1. Produccin de inculo de Pleurotus ostreatus para uso en biorremediacin de suelos contaminados con hidrocarburos de petrleo Bach. Enith Sifuentes Vsquez UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA LA MOLINA Facultad de Ciencias

2. Hongos como biorremediadores Micorremediacin Alcances Rol y Potencial 3. Hongos de pudricin blanca Degradan y mineralizan lignina. Mecanismo: Enzimas extracelulares de baja especificidad. Sistema ligninoltico Lignina Peroxidasa (LiP) Manganeso Peroxidasa (MnP) Peroxidasa Verstil (VP) Lacasa 4. Pleurotus ostreatus Morfologa Sistema enzimtico (MnP y Lac) Ventajas Bajo requerimiento de T Crecimiento rpido y fcil manejo Menos afectado por organismos nativos. Cultivo estandarizado. 5. Objetivos Objetivo general Producir inculo de Pleurotus ostreatus y cuantificar su crecimiento para un posible uso en biorremediacin de suelos. Objetivos especficos 1. Evaluar la produccin de biomasa del hongo P. ostreatus en granos de trigo y cebada. 2. Medir la colonizacin del inculo de P. ostreatus obtenido, en suelo contaminado con hidrocarburos. 6. Justificacin Bajo costo biorremediacin Amplio espectro de degradacin HPB Inocuidad y capacidad degradativa de P. ostreatus Escasez de metodologas y estudios de caracterizacin 7. MATERIALES Y MTODOS Produccin de inculo Medicin de biomasa por microscopa Medicin del nivel de colonizacin en suelo 8. Produccin de inculo Cultivo P. ostreatus Inoculacin de granos Esterilizacin granos trigo y cebada Cultivo grano inoculado Inculo Primario 26C 14 das PDA 22C 4 semanas 121C 15 lb 30 min. Inculo Secundario 9. Medicin de Biomasa por Microscopa Medicin de Colonizacin del inculo en Suelo 10. Medicin de Biomasa por Microscopa (Adapt. Gacura, M. 2009)Preparacin dilucin 1/25 Tincin con azul de metileno Toma de muestra Observacin al microscopio ptico con cmara de Neubauer Registro de imgenes con cmara fotogrfica Medicin de hifas mediante software UDR Transformacin de datos (m/g) C1 Granos de trigo C2 Granos de cebada T1 Inculo primario trigo T2 Inculo primario cebada T3 Inculo secundario trigo T4 Inculo secundario cebada Inculos trigo y cebada 11. Medicin de colonizacin en suelo Acondicionamiento del suelo Contaminacin del suelo con crudo de petrleo 10 000 ppm Preparacin de tratamientos en placas Petri Medicin de crecimiento de colonias c/4 das Incubacin durante 16 das a 22 C C Suelo sin contaminar+ inculo T1 Suelo contaminado + inculo T2 Suelo contaminado + inculo + soya 1% T3 Suelo contaminado + inculo + aserrn 10% 12. RESULTADOS Y DISCUSIONES 13. Produccin de biomasa del inculo primario 506.4 326 968.8 494.4 1210.4 673.08 Crecimiento(m/g) Sem 2 Sem 3 Sem 4 Sem 2 Sem 3 Sem 4 TRIGO CEBADA 14. Produccin de biomasa del inculo secundario 805.04 929.6 866 1013.2 1060 1289.6 Crecimiento(m/g) Sem 2 Sem 3 Sem 4 Sem 2 Sem 3 Sem 4 TRIGO CEBADA 15. Inculo primario de trigo y cebada 3 semanas TRIGO CEBADA 16. 506.4 326 968.8 494.4 1210.4 673.08 trigo cebada Crecimiento(m/g) 805.04 929.6 866 1013.2 1060 1289.6 trigo cebada Crecimiento(m/g) Inculo primario Inculo secundario 17. Referencia Longitud de hifa (m/g) Feng, X., et. al. 2004 1064.0 Bosiljic, G. et al. 2008 374 Gacura, M. 2009 114.48 Presente estudio 1289.6 18. Colonizacin del suelo por inculo secundario de trigo 1 1.2 1.4 1.6 1.8 2 2.2 2.4 0 4 8 12 16 20 Dimetro(cm) Tiempo (Das) C: suelo sin contaminar T1: Suelo cont. sin suplem T2: Suelo cont. + aserrn T3: Suelo cont. + soya 19. Colonizacin del suelo por inculo secundario de cebada 1 1.2 1.4 1.6 1.8 2 2.2 2.4 2.6 2.8 0 4 8 12 16 20 Dimetro(cm) Tiempo (Das) C: suelo sin contaminar T1: Suelo cont. sin suplem T2: Suelo cont. + aserrn T3: Suelo cont. + soya 20. 0 0.5 1 1.5 2 2.5 C T1 T2 T3 Crecimiento(cm) 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 C T1 T2 T3 Crecimiento(cm) Colonizacin del suelo por inculo secundario de trigo Colonizacin del suelo por inculo secundario de cebada 21. Se logr producir inculo del hongo P. ostreatus en granos de trigo y cebada, alcanzando una colonizacin total de dichos sustratos en cuatro semanas de cultivo. En los cultivos inoculados con micelio crecido en agar PDA (inculo primario), la produccin de biomasa fue mayor al utilizar trigo como sustrato (1210.40 m/g) en comparacin con la cebada (673.08 m/g), siendo estas diferencias significativas en la tercera y cuarta semana. En los cultivos inoculados con grano (inoculo secundario), la produccin de biomasa fue mayor al utilizar cebada como sustrato (1289.60 m/g) en comparacin con el trigo (1060 m/g) sin observarse diferencias significativas a lo largo del ensayo. 22. Se observ diferencias significativas en el dimetro de colonizacin entre los distintos tratamientos probados en la colonizacin del suelo, tanto con el inculo de trigo como el de cebada; sin embargo, no se pudo determinar que tratamiento fue el mejor. Pese a que la produccin de biomasa de P. ostreatus fue mayor al utilizar trigo para la produccin de inculo primario, los niveles de colonizacin en suelo contaminado alcanzados por los tratamientos con el inculo de cebada fueron mayores que los de trigo. Los suplementos (torta de soya y aserrn) adicionados al suelo en el ensayo de colonizacin, parecen no favorecer al crecimiento del hongo; y la humedad pudo ser un factor limitante del crecimiento miceliar de los inculos secundarios de trigo y cebada en el suelo contaminado. 23. RECOMENDACIONES Producir inculo primario usando granos de trigo para obtener mayor biomasa y luego utilizar sta para inocular granos de cebada para producir inoculo secundario que se utilizar para inocular un sustrato definitivo o suelo contaminado directamente. Optimizar la humedad en los sistemas con suelo contaminado, para prolongar el crecimiento del micelio. Sobre todo cuando se usen suplementos secos como el aserrn debido a que por su naturaleza absorbe humedad. Probar diferentes niveles de contaminacin de petrleo crudo en suelo sin ningn suplemento, para probar dosis mnimas y mximas que permitan el crecimiento del hongo. Medir nivel de degradacin de petrleo en dichos tratamientos. Realizar ensayo de colonizacin de suelo a temperaturas ms altas (entre 24 y 40C), debido a que los lugares de potencial aplicacin para biorremediacin se encuentran en zonas clidas como el Norte del Per y la Regin Amaznica. 24. Blgo. Juan Juscamaita M. Patrocinador - UNALM PhD. Carl Johnston Co- Patrocinador YSU, Ohio Ing. Jose Palacios Blgo. Hilver Charca Msc. Ladislao Luis Renjifo UNAS Blga. Mara Encarnacin Holgado - UNSAAC Familia y amigos 25. Muchas g MUCHAS GRACIAS 26. Caracterizacin Suelo 27. Ciclo de vida Basidiomicetos 28. Factor Crecimiento del micelio Fructificacin Temperatura 24 a 30C 15 a 18C Luminosidad Oscuridad Luz indirecta (longitudes de onda menores a 600 nm) y un fotoperiodo de 12 horas Humedad R. 30 a 40% 85 a 90% Aireacin 28% de CO2, 20 % de oxgeno en el ambiente 20% de Oxgeno y menos de 700 ppm de CO2 en el ambiente. pH 5-6 (bajo 4 existe inhibicin) 5-6 ( bajo 4 existe inhibicin) Cuadro 3. Factores que afectan el crecimiento de Pleurotus spp. Fuente: Sanchez, J., et al., 2001 Factores que afectan el crecimiento de P. ostreatus 29. Vas metablicas de HAP en P. ostreatus 30. Formula conversin biomasa cm hifa/ g grano = C cm hifa x B ml de agua D ml agua A g grano A= 1 g de grano B = 25 ml agua C = cm hongo medido (dato) D = volumen de agua en 10 campos de visin (6.25 x10^-3) 31. Profundidad: 0.1 mm2 32. Dilucin 1/25 30 segundos Tincin 10 campos de visin por repeticin Procesamiento de datos MEDICIN DE BIOMASA 33. Hongos de pudricin blanca Phanaerochaete chrysosporium Ganderma applanatum Schizophillum communne Trametes versicolorPycnoporus sanguineus Pleurotus ostreatus