1) no serían

suficientes para la autodepuración del sistema, por lo que se hizo necesario un proceso

bioaumentación con el producto BIOIL-FC. Además, los procesos de biorremediación por

bioaumentación evitan la excreción de metabolitos tóxicos que se forman durante el


47

proceso de biodegradación cuando se utilizan fertilizantes orgánicos para favorecer la

autodepuración del sistema (Lee and Tremblay, 1995; Magot et al., 2000). Durante el

proceso de biorremediación el análisis de los resultados demostró, que se produjo un

incremento del número de microorganismos degradadores a partir del segundo muestreo

posterior a la aplicación del bioproducto. La concentración de estos microorganismos fue

aumentando en un orden con respecto al muestreo que le antecedió, llegando a

predominar en el total de la población de heterótrofos. Esto pudiera estar relacionado con

el suministro del producto BIOIL-FC con una carga directa de microorganismos

hidrocarbonoclastas, así como a condiciones de nutrientes y oxigenación suficientes para

favorecer los procesos metabólicos de multiplicación celular y de oxidación del petróleo

contaminante del área tratada, corroborado con los resultados del análisis de

concentración de hidrocarburos en cada muestreo.

Es importante destacar que para la totalidad de las estaciones se produjo una disminución

significativa de la concentración de microorganismos degradadores al final de la

experiencia, relacionada con una disminución notable de la concentración de hidrocarburos

del petróleo (figura 6) como fuente de carbono necesaria para realizar los procesos de

síntesis y/o multiplicación celular.

Los resultados demuestran la ventaja de este producto, pues mientras existan

hidrocarburos en el medio ocurre el crecimiento poblacional. Sin embargo cuando la

concentración de petróleo disminuye drásticamente, la población microbiana añadida, para

el proceso de biorremediación por técnica de bioaumentación, decrece significativamente

lo cual evidencia el mínimo impacto que tiene este producto en el ambiente.

Resultados similares aparecen descritos luego de los accidentes ocurridos en las bahías

de Cienfuegos (1992) y de Matanzas (1998), en los derrames de las playas Jibacoa (2001)

y Varadero (2005); así como en el tratamiento de las parcelas de los Lácteos de Pinar del

Río (2009) (Núñez et al., 2009)

3.4. Análisis físico-químico

Los resultados obtenidos de los ensayos físico-químicos realizados para cada una de las


3.4.1. Análisis de la concentración de Hidrocarburos Totales del Petróleo

La biodegradación microbiana es un proceso complejo que consiste en la transformación

de los hidrocarburos en otros compuestos más solubles e inestables, llevada a cabo por


48

acción de monooxigenasas y dioxigenasas, enzimas que oxidan a los hidrocarburos con

incorporación directa de oxígeno molecular (Lee and Levy, 1989)

Las diferencias en la composición y concentración de hidrocarburos en el petróleo influyen

en su biodegradación. Así, un mismo microorganismo, puede presentar diferentes

porcentajes de remoción ante crudos de diferente procedencia o composición química en

iguales condiciones experimentales. Además los resultados de la biodegradación de los

hidrocarburos serán diferentes en dependencia de los microorganismos que lleven a cabo

el proceso (Lee and Levy, 1989).

El comportamiento de la concentración de hidrocarburos en el tiempo para cada área

tratada se muestra en la siguiente figura.

0 45 90 120

0300060009000

120001500018000210002400027000300003300036000390004200045000

Conc

entra

ción

(mg.

kg-1)

Intervalo de muestreo (días)

Observación 1 Observación 2 Observación 3 Observación 4 Observación 5 Observación 6 Observación 7

Figura 6. Variación y dispersión de las concentraciones de HTP por tratamiento durante el

proceso de biorremediación con el bioproducto BIOIL-FC (LSD Fisher, p<0.05).

A partir de la aplicación del BIOIL-FC se detectó una rápida y significativa degradación de

los hidrocarburos en cada una de las observaciones, obteniéndose concentraciones de

hidrocarburos totales inferiores a 3000 mg·Kg-1

SEMARNAT, 2003

, valores que no superan los límites

permisibles para este tipo de ecosistema ( ).


49

En la siguiente figura se presentan los niveles de remoción de hidrocarburos obtenidos en

el proceso de tratamiento con BIOIL-FC en cada una de las observaciones tomadas en el

área de manejo.

1 2 3 4 5 6 70

20

40

60

80

100%

de

Rem

oció

n

Observaciones

Figura 7. Porcentaje de remoción de hidrocarburos obtenidos a los 120 días de aplicado el

bioproducto BIOIL-FC.

Como se puede apreciar en todos los casos se obtienen porcientos de remoción superiores

al 90% en solo 120 días después de la interacción de los microorganismos integrantes del

BIOIL-FC con los contaminantes a pesar de ser un residual con carácter asfalténico (tabla

11).

Es significativo señalar que numerosos autores han estudiado la degradación de residuos

petrolizados similares al contaminante y solamente han detectado una buena degradación

en largos períodos de tiempo. Lee and Tremblay (1995) necesitaron 333 días para tener

resultados favorables de la degradación de un crudo pesado.

En la tabla 10 se muestran los valores de velocidad de degradación de HTP para cada

observación.


50

Tabla 10. Valor modular de la velocidad de degradación de HTP en el proceso de

biorremediación con BIOIL-FC, utilizando un modelo cinético de primer orden.

Observaciones Velocidad de degradación (mg⋅(kg⋅h)-1 R)

2

1 273,70a 0,996 2 198,90a 0,975 3 245,90a 0,976 4 329,20a 0,989 5 258,50a 0,908 6 219,30a 0,994 7 189,80a 0,997

El análisis estadístico de los datos demostró que no existen diferencias significativas entre

los valores de velocidad para cada parcela, lo que sugiere cierta homogeneidad en el

proceso de biorremediación dado por la preparación del área y el control de las

condiciones ambientales relativas a ella, como humedad, mezclado, entre otras. El valor de

velocidad media del proceso de biorremediación del área de manejo fue de 245,0±35,7

mg⋅(kg⋅h)

Los modelos de degradación para cada observación concuerdan con cinéticas de primer

orden, lo cual está relacionado con el mecanismo de degradación. La oxidación de los HTP

ocurre inicialmente mediante un mecanismo de metil-oxidación, proceso que en este caso

es muy rápido y el paso limitante es la β-oxidación representada por el coeficiente de

primer orden (

-1

Head, 1998).

A partir de los modelos cinéticos resultantes y la velocidad de los procesos de degradación

para cada uno de las parcelas, es poco probable que ocurran mecanismos de ∝-oxidación

y ω-oxidación, que son más lentos y menos comunes en la estrategia degradativa de los

microorganismos frente a los hidrocarburos (Head, 1998).

BIOIL-FC es un compuesto basado en células libres que utiliza los hidrocarburos del

petróleo en la síntesis de material celular para la multiplicación, acompañado de un gran

requerimiento energético. Mediante este mecanismo se obtiene acetil-Coa, que se

incorpora directamente al ciclo de los ácidos tricarboxílicos, para garantizar la síntesis de

compuestos esenciales y la obtención de energía.


51

Análisis cinéticos de fracciones del petróleo fueron realizados por Núñez (2003) y

Cabranes (2006), demostrando que los mecanismos más utilizados por las cepas

integrantes del BIOIL-FC, eran la metil y la β-oxidación, lo que corrobora los resultados

obtenidos en esta experiencia.

3.4.2. Análisis de la concentración de las fracciones saturadas, aromáticas, resinas y

asfalténicas

Los resultados de la biorremediación de los suelos contaminados demuestran una

significativa reducción de las cuatro fracciones fundamentales y más aún de las resinas y

asfaltenos típica de un petróleo añejado y que son las fracciones más complejas y difíciles

de degradar por los microorganismos. En todos los casos se lograron disminuir los niveles

de estas fracciones por debajo de la norma (SEMARNAT, 2003).

Tabla 11. Resultados de los análisis de SARA para las parcelas del área de biorremediación antes y 120 días después del tratamiento con BIOIL-FC.

Observaciones t(días) Saturados (mg·Kg-1

Aromáticos (mg·Kg) -1

Resinas (mg·Kg) -1

Asfaltenos (mg·Kg) -1)

1 0 14180,0 21270,0 16140,0 29290,0

120 610,0 2245,0 2060,0 4879,0 Remoción(%) 95,7 89,4 87,2 83,3

2

0 7020,0 19540,0 16950,0 30906,0 120 863,0 3680,0 2630,0 8665,0

Remoción(%) 87,7 81,2 84,5 72,0

3 0 15270,0 16800,0 13660,0 21310,0

120 980,0 856,0 1897,0 3324,0 Remoción(%) 93,6 94,9 86,1 84,4

4 0 20940,0 20940,0 15678,0 22980,0

120 870,0 1345,0 3109,0 5690,0 Remoción(%) 95,9 93,6 80,2 75,2

5 0 14340,0 19120,0 13980,0 20083,0

120 743,0 1098,0 1089,0 3492,0 Remoción(%) 94,8 94,3 92,2 82,6

6 0 7220,0 9630,0 10320,0 25009,0

120 213,0 709,0 993,0 4400,0 Remoción(%) 97,1 92,6 90,4 82,4

7 0 9900,0 21840,0 17520,0 42380,0


52

120 245,0 2290,0 2034,0 8765,0 Remoción(%) 97,5 89,5 88,4 79,3

En la tabla se observa un decrecimiento de los porcentajes de remoción en función de la

complejidad de las fracciones, desde Saturados hasta Asfaltenos. Es importante destacar

los altos porcientos de remoción (mayor que 70%) para la fracción asfalténica, dada su

complejidad y persistencia en los ecosistemas. La degradación de los compuestos del

petróleo por microorganismos se lleva a cabo secuencialmente en este orden: n-parafinas,

isoparafinas, aromáticos, naftalenos, resinas y asfaltenos, a través de mecanismos de metil

y β-oxidación (Lee and Levy, 1989; Magot et al., 2000), similar al mecanismo de los

operones referidos por Madigan et al., (2003).

Sin embargo al utilizar el BIOIL-FC esta secuencia de degradación se favorece pues se

utiliza un cultivo mixto que aunque utiliza una estrategia de degradación similar la misma

ocurre simultáneamente en todas las fracciones en dependencia de la afinidad de cada

una de las cepas por las diferentes fracciones (Núñez, 2003).

A continuación se presentan los valores de velocidad para cada una de las fracciones.

Tabla 12. Valor modular de la velocidad de degradación de cada una de las fracciones en

el proceso de de biorremediación con BIOIL-FC, utilizando diferentes modelos cinéticos de

primer y segundo orden.

Observaciones Saturados Aromáticos Resinas Asfaltenos

Metil β R β 2 R β 2 R β 2 R2

1 0,98 229,20 0,99 155,00 0,99 120,00 0,97 197,90 0,98 2 0,15 52,63 0,99 122,00 0,96 120,00 0,98 188,20 0,99 3 1,64 310,00 0,99 133,80 0,98 95,60 0,98 146,10 0,99 4 2,00 402,50 0,99 159,10 0,98 102,70 0,99 146,20 0,99 5 1,65 302,20 0,97 158,00 0,99 109,50 0,97 139,20 0,99 6 0,70 138,60 0,98 147,30 0,98 80,98 0,99 168,00 0,97 7 1,03 200,60 0,99 73,23 0,96 125,60 0,99 283,90 0,99

La degradación de los compuestos del petróleo se realiza mediante mecanismos de metil y

β-oxidación (Lee and Levy, 1989; Magot et al., 2000), además, durante la biodegradación


53

de los petróleos asfalténicos no sólo ocurren estos mecanismos clásicos de oxidación que

son más eficientes. También ocurren los mecanismos de α y ω oxidación, donde los

compuestos intermediarios que se obtienen son más largos y por ello el proceso de

biodegradación necesitará más tiempo que durante la oxidación de petróleos ligeros.

A partir de los modelos cinéticos resultantes y la velocidad de los procesos de degradación

para cada uno de los sustratos ensayados, es poco probable que ocurran mecanismos de

∝-oxidación y ω-oxidación, que son más lentos y menos comunes en la estrategia

degradativa de los microorganismos frente a los hidrocarburos (Head, 1998).

El mecanismo inicial en todo proceso de oxidación de hidrocarburos es la metil-oxidación,

sin embargo de forma similar a lo ocurrido con el análisis de hidrocarburos totales, este

paso no es limitante para la bioxidación de las fracciones de Aromáticos, Resinas y

Asfaltenos, siendo limitado el proceso fundamentalmente por la β-oxidación, quien permite

que sea una biodegradación eficiente para mineralización de los compuestos del petróleo.

A diferencia de estas fracciones, para la fracción de Saturados ajustan a un modelo

cinético de segundo orden donde el coeficiente cuadrático se corresponde con la velocidad

a la cual ocurre el mecanismo de metil-oxidación. Esto puede estar asociado con la

utilización de un cultivo mixto (BIOIL- FC) que dado el diseño del mismo se crean

competencias entre las cepas que lo integran y las obligan a degradar todas las fracciones

simultáneamente, por lo cual durante la degradación de las fracciones aromáticas, resinas

y asfalténicas se obtienen intermediarios saturados y nafténicos ocurriendo un

solapamiento en la degradación y la formación de compuestos Saturados (Núñez, 2003).

Es por ello que las velocidades de ambos mecanismos son significativas en la degradación

de esta fracción que aparentemente es la más simple.

Sin embargo en las células libres se observó que el valor modular del coeficiente

correspondiente a la β-oxidación es mayor que en las células inmovilizadas (tabla 12). En

las primeras se requiere de la síntesis de material celular para la multiplicación,

acompañado de un gran requerimiento energético. Mediante este mecanismo se obtiene

acetil-Coa, que se incorpora directamente al ciclo de los ácidos tricarboxílicos, para

garantizar la síntesis de compuestos esenciales y la obtención de energía.

El paso determinante en la velocidad de degradación de los hidrocarburos evaluados es la

metil-oxidación. El coeficiente de este mecanismo es mayor en las células inmovilizadas,


54

por lo que la velocidad global del proceso de biodegradación es mayor en estas

condiciones.

La superioridad de la degradación de petróleo, cuando se lleva a cabo por cultivos mixtos

exógenos (bioaumentación), está dada por una mayor velocidad de degradación por el uso

de poblaciones grandes de bacterias que garantizan la acción microbiana tanto en

hidrocarburos gaseosos como líquidos y sólidos de las series alifáticas, aromáticas, resinas

y asfalténicas de forma simultánea más eficiente que con cultivos puros al aprovechar la

competencias que se crean entre sus integrantes (Sirvins and Tramier, 1985).

Estos elementos demuestran una rápida respuesta de la biomasa bacteriana añadida, lo

cual posibilitó la recuperación del ecosistema afectado en sólo 120 días. En contraste con

los resultados obtenidos en el tratamiento de derrames por bioestimulación, que la

mitigación de los daños ocasionados requiere varios meses y hasta años.

Los resultados obtenidos con la aplicación del BIOIL-FC, resultan notablemente eficientes

no sólo al compararlos con valores referidos en la literatura, sino al tener en cuenta que los

residuos de hidrocarburos permanecieron durante más de 10 años en las áreas antes de la

aplicación del tratamiento.

3.5. Análisis ecotoxicológico Los resultados obtenidos de los ensayos ecotoxicológicos realizados para cada una de las


3.5.1. Determinación de la fitotoxicidad sobre la germinación de semillas en frijol y

maíz El la figura 8 se comparan los resultados de los ensayos de germinación de frijol (Faciola

Vulgaris) y maíz (Zea Maíz) de una muestra patrón contra las muestras obtenidas a los 90

y 120 días de aplicado el proceso de biorremediación con BIOIL-FC.


55

Patrón 90 días 120 días8

9

10

11

12

13

14

15 Germinación (Maíz)Germinación (Frijol)

Rang

o Pr

omed

io

MuestrasPatrón 90 días 120 días

6

8

10

12

14

16

18

20

22

Rang

o Pr

omed

ioMuestras

Figura 8. Rango promedio de germinación de semillas de frijol y maíz, obtenidos a los 90 y

120 días de aplicado el bioproducto BIOIL-FC.

Como se puede apreciar en la figura, a los 90 días de tratamiento es evidente que aún las

concentraciones de hidrocarburos no permiten la absorción de nutrientes por parte de las

semillas evaluadas en suelos con tales características. Sin embargo, a los 120 días la

germinación se comportó de forma similar a las obtenidas en los controles; evidenciando

una recuperación de la capacidad de absorción de agua por parte de la semillas y la no

presencia de componentes tóxicos en el medio que inhiban el proceso de germinación. Tal

comportamiento es coincidente con la disminución de las concentraciones de HTP y cada

una de sus fracciones fundamentales en el suelo, reportados en los análisis físico-químicos

discutidos en el epígrafe 3.4.

3.5.2. Ensayos de fitotoxicidad del suelo sobre el crecimiento en plantas terrestres

3.5.2.1. Determinación de la fitotoxicidad del suelo sobre el crecimiento de frijol


56

Patrón 0 días 90 días 120 días4

6

8

10

12

14

16

18

20

22

24Al

tura

(cm

)

MuestrasPatrón 0 días 90 días 120 días

6.0

6.5

7.0

7.5

8.0

8.5

9.0

9.5

10.0

Larg

o (c

m)


0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

Peso

(g)

Muestras

Patrón 0 días 90 días 120 días0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30

0.35

0.40

0.45

Peso

(g)


0.22

0.24

0.26

0.28

0.30

0.32

Proteína BrutaNitrógeno TotalMateria Seca Raíz

Peso Húmedo Raíz Materia Seca PlantaPeso Seco Planta

Peso Húmedo PlantaLargo de la Raíz Altura de la Planta

Peso

(g)


6

8

10

12

14

16

18

20

22

24

Porc

ient

o (%

)

Muestras

Patrón 0 días 90 días 120 días

6

8

10

12

14

16

Porc

ient

o (%

)


4

6

8

10

12

14

16

18

20

22

Porc

ient

o (%

)


2

4

6

Porc

ient

o (%

)

Muestras

Figura 9. Ensayos de toxicidad del suelo sobre el crecimiento de frijol, obtenidos durante el

proceso de tratamiento con BIOIL-FC.

El análisis integral de los parámetros que pondera el estudio para brindar un criterio sobre

el posible efecto tóxico agudo, y su influencia sobre el crecimiento del fríjol; comparando,

como muestra en la figura 9, el suelo patrón con los resultantes del tratamiento a los 0, 90

y 120 días, demuestra que para el suelo sin tratamiento disminuyen significativamente la

altura de la planta, el largo de la raíz, el peso húmedo de la raíz, el % de materia seca de la

raíz, el % de nitrógeno total y el % de proteína bruta de la planta. Así, aumenta

significativamente el peso húmedo de la raíz y el % de materia seca de la planta, no se

afecta el peso seco de la planta, ni el peso seco de la raíz.

Similar análisis, pero para el suelo biorremediado a los a los 90 días, nos muestra que la

planta no recupera la altura, el largo de la raíz, el peso húmedo de la planta, el % de


57

nitrógeno total y el % de proteína bruta. Sin embargo, recupera el % de materia seca de la

raíz y aumenta significativamente el peso húmedo y seco de la raíz.

En el suelo biorremediado a los 120 días no se restablece ni el % de nitrógeno total y ni el

% de proteína bruta; pero si se restablecen la altura de la planta, el largo de la raíz, el % de

materia seca de la raíz, el % de materia seca de la planta y aumenta significativamente el

peso húmedo y seco de la panta y la raíz.

El análisis integral de los resultados antes expuestos, para la especie estudiada y bajo

dichas condiciones experimentales, nos sugiere que el proceso de biorremediación

contribuye significativamente en la restauración de las características iníciales del

compartimiento ambiental tratado; demostrado a través de la viabilidad que muestra el

mismo en el proceso de crecimiento de la planta ensayada, medido a través de las

variables que directamente miden el grado de toxicidad.

3.5.2.2. Determinación de la fitotoxicidad del suelo sobre el crecimiento de maíz.

La evaluación del estudio de toxicidad sobre el crecimiento de maíz, como se aprecia en la

figura 10; sugiere que el suelo sin tratamiento disminuye significativamente el peso

húmedo de la planta, pero aumenta significativamente el largo de la raíz, no afecta la altura

de la planta, el peso seco de la planta, el peso húmedo de la raíz, el peso seco de la raíz, y

el % de materia seca de la planta y de la raíz.

En el suelo biorremediado a los a los 90 días, observamos que no se recupera ni el largo

ni el peso húmedo de la raíz; mientras que en este mismo estudio, pero a los 120 días, se

restablece el largo y el peso húmedo de la raíz. Parámetros afectados, como se indicó

anteriormente, en la muestra inicial y a los 90 días.

El análisis integral de los parámetros que dan una medida de la toxicidad, bajo las

condiciones de este experimento, nos muestra que estos resultados son coincidentes con

los ensayos descritos para Faciola Vulgaris.


58


2468

1012141618202224

Peso Seco Planta

Peso Húmedo PlantaLargo de la Raíz

Muestras

Altu

ra (c

m)


10

12

14

16

18

20

22

Larg

o (c

m)


18

20

22

24

26

28

30

32

34

Peso

(g)

Muestras


1.8

2.0

2.2

2.4

2.6

2.8

Peso

(g)


6

8

10

12

14

16

18

20

22

24 Materia Seca PlantaPeso Húmedo RaízPe

so (g

)

Patrón 0 días 90 días 120 días7.0

7.5

8.0

8.5

9.0

9.5

10.0

Muestras

Porc

ient

o (%

)

Muestras


16

18

20

22Materia Seca Raíz

Porc

ient

o (%

)


2.0

2.2

2.4

2.6

2.8

3.0

3.2

3.4

3.6

3.8

4.0 Proteína BrutaNitrógeno Total

Porc

ient

o (%

)


13

14

15

16

17

18

19

20

21

22

23

Altura de la Planta

Porc

ient

o (%

)

Muestras

Figura 10. Ensayos de toxicidad del suelo sobre el crecimiento de maíz, obtenidos durante

el proceso de tratamiento con BIOIL-FC.

3.6. Análisis costo-beneficio

Los resultados obtenidos de la determinación de los costos e ingresos para el cálculo de

los indicadores dinámicos de rentabilidad del proyecto, se describen en el anexo 4.

El Valor Neto Agregado (VAN) fue mayor que cero en condiciones normales de ejecución

del proyecto ($37674.61), mientras que la tasa Interna de Rentabilidad (TIR) fue superior a

la tasa de interés normal en el mercado de capitales (20-25%), como se puede observar en

la tabla 13.


59

Tabla 13. Valores de la Tasa Interna de Rentabilidad para condiciones normales de

ejecución del proyecto de biorremediación y para posibles fluctuaciones de los ingresos

(±30%).

TIR (%) Fluctuación de ingresos (%) 41 -30 23 0 95 +30

Del análisis de la tabla anterior se deduce que el proyecto no es sensible a las posibles

variaciones de las tasas de intereses, incluso con una reducción de hasta un 30% de sus

ingresos planificados.

En las figuras 11 y 12 se representan los Períodos de Recuperación de la Inversión (PRD)

para condiciones normales de ejecución del proyecto y para una disminución del 30% de

los ingresos planificados.

Figura 11. Período de recuperación de la Inversión en condiciones normales de ejecución

del proyecto de biorremediación.

-$60,000.00

-$40,000.00

-$20,000.00

$0.00

$20,000.00

$40,000.00

$60,000.00

$80,000.00

$100,000.00

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Fluj

o de

caj

a ac

umul

ado

Meses

Flujo de caja acumulado


60

Figura 12. Período de recuperación de la Inversión para una disminución del 30% de los

ingresos planificados del proyecto de biorremediación.

Del análisis de la figura 11 se deduce que es posible recuperar la inversión en un término

no mayor de dos meses y medio (PRD= 2,4) bajo condiciones normales de ejecución del

proyecto. Así, la figura 12 nos indica que con una disminución del 30% de los ingresos

planificados es posible recuperar la inversión apenas en un término inferior a tres meses y

medio (PRD=3,3).

El análisis de sensibilidad a los ingresos (figura 13) corroboró los resultados obtenidos del

cálculo de los indicadores dinámicos de rentabilidad.

Figura 13. Análisis de sensibilidad a los ingresos del proyecto de biorremediación.

-$50,000.00

-$40,000.00

-$30,000.00

-$20,000.00

-$10,000.00

$0.00

$10,000.00

$20,000.00

$30,000.00

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10Fl

ujo

de c

aja

acum

ulad

o

Meses

Flujo de caja acumulado

0.0

10000.0

20000.0

30000.0

40000.0

50000.0

60000.0

70000.0

80000.0

-40 -20 0 20 40

Fluj

o de

caj

a ac

umul

ado

Porciento de Ingresos (%)

Ingresos


61

Del análisis de sensibilidad para posibles fluctuaciones de la inversión resultó que el VAN

siempre es positivo incluso para fluctuaciones por debajo del 30%de los ingresos, lo que

conjuntamente con el análisis de la Tasa Interna de Rentabilidad y el Período de

Recuperación de la Inversión nos permite aseverar que el proyecto de biorremediación de

suelos contaminados con hidrocarburos es económicamente factible.

Conclusiones

62

CONCLUSIONES

1. El diseño de las parcelas de biorremediación resultó ser adecuado para el tratamiento

de los 479m3

2. El cultivo semicontinuo a escala de producción, permitió fermentar y aplicar 76 640L de

BIOIL-FC en solo 40h, obteniéndose concentraciones de biomasa en el orden de

10

de residual petrolizado; lográndose las condiciones idóneas de

homogeneidad, aireación y humedad del medio, lo que propició una actividad

metabólica óptima de los microorganismos hidrocarbonoclastas aerobios.

8cel·mL-1 para cada incremento, y una velocidad específica de crecimiento promedio

de 0,415 ± 0,050h-1,

3. Los análisis microbiológicos iníciales revelaron niveles de bacterias heterótrofas (BHT)

en el orden de 10

similar a las obtenidas en las escalas de zaranda, botellones y

800L respectivamente.

5 y 106cel·mL-1, mientras que las concentraciones de bacterias

degradadoras de petróleo (BDP) estuvieron en el orden de 104cel·mL-1. Posterior a la

aplicación del BIOIL-FC se produjo un incremento de BDP (106cel·mL-1

4. Al finalizar el tratamiento se produjo de una disminución significativa las

concentraciones de BDP (10

), llegando a

predominar en el total de la población de heterótrofos totales.

5cel·mL-1

5. Se logró una reducción significativa de los niveles de hidrocarburos totales del petróleo

(HTP) a los 120 días posteriores a la aplicación del BIOIL-FC; obteniéndose

porcentajes de remoción superiores al 90%.

), relacionado con una reducción considerable de

las concentraciones de hidrocarburos del petróleo en cada una de las parcelas de

biorremediación.

6. Las concentraciones de HTP obtenidas en cada una de las parcelas analizadas fueron

inferiores a 2 845mg·kg-1

SEMARNAT, 2003

, valores que no superan los límites máximos permisibles

establecidos por la norma ( ) .

7. Se obtuvieron porcentajes de remoción superiores al 70% de las fracciones pesadas y

superiores al 90% de las fracciones medias y ligeras, obteniéndose en cada una de las

parcelas analizadas valores de concentración inferiores a 6 000 y 3 000 mg·kg-1

SEMARNAT, 2003

respectivamente, inferiores a los límites máximos permisibles establecidos por la

norma ( ).

8. La velocidad media de degradación de HTP fue de 245,0±35,7mg⋅(kg⋅h)-1 mientras que

para las fracciones fundamentales del petróleo (SARA) se reportaron velocidades

Conclusiones

63

medias de degradación en el orden de 233,7±86,6; 135,5±22,7 ;107,8±11,8 y

181,4±37,4mg⋅(kg⋅h)-1

9. Los resultados obtenidos de los ensayos de germinación de semillas para frijol y maíz

a los 120 días, demostraron una recuperación de la capacidad de absorción de agua

por parte de las semillas y la no presencia de componentes tóxicos en el medio que

inhibiesen la germinación, de manera similar a los resultados obtenidos en el control

utilizado.

respectivamente; mediantes mecanismos de metil y β-

oxidación.

10. Las pruebas de fitotoxicidad sobre el crecimiento apara ambas especies tuvieron un

comportamiento similar , restableciéndose a los 120 días la altura de la planta, el largo

de la raíz, el % de materia seca de la raíz, el % de materia seca de la planta, el peso

húmedo y seco de la panta y la raíz. Lo que demuestra una recuperación de las

características iníciales del compartimiento ambiental tratado.

11. Los resultados microbiológicos, fisicoquímicos y ecotoxicológicos obtenidos en el

proceso de biorremediación con BIOIL-FC, unido a los resultados del análisis costo-

beneficio, con un VAN de $37674,61 una TIR de 60% y un PRD de 2,4 meses

demuestran que el proyecto de saneamiento de suelos contaminados con

hidrocarburos por métodos biocorrectivos en la península de “Punta Majagua”, es

factible tanto desde el puno de vista ambiental como económico.

Recomendaciones

64

RECOMENDACIONES

1. Complementar los estudios de toxicidad del residual con la implementación de otros

ensayos toxicológicos en organismos vivos y con el monitoreo de metales pesados

componentes del petróleo como criterio de disposición final.

2. Proseguir con el monitoreo de bacterias degradadoras hasta alcanzar concentraciones

similares a las existentes antes de la aplicación de BIOIL FC.

3. Hacer extensivo este tipo de tratamiento en otras zonas contaminadas con

hidrocarburos en el país.

Bibliografía

65

BIBLIOGRAFÍA

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Appl.Microbiol. Biotechno, vol. 36, pp. 689-696.

WRENN, B. A. & VENOSA, A. D. 1996. Selective enumeration of aromatic and aliphatic

hydrocarbon degrading bacteria by a most-probable-number procedure Can. J. Microbiol,

vol. 42, pp. 252–258.

ZAVALA, J., GAVI, F., HOWARD, R., FERRERA, R., PALMA, D. J. & VAQUERA, H. 2005.

Derrames de petróleo en suelos y adaptación de pastos tropicales en el activo cinco

presidentes, Tabasco, México, Terra Latinoamericana, vol. 23, pp. 293-302.

ZHOU, E. & CRAWFORD, R. L. 1995. Effects of oxygen, nitrogen, and temperature on gasoline

biodegradation in soil. Biodegradation, vol. 6, pp. 127-140.

Anexos

ANEXOS

Anexo 1. Tanques de almacenamiento de hidrocarburos situados en la península de “Punta Majagua”. Características generales.

Descripción u/m TK-1 TK-2 TK-3 TK-4 Diámetro m 31 31 34 34

Perímetro m 97,34 97,34 106,76 106,76 Columna HC m 0,068 3 0,262 0,005 0,130 Volumen HC m 51,59 2 197,64 4,11 117,96 Distancia al mar m 32 24 50 70

Anexos

Anexo 2. Proceso de biorremediación mediante la técnica de bioaumentación con BIOIL-FC.

¿Cumple los requerimientos de

calidad?

Si

Fase ejecutiva

No

Disposición final

Fin de Proyecto

Informe Final

Planificación y proyección de la solución técnica

Escalado y producción industrial

del BIOIL-FC

Diseño y construcción del área

de manejo

Proceso de Biorremediación

Diagnóstico del área impactada

¿Se requiere tratamiento “ex-

situ”?

Sí

Acondicionamiento del residual

Monitoreo y control del proceso de degradación

de hidrocarburos

Aplicación del BIOIL-FC

Monitoreo y control del proceso de fermentación

¿Cumple los requerimientos de

calidad?

Si

No

NoAcciones correctivas

Acciones correctivas

Fase de diagnóstico

Anexos

Anexo 3. Parcelas o estratos de biorremediación, puntos y patrones de muestreo del área

de manejo de residuos petrolizados.

Anexos

Anexo 4. Indicadores dinámicos de rentabilidad del proyecto (VAN, TIR y PRD). Inversión ($)Tasa de interes 0.15Concepto 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9Ingresos $64,597.27 $47,069.08 $47,069.08 $47,069.08 $47,069.08 $47,069.08 $47,069.08 $47,069.08 $47,069.08Costos Operacionales $17,319.57 $17,319.57 $17,319.57 $17,319.57 $17,319.57 $17,319.57 $17,319.57 $17,319.57 $17,319.57Beneficio Operacionales $47,277.70 $29,749.51 $29,749.51 $29,749.51 $29,749.51 $29,749.51 $29,749.51 $29,749.51 $29,749.51Depreciación $3,379.10 $3,379.10 $3,379.10 $3,379.10 $3,379.10 $3,379.10 $3,379.10 $3,379.10 $3,379.10Beneficios antes Impuestos $0.00 $43,898.60 $26,370.41 $26,370.41 $26,370.41 $26,370.41 $26,370.41 $26,370.41 $26,370.41 $26,370.41Impuestos $0.00 $13,169.58 $7,911.12 $7,911.12 $7,911.12 $7,911.12 $7,911.12 $7,911.12 $7,911.12 $7,911.12Beneficios despues Imp. $0.00 $30,729.02 $18,459.29 $18,459.29 $18,459.29 $18,459.29 $18,459.29 $18,459.29 $18,459.29 $18,459.29Inversión $40,549.18Flujo de caja -$40,549.18 $34,108.12 $21,838.38 $21,838.38 $21,838.38 $21,838.38 $21,838.38 $21,838.38 $21,838.38 $21,838.38Flujo de caja Actualizado -$40,549.18 $29,659.23 $16,512.96 $14,359.09 $12,486.17 $10,857.54 $9,441.34 $8,209.86 $7,139.01 $6,207.83Flujo de caja al descontado acumulado -$40,549.18 -$10,889.94 $5,623.01 $19,982.10 $32,468.27 $43,325.81 $52,767.14 $60,977.00 $68,116.01 $74,323.84VAN $ 37,674.61TIR 60%PRD (Meses) 2.4

Flujo de Caja Mensual

Inversión ($)Tasa de interes 0.15Concepto 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9Ingresos $45,218.09 $32,948.35 $32,948.35 $32,948.35 $32,948.35 $32,948.35 $32,948.35 $32,948.35 $32,948.35Costos Operacionales $17,319.57 $17,319.57 $17,319.57 $17,319.57 $17,319.57 $17,319.57 $17,319.57 $17,319.57 $17,319.57Beneficio Operacionales $27,898.52 $15,628.78 $15,628.78 $15,628.78 $15,628.78 $15,628.78 $15,628.78 $15,628.78 $15,628.78Depreciación $3,379.10 $3,379.10 $3,379.10 $3,379.10 $3,379.10 $3,379.10 $3,379.10 $3,379.10 $3,379.10Beneficios antes Impuestos $0.00 $24,519.42 $12,249.68 $12,249.68 $12,249.68 $12,249.68 $12,249.68 $12,249.68 $12,249.68 $12,249.68Impuestos $0.00 $7,355.83 $3,674.91 $3,674.91 $3,674.91 $3,674.91 $3,674.91 $3,674.91 $3,674.91 $3,674.91Beneficios despues Imp. $0.00 $17,163.59 $8,574.78 $8,574.78 $8,574.78 $8,574.78 $8,574.78 $8,574.78 $8,574.78 $8,574.78Inversión $40,549.18Flujo de caja -$40,549.18 $20,542.69 $11,953.88 $11,953.88 $11,953.88 $11,953.88 $11,953.88 $11,953.88 $11,953.88 $11,953.88Flujo de caja Actualizado -$40,549.18 $17,863.21 $9,038.85 $7,859.87 $6,834.67 $5,943.19 $5,167.99 $4,493.91 $3,907.74 $3,398.04Flujo de caja al descontado acumulado -$40,549.18 -$22,685.97 -$13,647.12 -$5,787.25 $1,047.42 $6,990.61 $12,158.60 $16,652.50 $20,560.25 $23,958.29VAN $ 6,078.79TIR 23%PRD (Meses) 3.3

Flujo de Caja MensualSensibilidad a la disminución de los ingresos (30%)

Anexos

Inversión ($)Tasa de interes 0.15Concepto 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9Ingresos $83,976.45 $61,189.80 $61,189.80 $61,189.80 $61,189.80 $61,189.80 $61,189.80 $61,189.80 $61,189.80Costos Operacionales $17,319.57 $17,319.57 $17,319.57 $17,319.57 $17,319.57 $17,319.57 $17,319.57 $17,319.57 $17,319.57Beneficio Operacionales $66,656.88 $43,870.23 $43,870.23 $43,870.23 $43,870.23 $43,870.23 $43,870.23 $43,870.23 $43,870.23Depreciación $3,379.10 $3,379.10 $3,379.10 $3,379.10 $3,379.10 $3,379.10 $3,379.10 $3,379.10 $3,379.10Beneficios antes Impuestos $0.00 $63,277.78 $40,491.13 $40,491.13 $40,491.13 $40,491.13 $40,491.13 $40,491.13 $40,491.13 $40,491.13Impuestos $0.00 $18,983.34 $12,147.34 $12,147.34 $12,147.34 $12,147.34 $12,147.34 $12,147.34 $12,147.34 $12,147.34Beneficios despues Imp. $0.00 $44,294.45 $28,343.79 $28,343.79 $28,343.79 $28,343.79 $28,343.79 $28,343.79 $28,343.79 $28,343.79Inversión $40,549.18Flujo de caja -$40,549.18 $47,673.55 $31,722.89 $31,722.89 $31,722.89 $31,722.89 $31,722.89 $31,722.89 $31,722.89 $31,722.89Flujo de caja Actualizado -$40,549.18 $41,455.26 $23,987.06 $20,858.32 $18,137.67 $15,771.88 $13,714.68 $11,925.81 $10,370.27 $9,017.63Flujo de caja al descontado acumulado -$40,549.18 $906.08 $24,893.14 $45,751.46 $63,889.12 $79,661.01 $93,375.69 $105,301.50 $115,671.77 $124,689.39VAN $ 69,270.44TIR 95%PRD (Meses) 2.0

Flujo de Caja MensualSensibilidad al incremento de los ingresos (30%)

Anexos

Anexo 5. Costos de inversión, producción e ingresos del proyecto de biorremediación de suelos contaminados por hidrocarburos.

COSTOS DE INVERSIÓN Costo Directo (CD) Valor $ Costo Equipos (CE) 15592,00 Costo Tuberías. y accesorios 1871,04 Instrumentación. y control (IC) 2338,80 Instalación Eléctrica (IE) 1559,20 Costo Edificación 0,00 Servicios. y facilidades (SF) 5457,20 Total Costo Directo (CD) 26818,24 Costo Indirecto (CI) Valor $ Ing. y Supervisión 2681,82 Gastos de Contratación 1877,28 Contingencias 2413,64 Total Costo Indirecto(CI) 6972,74 Capital Fijo de Inversión 33790,98 Costo Total de Inversión 40549,18

COSTOS DE PRODUCCIÓN Costo Directo Valor $ Materias Primas (MP) 10174,80 Utilidades (U) 1020,20 Mano de obra (MO) 17724,10 Supervisión (S) 1772,41 Mantenimiento (M) 3379,10 Suministro (Su 844,77 Gastos de laboratorio. (GL) 102,02 Subcontratación 3ros 9171,11 Total CDP 44188,51 Cargo Fijo (FC) Valor $ Depreciación (D) 3379,10 Seguros ,Impuestos (SI) 0,00 Total FC 3379,10 Gastos Generales (GG) Valor $ Distribución 0,1CTP Desarrollo e Investigaciones. 0,05 CTP Financiación 0,15 CTP

Anexos

Total GG 4527,79 Costo Total de Producción 52095,39

INGRESOS Ingresos por ventas 400644,44 Ahorros por operación Valor $ Agua dejada de pagar por ahorro 0,48 Materias primas y materiales 2,92 Gastos evitados por tratamiento 2,06 Ahorro por externalidades Valor $ Ahorro por daños y perjuicios al suelo, las Aguas de la bahía, la flora y la fauna 9000,00 Ahorro por impago de multas ambientales 13500,00 Ahorro por daños a la salud de los pobladores de la zona. 18000,00 Total de ingresos 441149,90

Anexos

Anexo 6. Perfil de suelo de la zona seleccionada para la construcción del área de manejo de residuos petrolizados.

Anexos

Anexo 7. Resultados de los análisis microbiológicos en las parcelas del área de biorremediación durante el tratamiento con BIOIL-FC.

Intervalo de muestreo (Días)

BHT (cel·mL-1 U )

BDP (cel·mL-1 U )

0 1,00E+06 ±1,00E+03 2,50E+04 ±1,58E+02

0 8,00E+05 ±8,94E+02 3,50E+04 ±1,87E+02 0 5,00E+05 ±7,07E+02 4,00E+04 ±2,00E+02 0 7,50E+05 ±8,66E+02 5,00E+04 ±2,24E+02 0 1,30E+06 ±1,14E+03 6,50E+04 ±2,55E+02 0 7,40E+06 ±2,72E+03 3,50E+04 ±1,87E+02 0 6,00E+05 ±7,75E+02 3,50E+04 ±1,87E+02 45 2,95E+06 ±1,72E+03 2,73E+06 ±1,65E+03 45 4,30E+06 ±2,07E+03 3,14E+06 ±1,77E+03 45 3,15E+06 ±1,77E+03 3,08E+06 ±1,75E+03 45 1,90E+06 ±1,38E+03 3,32E+06 ±1,82E+03 45 3,05E+06 ±1,75E+03 2,47E+06 ±1,57E+03 45 2,60E+06 ±1,61E+03 2,48E+06 ±1,57E+03 45 3,65E+06 ±1,91E+03 3,14E+06 ±1,77E+03 90 2,90E+06 ±1,70E+03 2,85E+06 ±1,69E+03 90 2,71E+06 ±1,65E+03 1,95E+06 ±1,40E+03 90 4,81E+06 ±2,19E+03 2,70E+06 ±1,64E+03 90 4,00E+06 ±2,00E+03 5,00E+06 ±2,24E+03 90 8,57E+06 ±2,93E+03 8,40E+06 ±2,90E+03 90 9,14E+06 ±3,02E+03 8,45E+06 ±2,91E+03 90 8,85E+06 ±2,97E+03 7,90E+06 ±2,81E+03

120 8,10E+06 ±2,85E+03 1,00E+06 ±1,00E+03 120 3.50E+06 ±1,87E+03 1,01E+06 ±1,00E+03 120 1,65E+06 ±1,28E+03 8,77E+05 ±9,37E+02 120 4,15E+06 ±2,04E+03 1,75E+06 ±1,32E+03 120 3.50E+06 ±1,87E+03 9,50E+05 ±9,75E+02 120 4,95E+06 ±2,22E+03 9,64E+05 ±9,82E+02 120 4,80E+06 ±2,19E+03 5,32E+05 ±7,29E+02 165 1,38E+06 ±1,17E+03 9,86E+05 ±9,93E+02 165 6,64E+05 ±8,15E+02 5,05E+05 ±7,10E+02 165 2,36E+05 ±4,86E+02 3,05E+05 ±5,52E+02 165 2,50E+06 ±1,58E+03 9,27E+05 ±9,63E+02 165 1,75E+06 ±1,32E+03 1,16E+06 ±1,08E+03

Anexos

165 7,77E+05 ±8,82E+02 1,06E+06 ±1,03E+03 165 2,43E+05 ±4,93E+02 1,05E+06 ±1,03E+03

Anexos

Anexo 8. Resultados de los análisis físico-químicos en las parcelas del área de biorremediación durante el tratamiento con BIOIL-FC.

Intervalo de muestreo (Días)

HTP (mg·Kg-1 U )

Saturados (mg·Kg-1 U )

Aromáticos (mg·Kg-1 U )

Resinas (mg·Kg-1 U )

Asfaltenos (mg·Kg-1)

0 35450 ±4254 14180 ±1701 21270 ±2552 16140 ±1936 29290 0 26060 ±3127 7020 ±842 19540 ±2344 16950 ±2034 30906 0 32070 ±3848 15270 ±1832 16800 ±2016 13660 ±1639 21310 0 41880 ±5025 20940 ±2512 20940 ±2512 15678 ±881 22980 0 33460 ±4015 14340 ±1720 19120 ±2294 13980 ±1677 20083 0 26850 ±3222 7220 ±866 9630 ±1155 10320 ±1238 25009 0 24140 ±2896 9900 ±1188 21840 ±2620 17520 ±2102 42380 45 21790 ±2396 5530 ±608 14570 ±1602 9098 ±1000 16802 45 13320 ±1465 5420 ±596 12390 ±1362 9980 ±1097 21220 45 17530 ±1928 3640 ±400 8900 ±979 7654 ±841 15190 45 23456 ±2580 6110 ±672 10987 ±1208 10540 ±1159 15690 45 12329 ±1356 2520 ±277 9870 ±1085 7480 ±822 14250 45 16850 ±1853 1750 ±192 4567 ±502 6750 ±742 14090 45 16560 ±1711 2299 ±252 13250 ±1457 10310 ±1134 29370 90 9460 ±898 1740 ±165 8400 ±798 3456 ±311 10329 90 7480 ±710 2490 ±236 9980 ±948 4845 ±436 12345 90 6830 ±648 1340 ±127 3150 ±299 4460 ±401 9456 90 9760 ±927 1420 ±134 5678 ±539 6590 ±593 8768 90 5510 ±523 1580 ±150 4730 ±449 2460 ±221 7614 90 5690 ±540 863 ±81 2050 ±194 2245 ±202 8440 90 7690 ±730 678 ±64 7820 ±742 5987 ±538 15678

120 2789 ±306 610 ±67 2245 ±380 2060 ±226 4879 120 1236 ±135 863 ±94 3680 ±532 2630 ±289 8665

Anexos

120 2845 ±312 980 ±107 856 ±490 1897 ±208 3324 120 2334 ±256 870 ±95 1345 ±724 3109 ±341 5690 120 1456 ±160 743 ±81 1098 ±270 1089 ±119 3492 120 1143 ±125 213 ±23 709 ±246 993 ±109 4400 120 1389 ±152 245 ±26 2290 ±658 2034 ±223 8765

Anexos

Anexo 9. Resultados de los análisis ecotoxicológicos en las parcelas del área de biorremediación durante el tratamiento con BIOIL-FC. Ensayos de fitotoxicidad sobre la germinación de semillas Muestra Frijol (Faciola Vulgaris) Maíz (Zea Maíz)

Patrón 14,50 20,50 90 días 8,75 7,50 120 días 14,50 20,50

Ensayos de fitotoxicidad sobre el crecimiento de la planta Frijol (Faciola Vulgaris)

Muestra Altura de la

planta (cm)

Largo de la Raíz (cm)

Peso húmedo planta

(g)

Peso seco de la planta

(g)

Peso húmedo de la raíz

(g)

Materia Seca

Planta (%)

Materia Seca raíz

(%)

Nitrógeno Total (%)

Proteína Bruta (%)

Patrón 22,5 6,82 2,35 0,42 0,29 22,25 14,4 21,25 5,38 0 días 6,88 8,57 0,98 0,09 0,32 7,25 6,06 5,38 2oo 90 días 5,63 8,97 0,66 0,08 0,23 7,25 7,96 6,5 2,25 120 días 12,5 7,05 1,81 0,16 0,27 8,50 9,64 18,75 4,83

Maíz (Zea Maíz)

Muestra Altura de la

planta (cm)

Largo de la Raíz (cm)

Peso húmedo planta

(g)

Peso seco de la planta

(g)

Peso húmedo de la raíz

(g)

Materia Seca

Planta (%)

Materia Seca raíz

(%)

Nitrógeno Total (%)

Proteína Bruta (%)

Patrón 11,75 20,46 30,95 2,27 10,50 7,30 21,73 3,60 22,50 0 días 3,25 10,17 18,34 1,80 6,50 9,80 15,55 2,22 13,98 90 días 5,75 14,45 20,65 2,00 18,50 9,70 18,38 2,23 14,50 120 días 22,25 20,19 32,86 2,66 22,50 8,10 21,68 2,70 16,80

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Biorremediación de suelos contaminados con hidrocarburos a