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Enrique Castro, 2003
1© 2010 Enrique Castro
Comunicación intercelular: SeñalizaciónComunicación intercelular: Señalización
➢Señalización extracelularModos de comunicaciónReceptores y hormonas
➢Receptores nuclearesEstructura de hormonas y receptores
Mecanismos de acción
➢Receptores de membranaTransducción y Segundos mensajerosTipos y mecanismos generales
➢Señalización extracelularModos de comunicaciónReceptores y hormonas
➢Receptores nuclearesEstructura de hormonas y receptoresMecanismos de acción
➢Receptores de membranaTransducción y Segundos mensajerosTipos y mecanismos generales
➢Receptores acoplados a proteínas GTransducción por proteínas Gruta de AC/cAMP
ruta dePLC/IP3/Ca2+
Ruta NO/cGMP
➢Receptores Tirosina-quinasasMecanismos generales Receptor de EGF
Receptor de insulina
Para © Enrique Castro Los trabajos de terceros retienen su licencia original
Enrique Castro, 2003
2© 2010 Enrique Castro
Modos de comunicación intercelularModos de comunicación intercelular
Comunicación por molécula secretada
(extracelular, difusible)
mensajero,molécula señal
emisor
dianas
receptor
diana
Receptor Nuclear
Comunicación citosólica directa
(intracelular, difusible, via gap junctions)
Comunicación por contacto celular
(extracelular, no difusible)
ReceptorMol. señal
Receptor
Mol. señalhidrofílica
Receptor
Mol. señalhidrofóbica Proteína
transportadora
Receptor de membrana
Enrique Castro, 2003
3© 2010 Enrique Castro
Ciclo de las señales intercelularesCiclo de las señales intercelulares
➢1. Síntesis de la molécula señal por la célula emisora
➢2. liberación al medio de la molécula señal
➢3. Transporte de la señal hasta la célula diana
➢4. Detección por una proteína receptora específica
➢5. Accción (respuesta): cambio en el metabolismo intracelular, función o programa de desarrollo por el complejo señalreceptor
➢6. Eliminación de la señal y terminación de la respuesta celular
Enrique Castro, 2003
4© 2010 Enrique Castro
Señalización: Regulación de la actividad celularSeñalización: Regulación de la actividad celular Señalización por
receptores de membrana
• Segundo mensajero intracelular• Regulación de la actividad enzimática
• Factores de transcripción controlados por hormonas
• Regulación de la expresión génica
Señalización por receptores nucleares
Quinasas / fosfatasasProteínas GcAMP / Ca2+
Co-activadoresCo-represoresHAC/HDAC
AB
CDE
F
G
H
Nuevas proteínas
Enrique Castro, 2003
5© 2010 Enrique Castro
Tipos de señalización intercelularTipos de señalización intercelular
S. autocrina
S. paracrina
Coordinación intratisular
S. endocrina S. neurocrina
Acción local Acción a distancia
glándula endocrina
neurona emisora
vasosaxón
Tejido diana
célula diana
Coordinación intertisular
• Lenta
• Baja [M]
• Rápida
• Alta [M]
Cooperación intercelular
axón• Lenta
• Baja [M]
• Rápida
• Alta [M]
Enrique Castro, 2003
6© 2010 Enrique Castro
Mecanismos de especificidadMecanismos de especificidad
➢ Esp. de unión➢ Esp. de efector
Varios mensajeros
Células endocrinas
Células diana
Receptores específicos de hormona
Com. hormonal
Com. neurocrina
Proyección topográfica
neuro-transmisor
nAchR
Músculo esquelético contracción
nAchR
Médula suprarrenal secreción
Músculo cardíaco relajación
Glándula salivar secreción
mAchR mAchR
Acetilcolina (Ach)
Enrique Castro, 2003
7© 2010 Enrique Castro
Señalización combinatoriaSeñalización combinatoria
Cóctel combinado• No hay señales únicas(master commander)
• Graduación• Cooperación / integración
Cóctel combinado• No hay señales únicas(master commander)
• Graduación• Cooperación / integración
Enrique Castro, 2003
8© 2010 Enrique Castro
Propiedad Esteroides Tiroideas Péptidos yproteínas
Neuro-transmisores
Regulación de lasíntesis
Si Si Si Si
Almacenamiento No Como proteína Gránulos desecreción
Vesículas desecreción
Mecanismo desecreción
Difusión pasiva através de membrana
Proteolisis ydifusión
Exocitosis Exocitosis
Unión a proteínasplasmáticas
Si Si Muy raro No
Vida mediaextracelular
Horas Dias minutos segundos
Mecanismo deeliminación
Metabolizaciónenzimáticaintracelular
Metabolizaciónenzimáticaintracelular
Hidrólisisextracelular
Recaptación,inactivaciónextracelular
Duración de laacción
Horas a días Días Minutos-segundos
Segundos-milisegundos
Tipo de receptor intracelular nuclear De membrana De membrana
Mecanismo deacción
Control directo de latranscripción
Control directode latranscripción
2º mensajerocitosólico
2º mensajerocitosólico ocorrientes iónicas
Características de las señales extracelularesCaracterísticas de las señales extracelulares
Receptores Nucleares Receptores de membrana
Enrique Castro, 2003
9© 2010 Enrique Castro
Clase Síntesis Alcance Acción Estructura
Hormonas Glándulaendocrina
Circula ensangre
Variablerápida (Adr)lenta (tiroideas)
Aminas (Adr)Esteroides (cortisol)Proteínas (FSH, LH) Péptidos (MSH, ACTH)
Neurotransmisores Terminalespresinápticos
Hendidurasináptica
Muy rápida,transitoriams-min
Aminas (NA, Ach, 5-HT)aa (Glutamato, GABA)péptidos (opioides)
Neuromoduladores Neuronas,sinapsis
paracrino Sostenida, varios minutos
Adenosinapéptidos (NPY, endorfinas)
Factores decrecimiento
Célulasinespecíficas
Autocrina/paracrina
Sostenidahoras-diasMitogénesis,diferenciación
Proteínas(EGF, IGF, NGF, TGF)
Citoquinas Célulasinespecíficasleucocitos
Autocrina/paracrina
Sostenida horas-diasproliferación,diferenciación
Proteínas, (Interferones,interleuquinas, IL, TNF)
Autacoides diversas Autocrina/paracrina
variable Aminas,péptidos
Nombres, clases y tipos de mensajerosNombres, clases y tipos de mensajeros
Enrique Castro, 2003
10© 2010 Enrique Castro
Señalización ultrarápida: transmisión sinápticaSeñalización ultrarápida: transmisión sináptica
Neurona motora
Fibra muscular
Placa motora
Transmisión nerviosa: eléctrica intracelular
Transmisión sináptica y neuromuscular• Permeabilidades iónicas de la membrana• Receptores ionotrópicos
Escala de tiempo ultra-rápida
Transmisión sináptica y neuromuscular• Permeabilidades iónicas de la membrana• Receptores ionotrópicos
Enrique Castro, 2003
11© 2010 Enrique Castro
Respuestas rápidas: control de la glucemiaRespuestas rápidas: control de la glucemiaIngestión de azúcar
Curva de tolerancia a la glucosa
Hiperglucemia:hígado toma glucosa de la sangre
Hipoglucemia:hígado vierte glucosa a la sangre
Mecanismo hormonal:Regulación de la actividad enzimática
Enrique Castro, 2003
12© 2010 Enrique Castro
Respuestas lentas: ciclo menstrualRespuestas lentas: ciclo menstrual
Enrique Castro, 2003
13© 2010 Enrique Castro
Receptores de membranaReceptores de membrana
➢Cascadas de transducción Organización funcional Motivos comunes
➢Mecanismos de transducción R. ionotrópicos R. acoplados a proteínas G (7TM)
R. RTK y similares (1TM) Actividad en zimática intrínseca- Guanilato ciclasas / fosfatasas- S/T-quinasas- Y-quinasas
Reclutan enzimas- SF R. de citoquinas- SF R. de TNF
➢Cascadas de transducción Organización funcional Motivos comunes
➢Mecanismos de transducción R. ionotrópicos R. acoplados a proteínas G (7TM) R. RTK y similares (1TM) Actividad en zimática intrínseca- Guanilato ciclasas / fosfatasas- S/T-quinasas- Y-quinasas
Reclutan enzimas- SF R. de citoquinas- SF R. de TNF
Enrique Castro, 2003
14© 2010 Enrique Castro
Cascadas de transducción de señalesCascadas de transducción de señalesseñal
Transducción
Respuestas
Receptor
Especificidad• Receptor-ligando
Amplificación• Enzimático
Terminación• Constitutiva, esencial• GTPasa de proteínas G
Regulación• Desensibilización/adaptación• Integración:
Sensibilidad• graduada/sigmoidal
agonista
antagonista
A
A*
⊕B
B*
⊕C
C*
⊕10
100
1000
x10señal
receptor⊕
⊗
respuesta
señal
T
convergencia
T
divergencia
estímulo
Res
pues
ta
Sigmoidalinterruptor (switch-like)
hiperbólicagraduada
Especificidad• Receptor-ligando
Amplificación• Enzimático
Terminación• Constitutiva, esencial• GTPasa de proteínas G
Regulación• Desensibilización/adaptación• Integración:
Sensibilidad• graduada/sigmoidal
Enrique Castro, 2003
15© 2010 Enrique Castro
Niveles de señalizaciónNiveles de señalización
Hormona(1er Mensajero)
Receptor de membrana
Segundo mensajero
Quinasas efectoras
IP3/Ca2+
PKA PKC PKGCaMPK
cAMP cGMPDAG
MAPK p38 SAPK
MEK
Src
Acciones
Transducción de señal
AC PLC
NO
MEKMEK
IRS
JakGrb, SHC
G pequeñasras
Proteínas G
MEKKs
S/T-quinasasS/T-quinasas
cross-talk
Y-quinasas
Y-quinasas
Interacciones proteína-proteína
GPCR
Enrique Castro, 2003
16© 2010 Enrique Castro
Segundos mensajerosSegundos mensajeros
Característicos • Intracelulares• Moléculas pequeñas (bajo Mr, no proteínas)• Difusibles• Unen a S/T-quinasas (u otros efectores)
Especiales (indirectos)• IP3: activa IP3R• NO: intra/extracelular, activa GC
Característicos • Intracelulares• Moléculas pequeñas (bajo Mr, no proteínas)• Difusibles• Unen a S/T-quinasas (u otros efectores)
Especiales (indirectos)• IP3: activa IP3R• NO: intra/extracelular, activa GC
Enrique Castro, 2003
17© 2010 Enrique Castro
Esquemas comunes en vías de señalización (1)Esquemas comunes en vías de señalización (1)
Proteínas G: GTPasas controladoras• Interruptor molecular• Amplificación (ganancia)
Formaactiva
Formainactiva
hidrólisis(endógeno)
Intercambio GDP/GTP(catalizado por receptor)
actividad GTPasa intrínseca(reloj molecular)
terminación de la señal
• Heterotriméricas (GPCR)• GTPasa constitutiva
• Pequeñas (bajo Mr)• GTPasa activable• Multifunción• Multiples familias
Factores GEF
Factores GAP
Proteínas G: GTPasas controladoras• Interruptor molecular• Amplificación (ganancia)
• Heterotriméricas (GPCR)• GTPasa constitutiva
• Pequeñas (bajo Mr)• GTPasa activable• Multifunción• Multiples familias
Enrique Castro, 2003
18© 2010 Enrique Castro
Esquemas comunes en vías de señalización (2)Esquemas comunes en vías de señalización (2)
Fosforilación de proteínas• quinasas/fosfatasas• actividad/unión
Formadesfosforilada
Formafosforilada
Proteína quinasa
Proteína fosfatasaterminación de la señal
• Actividad enzimática• Capacidad de unión
•Reclutamiento•Translocación
• S/T: quinasas efectoras• Y: transducción• H: quinasas efectoras
Fosforilación de proteínas• quinasas/fosfatasas• actividad/unión
• Actividad enzimática• Capacidad de unión
•Reclutamiento•Translocación
Enrique Castro, 2003
19© 2010 Enrique Castro
Esquemas comunes en vías de señalización (3)Esquemas comunes en vías de señalización (3)
Proteínas adpatadoras• Dominios proteína-proteína• Complejos de señalización• Andamiajes moleculares
acción
acción
Complejo de señalización
(Signalosometransductiosome)
enzimasefectoras
Cambio conformacional(inducido por ligando)
ligando
receptor
Proteína adaptadora
• Dos dominios P/P• Andamio molecular
Proteínas adpatadoras• Dominios proteína-proteína• Complejos de señalización• Andamiajes moleculares
• Dos dominios P/P• Andamio molecular
Enrique Castro, 2003
20© 2010 Enrique Castro
Clasificación de receptores de membranaClasificación de receptores de membrana
Canales activados por transmisor• Varios TM (2-6)• Oligómeros constitutivos (3-5)• Canales iónicos transmembrana
R. acoplados a proteínas G (GPCR)• 7 TM• Monómeros/dímeros constitutivos• Sin actividad enzimática (GEF)
R. de segmento transmembrana único (1TM)• 1 TM• Oligomerización inducida por ligando
• SF Receptores ionotrópicos• SF Receptores metabotrópicosCon actividad enzimática intrínseca• F. Rec. guanilato-ciclasas (membrana)• F. Rec. Tyr-fosfatasas (CD45)• SF Receptor de TGF (S/T-quinasa)• SF Receptores Tyr-quinasas (RTK)
Sin actividad, Reclutan enzimas• SF Receptor de citoquinas• SF Receptor de TNF (dominios de muerte)• SF Integrinas (contacto intercelular)
Tyr-quinasas solublesJakSrcLck
Canales activados por transmisor• Varios TM (2-6)• Oligómeros constitutivos (3-5)• Canales iónicos transmembrana
R. acoplados a proteínas G (GPCR)• 7 TM• Monómeros/dímeros constitutivos• Sin actividad enzimática (GEF)
R. de segmento transmembrana único (1TM)• 1 TM• Oligomerización inducida por ligando
• SF Receptores ionotrópicos
• SF Receptores metabotrópicos
Con actividad enzimática intrínseca• F. Rec. guanilato-ciclasas (membrana)• F. Rec. Tyr-fosfatasas (CD45)• SF Receptor de TGF (S/T-quinasa)• SF Receptores Tyr-quinasas (RTK)
Sin actividad, Reclutan enzimas• SF Receptor de citoquinas• SF Receptor de TNF (dominios de muerte)• SF Integrinas (contacto intercelular)
Enrique Castro, 2003
21© 2010 Enrique Castro
Receptores ionotrópicosReceptores ionotrópicos
Estructura• Varios TM (2-6)• Oligómeros constitutivos (3-5)• Tres familias principales
Función• Unión cooperativa de 2 ligandos• Canales iónicos transmembrana• Corrientes/potenciales eléctricos transmembrana
6,5 nm
Bicapa lipídica
nAchRpentámeros
iGluRpentámeros ?
P2X (ATP)trimeros ?
4 TM
3+2 TM
2 TM
AchNa+,K+
Corriente eléctrica
• Transmisión sináptica rápida• Transmisión neuromuscular
Estructura• Varios TM (2-6)• Oligómeros constitutivos (3-5)• Tres familias principales
Función• Unión cooperativa de 2 ligandos• Canales iónicos transmembrana• Corrientes/potenciales eléctricos transmembrana
• Transmisión sináptica rápida• Transmisión neuromuscular
I=nº iones / sN av
⋅F
Enrique Castro, 2003
22© 2010 Enrique Castro
γβ
α GDPE
γβ
α GDPE
γβ
α GTPE
γβ
αGTPEγ
βα GDP
E
Acción
Intercambio GDP/GTPDisociación
Unión al efectoractivación
Hidrólisis GTPreasociación
GTP
GDP
Pi
extracelular
intracelular
N
C
extracelular
7TM
Unión de ligando
Unión a G
i1 i2 i3
e1e2 e3 R
H
RH*
RH*RH*
Receptores acoplados a proteínas GReceptores acoplados a proteínas G
Unión de ligandointeracción con proteína G
➢ Estructura➢ Mecanismo• 7TM• N extracelular (unión ligando)• C intracelular
➢ Ligandos• Aminas DA, NA, Adr, 5HT• Péptidos SP, BK, ACTH, glucagón• H. Polipeptídicas FSH, LH• Prostaglandinas
➢ Estructura ➢ Mecanismo• 7TM• N extracelular (unión ligando)• C intracelular
➢ Ligandos• Aminas DA, NA, Adr, 5HT• Péptidos SP, BK, ACTH, glucagón• H. Polipeptídicas FSH, LH• Prostaglandinas
Enrique Castro, 2003
23© 2010 Enrique Castro
Receptores GuanilatociclasaReceptores Guanilatociclasa
A B C
Estructura• 1 TM• N extracelular
Función• Guanilato ciclasa de membrana• Receptores de: ANP (péptido atrial natriurético) (pérdida de Na+ por riñon) F. quimiotácticos de esperma Guanilina (enteropéptido) (secreción de fluidos, intestino)
D. similar a Y-quinasa(no funcional)
D. ciclasa(catalítico)
ANP
PPi
GTP cGMP
Oligomerización?
D. extracelular distintivo
AC
EGF
GC soluble
GC
enterotoxinasdiarreas
Estructura• 1 TM• N extracelular
Función• Guanilato ciclasa de membrana• Receptores de: ANP (péptido atrial natriurético) (pérdida de Na+ por riñon) F. quimiotácticos de esperma Guanilina (enteropéptido) (secreción de fluidos, intestino)
Enrique Castro, 2003
24© 2010 Enrique Castro
Receptores S/Tquinasas: SF Receptor de TGFβReceptores S/Tquinasas: SF Receptor de TGFβ
Estructura• 2 tipos de subunidades• 1 TM• N extracelular• dominios S/T-quinasa• transfosforilación
Función• Proteína S/T-quinasa• Vía Smads (R, Co, I)• Activador transcripcional• Diferenciación, antimitótico (p21)
TTSGSGSGLPMotivo GS
D. S/T-quinasa(activo) D. S/T-quinasa
(inactivo)
activador
Tipo ITipo IIligando
Transfosforilaciónactivadora
Tipo IITipo I
4. II fosforila I5. I activado fosforila Smads
6. heterodimerización
7. translocación
8. heterotrímero
Fast-1
3. oligomerización
R-Smad
Co-Smad
Gen diana
Tipo III (-glicano)presentación
tetrámeroactivo
9. transcripción
TGFBMPGDFActivinas
morfogenéticos
Estructura• 2 tipos de subunidades• 1 TM• N extracelular• dominios S/T-quinasa• transfosforilación
Función• Proteína S/T-quinasa• Vía Smads (R, Co, I)• Activador transcripcional• Diferenciación, antimitótico (p21)
Enrique Castro, 2003
25© 2010 Enrique Castro
Y Y
transfosforilación y activación
dimerización inducida por ligando
ss
ss ss
D. similar a Ig
D. rico en Cys
EGF-R
R. insulinaIGF-R
NGF-R FGF-RPDGF-RCSF-R
VEGF-R
N
C
extracelular
1TM
Clase I
Clase II Clase III
Y Y -PP-SH2
reclutamientovia SH2
fosforilación de sustratos
P-Y
extracelular
MAPK
Superfamilia de receptores TyrquinasaSuperfamilia de receptores Tyrquinasa
R. Factores de crecimientomitógenos
RTK• Un único segmento transmembrana• Oligomerización inducida por ligando• Dominio conservado Y-quinasa intracelular (transfosforilación)
• Dominios extracelulares variables (clasificación)• Señalización vía dominios SH2 y MAPKs
RTK• Un único segmento transmembrana• Oligomerización inducida por ligando• Dominio conservado Y-quinasa intracelular (transfosforilación)
• Dominios extracelulares variables (clasificación)• Señalización vía dominios SH2 y MAPKs
Enrique Castro, 2003
26© 2010 Enrique Castro
Receptor de citoquinas: γIFNReceptor de citoquinas: γIFN
1
228
252
472
LPKS
YDKPH
221 aa
1
226
251
316
66 aaPPIPLQIEEYL
23 aa 24 aa
Estructura• 2 tipos de subunidades• 1 TM• N extracelular• Sin actividad enzimática• Motivos de reclutamiento NRTK
1 TM
Unión deJak1 Unión de
Jak2
reclutamientode Stat
(fosfo-Y/SH2)
uniónseñalización
señalización
Transfosforilación de STATs reclutadas
Estructura• 2 tipos de subunidades• 1 TM• N extracelular• Sin actividad enzimática• Motivos de reclutamiento NRTK
Enrique Castro, 2003
27© 2010 Enrique Castro
Señalización por citoquinas: Ruta Jak/STATsSeñalización por citoquinas: Ruta Jak/STATsBasal: / disociadas
Jaks unidas (Jak1,2, Tyk2)
Ensamblaje del tetrámero activo• dimerización -L-• reclutamiento
Activación de Jaks y transfosforilación• Activación Jak2• Transfosforilación• Sitio de unión STAT
Reclutamiento y activación de STATS• Unión vía SH2/fosfo-Y• Fosforilación en Y
Jak2 → Jak1Jak1 → Stat
Dimerización de STATs• Unión vía SH2/fosfo-Y
Translocación nuclear
GAS
ISRE
p48
Activación de transcripción
STATs= factores de transcripción
Especificidad: uso de Jak/Tykisoformas STATn
Ensamblaje del tetrámero activo• dimerización -L-• reclutamiento
Activación de Jaks y transfosforilación• Activación Jak2• Transfosforilación• Sitio de unión STAT
Reclutamiento y activación de STATS• Unión vía SH2/fosfo-Y• Fosforilación en Y
Dimerización de STATs• Unión vía SH2/fosfo-Y
Enrique Castro, 2003
28© 2010 Enrique Castro
TNFα y dominios de muerte (DD)TNFα y dominios de muerte (DD)
Enrique Castro, 2003
29© 2010 Enrique Castro
GPCR y proteínas GGPCR y proteínas G
➢ Receptores 7TM (GPCR) Estructura ClasificaciónInteracciones con Proteínas GRegulación
➢ Proteínas G heterotriméricas Estructura Ciclo vital de las proteínas G Regulación de la transducción
Enrique Castro, 2003
30© 2010 Enrique Castro
Estructura de los GPCREstructura de los GPCR
Homo/heterodímeros funcionales
1 2 3 4 5 6 7
NH2
COOH
S-S
S|S
e1 e2 e3
i3i1 i2
P
N-terminal:• Variable 6-400• Glicosilado• Puentes SS• Unión de ligando
MotivoDRY / ERW
Fosforilación GRKdesensibilización
Fosforilación PKAdesensibilización
Buclevariable
i3: InteracciónProteína G
C-terminal:• Variable 100-200• fosforilación/regulación• Ancla palmitoilo
>1000 genes
Enrique Castro, 2003
31© 2010 Enrique Castro
Familias de receptores GPCR (homología)Familias de receptores GPCR (homología) Familia A: Rodospsina/βAR
• R. de aminas biógenas: DA, NA, 5-HT, HA, mAchR)• R. de péptidos
(CCK, endotelinas, taquiquininas,NPY, TRH, bombesina y opsinas)• R. de bradiquinina• R. de glicoproteínas y similares
(FSH, LH, TSH, GnRH, fMLP, ADH, oxitocina, somatostatina, opioides)(Nucleótidos, eicosanoides, opioides)(Activados por proteasa)
• R. olfativos y similares (odorantes, adenosina, cannabinoides,melanocortina)
• R. de melatonina
Familia B: péptidos tipo glucagón• R. de Calcitonina, CGRP, CRF• R. de PTH y PTHrP• R. de Glucagón y similares
(GIP, GHRH, PACAP, VIP, secretina)• R. de latrotoxina
Familia C: glutamato/Ca2+
• R. metabotrópicos de glutamato mGluR• R. metabotrópicos de GABA, GABAB
• R. gustativos• R. de feromonas• R. de Ca2+ extracelular
DRY /ERW
N extra largo
N largo
SS
No DRY
Ancla C
No ancla
e3 extra corto
Dímeros obligatorios
C extra largo
Sitio de unión interno DRY
N presenta el ligando.ERW
auto-ligando
>1000 tipos
Enrique Castro, 2003
32© 2010 Enrique Castro
Proteínas G heterotriméricas: EstructuraProteínas G heterotriméricas: Estructura
C=O|NHG
|SC-OMe
Anclaje a la membrana(esencial)
N-terminal miristoilado
C-terminal isoprenilado
C15: farnesiloC20: geranil-geranilo
Subunidad Dímero
20 isoformasmayor, 39-52 Kda2 subdominios
1-5 isoformasmediana, 35-37 KDamotivos WD, molinillo
1-12 isoformaspequeña, 7-9 KDahélice enrollada
•Unión GDP/GTP•Actividad GTPasa•Interacción con receptor•Interacción con efector
•Secuestro de G •desensibilización•Interacción con receptor•Interacción con efector
D. GTPasa
D. helicoidal
Enrique Castro, 2003
33© 2010 Enrique Castro
Acción
Unión de ligando,interacción proteína G Intercambio GDP/GTP,
Disociación
extracelular
βα
GDP
γβ
αGTP
γβ
α GTPE
E
E
βα
GDP
baja afinidad
Alta afinidad
Pi
anclaje a membrana
varios efectores
- reloj molecular- amplificación
Ciclo de acción de proteínas G heterotriméricas Ciclo de acción de proteínas G heterotriméricas
Unión al efector,activación
Hidrólisis GTPreasociación
Estado basal, en reposo
Estado activo
Amplificación: 1 R → varias G 1 G → varios E
GTP
GDP
extracelular
Gα activa Gβγ activa
Enrique Castro, 2003
34© 2010 Enrique Castro
Efectores: Dianas de proteínas GEfectores: Dianas de proteínas G
Proteína G
G
G t
o i
q
s ↑ AC (cAMP)
↑ PLC (IP3/DAG)
↑ cGMP-PDE
↑ IK↓ ICa
↓ AC (I,V,VI)
↑ PLC (IP3/DAG)
↑ IK↓ ICa
↑ PLA2 (AA)
↓ AC (I)
Enrique Castro, 2003
35© 2010 Enrique Castro
Mutiplicidad de proteínas G y efectoresMutiplicidad de proteínas G y efectores
Enrique Castro, 2003
36© 2010 Enrique Castro
Hélice switch IIUnión al efector
Activación de proteínas G heterotriméricasActivación de proteínas G heterotriméricas
D. helicoidal
D. GTPasa
Motivos WDUnión al efector reclutamiento GRKs
s
AC (adenilil-ciclasa)
Enrique Castro, 2003
37© 2010 Enrique Castro
Ciclo de las proteínas G: herramientasCiclo de las proteínas G: herramientas
GDP
GTP
+
GTPGDP
Intercambio,receptor
Hidrólisis, GTPasa intrínseca
disociación
Pi
inactivo
activo
X
X
Toxina pertussis(ADP-ribosilación G)Gi,Go
Toxina colérica(ADP-ribosilación G)Gs
Análogos GTP no hidrolizables(GTPS, GDPNHP)todas G
Activación permanente
Inhibición permanente
NAD+
nicotinamida
Enrique Castro, 2003
38© 2010 Enrique Castro
Papeles de las proteínas GPapeles de las proteínas G
Amplificación• R → G • G → E
Control temporal• Reloj molecular
Control espacial• Difusión en la membrana
Integración• Convergencia / divergencia
Modulación• Sitios de regulación• Proteínas RGS• Desesibilización
AR Gs s ↑AC ↑cAMP
Gi i ↓AC
Go ↑ IK
Gq q ↑PLC
mAchR
R. promiscuos
R. exclusivos
GE
1E2
E3
Difusión a efectores distantes
Difusión a otros receptores
Ciclos deamplificación
Enrique Castro, 2003
39© 2010 Enrique Castro
Desensibilización de receptoresDesensibilización de receptores
receptor
⊕⊗
respuesta
señal
receptor 2
⊕
señal 2
respuesta 2
⊗
Pérdida de respuesta: adaptación• Exposición repetida• Alta intensidad• Retroalimentación negativa
(seguridad)
D. Heteróloga: Perdida respuesta a otras señales
D. Homóloga: Perdida a si mismo
Internalización(secuestro)
Internalización y degradación
(down-regulation)
desacoplamiento Inactivación del transductor
Inhibidor /antagonista
endosoma
lisosoma
transductor
Inhibidor
Mecanismos
Enrique Castro, 2003
40© 2010 Enrique Castro
Desensibilización heterólogaDesensibilización heteróloga
Pérdida de respuesta: adaptación• Específico de vía (efector final)• Retroalimentación negativa por efector final• Desacoplamiento del Receptor• Inactivación de G?
1 2 3 4 5 6 7
NH2
COOH
S-S
S|S
i3
AR
Gs
s
AC
cAMP
PKA
R1
R2⊗
⊗ ⊗
PKA(PKC)
Fosforilación i3 (S/T) desacoplamiento
fosforilación G?
GX
Cambio de función• Específico de vía
R RPKA
Gs Gi Gs Gi— —
Enrique Castro, 2003
41© 2010 Enrique Castro
Desensibilización homólogaDesensibilización homóloga Pérdida de respuesta: adaptación
• Específico de agonista• Desacoplamiento por GRKs• Internalización
Basal, desocupadoUnión deligando
GRK
Exposición de i3
β
α
Gcompetencia GRK
Reclutamientode GRK
i3, (WD)
FosforilaciónC-terminal
Vía de acción
Vía de desensibilización
Reclutamientode arrestina
P-C-term.Sitio de uniónde arrestina
arrestina
Bloqueadainteracción con G
Unión Src
MAPKsCambio de señal
Src
Cambio de función• Específico de vía
internalización
GRK• Constitutivamente activas• Actividad por disponibilidad de sustrato• Fosforilación C-terminal
Enrique Castro, 2003
42© 2010 Enrique Castro
Desensibilización homóloga: internalizaciónDesensibilización homóloga: internalizaciónReceptor unido a
p-arrestina
Desfosforilaciónde p-arrestina
Reclutamiento de clatrina
Endocitosismediada
por clatrina
denudaciónacidificación
Desfosforilación del receptor fosfatasa PP2A membranaLiberación del ligando acidificación
resensibilización
lisosomaproteasasdegradación
Regulación negativa(down-regulation)
dinamina
arrestina adaptador
endosoma
Vesículaendocítica
Inserción enmembrana
reciclaje
Receptor internalizado
Enrique Castro, 2003
43© 2010 Enrique Castro
Vías de 2º mensajerosVías de 2º mensajeros
➢ Receptores 7TM (GPCR) Estructura Clasificación
Interacciones con Proteínas GRegulación
➢ Proteínas G heterotriméricas Estructura Ciclo vital de las proteínas G
Regulación de la transducción
➢ Vía Gs-cAMP-PKA Estructura Clasificación Acciones de la PKA Regulación
➢Vía Gq -IP3/Ca2+-PKC/CaMPK
PLCβ y fosfoinosítidos DAG y PKC
Acciones PKC
Homeostasis del Ca2+
Receptores de IP3 y RyR
Calmodulina y sus acciones CaMPK: regulación y acciones
➢ Otros mensajeros NO y vía cCMP-PKG A. Araquidónico, Pgs y LTs
Enrique Castro, 2003
44© 2010 Enrique Castro
Niveles de señalizaciónNiveles de señalización
Hormona(1er Mensajero)
Receptor de membrana
Segundo mensajero
Quinasas efectoras
IP3/Ca2+
PKA PKC PKGCaMPK
cAMP cGMPDAG
MAPK p38 SAPK
MEK
Src
Acciones
Transducción de señal
AC PLC
NO
MEKMEK
IRS
JakGrb, SHC
G pequeñasras
Proteínas G
MEKKs
S/T-quinasasS/T-quinasas
cross-talk
Y-quinasas
Y-quinasas
Interacciones proteína-proteína
GPCR
Enrique Castro, 2003
45© 2010 Enrique Castro
cAMP como 2º mensajerocAMP como 2º mensajero
βα AC PPi 2Pi
ΔGº=-33 KJ/mol
ATP
3',5'-cAMP
5'-AMP
ACAdenilil-CiclasaΔGº=+6.7 KJ/mol
PDEfosfodiesterasaΔGº=-50 KJ/mol
PKA
otrasaccionesMetabolismo
síntesis
degradación
Inicio de la señal
Terminaciónde la señal
Acciones
Complejo H-R-G-E
Enrique Castro, 2003
46© 2010 Enrique Castro
Cinética de Segundos MensajerosCinética de Segundos Mensajeros
↑AC
↓PDE ↓PDE
↑AC
[cAMP]
10 µM
1 µM
Actividad AC basal baja
↑AC↓PDE ↓PDE
↑AC
[cAMP]
10 µM
1 µM
Actividad AC basal alta
Bajo recambio Alto recambio
Balance síntesis ↔ degradación[cAMP]
sintesis degradación
forskolinaT. cólera
IBMXcafeínateofilina
Enrique Castro, 2003
47© 2010 Enrique Castro
Dianas del cAMP: PKA y otrosDianas del cAMP: PKA y otros
PKA• Heterotetrámero R2C2
• 4 sitios cAMP, cooperativos• S/T-quinasa• Diana RRpS/T
Otras dianas• Canales iónicos activados por cAMP (epitelio olfatorio)• Rap1-GEF (proteínas G pequeñas)
4 cAMP
Kd2
<Kd1
Unióncooperativa
+
inactivo
activo
[cAMP]i
100%-
50%-
Act
ivid
ad q
uinas
a
≈10 µM
Activación cooperativa
sigmoidal
Bucleinhibitorio
-RRpS/T-
OH
proteína
-RRpS/T-
O-
proteína
PiATP ADP
Fosforilación de proteínas diana (secuencia específica)
Umbral de activación
Enrique Castro, 2003
48© 2010 Enrique Castro
Estructura de la holoPKAEstructura de la holoPKA
N C
Dimerización R-R Unión cAMP
Unión a C Bucle pseudosustrato
Subunidadcatalítica
Subunidades reguladoras
Estructura de R• homodimerización• R-I citosólica / R-II membrana
Estructura de C• Bilobar con surco
Bucle inhibidorpseudosustrato
-R-R-G-A-I
R inhibe constitutivamente a C por bloqueo del centro catalítico
Lóbulo dereconocimiento
Lóbulocatalítico
N
C
Unión ATPTransferencia Pi
D. quinasaconservado
Surco de unión
ATP
Secuencia diana
Unión de sustrato
Enrique Castro, 2003
49© 2010 Enrique Castro
Dianas de la PKA: efectos del cAMPDianas de la PKA: efectos del cAMP
βα AC
Complejo H-R-G-E
CFTR
Fosforilasaquinasa
TG-lipasa
ICa
↑ Glucogenolisis hepatocitos, músculo esquelético
↑ Lipolisis adipocitos
↑ Fuerza contráctil corazón
↑ Secreción de electrolitos intestino, bronquios
ATPcAMP
CREB
Efectoscitosólicos
Translocaciónnuclear de C
Activacióntranscripcional
CBP/p300
pCAFmediator
RNApol II
HAT
5' TGACGTCA 3'
Enrique Castro, 2003
50© 2010 Enrique Castro
Terminación de la señal: fosfodiesterasas (PDEs)Terminación de la señal: fosfodiesterasas (PDEs)
βα AC
PPiATP3',5'-cAMP
5'-AMP
PDEfosfodiesterasaΔGº=-50 KJ/mol
Complejo H-R-G-E
PDE 1 CaM/Ca2+ ↑ (muy abundante)PDE 2 cGMP ↑ PDE 3 cGMP ↓ PDE 10 cAMP ↓
PDE 4PDE 7,8 no inhibida IBMX
PDE 5,9 5 inhibida SildenafiloPDE 6 Gt ↑ (fotoreceptores)
XInhibida por
xantinasIBMX, cafeínateofilina (asma)
reguladoresInespecíficascAMP y cGMP
EspecíficascAMP
EspecíficascGMP
N
C
D. localización membrana, citosol citoesqueleto
D. regulador unión reguladores
D. catalítico conservado
D. regulador unión PDE1
Enrique Castro, 2003
51© 2010 Enrique Castro
Terminación de la señal: fosfatasasTerminación de la señal: fosfatasas Fam. PPP
• PP1: dimérica, espectro ≈ PKA• PP2A: trimérica, amplio espectro• PP2B: dimérica, CaM/Ca2+
Fam. PPM• PP2C: monomérica
Fam. PTP• Específicas Y-P (>30)
ProtProtP
H2O Pi
Función esencial:desfosforilación
AB
Estructura• diméricas
Regulación • por localización (B)
Por proteínas inhibidoras• reguladas por fosforilación
G: glucógenoM: músculoPNUTS: núcleoPR55: somaPR55: dendritas
PP1BPP1
B P+
PKA
B
PPI
A
PPIB A
PPIP
P
PKA
reguladora
catalítica
N C
Unión Bcalcineurina
Autoinhibitorio
CaM
Enrique Castro, 2003
52© 2010 Enrique Castro
Adenilil ciclasa (AC)Adenilil ciclasa (AC) Estructura
• Duplicación interna: 2 x (6 TM+ catalitico)• N y C citosólicos
Regulacion• 9 isoformas de membrana• Gs estimula todas• 4 reguladores: s, i, Ca2+ • fosforilable
1er clúster TM 2º clúster TMSitio principal de glicosilación
C1
C2
ATP·Mgs
Unión de forskolina
i: ↓1,5,6,8
o: ↓1
Regulación por CaM/Ca2+
↑4,7 ↓1Regulación
por ↑1,8 ↓5,6 i
PKC↑1-3,7 ↓4
PKA↓5,6
CaMPK-II↓3
AC = integrador de señalesdetector de coincidencias
Enrique Castro, 2003
53© 2010 Enrique Castro
Integración en la ruta del cAMPIntegración en la ruta del cAMP
AC
Prot ProtP
Pi
ATP
3',5'-cAMP5'-cAMP PDE
PP
s⊕
⊕ ⊕⊕
PKC
⊖
⊖⊖
⊖
⊖
⊖ i
⊕cGMP
Ca2+
Adrenalina (AR)DA (D1,D2)5-HT (5HT1, 5HT2)HA (H-2)PGEAdenosina (A2)glucagónopioidesACTH, CRHFSH, LH, TSH, PTHodorantesgusto (amargo,dulce)
Estimulantes Inhibidores noradrenalina (2AR)
Acetilcolina (mAchR)Adenosina (A1)Dopamina5-HTopioides Glutamato (mGluR)somatostatina
⊖
Enrique Castro, 2003
54© 2010 Enrique Castro
Vías de 2º mensajerosVías de 2º mensajeros
➢ Receptores 7TM (GPCR) Estructura
ClasificaciónInteracciones con Proteínas G
Regulación
➢ Proteínas G heterotriméricas Estructura
Ciclo vital de las proteínas G Regulación de la transducción
➢ Vía Gs-cAMP-PKA
Estructura
Clasificación
Acciones de la PKA
Regulación
➢Vía Gq -IP3/Ca2+-PKC/CaMPK
PLCβ y fosfoinosítidos
DAG y PKC Acciones PKC
Homeostasis del Ca2+
Receptores de IP3 y RyR
Calmodulina y sus acciones CaMPK: regulación y acciones
➢ Otros mensajeros
NO y vía cCMP-PKG
A. Araquidónico, Pgs y LTs
Enrique Castro, 2003
55© 2010 Enrique Castro
Señalización por Fosfolipasa CSeñalización por Fosfolipasa C
Ruta• Gq, Go, G• Dos segundos mensajeros
Estructura• Dominios PH, C2 y catalítico
PH C2cat cat CN
PH C2cat cat CN P HSH3SH2 SH2
PH C2cat cat CN
PLC DAG(membrana)
IP3
citosol
PIP2
Sustratolipídico
(membrana)
Dobleacción
Unión de 1er mensajero
extracelular
GqGo
Dos 2º mensajeros
noradrenalina (1AR)
Acetilcolina (mAchR)5-HT (5HT-1c)HA (H1)ATP (P2Y)Glutamato (mGluR)quininas: BK, ATCRH, TRH, oxitocina
PLC
PLC
PLCPIP3/PIP2/IP3BP
PIP3
Unión PIP2 Manos EF Unión PS/Ca2+ Unión G
Actividad GAP
No funcional
Ca
Ca
Ca
X YGq
Fosforilación Tyr
Ca2+/CaM
Activadores
Enrique Castro, 2003
56© 2010 Enrique Castro
Reciclaje de 2º mensajeros en la ruta PLCReciclaje de 2º mensajeros en la ruta PLC
DAGquinasa
PLC
DAGquinasa
ATP ADPDAG
PA
IP3 IP3
quinasaIns-P
5-fosfatasa
Ins-P4-fosfatasa
Ins-P4-fosfatasa
Ins-P1-fosfatasa
inositol-1,4,5-trisfosfato
Ins-1,3,4,5-tetrakisfosfato
PI-4-quinasa
PIP-5-quinasa
Ins-1,4-bisP
Ins-4-P
Ins-3,4-P2
Ins-1,3,4-P3
Ins-3-isP
XX
X
X
Inhibidor Li+
CDP-DAG
CTP
Terminación de la señal
reciclaje
Enrique Castro, 2003
57© 2010 Enrique Castro
Efectores en la ruta PLC: DAG/PKC y Ca2+/CaMPKEfectores en la ruta PLC: DAG/PKC y Ca2+/CaMPK
G
R
PLC
PKC
CaMPK
[Ca2+] ≈ 500 µM
Ca2+
DAG
IP3
⊕
IP3R
Canal de Ca2+
Retículo endoplásmico
[Ca2+]i ≈ 100 nM
Membrana plasmática
Respuestacelular
Respuestacelular
Acción dualDos sistemas efectores
Enrique Castro, 2003
58© 2010 Enrique Castro
cPKC, convencional
nPKC, nueva
uniónATP catalítico
C1 C1 C2 C4C3
aPKC, atípicas
UniónDAG
unión Ca2+
PS
PS, no Ca2+
pseudosustratoautoinhibidor
forbol
α, β, γ
δ, ε, η, θ
ξ, ι, λ, ζ
PS, DAG, Ca2+ / AA
PS, DAG,
PS, AA, PI3K?
nPKC, nuevas
Estructura y tipos de PKCEstructura y tipos de PKC Familias de PKC
Enrique Castro, 2003
59© 2010 Enrique Castro
Regulación de la PKCRegulación de la PKC
PKC en reposo (citosol, citoesqueleto)
inactiva
activa
Translocación
PKC quinasa autofosforilación
alinea D. catalíticocoloca autohibidor N-pseudosustrato
Unión DAG, activación
desfosforilación inactiva
membrana
Regulación
Fosforilaciones constitutivas
•Translocación•Activación
Enrique Castro, 2003
60© 2010 Enrique Castro
Acciones de la PKCAcciones de la PKC
Genes de respuesta tempranamitogénesis
Genes pro-inflamatorios
IL-2COX-2NOS-2
FosJun
P PP
SRF
MAPKpp90rsk
SRF Elk-1(TCF)
βα DAG
Ca2+
PKC
GSK3 ↓Glucógeno-sintasa
-quinasa
raf1
Canales iónicostransportadores
IKK
GLUT
↑↓ corrientes sinápticas neuronas
↓ Glucogeno-síntesis Hepatocitos, músculo
↑ captura de glucosa intestino, músculo
pp90rsk
Calponina ↑ contracción músculo liso
MAPK
PKC TFRegulación expresión génica
Tranlocaciónnuclear
DegradaciónIB
IB
NF-IB
↑ resp. inmune linfocitos
atípicas
Enrique Castro, 2003
61© 2010 Enrique Castro
Producción sostenida de DAGProducción sostenida de DAG
DAG
PA
PC
PLD
PC-PLC
PAPH
PIP2
IP3
PI-PLC
colinaPi
Colina + Pifosforil-colina
•20-50% PL•memb. Plasmática•memb. RE•otras memb.
•<0.1% PL•memb. Plasmática
PKC, inducción⊕
PKC, Tyr-quinasas
⊕
0 s m htiempo
0
[señal]
cPKC nPKC
IP3
PA DAGPI-PLC
PLDPC-PLC
metabolismo
Recambio temporal
►Localización DAG• plasmalema• RE• núcleo
►Isoforma PKC• Ca2++ DAG → cPKC• DAG → nPKC
Enrique Castro, 2003
62© 2010 Enrique Castro
Ca2+
100 nM
VOCCs
ROCCsSMOCs GPCR
SERCA
Ca2+
IP3
Ca2+
SERCAIP3R
cADPR
Ca2+
Ca2+
Ca2+
Ca2+
Ca2+
Ca2+
Ca2+
Ca2+
Ca2+Na+
Ca2+
PMCAIntercambiador
Na+/Ca2+
Ca2+
uniportador Ca2+
mitocondrial
RyR
PLC
Tampones Ca2+calbindina,
parvalbúmina
acciones
entrada por membrana plamática
liberación de reservorios
intracelulares
Ca2+
1-2 mM
Retículo endoplásmico
Homeostasis intracelular del Ca2+Homeostasis intracelular del Ca2+
Mecanismos de subida de [Ca2+]i
Mecanismos de bajada de [Ca2+]i
Ca2+
0.5 mM
Enrique Castro, 2003
63© 2010 Enrique Castro
Tipos de señales de Ca2+Tipos de señales de Ca2+
Enrique Castro, 2003
64© 2010 Enrique Castro
Señales de Ca2+: IP3, RyR y CICRSeñales de Ca2+: IP3, RyR y CICR
➢CICR ● amplificación● extensión ● oscilaciones
IP3R
controlado por IP3
RyRcontrolado por Ca2+
Ca2+ IP3 Ca2+ cADPR
alta afinidad(sat. a [Ca2+]r)
inhibitorio
alta afinidad(saturado en reposo)
baja afinidad
baja afinidad
Moduladores múltiples
Enrique Castro, 2003
65© 2010 Enrique Castro
Mano EFHélice E
Hélice F
Bolsillos hidrófobos, Met ocultas
Met expuestas
4 Ca2+
Ca2+
Ca2+
Sitio de uniónde Ca2+
Met expuestas
región bisagra
nuevos sitios de unión por “parches” hidrófóbicos
Kd
0.5-1 µM
N
N
C
C
parcialmente expuesto
Unión cooperativaE
D
DN
H2O
carbonilo
Estructura de la CalmodulinaEstructura de la Calmodulina
Sitio de unión de Ca2+
apo-Calmodulina Ca2+-Calmodulina
N C4 repeticiones
Bisagra (x2)
Enrique Castro, 2003
66© 2010 Enrique Castro
Dianas de calmodulina: baahDianas de calmodulina: baah Motivos de unión a calmodulina
• Baah: basic amphipatic alpha helix
Unión de calmodulina a baah• Interacciones hidrofóbicas
bisagra
péptido MLCK (diana)
Ca2+-calmodulina,conformación extendida
Zonahidrofóbica
MLCK
Motivobaah
CaMPK-I
R HK
T
T
L
S
FMV
A
A
W
V Baah de espectrina
Cara básica
Cara hidrófóbica(unión a calmodulina)
Enrique Castro, 2003
67© 2010 Enrique Castro
Dianas y acciones del Ca2+ citosólicoDianas y acciones del Ca2+ citosólico
Calcineurina ↑fosfatasa
↑ Respuesta inmune linfocitos
S100 Proliferación celularCáncer y metástasis
TnC ↑ Contracción músculo estriadoSinaptotagminaExocitosis,
liberación NTneuronas
Canales iónicosIK
Integración sináptica neuronas
MLCK ↑ ↑ Contracción músculo liso
Fosforilasa↑quinasa
↑ glucogenolisis músculo
↑ Ca-ATPasa↓ IP
3R
↑ Homeostasis del Ca2+
AC PDE
Modulación cAMP
↑ NOS↑ NO/cGMP
↑ Pyk2↑ MAPK Proteína-quinasasdependientes
de CaMCaMPK-IICaMPK-IV
Aprendizaje y memoria (neuronas)
motilidad celular (fibroblastos, macrófagos)
proliferación/apoptosis
Ca2+
CaM
Interacciones con otras rutas
Accionesdirectas
Acciones mediadaspor CaM
citosólica
nuclear
Enrique Castro, 2003
68© 2010 Enrique Castro
Acciones nucleares del Ca2+: expresión génicaAcciones nucleares del Ca2+: expresión génica
CaMCaMPK-II
Ca2+citosol
inmunosupresores
Enrique Castro, 2003
69© 2010 Enrique Castro
Vías de 2º mensajerosVías de 2º mensajeros
➢ Receptores 7TM (GPCR) Estructura Clasificación
Interacciones con Proteínas GRegulación
➢ Proteínas G heterotriméricas Estructura Ciclo vital de las proteínas G
Regulación de la transducción
➢ Vía Gs-cAMP-PKA
Estructura
Clasificación
Acciones de la PKA
Regulación
➢Vía Gq -IP3/Ca2+-PKC/CaMPK
PLCβ y fosfoinosítidos
DAG y PKC
Acciones PKC
Homeostasis del Ca2+
Receptores de IP3 y RyR
Calmodulina y sus acciones
CaMPK: regulación y acciones
➢ Otros mensajeros NO y vía cCMP-PKG A. Araquidónico, Pgs y LTs
Enrique Castro, 2003
70© 2010 Enrique Castro
NO: Acción paracrinaNO: Acción paracrina
endotelio
músculo liso vascular
Ach (mAchR)BKSP
NO: mensajero intercelular (transitorio, local)dianas: GC → cGMP
nitrosilación de proteínas (Hb, NF-B)
Enrique Castro, 2003
71© 2010 Enrique Castro
cGMP cGMPcGMP cGMP
La ruta cGMP / PKGLa ruta cGMP / PKG
fosfolambano ↑ Relajación músculo liso
Activaciónplaquetaria
Expresión génicanúcleo
IP3R
PLC?
cG2cG1N C
D. dimerización unión cGMPD. catalítico
Thr-P
Cooperativasigmoidal
NLS(I)
B. pseudosustratoLeuzip
Localización (I: acetil, II: miristoil)
TF
cGMP
cGMP cGMPcGMP cGMP
Guanilato ciclasa
Guanilato ciclasa
GTPPKG-II
(membrana)
↑ Secreción de fluidos intestino, bronquios
GMP
GC soluble
GC membrana
hemo
NO PDE
PKG-I(citosol)
Enrique Castro, 2003
72© 2010 Enrique Castro
Comunicación intercelular: vías de TyrquinasasComunicación intercelular: vías de Tyrquinasas
➢Mecanismos generalesTipos de Tyr-quinasasReceptores y transfosforilación
Proteínas adaptadoras: dominiós de interacción P-P
Proteínas G pequeñas
➢Receptores RTKEstructura de hormonas y receptoresMecanismos de activación
➢Las rutas de MAPKsTipos y mecanismos generales
La ruta ras-raf-erk. Papel de ras.Regulaciones en la ruta raf-ras-erkEfectores y acciones de las MAPKsOtras rutas de MAPKs
➢La ruta de PI3K y relacionadasPI3K y PIPn de membrana
Activación y efectos de PKBMecanismos de acción de la insulina
Otras enzimas reclutadas por RTK
➢Receptores de citoquinasTipos de receptoresTyr-Quinasas solubles
➢Mecanismos generalesTipos de Tyr-quinasasReceptores y transfosforilación
Proteínas adaptadoras: dominiós de interacción P-P
Proteínas G pequeñas
➢Receptores RTKEstructura de hormonas y receptoresMecanismos de activación
➢Las rutas de MAPKsTipos y mecanismos generales
La ruta ras-raf-erk. Papel de ras.Regulaciones en la ruta raf-ras-erk
Efectores y acciones de las MAPKsOtras rutas de MAPKs
Enrique Castro, 2003
73© 2010 Enrique Castro
Niveles de señalizaciónNiveles de señalización
Hormona(1er Mensajero)
Receptor de membrana
Segundo mensajero
Quinasas efectoras
IP3/Ca2+
PKA PKC PKGCaMPK
cAMP cGMPDAG
MAPK p38 SAPK
MEK
Src
Acciones
Transducción de señal
AC PLC
NO
MEKMEK
IRS
JakGrb, SHC
G pequeñasras
Proteínas G
MEKKs
S/T-quinasasS/T-quinasas
cross-talk
Y-quinasas
Y-quinasas
Interacciones proteína-proteína
GPCR
Enrique Castro, 2003
74© 2010 Enrique Castro
Señalización por fosforilación en TyrSeñalización por fosforilación en Tyr
➢ Fosforilación en Tyr es rara• Abundancia de proteínas fosfo-Y ~1% respecto a fosfo-Ser/Thr
➢ Mediada por Tyr-quinasas y Tyr-fosfatasas• Balance de actividades
➢ Múltiples y diversas acciones fisiológicas• Regulación de enzimas citosólicas• Regulación de citoesquelo• Regulación de tráfico de vesículas• Regulación de la expresión génica
Fosforilación de proteínas en Tyr es un mecanismo primario de
transducción de señales
Proliferación celularApoptosisDiferenciación celular
Cáncer
Respuesta inmune
quinasa
fosfatasa
➢ Fosforilación en Tyr es rara• Abundancia de proteínas fosfo-Y ~1% respecto a fosfo-Ser/Thr
➢ Mediada por Tyr-quinasas y Tyr-fosfatasas• Balance de actividades
➢ Múltiples y diversas acciones fisiológicas• Regulación de enzimas citosólicas• Regulación de citoesquelo• Regulación de tráfico de vesículas• Regulación de la expresión génica
Enrique Castro, 2003
75© 2010 Enrique Castro
Mensajeros y señalización Tyrquinasas Mensajeros y señalización Tyrquinasas
● [Ca2+]i
● Reorganización citoesqueleto
● Síntesis de proteínas
● Expresión génica
vía PLC
vía MAPKs
Vía Rho/Rac Crecimiento celularSíntesis DNADivisión celularProliferaciónDiferenciaciónVía PI3K
Tyr-proteína-quinasasy
fosfoproteínas
Mitógenos(factores de crecimiento)
EGFFGF
PDGF
Factores de supervivencia(factores de crecimiento)
InsulinaIGFs
CitoquinasIL-2,3,4,5,6
F. HematopoyéticosGH, PRL, Lep
R. de antígenosTCRBCR
● [Ca2+]i
● Reorganización citoesqueleto
● Síntesis de proteínas
● Expresión génica
Enrique Castro, 2003
76© 2010 Enrique Castro
Mecanismos GF/ras/MAPKs: proliferaciónMecanismos GF/ras/MAPKs: proliferación
Grb2Sos
raf
MEK
ERKs
EGFFGFPDGF Factores de crecimiento
Síntesis nucleótidos/DNAFactores de transcripción(respuesta temprana)
ProliferaciónDiferenciación celular
ras
Hormona(1er Mensajero)
Receptor de membrana
Cascada MAPKS
Quinasas efectoras
Transducción de señal
Enrique Castro, 2003
77© 2010 Enrique Castro
SH2
Transducción de señales por RTKTransducción de señales por RTK
YP-
extracelular
Y -P
MAPK
MAPKKK
MAPKK
G
SH2
1. Transfosforilación RTK• Inducido por ligando
2. Reclutamiento de adaptadores• Unión D. SH2/SH3 etc.• Asociación con proteínas G pequeñas
4. Cascada 3 quinasas• Fosforilación secuencial• Activación quinasas efectoras (MAPKs)
3. Activación G pequeña• Interruptor molecular• Activación de quinasas iniciadoras
5. Activación otras rutas
• Múltiples acciones
Andamiajes moleculares• Reclutamiento/Localización• Regulación
PLC
PI3K
1. Transfosforilación RTK• Inducido por ligando
2. Reclutamiento de adaptadores• Unión D. SH2/SH3 etc.• Asociación con proteínas G pequeñas
4. Cascada 3 quinasas• Fosforilación secuencial• Activación quinasas efectoras (MAPKs)
3. Activación G pequeña• Interruptor molecular• Activación de quinasas iniciadoras
5. Activación otras rutas
• Múltiples acciones
Andamiajes moleculares• Reclutamiento/Localización• Regulación
Enrique Castro, 2003
78© 2010 Enrique Castro
Activación de proteína G rasActivación de proteína G ras
P P Grb2
ras
GDP
ras
GTP actividad GEF de sos• Intercambio GDP/GTP• Activación de ras
efector de ras: raf• Ser/Thr quinasa• Activación cascada MAPKs
actividad GAP• Reguladora (terminación)• RasGAP (reclutable, fosforilable)
Ras controla:• Duración• Amplificación• Localización
PH GAP CN SH3 SH3SH2
P
PPi
GTP GDP
actividad GEF de sos• Intercambio GDP/GTP• Activación de ras
raf
MEK
ERKs
efector de ras: raf• Ser/Thr quinasa• Activación cascada MAPKs
GAP
actividad GAP• Reguladora (terminación)• RasGAP (reclutable, fosforilable)
Ras controla:• Duración• Amplificación• Localización
Anclaje a membrana
CascadaMAPKs
p130 GAP
ras
GDP
ras
GTP
PH GAP CN SH3 SH3SH2
Sos Grb2 P
P
Enrique Castro, 2003
79© 2010 Enrique Castro
La cascada MAPK de ERKLa cascada MAPK de ERK
T-E-Y
ERK
T-E-Y
ERK
P P
raf raf
ras
GTPP
P Módulo MAPK• Cascada 3 quinasas sucesivas• Fosforilación múltiple• Fosforilación dual: S/T - Y
Acciones delas ERKFosforilación
proteínas diana
ATP ADP
ATP ADP
ATP ADP
Inductorproteína G pequeña
MAPKKKquinasa S/T
MAPKKDSK: doble especificidadfosforila S/T y también Y
MAPKquinasa S/T
ras GTP
Activación complejaMuy regulada
raf
MEK
ERKs
Activación secuencialen
complejo multiproteico
Estequiometría 1:1no amplificación
cinética “interruptor”
Bucle de activación
(AL)
MP1
Módulo MAPK• Cascada 3 quinasas sucesivas• Fosforilación múltiple• Fosforilación dual: S/T - Y
ras GTP
raf raf
ras
GTPP
P
S-xxxx-S/T
MEK
S-xxxx-S/T
MEK
P P
Enrique Castro, 2003
80© 2010 Enrique Castro
Mecanismos IR/PI3K/PKB: crecimientoMecanismos IR/PI3K/PKB: crecimiento
IRS
PDK
PKB
InsulinaIGF
Crecimiento celularSupervivencia/antiapoptosis
Efectos metabólicos (GLUT, GSK)
Hormona(1er Mensajero)
Receptor de membrana
Cascada MAPKS
Quinasas efectoras
Transducción de señal
Segundo mensajero
SHC PI3K
3'-PIP3
rho PLD
DAG
PKC
Enrique Castro, 2003
81© 2010 Enrique Castro
La ruta Insulina/PI3K/PKBLa ruta Insulina/PI3K/PKB
Basal Complejo de señalización Acciones•
1. Reclutamientoadaptadores
2. Reclutamientoefector primario:
PI3K3. Síntesis mediador
lipídico Reclutamiento de Q. efectora
4.Translocación
de PKB 5.Activación
de PKB
Basal Complejo de señalización
Acciones•
3. Síntesis mediador
lipídico
Reclutamiento de Q. efectora
2. Reclutamientoefector primario:
PI3K
Enrique Castro, 2003
82© 2010 Enrique Castro
El complejo de señalización de InsREl complejo de señalización de InsR
PI(4,5)P2
pY-SHC
PH
-pY -pY
pY-
pY-
pY
PI3K
SHP2
Otros adaptadores Gab1-SHP2 Cbl/APS/Crk
Acciones principalesMetabólicasSupervivenciaCrecimiento
Grb2 Grb
2
rasAcciónmitogénica(pobre)
Acciones en membrana
PH
-pY
-pY
pY-
pY-
PI3K
Otros adaptadores Gab1-SHP2 Cbl/APS/Crk
Enrique Castro, 2003
83© 2010 Enrique Castro
Pras
Vías de acción de InsulinaVías de acción de Insulina
insulina
InsR
Supervivenciaantiapoptosis
Efectos metabólicos
Expresión génicaSupervivenciaciclo celular
Síntesis de proteínasCrecimiento celular
rab
rho/rac
PKB
??
Proliferación
Translocación GluT
Membraneruffling
● Insensible a wortmaninaactivación PDH
● Parcialmente sensibleactivación ras/MAPKsproliferación
● Bloqueado por wortmaninaactivación Rho/rac (membrane ruffling)translocación GluTActivación PKB (todo lo demás)
● Insensible a wortmaninaactivación PDH
● Parcialmente sensibleactivación ras/MAPKsproliferación
● Bloqueado por wortmaninaactivación Rho/rac (membrane ruffling)translocación GluTActivación PKB (todo lo demás)
Enrique Castro, 2003
84© 2010 Enrique Castro
mTOR y crecimiento celularmTOR y crecimiento celular
mTORGL raptor
mTORGL rictor
rheb GTP
TSC1
TSC2
PKB
eIF-4APAB
eIF-4E
eIF-4A
Mnk1eIF-4E
eIF-4E
4E-BP
p70 S6K
eEF2-K
eEF2Subunidad
40S
rpS6P
4E-BPP P P
P
P PP
P
PActividadGAP
estimulación
actividadquinasa
Desfosfo-eEF2 activo elongación de
proteínas
X
Traducción 5'TOP mRNAsBiogénesis de ribosomas
raptor/rictor:Especificidad de sustratos
Otrasacciones
Complejo de iniciación (eIF3/mRNA) Ensamblaje de ribosoma funcional Traducción de 5'cap-mRNAs(genes estructurales: proteínas )
mRNA
ERKs
Regulaciónactividad PDK2
Desfosfo-eEF2 activo elongación de
proteínas Traducción 5'TOP mRNAsBiogénesis de ribosomas
Complejo de iniciación (eIF3/mRNA) Ensamblaje de ribosoma funcional Traducción de 5'cap-mRNAs(genes estructurales: proteínas )
rheb GTP
Enrique Castro, 2003
85© 2010 Enrique Castro
IB
InsR/PKB : supervivenciaInsR/PKB : supervivencia
BAD
X
Bad (proapoptótico) FoxO (FasL, Bim, proapoptóticos) p53 (proapoptóticos)
CREB (Bcl-2, antiapoptótico) NF-B (Bcl-xL, IAPs, antiapoptótico)
Bcl-2CREBCREBP P
CRE
Fas-LBim
Bcl-xLIAPsp50
p65
B
PKB
tBid
Bax
Cit C
Caspasa 9
Apoptosis
14-3-3
BADPP
X
FoxO
14-3-3PP
X
IKK
p50 p65
P P
Genesanti-apoptóticos Genespro-apoptóticos
p53
X
Bad (proapoptótico) FoxO (FasL, Bim, proapoptóticos) p53 (proapoptóticos)
CREB (Bcl-2, antiapoptótico) NF-B (Bcl-xL, IAPs, antiapoptótico)
Genesanti-apoptóticos
Enrique Castro, 2003
86© 2010 Enrique Castro
Efectos metabólicos de InsREfectos metabólicos de InsRglucosa
Pyr
Acetil-coA
OAA
Citrato
Citrato
malonil-coA
FFA
TAG(grasa)
Acetil-coA
glucosa
G6P
Pyr
G6P Glucógeno
OAA
Translocación GluT4
Trasporte Glu HK/GK PFK-2
PKB
rab
PP1 fosforilasa GS GSK3
PKB
ATP:citrato liasa GSK3
PKB
acetil-coA carboxilasa Captura de glucosa Síntesis de glucógeno PDE3 cAMP FFA sintetasa TG Lipasa Síntesis de triglicéridos Utilización de glucosa inducción
enzimasglucolíticas
PDH
???
FFA
-oxidación
6PGA
G6PDH
Trasporte Glu
HK/GK
PFK-2
ATP:citrato liasa
acetil-coA carboxilasa
Captura de glucosa
Síntesis de glucógeno
PDE3 cAMP
FFA sintetasa
TG Lipasa Síntesis de triglicéridos
Utilización de glucosa
inducciónenzimasglucolíticas
-oxidación
PP1
fosforilasa
GS
GSK3
GSK3
G6PDH